JP7237890B2 - 多能性幹細胞の分化能の予測方法及びそのための試薬 - Google Patents
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Description
本発明の別の目的は、前記分化抵抗性予測マーカーの発現を指標として、多能性幹細胞の分化能の保持に適した培養条件を探索する手段を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、前記分化抵抗性予測マーカーの発現を指標として、多能性幹細胞用培地を評価する方法を提供することである。
本発明の更なる目的は、多能性幹細胞の分化抵抗性を低下またはなくす方法を提供することである。
[1]ヒト多能性幹細胞におけるCHD7の発現レベルを測定することを含む、該多能性幹細胞の分化能の予測方法。
[2]前記CHD7の発現レベルがトータルRNA 5ng中1500コピー以上であるヒト多能性幹細胞を、分化刺激に応答して分化能を示すと予測することを特徴とする、[1]に記載の方法。
[3]前記CHD7の発現レベルがトータルRNA 5ng中2710コピー以上である、[2]に記載の方法。
[4]前記CHD7の発現レベルがEssential 8培地又はStem-Partner(登録商標) Human iPS/ES cells mediumを用いて5継代以上培養したヒト多能性幹細胞における発現レベルである、[2]または[3]に記載の方法。
[5]前記ヒト多能性幹細胞が胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]ヒト多能性幹細胞におけるCHD7の発現レベルを測定することを含む、該多能性幹細胞用培地の評価方法。
[7]前記ヒト多能性幹細胞が、被験培地で5継代以上培養したヒト多能性幹細胞である、[6]に記載の方法。
[8]前記CHD7の発現レベルがトータルRNA 5ng中1500コピー以上である場合に、該被験培地は、分化刺激に応答して分化能を示すようにヒト多能性幹細胞を維持し得ると評価することを特徴とする、[6]又は[7]に記載の方法。
[9]前記CHD7の発現レベルがトータルRNA 5ng中2710コピー以上である、[8]に記載の方法。
[10]前記ヒト多能性幹細胞が胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、[6]~[9]のいずれかに記載の方法。
[11]CHD7の発現を検出し得る物質を含有してなる、ヒト多能性幹細胞の分化能を予測、及び/又はヒト多能性幹細胞用培地を評価するための試薬又はキット。
[12]CHD7をコードする核酸を含有してなる、ヒト多能性幹細胞の分化誘導剤。
[13]前記CHD7の発現レベルが、分化抵抗性を示すヒト多能性幹細胞におけるCHD7タンパク質レベルと比較して2倍以上のタンパク質レベルであるヒト多能性幹細胞を、分化刺激に応答して分化能を示すと予測することを特徴とする、[1]に記載の方法。
[14]前記CHD7の発現レベルがEssential 8培地又はStem-Partner(登録商標) Human iPS/ES cells mediumを用いて5継代以上培養したヒト多能性幹細胞における発現レベルである、[13]に記載の方法。
[15]前記分化抵抗性を示すヒト多能性幹細胞が、ReproFF2培地を用いて5継代以上培養したヒト多能性幹細胞である、[13]又は[14]に記載の方法。
本明細書において、多能性幹細胞の「分化能」とは、多能性幹細胞が自発的に、あるいは特定の分化刺激に応答して、三胚葉系列又は特定の細胞系列に分化する能力を意味する。本発明の好ましい実施態様においては、ある特定の分化刺激に応答して、その分化刺激に対応する細胞系列に分化する能力を有するヒト多能性幹細胞を予測し、選択する。そのような分化刺激としては、PSCが未分化状態を脱していずれかの分化細胞が誘導され得る刺激であって、その分化の方向性が既知である限り特に制限されないが、例えば、後述の実施例におけるEB形成アッセイやサイトカイン誘導性分化アッセイに使用される培養条件等が挙げられる。
本明細書において、「CHD7の発現レベル」とは、特に明記した場合を除き、CHD7遺伝子の発現レベル及びCHDタンパク質の発現レベルのいずれを意味してもよい。
CHD7タンパク質濃度は、培養した細胞のLysateにおけるCHD7タンパク質濃度を直接測定した値でもよいし、培養した細胞のLysateを標準品として、標準品に対する相対値であってもよい。該培養した細胞は、分化抵抗性を示す幹細胞であってもよく、正常な分化能を示す幹細胞であってもよく、該Lysateは、濃縮されたものであってもよく、濃縮されていなくてもよい。
ES細胞の場合、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー細胞上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor(LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor(bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848; Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147; H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932; M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559; H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585;Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。また、ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Research Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
EG細胞は、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
nt ES細胞の作製のためには、核移植技術(J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646)とES細胞作製技術(上記)との組み合わせが利用される(若山清香ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊), 47~52頁)。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
mGS細胞はWO 2005/100548に記載される方法に従って、精巣細胞から作製することができる。
一方、リアルタイムRT-PCRは、PCRの増幅量をリアルタイムでモニタリングできるので、電気泳動が不要で、より迅速にCHD7の遺伝子発現を解析可能である。通常、モニタリングは種々の蛍光試薬を用いて行われる。これらの中には、SYBR Green I、エチジウムブロマイド等の二本鎖DNAに結合することにより蛍光を発する試薬(インターカレーター)の他、上記プローブとして用いることができる核酸(但し、該核酸は増幅領域内で標的核酸にハイブリダイズする)の両端をそれぞれ蛍光物質(例:FAM、HEX、TET、FITC等)および消光物質(例:TAMRA、DABCYL等)で修飾したもの等が含まれる。
また、デジタルPCR分析は、抽出したmRNAからcDNAを合成し、超微小区画や油中水滴(W/O型)エマルションの水滴中にcDNAが1または0となるように希釈し分散させてPCR増幅を行い、増幅シグナルがポジティブの微小区画や水滴の数を直接カウントすることにより、サンプル中のターゲット遺伝子の発現量を絶対的に測定する分析手法のことであり、特に好適に用いることができる。デジタルPCR分析は、市販のデジタルPCR分析装置を用いることができ、QuantStudio 3D デジタル PCR システム(Thermo Fisher Scientificの商品名)、BioMark HD(Fluidigmの商品名)やDroplet Digital PCR方式を採用したBio-Rad Laboratoriesの製品等を用いることができ、各装置の取扱説明書やプロトコールに従って分析することができる。
CHD7タンパク質濃度は、培養した細胞のLysateにおけるCHD7タンパク質濃度を直接測定した値でもよいし、培養した細胞のLysateを標準品として、標準品に対する相対値であってもよい。該培養した細胞は、分化抵抗性を示す幹細胞であってもよく、正常な分化能を示す幹細胞であってもよく、該Lysateは、濃縮されたものであってもよく、濃縮されていなくてもよい。
従って、本発明はまた、PSCにおけるCHD7の発現レベルを測定することを含む、該多能性幹細胞用培地の評価方法(以下、「本発明の評価方法」ともいう)を提供する。被験培地としては、上記CHD7の発現レベルを測定する工程に先立ってPSCを維持培養するのに使用され得る各種培地が挙げられる。
CHD7タンパク質濃度は、培養した細胞のLysateにおけるCHD7タンパク質濃度を直接測定した値でもよいし、培養した細胞のLysateを標準品として、標準品に対する相対値であってもよい。該培養した細胞は、分化抵抗性を示す幹細胞であってもよく、正常な分化能を示す幹細胞であってもよく、該Lysateは、濃縮されたものであってもよく、濃縮されていなくてもよい。
従って、本発明はまた、CHD7をコードする核酸を含有してなる、PSC、特にhPSCの分化誘導剤、並びに該核酸を、分化抵抗性を示すPSCに導入することを含む、該PSCの分化誘導方法を提供する。
本明細書において、すべての実験はヒトESCおよびヒトiPSCを使用した。本研究は、先端医療振興財団/神戸医療産業都市推進機構(FBRI)の倫理委員会の承認を受けた。
ヒト胚性幹細胞(ESC)株 KhES-1(Riken BRC)(Navarro-Alvarezら, Cell Transplant2008; 17(1-2): 111-119)及びH9(WiCell Research Institute, Levensteinら, Stem Cell; 24(3):568-74, 2006 Mar.)、ならびにヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)株 PFX#9 (Nishishitaら. PLoS One. 2012; 7(6): e38389)、201B7(Riken RBC)及びSHh#2(Nishishitaら, PLoS One. 2012; 7(6))のいずれかを、マイトマイシンC処理したSNL76/7細胞(SIM strain embryonic fibroblast, ECACC; European Collection of Authenticated Cell Culture)上で、hPSCs培地(Takenakaら, PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)を用いて、またはrhVitronectin-N(組換えヒトビトロネクチン-N)(VTN-N, Thermo Fisher Scientific)でコーティングしたディッシュ上で、Essential 8培地(Es8, Thermo Fisher Scientific)(Chen ら. Nat Methods 2011; 8(5): 424-429,)、SPM(Stem-Partner(登録商標) Human iPS/ES cells medium)(Takenakaら, PLoS ONE 2015;10(6): e0129855,)(Kyokuto Pharmaceutical Co. Ltd.)又はRiproFF2培地(RFF2, ReproCELL)を用いて培養した。細胞を、Gentle Cell Dissociation Reagent(GCDR; Stem Cell Technologies)を用いて凝集で継代し、iPSCの場合は1:3の比率で、hESCの場合は1:3.5の比率で分割した。あるいは、TrypLE Select(Life Technologies)(Takenakaら,PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)を用いて単一細胞懸濁液を播種することにより、細胞を継代した。単一細胞懸濁液中の細胞を、6ウェルプレートに1ウェルあたり、Es8で培養する場合は3×105個、RFF2培地で培養する場合は1×105 個播種した。インキュベーター(MCO-19AIC、Panasonic、Osaka、Japan)内で、37℃、5%CO 2の条件下で細胞を培養した。KhES-1、H9及びPFX#9の核型を、5回の継代毎にmulticolor fluorescence in situ hybridization(mFISH)により、10継代ごとにG-バンドにより検査し、正常な核型を有するPSCをこの研究で使用した。
指定のない限り、すべての試薬はThermo Fisher Scientificから調達した。siCHD7又はコントロールsiRNA(mock)導入実験のために、予め設計したサイレンサーセレクト(Silencer Select)ヒトCHD7 siRNA(カタログ番号4392420; ID:s31142)及びサイレンサーセレクトネガティブコントロールNo.1(カタログ番号4404021)を使用した。これらの試薬の導入は以下のように行った。
VTN-Nでコーティングした6ウェルプレートに、1ウェルあたり2×10 5個のESCを播種し、4mLのEs8、SPM又はRFF2を用いて培養した。翌日に培地を交換し、メーカーの説明書に従い、Lipofectamine RNAiMAXinを用いて細胞にsiCHD7(トランスフェクション量50pmol、30pmolもしくは10pmol)又はコントロールsiRNAをトランスフェクションした。50pmolのsiCHD7の導入について簡潔にいえば、カクテルA(4μL Lipofectamine RNAiMAX試薬及び150μL Opti-MEM培地)を、カクテルB(1μLの50μM siCHD7(50 pmol)又はコントロールsiRNA(50 pmol)及び150μL Opti-MEM培地)と混合し、室温で5分間インキュベートした。混合したカクテル(240μL)を用いてsiCHD7(最終濃度10nM)又はコントロールsiRNA(最終濃度10nM)をES細胞にトランスフェクションし、48時間インキュベートした。試薬の形質導入効率は、指定された時点で、トランスフェクションされた細胞中のCHD7 mRNAをqRT-PCRで検出することにより評価した。
T7プロモーター及びT7ターミネーターを、それぞれCHD7 アイソフォーム 2(NM_001316690.1(配列番号3))の5 'および3' コーディング配列に融合させ、pMXベクターにクローニングした。SfiIでpMXベクターを消化した後、mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA Transcription Kitを用いてCHD7 アイソフォーム 2の合成mRNAを作製した。同様の方法により、クロモドメインおよびSNF2-like ATPase/helicasドメインの両方をカバーする合成mRNA(CHD7 DN1)を作製した。公開されたCHD1配列(Ryanら. Embo j 2011; 30(13):2596-2609)とのホモロジーに基づいてCHD7におけるSANT-SLIDEドメイン領域を決定し、同様の方法により合成mRNA(CHD7 DN2)を作製した。得られたmRNA量をND-1000(Nano Drop)で測定した。同じベクターのバックボーンから得られた高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)のmRNAを、コントロール(コントロールmRNA、mock)として使用した。
VTN-Nでコーティングした6ウェルプレートの各ウェルに5ng / mLの線維芽細胞増殖因子2(FGF2; Peprotech)を添加したRFF2を充填し、ESC(3×10 5個)を播種した。メーカーの説明書に従い、Lipofectamine Messenger MAXを用いて細胞にmCHD7又はコントロールmRNA(mock)をトランスフェクションした。簡潔にいえば、カクテルA(3.75 μL Lipofectamine Messenger MAXトランスフェクション試薬及び125μL Opti-MEM培地)を室温で10分間インキュベートした。次いで、カクテルB(2.5μgのmCHD7又はコントロール mRNA、及び125μLのOpti-MEM培地)を調製し、カクテルAと混合した後、室温で5分間インキュベートした。混合したカクテル(240 μL)に、最終濃度として5ng/mLとなるように FGF2を添加した4 mLの RFF2を加えた。本培地を用いて37℃で24時間、細胞をインキュベートした。試薬の形質導入効率は、指定された時点で、トランスフェクションされた細胞中のCHD7 mRNA発現をqRT-PCRで決定することにより評価した。
Infinium Human Methylation 450 BeadChip(Illumina)を用いて、培養したESCまたはiPSCのメチル化状態を測定した。プロモーター領域のメチル化パターンは、Cluster 3.0を用いて階層的にクラスター化し、Java Tree Viewで可視化した。プロモーター領域の各遺伝子のメチル化状態は、GeneChip(Human Genome U133 Plus2.0 Array、Affymetrix)アレイデータにより得られた遺伝子発現シグナルと比較して候補遺伝子を抽出することにより評価した。
4mLのEs8を用いてVTN-Nでコーティングしたウェル上で培養した細胞を、siCHD7(50pmol)または対照siRNA(mock)をトランスフェクションした48時間後に、PBS(-)で1回洗浄した。次に、細胞をセルスクレーパー(Iwaki)で掻き取り、ピペッティングにより解離させ、低接着性6ウェルプレート(Corning)に移し、10mMのROCKインヒビター(Y-27632、和光)を含むEssential 6培地(Es6)を用いて1日間培養し、EB形成のためにEs6のみを用いて13日間培養した。培地を2日ごとに交換した。顕微鏡(Olympus IX71、Olympus)を用いてEBの数および形態を観察した。qRT-PCRによりCHD7の遺伝子発現を決定し、qRT-PCR device(QuantStudio 12K Flex)を用いてTaqMan(登録商標) Scorecard Panel(A15870)により遺伝子発現プロファイルを決定した。CHD7のプライマー配列を表1に示す。
最終濃度として5ng/mLになるようにFGF2を添加したRFF2を用いてVTN-Nでコーティングしたウェル上で培養した細胞を、mCHD7または対照mRNAを導入した24時間後にPBS(-)で1回洗浄した。次に、細胞をセルスクレーパー(Iwaki)で掻き取り、ピペッティングにより解離させ、低接着性6ウェルプレート(Corning)に移し、10mM ROCKインヒビター(Y-27632、和光)を含み且つFGF2を含まないRFF2を用いて1日間培養し、EB形成のためにFGF2を含まないRFF2を用いて培地を毎日交換しながら培養した。顕微鏡(Olympus IX71、Olympus)を用いてEBの数および形態を観察した。qRT-PCRによりCHD7の遺伝子発現を決定し、qRT-PCR device(QuantStudio 12K Flex)を用いてTaqMan(登録商標)Scorecard Panel(A15870)により遺伝子発現プロファイルを決定した。
メーカーの説明書に従い、RNeasyマイクロキット(74004、QIAGEN)を用いてトータルRNAを抽出した。QuantiTect Reverse Transcription Kit(205311、QIAGEN)を用いてcDNAを合成するために、1μgのトータルRNAを使用した。TaqMan(登録商標) hPSC Scorecard Panel(A15870)を用いて、三胚葉及び自己増殖に関連する遺伝子発現のプロファイリングのための定量的PCR(qPCR)を行った。SYBR(登録商標)Select Master Mix及びStepOnePlusを用いて、逆転写反応により500ngのトータルRNAからcDNAを合成した。反応は、95℃で10分間、及び95℃で15秒間、60℃で1分間及び72℃で15秒間を40サイクルという条件で行った。用いたプライマーを表1に列挙した。相対的な定量は、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)での標準化後に2-ΔΔCt法を用いて計算した。
CHD7転写物のコピー数は、Droplet Digital PCRシステム(Bio-Rad Laboratories)によって決定した。具体的には、TaqMan(登録商標)Gene Expression Assay(Hs00215010_m1、Thermo Fisher Scientific)のプローブを用いて、Es8またはRFF2で培養したKhES-1から抽出した5ngのトータルRNAからcDNAを生成した。RT-PCR反応混合物をQX100システム(Bio-Rad Laboratories)を用いて、取扱い説明書に従ってエマルションを生成した。その後、Applied Biosystems GeneAmp 9700 Thermalcyclerを用いて、Es8培養物およびRFF2培養物からcDNAをそれぞれ増幅した。各反応液は、10μLのddPCRプローブSupermix、1000nMプライマー、250nMプローブ、および鋳型cDNAを含む20μL溶液から成り、反応は、95℃で10分間処理後、94℃で30秒間の変性と53℃で60秒間の伸長反応を40サイクル繰り返し、最後に98℃で10分間という条件で行った。反応後、各ウェルの生の蛍光データをソフトウェアQuantaSoft ver. 1.2(Bio-Rad Laboratories)で分析した。
細胞を播種した72時間後、ウエスタンブロッティング用の細胞溶解物を調製した。プロテアーゼ阻害剤カクテル錠(Complete Mini、Roche)を添加したComplete Lysis-M(Roche)を用いてタンパク質を抽出した。1次抗体及び2次抗体としてそれぞれ、ポリクローナルヒツジIgG 抗Chd7 抗体(AF7350、R&D Systems)及びホースラディッシュペルオキシダーゼで標識されたウサギ抗ヒツジIgG(H + L)抗体を用いた。Chemi-Lumi One Super reagents(Nacalai Tesque)を用いてシグナルを検出した。レーンにアプライする前に、ビシンコニン酸総タンパク質アッセイキット(Nacalai Tesque)を用いて総タンパク質を測定した。
ESCを種々の条件で培養した。具体的には、H9をEs8で17継代培養(P1)、KhES-1をEs8で10継代培養(P2)、及びKhES-1をRFF2で11継代培養(N)した。いずれの細胞も、VTN-Nでコートしたディッシュで、フィーダー細胞フリーで、単一細胞で培養した。培養したESCをそれぞれ、cOmplete Lysys-M(Merck KGaA、製品番号:04719956001)のプロトコールにしたがって溶解し、タンパク濃度を測定した後、500μLずつ分注して液体窒素で急速に冷凍し、使用するまで-80℃で保存した。総タンパク濃度は、P1が、1.25mg/mL、P2が、1.27mg/mL、Nが、0.84mg/mLであった。H9細胞を、Es8又はRFF2で培養し、cOmplete Lysys-Mのプロトコールに従って溶解した後、アミコン ウルトラ-4, PLTK ウルトラセル-PL メンブレン, 30 kDa(Amicon(登録商標) Ultra-4 PLTK Ultracel-PL membrane, 30 kDa、カタログ番号:UFC803024、Merck KGaA)を使用し、4000 X g、4℃で濃縮したものをそれぞれ、標準品及びネガティブコントロール(N2)とした。標準品及びネガティブコントロール(N2)を500μLずつ分注して液体窒素で急速に冷凍し、使用するまで-80℃で保存した。標準品及びネガティブコントロール(N2)の総タンパク濃度は、それぞれ4.06mg/mL、10.23mg/mLであった。
サンドイッチELISAには、捕捉(固相)抗体は、ヒトCHD7(配列番号2)のAla 263-Gln 457を大腸菌で発現させたポリペプチドを抗原として得られたモノクローナル抗体(マウスIgG1)をProtein A又はProtein Gで精製したもの、一次抗体としてヒトCHD7(配列番号2)のGly 25-Met 200を大腸菌で発現させてウサギに免疫し、抗原でアフィニティー精製した抗ヒトCHD7ウサギIgG、二次抗体として抗ウサギIgG‐HRP(SouthernBiotech, 4090-05)をそれぞれ使用した。
サンドイッチELISAは、以下の方法で行った。サンドイッチELISAの最適な条件を設定するために、一次抗体と二次抗体の濃度については、以下の表に示す条件で検討した。D-PBS(-)で3μg/mLに希釈した捕捉抗体の溶液を96穴プレート(MaxiSorp(登録商標)、Nunc、44-2404-21)のウェルに100μLを加え、プレートシールで密閉して4℃で一晩静置した。その後、捕捉抗体の溶液をデカンテーションで除き、0.05%Tween(登録商標)20を含むD-PBS(-)(以下、「洗浄液」ともいう。)を200μL加えて軽く攪拌し5分静置後除去して洗浄しこれを3回繰り返した。洗浄液を除いたウェルに、洗浄液に1%BSAを加えたブロッキング溶液を加え、室温で1時間インキュベーションしてブロッキングを行った。次いで、ブロッキング溶液で希釈した標準品、目的サンプルを100 μL/ウェル、Blank用ウェルにはブロッキング溶液を同量添加して、プレートシールをしっかりと貼り液が蒸発しないようにして4℃で一晩インキュベーションした。その後、ウェルを洗浄液で3回洗浄し、ブロッキング溶液で1μg/mL又は3μg/mLに希釈した一次抗体を100μL加え、室温で1時間インキュベーションした。その後、一次抗体を除き、ウェルを洗浄液で3回洗浄した。次いで、5000倍又は10000倍に希釈した二次抗体をウェルに100μL添加し、室温で1時間インキュベーションした。その後、洗浄液で3回洗浄し、100μLの基質溶液(TMB、ScyTek Laboratories, TM4500)を添加して遮光して20~30分インキュベーションして100 μL/ウェルの0.5 M H2SO4を添加し反応を停止させ、マイクロプレートリーダーで450 nm(Abs450nm)および650 nm (リファレンス波長、Abs650nm)の吸光度を測定し、基準品の原液CHD7濃度を1000unitとして、500 U/mLから2倍希釈の希釈系列で8点以上、又は3倍希釈の希釈系列で6点以上を作成して測定した。
CHD7の濃度は、以下の工程により算出した。
1) 測定した吸光度から式1によりΔAbsを算出する。
1. ESCの分化能は培養条件を変えることにより変化する:
正常な核型を示すKhES-1細胞を、hrVitronectin-N(VTN-N)でコーティングしたディッシュ上でEssential 8培地(Es8)を用いて培養すると、KhES-1細胞は、自己増殖能および分化能の両方を保持した。KhES-1細胞は、ReproFF2(RFF2)で5回継代培養後に分化能を失ったが、Es8で培養後に再び分化能を回復した(図1)。また、SPM(Takenaka ら, PLoS ONE 2015; 10(6): e0129855)で培養したKhES-1細胞は分化能を保持したが、RFF2で5継代培養することによって分化能は失われた。さらに、正常な核型を示すPFX#9 iPSC(Nishishitaら, PLoS One 2012; 7(6): e38389)を、VTN-Nでコーティングしたディッシュ上でEs8を用いて培養した後にRFF2で培養したところ、同じ結果が得られた(図2)。これらの結果により、PSCの分化能が培養条件によって可逆的に変化し得ることが示された。そして、細胞のエピジェネティック状態における変化がこれらの応答に関連すると考えられた。
Es8を用いて培養したKhES-1細胞は、分化能を保持し、EBを形成する。まず、KhES-1細胞において、siCHD7をトランスフェクションした際に、CHD7のダウンレギュレーションが起こるかどうかを調べた。6ウェルディッシュの1ウェル当たり10pmol、30pmol又は50pmolのsiCHD7をトランスフェクションしCHD7の発現量を調べた。その結果、siCHD7の導入量の増加に従ってCHD7の発現量は減少し、導入量の依存性が見られた(図7B)。次に、siCHD7をトランスフェクションしたKhES-1細胞の三胚葉への分化を調べた。EBにおいて、5日目に中胚葉の分化の乱れが観察され、14日目に中胚葉および内胚葉の発達が中程度に抑制された(図8)。siCHD7の1回の導入によるCHD7 mRNAのダウンレギュレーションは、完全ではなかった。siCHD7の1回の導入は、外胚葉分化の開始を阻止できなかったが、14日間培養した後の中胚葉および内胚葉の発生を混乱させた。これらのデータにより、三胚葉発生を促進するために、CHD7の発現レベルがEBの分化を通じて一定のレベルで維持される必要があることが示唆された。
CHD7アイソフォーム2 mRNAの導入は、いかなる追加の分化刺激を伴わずに、RFF2で培養したKhES-1細胞における「自発的な」分化を誘導した(図12)。RFF2培地で培養したKhES-1細胞にCHD7アイソフォーム2をトランスフェクションし、1、2および3日後のKhES-1細胞における94の遺伝子の発現レベルをqRT-PCR scorecard panelにより決定した(表6)。表において、fold change(fc)が2.0以上の場合は、アップレギュレーションしていることを意味し、0.1以下の場合は、ダウンレギュレーションしていることを意味する。PSCの培養系は、分化細胞ではなく未分化細胞を維持するように設計されている。KhES-1細胞は、分化した場合、VTN-Nでコーティングしたディッシュ上で培養することができず、RFF2培養物中のKhES-1細胞数は、細胞が分化するにつれて減少した(図11C及び図12)。特に、CHD7アイソフォーム2の過剰発現は、連続した分化プロセスに従わずに、三胚葉分化を同時に誘導した。
CHD7の他の機能は、ESCの増殖を支持することである。6ウェルプレートの1ウェルあたり1×10 5個のKhES-1細胞を播種し、Es8で細胞を培養し、3日後に8×10 5個の細胞を採取した。RFES2培地中のKhES-1細胞の増殖率はEs8を用いた場合の1/3であったが、Es8を用いた場合、培養3日後にKhES-1細胞は8倍の拡大が観察された。CHD7発現レベルが濃度依存的にESCの増殖率を調節し得るか否かを調べるために、KhES-1細胞へのsiCHD7のトランスフェクションによりCHD7をダウンレギュレーションし、Es8で細胞を培養し、培養中の細胞数の測定を行った(図15 A、B)。その結果、KhES-1細胞の増殖率は、CHD7 mRNAの発現レベルによって調節された(図15 C、D)。さらに、クロモドメイン及び/又はSANT-SLIDEドメインを網羅するCHD7のドミナントネガティブタンパクを生成する mRNAのKhES-1細胞への導入は、細胞増殖率を劇的に低下させた(図13)。
様々な条件下で培養したPSCにおけるCHD7 mRNAの発現量を測定して、CHD7 mRNAレベルがESCの分化能と相関するか否かを調べた。まず、GeneChipデータベースを用いて、着床前の様々な胚形成期における胚のCHD7 mRNAの発現レベル、ならびにPSCおよびEBにおけるCHD7 mRNAの発現レベルを調べた(図16)。アイソフォーム1に対応するCHD7 mRNAは、2細胞期および4細胞期において比較的高レベルで発現し、その後、桑実胚期および胚盤胞期において低レベルで発現した(図16 「2 cell」、「4 cell」、「morula」及び「blastocyst」)。胚形成の間、受精卵は分化して増殖する。そして、胚は、内部細胞塊と呼ばれる、発達軸(developmental axis)のない同一の細胞塊を増殖させることからなる胚盤胞期に達する。GeneChip発現シグナルの測定において、PSCは、着床後のマウス エピブラストの遺伝子発現プロファイルと同様の遺伝子発現プロファイルを示し、培養条件に応じて様々なレベルのCHD7 mRNAを有していた。CHD7の発現が低いPSC(図16「KhES-1 RFF2/N」及び「PFX#9 RFF2/N」)は、未分化状態で増殖能を保持したが、分化能を失った。
CHD7のmRNAのコピー数だけではなく、CHD7タンパクの発現量とPSCの分化能との関係を検討するため、CHD7のタンパク質の発現量の測定を試みた。
CHD7タンパク質レベル及び遺伝子の発現レベルも考慮して、上記の結果を用いて閾値を求めた。
Claims (2)
- ヒト多能性幹細胞におけるCHD7の発現レベルを測定することを含む、該多能性幹細胞の三胚葉系列への分化能の予測方法であって、CHD7の発現レベルが、胚様体形成能を喪失した分化抵抗性を示すヒト多能性幹細胞におけるCHD7タンパク質レベルと比較して2倍以上のタンパク質レベルであるヒト多能性幹細胞を、分化刺激に応答して分化能を示すと予測することを特徴とする、方法。
- 前記CHD7の発現レベルがEssential 8培地又はStem-Partner(登録商標) Human iPS/ES cells mediumを用いて5継代以上培養したヒト多能性幹細胞における発現レベルである、請求項1に記載の方法。
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