KR101647030B1 - 미토푸신 억제제를 포함하는, 세포 리프로그래밍 촉진용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

미토푸신 억제제를 포함하는, 세포 리프로그래밍 촉진용 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 촉진용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 분화된 세포에서 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포로의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포, 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 방법 및 상기 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 전분화능 줄기세포를 제작하기 위한 리프로그래밍 유도 과정에서, 리프로그래밍 유도 효율을 증진시킬 뿐만 아니라, 리프로그래밍 유도에 소요되는 시간을 감소시킴으로써, 전분화능줄기세포의 산업화에 요구되는 고효율 전분화능 줄기세포 제작 기술 및 안정적 대량 배양 시스템을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 전분화능 줄기세포를 유지하고, 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍을 촉진할 수 있는 화합물을 스크리닝하는데 유용하게 활용될 수 있다.

Description

미토푸신 억제제를 포함하는, 세포 리프로그래밍 촉진용 조성물 및 이의 용도{Compositions comprising a mitofusin inhibitor for promoting cell reprogramming and the use thereof}
본 발명은 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 역분화/리프로그래밍 촉진용 조성물, 상기 조성물을 이용하여 분화된 세포에서 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포로의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포, 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 방법 및 상기 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포에 관한 것이다.
세포 운명의 전환(transition)은 배아발생, 노화, 조직 재생, 암의 시작 및 진행을 포함하는 다양한 발달학적, 생리학적 및 병리학적인 조건 하에 일어난다. 세포 운명 전환에 대한 세포 및 분자 메커니즘을 규명하여, 상기 메커니즘을 조절하면 잘못된 세포 운명 조절로 인한 비정상적인 병리학적 상태를 치료할 수 있다. 최근에 규명된 리프로그래밍 인자를 이용하여 체세포를 전분화능 줄기세포로 리프로그래밍하는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 기술의 발달로 인해 미래 바이오의료 및 재생의학 발전에 효과적으로 적용할 수 있는 다양한 세포를 생산할 수 있는 세포 운명 전환 기술에 대한 수요 범위가 급진적으로 확대되고 있다.
전반적으로 체세포 리프로그래밍 과정 동안 유전적, 후성적 및 대사적 수준에서 복잡한 분자 변화가 동시적 또는 순차적으로 발생하며, 상당부분 확률에 의존하는 초기 리프로그래밍 단계에서 전분화능 획득의 성공률을 높이기 위해서는 세포의 안정성(stability)과 가소성(plasticity)의 균형 유지가 중요하며, 세포주기 확인점, MET(mesenchymal epithelial transition) 및 대사 리프로그래밍과 같은 리프로그래밍 장벽을 효과적으로 극복하는 전략적, 기술적 방법을 적용하는 것이 매우 중요하다.
p53은 리프로그래밍 유도과정에서 자연적으로 발생하는 세포의 스트레스로부터 게놈을 보호하기 위하여 유도되는 세포 주기 억제, 노화, 사멸에 연관된 신호전달조절의 핵심인자로서 p53 신호전달 저해는 리프로그래밍 과정을 촉진한다. 또한, p53은 리프로그래밍 과정 초기에 Klf4-매개의 상피 유전자 발현을 억제함으로써 MET를 저해하고, 해당과정(glycolysis)으로의 대사 리프로그래밍을 억제함으로써 종양으로의 발달을 억제한다.
미토콘드리아 다이나믹스 균형은 세포 항상성을 유지하는데 필수적이고, 비정상적인 미토콘드리아 다이나믹스는 다양한 질병을 야기한다. iPSC 및 암세포와 같이 증식성이 강한 세포는 미토콘드리아 ATP 생산 의존도가 감소하고, 미토콘드리아의 산화 스트레스를 경감시킬 수 있으며, 고분자 생합성에 용이한 해당과정을 통해 에너지를 획득하는 것을 선호한다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 전분화능 세포로의 리프로그래밍 과정에서 리프로그래밍 효율을 증진시키는 기술을 개발하기 위하여 미토콘드리아의 대사 리프로그래밍 과정을 개선하는 방법론을 확보하기 위해 예의 노력한 결과, 리프로그래밍 효율이 높은 p53-결손 및 p21-결손 세포는 낮은 레벨로 미토푸신 1 및 2를 발현하고, 상기 미토푸신을 억제 또는 유전적으로 제거하면 분화된 세포에서 전분화능 세포로의 리프로그래밍 효율이 획기적으로 증가되며, 전분화능 줄기세포의 전분화능 상태 유지에도 양성효과가 있음을 확인하고, 미토푸신 프로모터 활성을 억제하는 화합물은 상기 리프로그래밍 효율을 증가시키고, 전분화능 유지에 효과적으로 작용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국공개특허공보 제10-2013-0133638호
Takahashi K, et al., Cell, 2006, 126(4), 663-676
본 발명의 목적은 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 상태의 전분화능 줄기세포 유지 및 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 분화된 세포에 리프로그래밍 유도인자를 전달하는 단계; 및 (b) 분화된 세포를 본 발명의 리프로그래밍 촉진용 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 분화된 세포에서 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포로의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 분화된 세포의 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 분화된 세포의 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서 본 발명은 미토푸신 억제제를 유효성분으로 포함하는, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 촉진용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 "미토푸신(mitofusin)"은 미토콘드리아 외부 막에 박혀있는 GTP-결합 단백질의 일종으로 미토콘드리아간의 결합을 유도하는 구조 단백질을 의미한다. 구체적으로 상기 미토푸신은 생쥐 또는 인간 유래일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 미토푸신은 구체적으로 미토푸신 1(mitofusin 1, Mfn1) 또는 미토푸신 2(mitofusin 2, Mfn2)일 수 있으며, 더욱 구체적으로 서열번호 1(생쥐 유래) 또는 서열번호 3(인간 유래)의 아미노산 서열을 가진 Mfn1 또는 서열번호 2(생쥐 유래) 또는 서열번호 4(인간 유래)의 아미노산 서열을 가진 Mfn2일 수 있으며, 더욱더 구체적으로 서열번호 5 또는 6의 프라이머로 증폭될 수 있는 염기서열로 코딩되는 Mfn1, 또는 서열번호 7 또는 8의 프라이머로 증폭될 수 있는 염기서열로 코딩되는 Mfn2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 분화된 세포에서 미토푸신을 억제 또는 유전적으로 제거하면 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가되며, 전분화능이 유지됨을 본 발명자들이 최초로 규명하였다.
이러한 Mfn1 및 2의 서열을 바탕으로 Mfn1 및 2의 유전자 발현 억제제 또는 단백질 활성 억제제를 설계할 수 있으며, 상기 서열은 이러한 설계에 있어 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98%의 상동성이 유지되는 서열 역시 사용할 수 있음은 자명하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Mfn1/2 감소가 체세포 리프로그래밍에 기여하는지 확인하기 위해 알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, AP) 염색을 통해 분석한 결과, shRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 경우 생쥐(도 6a) 및 인간 세포 시스템(도 6b)에서 대조군 shRNA를 사용한 경우에 비해 리프로그래밍된 세포 수가 현저하게 증가됨을 확인하였다. 또한, 생쥐에서 shRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 경우 대조군 shRNA를 사용한 경우에 비해 리프로그래밍에 소요되는 시간이 단축됨을 확인하였다(도 6g).
또한, 분화 조건인 unconditioned medium(UM)을 사용한 배양 조건에서 인간 배아줄기세포(human embryonic stem cells, hESC)는 분화가 일어났지만, siRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 hESCs는 미분화 상태로 유지되었다(도 6c). 또한 UM 배양 조건 하 hESCs에서 Oct3/4 및 Nanog와 같은 전분화능 관련 마커의 발현은 Mfn1 및 2를 억제시키는 동안 유지되었다(도 6d 및 7).
아울러, Mfn1 및 2의 유전적 제거를 통해 완벽히 억제한 경우에 정상 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)에 비하여 현저하게 높은 리프로그래밍 효율(도 6e)을 보이고, 끊어진 형태의 미토콘드리아 모양(도 6f)을 나타내었다. 특히, Mfn1 -/-(Mfn1-KO)는 WT에 비해 약 500배 이상, Mfn2 -/-(Mfn1-KO)은 약 200배 이상 AP+ 콜로니 수가 현저하게 증가함을 확인한 바(도 6e), Mfn1 및 2의 제거를 통해 체세포의 리프로그래밍 효율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 하지만, 이러한 효과는 미토콘드리아 분열 저해제인 Mdivi1 처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다(도 6e 및 6f).
이를 통해, 미토콘드리아의 구조 단백질인 Mfn을 억제 또는 유전적으로 제거하면, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가되며, 전분화능이 유지됨을 알 수 있었다.
본 발명에서 용어 "미토푸신 유전자의 발현 억제제"란 상기 미토푸신의 발현을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 보다 구체적으로는 미토푸신의 발현을 전사 수준 또는 단백질 수준에서 감소시키는 모든 물질을 포함할 수 있다. 상기 미토푸신 발현을 억제하는 물질은 미토푸신을 표적으로 하여 미토푸신의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등 그 형태에 제한없이 사용 가능하다. 구체적으로, 상기 미토푸신 유전자의 발현 억제제는 미토푸신 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 미토푸신 유전자의 발현을 억제하면 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가되며, 전분화능이 유지되므로, 상기 미토푸신 유전자의 발현 억제제는 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 증가시키는 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 Mfn1/2 감소가 체세포 리프로그래밍에 기여하는지 확인하기 위해, shRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 경우 대조군 shRNA를 사용한 경우에 비해 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가된 것을 확인하였다(도 6a 및 6b). 또한, siRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 hESCs는 UM에서 미분화 상태로 유지되었다(도 6c). 또한 UM 배양 조건 하 hESCs에서 Oct3/4 및 Nanog와 같은 전분화능 관련 마커의 발현이 Mfn1 및 2가 억제될 때 유지되었다(도 6d 및 7).
또한, 구체적으로 상기 미토푸신 유전자의 발현 억제제는 미토푸신의 프로모터 활성을 억제하는 것일 수 있으며, 그 예로 피세아타놀(piceatannol), 테트라메틸피라진(tetramethylpyrazine), 21-[4-(2,6-디-1-피롤리디닐-4-피리미디닐)-1-피페라지닐]프레그나-1,4,9[11]-트리엔-3,20-디온 말레이트(21-[4-(2,6-Di-1-pyrrolidinyl-4-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]pregna-1,4,9[11]-triene-3,20-dione maleate), 레티닐 팔미테이트(Retinyl palmitate) 및 D-α-토코페릴퀴논(D-α-Tocopherylquinone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 미토푸신 유전자의 발현을 저해하며 분화된 세포를 리프로그래밍시킬 수 있는 물질은 제한없이 포함될 수 있다. 미토푸신의 프로모터 활성을 억제하면 미토푸신 유전자의 발현이 억제되어 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가되며, 전분화능이 유지되므로, 상기 미토푸신의 프로모터 활성 억제제는 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율을 증가시키는 용도로 사용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 84개의 산화환원 라이브러리 화합물을 이용하여 생쥐 또는 인간 Mfn1의 프로모터 활성을 변화시킬 수 있는 화학 물질을 스크리닝한 결과, 생쥐 Mfn1 프로모터 활성을 감소시키는 상위 3개 화합물(피세아타놀(piceatannol), 테트라메틸피라진(tetramethylpyrazine) 및 21-[4-(2,6-디-1-피롤리디닐-4-피리미디닐)-1-피페라지닐]프레그나-1,4,9[11]-트리엔-3,20-디온 말레이트(21-[4-(2,6-Di-1-pyrrolidinyl-4-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]pregna-1,4,9[11]-triene-3,20-dione maleate), U74389G maleate)와 증가시키는 상위 2개 화합물(Tanshinone IIA, erbinafine·HCl)의 새로운 용도를 규명하였다(도 12d). 상기 생쥐 Mfn1 프로모터 활성을 억제하는 화합물은 생쥐뿐만 아니라 인간의 체세포 리프로그래밍 효율을 증가시키고(도 12f 및 13a), 생쥐 ESCs(도 12g)와 인간 ESCs(도 13b)의 미분화 상태를 유지시킴을 확인하였다.
또한, 인간 Mfn1 프로모터 활성을 가장 잘 억제하는 3가지 화합물(U74389G maleate, 레티닐 팔미테이트 및 D-α-토코페릴퀴논)의 새로운 용도를 규명하였다(도 12h). U74389G maleate는 생쥐와 인간 세포 모두에서 Mfn1 프로모터 활성을 억제시킴을 확인하였다.
이를 통해 Mfn1 또는 2의 억제제는 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍을 현저하게 촉진시키며, 전분화능을 유지시키므로 종래의 리프로그래밍 조건에 비해 현저히 개선되었음을 알 수 있었다(도 14).
또한, 본 발명의 리프로그래밍 촉진용 조성물은 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍을 촉진시킬 수 있다면 다양한 농도로 상기 미토푸신 유전자의 발현 억제제를 포함할 수 있으나, 구체적으로, 1nM 이상 100μM 이하, 더욱 구체적으로, 10nM 이상 10μM 이하로 포함할 수 있다.
본 발명 구체적인 일 실시예에서는 생쥐 및 인간의 Mfn1 프로모터 리포터 (Genecopoeia) 세포를 각각 Mfn1-/- MEFs와 293T 세포를 이용하여 제작하고, 84개의 화합물을 포함하는 Screen-Well™ REDOX 라이브러리를 10μM 농도로 48시간 동안 처리하여, 피세아타놀, 테트라메틸피라진 및 U74389G maleate는 생쥐 Mfn1 프로모터 활성을 감소시키고(도 12d), U74389G maleate, 레티닐 팔미테이트 및 D-α-토코페릴퀴논은 인간 Mfn1 프로모터 활성을 감소시킴을 확인하였다(도 12h).
이로부터 상기 농도범위에서 미토푸신의 프로모터 활성 억제제를 처리할 경우 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가하므로, 종래의 리프로그래밍 조건에 비해 현저히 개선되었음을 알 수 있었다.
본 발명에서 용어 "미토푸신 단백질의 활성 억제제"는 상기 미토푸신 단백질의 활성을 감소시키는 물질을 통칭하는 의미로 사용되며, 구체적으로 미토푸신 유전자로부터 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 항체는 다클론 항체, 단일클론 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 상기 항체의 단편들도 본 발명의 항체에 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체 및 인간 항체 등도 포함하며, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다. 상기 항체는 미토푸신 유전자로부터 발현되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "분화"는 세포가 분열하여 증식하며 전체 개체가 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 즉, 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어지는 역할을 수행하기 위해 적합한 형태 및 기능으로 변하는 과정을 말하며, 예를 들어, 배아줄기세포와 같은 전분화능 줄기세포가 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포로 변하는 과정뿐 아니라 조혈모세포가 적혈구, 백혈구, 혈소판 등으로 변하는 과정, 즉 전구세포가 특정 분화형질을 발현하게 되는 것도 모두 분화에 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어, "분화된 세포"란, 상기 분화과정이 진행되어 일정 형태 및 기능을 가지게 된 세포를 말한다. 본 발명의 분화된 세포는 특별한 제한은 없으나 구체적으로는 생식세포, 체세포(somatic cell) 또는 전구세포(progenitor cell)일 수 있다. 그 예로 인간에게서 유래한 세포일 수 있으나, 다양한 개체에서 유래된 세포 역시 본 발명의 범위 내에 속한다.
또한, 본 발명의 분화된 세포에는 생체내 또는 생체외의 분화된 세포를 모두 포함할 수 있으며, 인간을 제외한 동물의 분화된 세포일 수 있고, 생체에서 분리된 분화된 세포일 수 있다.
상기 "체세포"는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화형질을 발현하지 않으나, 그 분화운명(fate)를 가지고 있는 부모세포를 말한다. 예를 들면, 신경세포(뉴런)에 대해서는 신경아세포(뉴런간세포)가 전구세포에 해당하고, 근관세포에 대해서는 근아세포가 전구세포에 해당한다.
본 발명에서의 용어 "전분화능 또는 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)"란 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 전분화능 또는 다능성이며 자가재생산능을 갖는 줄기세포를 말한다. 그 예로, 배아줄기세포와 유도만능줄기세포를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 전분화능 줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 전분화능 줄기세포를 포함할 수 있으며, 구체적으로 인간 유래의 전분화능 줄기세포일 수 있다.
상기 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 리프로그래밍 과정을 통해 전분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미한다. 인위적인 리프로그래밍 과정은 레트로바이러스 및 렌티바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용, 단백질 및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 리프로그래밍 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 리프로그래밍 과정을 포함할 수 있다. 유도만능줄기세포는 배아줄기세포와 거의 같은 특성을 가진다. 구체적으로는 비슷한 세포 모양을 보여주며, 유전자 및 단백질 발현 패턴이 유사하고, 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo)에서 전분화능을 가지며, 테라토마(teratoma)를 형성하고, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 생쥐를 형성할 수 있으며, 유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다. 본 발명의 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함할 수 있으며, 구체적으로 인간 유래의 유도만능줄기세포일 수 있다.
본 발명에서의 용어 "배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수는 전분화능이 있는 자가재생산능을 갖는 세포를 의미하며, 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함할 수 있다. 본 발명의 배아줄기세포로는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아줄기세포를 포함할 수 있으며, 구체적으로 인간 유래의 배아줄기세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 "역분화(dedifferentiation)"는 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 상태로 복원될 수 있는 프로세스를 의미한다. 또한, 상기 역분화는 본 발명에서 세포 리프로그래밍(reprogramming)과 동일한 의미로 사용될 수 있다. 이러한 세포의 리프로그래밍 기작은 핵 내의 후생유전학(뉴클레오타이드 서열에서의 변화없이 기능에서의 유전적 변화를 일으키는 것과 관련된 DNA 상태)적 마크가 삭제된 후, 상이한 세트의 후생유전학적 마크를 수립하는 것을 의미하는데, 다세포 생물이 분화 및 성장하는 동안, 상이한 세포 및 조직은 상이한 유전자 발현 프로그램을 획득하게 된다.
본 발명에서 용어 "리프로그래밍 촉진" 이란 리프로그래밍이 일어나는 과정에서 리프로그래밍의 과정이 빠르게 일어나게 하거나 리프로그래밍되는 효율을 증가시키는 것을 말하며, 리프로그래밍의 효율을 속도 또는 비율 면에서 증진한다는 의미를 포함할 수 있다.
본 발명 구체적인 일 실시예에서는 shRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 경우 대조군 shRNA를 사용한 경우에 비해 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가된 것을 확인하였다(도 6a 및 6b). 또한, Mfn1 및 2의 유전적 제거를 통해 완벽히 억제한 경우에는 정상 생쥐 배아 섬유아세포에 비하여 현저하게 높은 리프로그래밍 효율(도 6e) 및 끊어진 형태의 미토콘드리아 모양(도 6f)을 나타내었다. 특히, Mfn1 -/-(Mfn1-KO)는 WT에 비해 약 500배 이상 Mfn2 -/-(Mfn1-KO)은 약 200배 이상 AP+ 콜로니 수가 현저하게 증가함을 확인한 바(도 6e), Mfn1 및 2의 제거를 통해 체세포의 리프로그래밍 효율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.
결과적으로, 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 포함하는 조성물을 이용하여 리프로그래밍이 효과적으로 빠르게 이루어지도록 할 수 있으며, 상기 조성물을 이용하여 제조된 전분화능(유도만능) 줄기세포가 정상적으로 전분화능을 획득하고 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 리프로그래밍 촉진용 조성물은 배양 배지 또는 배양 배지 첨가제 형태일 수 있다. 이에 따라 본 발명의 조성물에는 분화된 세포가 전분화능 줄기세포로 리프로그래밍하는데 방해가 되지 않는 한, 일반적으로 세포 배양 배지에 포함되는 물질이 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명에서 분화된 세포를 전분화능을 가지는 줄기세포로의 리프로그래밍을 촉진하는 조성물에는 하나 이상의 리프로그래밍 유도인자들이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "리프로그래밍 유도인자"란 최종적으로 분화된 세포가 새로운 유형의 분화되는 잠재력을 갖는 전분화능 줄기세포로 리프로그래밍 되도록 유도하는 물질이다. 상기 리프로그래밍 유도인자는 최종적으로 분화된 세포의 리프로그래밍을 유도하는 물질이면 제한 없이 포함할 수 있으며, 분화시키려는 세포의 종류에 따라 선택할 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 리프로그래밍 유도인자로서 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질 또는 이들 단백질을 코딩하는 핵산분자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "단백질을 코딩하는 핵산분자"는 세포 내에 전달되면 그 자체로 해당 단백질을 발현할 수 있도록 프로모터 등에 작동 가능하게 연결된 형태일 수 있으며, 또한, 세포 내 염색체에 삽입되어 해당 단백질을 발현할 수 있는 핵산 분자를 폭넓게 포함한다. 예를 들어, 리프로그래밍 유도인자로서 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질을 코딩하는 핵산분자가 발현벡터 안에 작동 가능하게 연결되어 세포 내로 전달될 수 있으며, 숙주 세포의 염색체 내로 삽입되는 형태로 세포 내로 전달될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 리프로그래밍 유도인자인 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc을 코딩하는 레트로바이러스 1 MOI(multiplicity of infection)를 체세포에 감염시켜 형질도입함으로써 생쥐 또는 인간 섬유아세포의 리프로그래밍을 유도하였다(실험예 3).
상기 조성물은 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로 리프로그래밍을 촉진시키기에 충분한 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 상태의 전분화능 줄기세포 유지 및 배양용 배지 조성물을 제공한다. 본 발명에서 상기 미토푸신 유전자의 발현 억제제 또는 미토푸신 단백질의 활성 억제제는 전분화능 줄기세포를 미분화 상태로 유지시키는 기능을 포함할 수 있으므로, 상기 조성물에 사용될 수 있다. 한편, 본 발명의 전분화능 줄기세포 유지 및 배양용 배지 조성물은 미분화 상태로 유지/배양하는데 방해가 되지 않는 한, 일반적으로 세포 배양 배지에 포함되는 물질이 추가로 포함될 수 있다.
상기 "미토푸신 유전자의 발현 억제제", "미토푸신 단백질의 활성 억제제", "전분화능 줄기세포"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 UM을 사용한 배양 조건에서 hESC는 분화가 일어났지만, siRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 hESCs는 미분화 상태로 유지됨을 확인하였다(도 6c). 또한, UM 배양 조건 하 hESCs에서 Oct3/4 및 Nanog와 같은 전분화능 관련 마커의 발현은 Mfn1 및 2가 억제될 때 유지됨을 확인하였다(도 6d 및 7). 이를 통해, 미토푸신을 억제 또는 유전적으로 제거하면 미분화 상태의 전분화능 줄기세포가 유지됨을 알 수 있었다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (a) 분화된 세포에 리프로그래밍 유도인자를 전달하는 단계; 및 (b) 분화된 세포를 상기 리프로그래밍 촉진용 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 분화된 세포에서 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포로의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 분화된 세포에서 미토푸신을 억제하여 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포를 제조하는 방법은 기존의 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포를 제조하는 방법에 비해 리프로그래밍된 세포수가 매우 증가하고, 리프로그래밍에 소요되는 시간이 매우 단축되므로, 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가한다.
상기 "분화된 세포", "리프로그래밍 유도인자" 및 "전분화능 줄기세포"는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계의 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 전달하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포에 핵산분자 또는 단백질을 제공하는 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로는 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포의 배양액에 투여하는 방법, 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법 또는 리프로그래밍 유도인자의 유전자를 삽입한 바이러스 벡터로 트랜스펙션시킨 패키징 세포로부터 수득한 바이러스로 분화된 세포를 감염시키는 것인 방법을 사용할 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스(Retroviruses), 예를 들어 HIV(Human immunodeficiency virus), MLV(Murine leukemia virus), ASLV(Avian sarcoma/leukosis), SNV(Spleen necrosis virus), RSV(Rous sarcoma virus), mMTV(Mouse mammary tumor virus) 등, 렌티바이러스(Lentivirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated virus), 헤르페스 심플렉스바이러스(Herpes simplex virus) 등에서 유래한 벡터를 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 구체적으로는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있고, 더욱 구체적으로는 레트로바이러스 벡터 pMXs를 사용할 수 있다.
상기 리프로그래밍 유도인자를 분화된 세포에 직접 주입하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 선택하여 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 직접근육주입법, 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존을 이용한 방법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다.
또한, 상기 (a) 및 (b)의 단계는 동시, 순차적 또는 역순으로 수행될 수 있으며, 상기 방법은 단계 (b)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍은, 분화된 세포 대비 리프로그래밍된 세포에서 해당과정의 부산물인 젖산의 생성이 증가하거나, Ras-Raf-HIF1α 신호가 활성화되거나, 산소 소비량이 감소하거나, 또는 리프로그래밍 유도 시간 단축 및 리프로그래밍된 세포수 증가로 인해 리프로그래밍 효율이 증진될 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 해당과정에 관여하는 주요 효소를 인코딩하는 유전자의 발현 및 해당과정의 각 단계에서의 대사물질의 상대적인 양은 대조군에 비하여 Mfn1 및 2 억제 세포에서 현저하게 증가함을 확인하였고(도 8a 및 8b), 세포 내 젖산 생성도 증가함을 확인하였다(도 8c).
또한, 초기 리프로그래밍 단계 동안 Mfn1/2 및 p53/p21 기전의 상호 억제는 Ras-Raf 신호를 활성화시키고, 이는 연속적으로 HIF1α의 안정화를 가져오므로(도 10f), 효율적인 리프로그래밍을 가능하게 하는 저산소 조건을 모방할 수 있음을 확인하였다. 또한, 저산소 조건 하에 iPSC 발생이 현저하게 증가함을 확인하였으며(도 12a), HIF1α와 LDHA 단백질의 발현 증가에 상관성을 확인하였다(도 12b). 동일한 조건 하에, Mfn1의 프로모터 활성은 현저하게 감소하였고(도 12c), Mfn1 및 2의 단백질 발현도 매우 감소하였다(도 12b).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 분화된 세포에서 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포로의 제조방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포를 제공한다. 구체적으로 상기 전분화능 줄기세포는 유도만능줄기세포일 수 있다.
상기 "전분화능 줄기세포" 및 "유도만능줄기세포"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 리프로그래밍 효율이 매우 높은 전분화능 줄기세포 제조방법을 통해 생쥐 및 인간 섬유아세포로부터 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포를 수득하였다(도 6a, 6b 및 6e).
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 분리된 분화된 세포의 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 분화된 세포의 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 분리된 분화된 세포의 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계는 상기 리프로그래밍 촉진용 조성물을 분화된 세포에 처리하여 수행될 수 있다.
상기 "분화된 세포", "미토푸신 유전자의 발현", "단백질의 활성을 억제", "전분화능 줄기세포" 및 "리프로그래밍"은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 리프로그래밍 방법에 의해 제조된 전분화능 줄기세포를 제공한다. 구체적으로 상기 전분화능 줄기세포는 유도만능줄기세포일 수 있다.
상기 "전분화능 줄기세포" 및 "유도만능줄기세포"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 조성물은 전분화능 줄기세포를 제작하기 위한 리프로그래밍 유도 과정에서, 리프로그래밍 유도 효율을 증진시킬 뿐만 아니라, 리프로그래밍 유도에 소요되는 시간을 감소시킴으로써, 전분화능 줄기세포의 산업화에 요구되는 고효율 전분화능 줄기세포 제작 기술 및 안정적 대량 배양 시스템을 개발하는데 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 전분화능 줄기세포를 유지하고, 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍을 촉진할 수 있는 화합물을 스크리닝하는데 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 미토콘드리아 기능이 p53-KO(p53-/-) 및 p21-KO(p21-/-) 체세포의 초기 단계 리프로그래밍 동안에 감소함을 나타낸 도이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05, **p < 0.01 (Student’s t-test).
도 1a는 OSKM 리프로그래밍 인자의 레트로바이러스 형질도입을 통해 정상(WT) MEFs, p53-/- MEFs 및 p21-/- MEFs를 리프로그래밍한 후, 11일째(D11)의 AP+ 콜로니 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 1b는 전사체 및 대사체 분석을 위한 샘플 준비 단계를 나타낸 도이다.
도 1c는 리프로그래밍 D7일 때의 세포 모양을 나타낸 사진이다(스케일 막대 = 50μm).
도 1d는 해당과정 주요 효소를 인코딩하는 유전자의 발현(왼쪽) 및 해당과정과 관련된 각 대사체의 상대적인 양(오른쪽)을 각각 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)및 모세관 전기영동 비행시간형 질량 분석기(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry, CE-TOFMS)를 통하여 분석한 결과를 나타낸 도이다. D7일 때 p53-/- 및 p21-/- 리프로그래밍 배양에서 정상 대조군에 대한 대사체의 fold 변화를 색-코드 인덱스 막대를 통해 나타내었다.
도 1e는 리프로그래밍 D7일 때의 OSKM-도입된 WT, p53-/- 및 p21-/- MEFs에서 미토콘드리아 기능에 대한 전사체 분석결과를 나타낸 도이다.
도 1f는 WT, p53-/- 및 p21-/- 리프로그래밍 배양 D7일 때, 미토콘드리아에 의해 인코딩된 산화적 인산화(oxidative phosphorylation, OXPHOS) 소단위체인 ND1 및 Atp6ap1 및 미토콘드리아 결합 유전자인 미토푸신1(Mitofusin1, Mfn1) 및 미토푸신2(Mitofusin2, Mfn2)에 대한 실시간 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 초기 리프로그래밍에서의 WT MEFs, p53-/- MEFs 및 p21-/- MEFs의 전사체 분석을 나타낸 도이다. 비는 색-코드 인덱스 막대로 나타내었다.
도 2a는 리프로그래밍 단계를 식별하기 위한 마커의 발현을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 2b는 WT MEFs, p53-/- MEFs 및 p21-/- MEFs의 리프로그래밍 7일째(D7)에 발현 수준이 증가 또는 감소된 유전자를 비교한 도이다.
도 2c는 WT MEFs, p53-/- MEFs 및 p21-/- MEFs의 리프로그래밍 7일째(D7)에 해당과정의 유전자 발현 양상을 비교한 도이다.
도 3은 p53-/- 및 p21-/- MEFs의 후기 리프로그래밍에서 해당과정 전환이 촉진됨으로, 상기 해당과정 전환이 체세포 리프로그래밍에 필수적임을 나타내는 도이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05, **p < 0.01 (Student’s t-test).
도 3a는 리프로그래밍의 단계별로 각 그룹의 세포 용해물에서 세포내 젖산 생성을 측정한 그래프이다.
도 3b는 리프로그래밍 과정에서 해당과정 억제제인 2-디옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose, 2-DG)의 효과를 나타낸 도이다(상: AP+ 콜로니의 대표 이미지, 하: D11일 때 계수한 AP+ 콜로니의 전체 수).
도 4는 OXPHOS 구성을 인코딩하는 유전자의 발현이 p53-/- 및 p21-/- MEFs의 초기 단계 리프로그래밍에서 감소됨을 나타내는 도이다.
도 4a는 OXPHOS 콤플렉스 구성의 유전자 발현 프로파일을 나타낸 도이다.
도 4b는 핵에 의해 인코딩되는 OXPHOS 서브유닛인 Sdhb, Uqcrc1, p53 및 p21의 실시간 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 4c는 D7일때의 WT, p53-/- 및 p21-/- 리프로그래밍 배지에서 측정된 ADP/ATP 에너지 전환율을 나타낸 도이다. 데이터는 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; ***p < 0.001 (Student’s t-test).
도 5는 p53-/- 및 p21-/- 세포, 및 전분화능 리프로그래밍 중간물이 미토콘드리아 결합 단백질을 낮은 수준으로 발현함을 나타낸 도이다.
도 5a는 리프로그래밍 D7일때의 OSKM이 도입된 WT, p53-/- 및 p21-/- MEFs를 Tom20(미토콘드리아, 초록색) 및 DAPI(핵, 파란색)로 염색한 사진(상) 및 이의 고배율 사진(하)이다.
도 5b는 Mitotracker(빨간색)로 염색한 WT, p53-/- 및 p21-/- MEFs의 미토콘드리아 모양 및 확대한 이미지(위의 오른쪽)를 나타낸 사진이다.
도 5c는 WT, p53-/- 및 p21-/- MEFs의 세포 수를 나타낸 그래프이다.
도 5d는 사이클린 B1 및 미토콘드리아 분열(Drp)-결합(Mfn) 구성의 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다. β-액틴을 대조군으로 사용하였다.
도 5e는 D11에 자기활성 세포 분리(magnetic-activated cell sorting, MACS)를 사용하여 리프로그래밍 중간물을 Thy1 및 SSEA1 발현을 기반으로 분리한 결과를 나타낸 도이다(스케일 막대 = 50μm). 위쪽 사진은 D14일 때, 각 하위집단의 대표 이미지이고, 중간 사진은 Mitotracker(빨간색)로 염색한 미토콘드리아 모양을 나타낸 사진이며(중간의 오른쪽: 확대한 이미지)이며, 아래쪽 그래프는 절단/중간상태/결합된 미토콘드리아를 가진 세포의 백분율을 나타낸 그래프이다.
도 5f는 미토콘드리아 분획의 미토콘드리아 분열(Drp)-결합(Mfn) 구성 성분에 대한 웨스턴 블랏 분석 및 MEFs 및 하위그룹의 세포 용해물 전체에서 전분화능 마커인 Nanog에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다. HSP60 및 β-액틴을 대조군으로 사용하였다.
도 5g는 p53-/- 및 p21-/- MEFs 세포를 도식적으로 나타낸 도이다.
도 6은 Mfn1 및 2의 제거가 전분화능 획득 및 유지를 촉진함을 나타낸 도이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01 (Student’s t-test).
도 6a는 MEFs에 대조군, Mfn1 및 Mfn2 렌티바이러스 shRNAs(각각 shCon, shMfn1, shMfn2)를 레트로바이러스 OSKM 리프로그래밍 인자와 함께 형질도입하여 리프로그래밍의 D11에 AP 염색을 통해 얻은, AP+ 콜로니의 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니의 수를 나타낸 도이다(아래쪽).
도 6b는 인간포피섬유아세포(Human foreskin fibroblasts, HFFs)에 대조군, Mfn1 및 Mfn2 렌티바이러스 shRNAs(각각 shCon, shMfn1, shMfn2)를 레트로바이러스 OSKM 리프로그래밍 인자와 함께 형질도입하여 리프로그래밍의 D28에 AP 염색을 통해 얻은, AP+ 콜로니의 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니의 수를 나타낸 도이다(아래쪽).
도 6c는 H9 hESCs를 대조군, Mfn1 및 Mfn2 siRNA(각각 siCon, siMfn1, siMfn2)로 감염시킨 후, UM으로 배양한 후 AP 염색을 통해 얻은, AP+ 콜로니의 이미지(위쪽) 및 feeder-free 조건 하 D5일 때, AP+ 콜로니의 상대적 비율(아래쪽)을 나타낸 도이다. 미분화 배지(conditioned medium, CM)로 배양한 hESCs를 미분화 대조군으로 사용하였다.
도 6d는 D5일 때 siRNA 감염된 hESCs의 Mfn1, Mfn2 및 전분화능 마커인 Oct3/4와 Nanog 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다. β-액틴을 대조군으로 사용하였다.
도 6e는 미토콘드리아 분열 억제제인 Mdivi1 50μM이 없을 때(위쪽) 및 있을 때(가운데) OSKM의 레트로바이러스 형질도입을 통해 WT, Mfn1-/-(Mfn1-KO) 및 Mfn2-/-(Mfn2-KO) MEFs를 리프로그래밍한 후 D11에 얻은, AP+ 콜로니의 이미지 및 AP+ 콜로니의 수(아래)를 나타낸 도이다.
도 6f는 D7에 Mito-EYFP(초록색)를 이용하여 관찰된 각 리프로그래밍 배양의 미토콘드리아 모양을 나타낸 사진 및 이를 확대한 사진(오른 위쪽 코너)이다(스케일 막대 = 50μm).
도 6g는 MEFs에 대조군, Mfn1 및 Mfn2 렌티바이러스 shRNAs(각각 shCon, shMfn1, shMfn2)를 레트로바이러스 OSKM 리프로그래밍 인자와 함께 형질도입하여 리프로그래밍할 때, 리프로그래밍에 소요되는 시간을 나타내는 그래프이다.
도 7은 hESCs에 siRNA를 형질 도입하여 Mfn1 및 2의 발현을 억제시킨 결과를 나타낸 도이다. Mfn1 및 2 siRNA로 감염시킨 hESCs를 UM 배지에서 배양한 후 D5일 때, Mfn1 및 Mfn2 유전자에 대해 실시간 PCR 분석을 수행하였다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (Student’s t-test).
도 8은 Mfn1 및 2의 억제가 리프로그래밍 초기 단계에 해당과정 전환을 촉진함을 나타낸 도이다.
도 8a는 리프로그래밍 D7일 때 OSKM 및 shRNAs를 형질도입한 MEFs에서 해당과정과 관련 있는 유전자 세트에 대한 전사체 분석 결과를 나타낸 도이다. 비는 색-코드 인덱스 막대로 나타내었다.
도 8b는 해당과정 주요 효소를 인코딩하는 유전자의 발현(왼쪽) 및 해당과정과 관련된 각 대사체의 상대적인 양(오른쪽)을 각각 실시간 PCR 및 CE-TOFMS를 통해 분석한 결과를 나타낸 도이다. D7일 때 대조군과 비교하여 Mfn1 및 2 shRNA-형질 도입한 리프로그래밍 배양에서 대사체의 폴드 변화를 색-코드 인덱스 막대로 나타내었다.
도 8c는 각 그룹의 세포 내 젖산 생성량을 나타낸 그래프이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01 (Student’s t-test)
도 9는 초기 리프로그래밍 동안 Mfn1 및 2 억제가 OXPHOS 컴플렉스 구성 및 세포주기 조절자의 유전자 발현 프로파일에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9a는 리프로그래밍 D7일 때 OSKM과 표시된 shRNAs로 형질도입시킨 MEFs에서 OXPHOS 컴플렉스 구성에 대한 전사체 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 리프로그래밍 D7일 때 OSKM과 표시된 shRNAs로 형질도입시킨 MEFs에서 Mfn1 및 2, p53(Trp53), p21(Cdkn1a) 및 p16(Cdkn2a)에 대한 전사체 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 9c는 리프로그래밍 D7일 때 OSKM과 표시된 shRNAs로 형질도입시킨 MEFs에서 p53 및 p21의 실시간 PCR 분석 결과를 나타낸 도이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05 (Student’s t-test)
도 10은 p53/p21 및 Mfn1/2의 상호 억제가 Ras-Raf-HIF1α 신호를 활성화시킴을 나타낸 도이다. β-액틴을 대조군으로 사용하였고, 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01 (Student’s t-test)
도 10a는 p53을 안정화하는 MDM2 억제제인, Nutlin3a 25μM가 없을 때와 있을 때 OSKM의 레트로바이러스 형질 도입을 통해 WT, Mfn1-/- 및 Mfn2-/- MEFs를 리프로그래밍한 후, D11일 때 p53 및 p21에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10b는 Mfn1 과발현이 있을 때와 없을 때의 OSKM의 레트로바이러스 형질도입을 통해 WT, p53-/- 및 p21-/- MEFs를 리프로그래밍한 후, D11일 때 Mfn1에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10c는 각 표시된 그룹에서 얻은 AP+ 콜로니 이미지(위쪽 및 가운데) 및 AP+ 콜로니의 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 10d는 각 표시된 그룹에서 얻은 AP+ 콜로니 이미지(위쪽 및 가운데) 및 AP+ 콜로니의 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 10e는 리프로그래밍 D7일 때 OSKM, Mfn1 및 2 shRNA를 형질도입시킨 MEF에서 Ras-Raf 신호에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 10f는 Mfn1/2 감소 세포에서 Ras-Raf-HIF1α 신호의 활성화를 보여주는 모델을 나타낸 도이다.
도 11은 Mfn1 및 2 억제에 의한 리프로그래밍 및 해당과정 촉진이 HIF1α에 의존적임을 나타내는 도이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (Student’s t-test).
도 11a는 OSKM 및 표시된 shRNA의 형질도입을 통해 MEF를 리프로그래밍한 후, D7일 때 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다. β-액틴을 대조군으로 사용하였다.
도 11b는 각 그룹의 세포 용해물에서 측정된 젖산 생성량을 나타낸 도이다.
도 11c는 각 표시된 그룹에서 얻은 AP+ 콜로니 이미지(위쪽 및 가운데) 및 AP+ 콜로니의 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 12는 저산소 상태가 Mfn1 및 2 발현을 감소시키며, Mfn1 발현을 억제하는 화합물이 리프로그래밍을 촉진하고 전분화능을 유지시킴을 확인한 도이다. β-액틴을 대조군으로 사용하였다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (Student’s t-test).
도 12a는 정상 산소(N) 및 저산소(H, 5% O2) 조건 하에 OSKM의 레트로바이러스 형질도입을 통해 MEFs를 리프로그래밍한 후, D11일 때의 AP+ 콜로니 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 12b는 정상 산소 및 저산소 조건 하에 리프로그래밍의 D7일 때 Mfn1, Mfn2, HIF1α 및 LDHA에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12c는 정상 산소 및 저산소 조건 하에 배양 48시간 후 Mfn1 프로모터 리포터 컨스트럭트를 안정하게 발현하는 Mfn1-/- MEFs에서 측정된 Mfn1 프로모터 활성을 나타낸 그래프이다.
도 12d는 Mfn1 프로모터 리포터를 포함하는 Mfn1-/- MEFs에 84종의 산화환원 라이브러리 화합물 10μM을 처리하고, 48시간 후 상대적인 루시퍼레이즈 활성을 측정한 그래프이다. Mfn1 프로모터 활성을 가장 잘 억제하는 3가지(-1, -2 및 -3) 및 가장 잘 증가시키는 2가지(+1 및 +2) 화합물을 나타내었다.
도 12e는 OSKM의 레트로바이러스 형질도입과 선택된 화합물 1uM 처리를 통해 MEFs를 리프로그래밍한 후, D9일 때 Mfn1 단백질 발현에 대한 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 12f는 선택된 화합물 각 1μM을 처리하여 리프로그래밍한 후, D11일 때의 AP+ 콜로니 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니의 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 12g는 J1 mESCs를 LIF가 없을 때(-; 비 자가재생산 조건, 위쪽)와 있을 때(+; 자가재생산 조건, 가운데) 선택된 화합물 각 1μM을 처리하여 배양한 후, D5일 때의 AP+ 콜로니 이미지 및 AP+ 콜로니의 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 12h는 인간 Mfn1 프로모터 리포터를 포함하는 293T 세포(인간 배아 신장 세포)에 84종의 산화환원 라이브러리 화합물 10μM을 처리하고, 48시간 후 상대적인 루시퍼레이즈 활성을 측정한 그래프이다.
도 13은 Mfn1 프로모터 활성-억제 화합물이 전분화능 획득 및 유지에 효과가 있음을 나타낸 도이다. 데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. *p < 0.05 (Student’s t-test)
도 13a는 레트로바이러스 OSKM의 형질도입을 통해 HFFs를 리프로그래밍 하면서 Mfn1 프로모터 활성 조절 화합물을 각 10uM 처리한 후, D28일 때의 AP+ 콜로니 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니 수(아래쪽)를 나타낸 도이다.
도 13b는 H9 hESCs를 UM(분화 조건)으로 배양하였고, UM 존재 하에 Mfn1 프로모터 활성 조절 화합물을 각 10uM 처리한 후, feeder-free 조건 하에 D5일 때의 AP+ 콜로니 이미지(위쪽) 및 AP+ 콜로니의 상대적인 폴드 차이(아래쪽)를 나타낸 도이다. CM-배양한 hESCs를 미분화 대조군으로 사용하였다.
도 14는 p53/p21 및 Mfn1/2 기전의 상호 작용을 통한 세포 안정성 및 가소성의 조절에 대한 모델을 나타내는 도이다. Mfn1/2의 감소는 체세포 리프로그래밍을 촉진시키며(위쪽), 이는 미토콘드리아 결합, 세포 주기 억제 또는 대사 리프로그래밍 실패와 같은 리프로그래밍 장벽을 극복할 수 있도록 함으로써 세포 가소성을 증진시킴에 의한다(아래쪽).
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실험예 1. 시약
Mdivi1, 2-디옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose, 2-DG) 및 유전자 억제를 위한 각각의 shRNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터는 Sigma에서 구입하였다. 미토푸신 1 또는 2(Mfn1/2) 억제를 위한 siRNA는 Dharmacon에서 구입하였다. Nutlin3a는 Cayman Chemical Co에서 구입하였다. A Screen-Well™ REDOX 라이브러리는 Enzo Life Sciences에서 구입하였다.
실험예 2. 쥐 및 세포 배양
모든 동물 실험 프로토콜은 KRIBB의 생명윤리위원회의 승인을 받았다. WT, p53-결손(p53-/-) 및 p21-결손(p21-/-) 생쥐(The Jackson Laboratory)에서 얻은 12.5일째의 배아로부터 생쥐 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)를 분리하였고 10% 소태아혈청(FBS, Invitrogen), 1% 비필수아미노산(NEAA, Invitrogen), 0.1mM β-메르캅토에탄올(Sigma) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)을 포함한 DMEM(Invitrogen)에서 유지하였다. 생쥐의 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESC) 라인 J1(ATCC) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC) 라인을 15% FBS, 1% NEAA, 1% L-글루타민(Invitrogen), 20mM HEPES(Invitrogen), 0.1mM β-메르캅토에탄올, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 1,000U/ml LIF(Millipore)를 포함한 DMEM(Invitrogen)에서 γ-조사된 MEFs 또는 Matrigel™(BD Biosciences)-코팅된 플레이트에 유지시켰다. 배양 배지는 이틀에 한번 갈아주었다. 인간 H9 ESC 라인(WiCell Research Institute)을 γ-조사된 MEFs 위에 hESC 배양 배지(분화 조건, unconditioned medium, UM)로 배양하거나, Matrigel™-코팅된 플레이트에서 MEF-CM(미분화 조건, conditioned medium, CM) 배양 배지로 유지시켰다. 배양 배지는 매일 갈아주었고, 세포는 5-7일 마다 collagenase IV(1mg/ml; Invitrogen) 또는 디스파제(1mg/ml; Invitrogen)를 처리하여 계대하였다. 인간포피섬유아세포(hFFs; ATCC)를 10% FBS, 1% NEAA, 1mM L-글루타민 및 0.1mM β-메르캅토에탄올을 포함한 DMEM에서 배양하였다.
실험예 3. 바이러스 생산 및 iPSC 제작
리포펙타민 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여, GP2-293 패키징 세포를 Oct4(POU5F1), Sox2, Klf4 및 c-Myc(OSKM, Addgene)의 인간 cDNAs를 포함하는 pMX 벡터 및 VSV-G envelope 벡터로 함께 감염시켰다. 바이러스-포함 상층액을 감염 후 48 및 72시간 후에 수득하였고, 초원심분리기(Beckman Coulter)를 통해 25,000rpm 에서 90분 동안 농축시켰다. iPSCs 제작을 위하여, 형질도입 전날, 6-웰 플레이트에 웰 당 1 × 105 세포로 MEFs를 시딩하였고, 그 후 폴리브렌(8μg/ml) 존재하에 1 MOI로 농축된 바이러스를 MEFs에 도입하였다. 도입 4일 후에, MEFs를 트립신 처리하고 Matrigel™-코팅된 12-웰 플레이트에 웰 당 3 × 104 밀도로 다시 시딩하였다. 다음날, 생쥐 ESC 배지로 배지를 갈아주었고, 그 후에 배지를 이틀에 한 번씩 갈아주었다.
실험예 4. 알칼리포스파타제 염색
알칼리포스파타제(alkaline phosphatase, AP) 키트를 사용하여 프로토콜(Sigma)에 따라서 수행하였다. 세포를 시트로산염-아세톤-포름알데히드 용액으로 30초 동안 고정하였고, 암 조건에서 15분 동안 AP 염색 용액(Naphthol/Fast Red Violet)으로 염색하였다. AP+ 세포의 이미지를 HP Scanjet G4010(Hewlett-Packard)으로 얻었다.
실험예 5. RNA 추출, 실시간 PCR 및 마이크로어레이 분석
전체 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 분리하였고, SuperScript First-Strand Synthesis System Kit(Invitrogen)로 프로토콜에 따라서 역전사시켰다. 7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)을 사용하여 Fast SYBR® Green Master Mix(Life Technologies)로 정량 실시간 PCR을 수행하였다. 본 발명에서 사용한 프라이머 시퀀스는 하기 표 1에 나타내었다. 전사체 분석은 Agilent Mouse Genome 44k Arrays를 이용하여 수행하였다.
유전자 포워드 프라이머 리버스 프라이머
Mfn1 TGAAAGCTGGCTGTCTTGTG
(서열번호 5)		 AGAGCCGCTCATTCACCTTA
(서열번호 6)
Mfn2 CCTCACAGAGGGCTCAGAAG
(서열번호 7) 		GTCCAGCTCCGTGGTAACAT
(서열번호 8)
p53 AGAGACCGCCGTACAGAAGA
(서열번호 9)		 CTGTAGCATGGGCATCCTTT
(서열번호 10)
p21 CGGTGGAACTTTGACTTCGT
(서열번호 11)		 CAGGGCAGAGGAAGTACTGG
(서열번호 12)
해당과정
Glut1 GATCCTGGGCCGCTTCAT
(서열번호 13) 		ACATGGGCACGAAGCCTG
(서열번호 14)
Hif1 α TCAAGTCAGCAACGTGGAAG
(서열번호 15) 		TATCGAGGCTGTGTCGACTG
(서열번호 16)
Hk2 GGGACGACGGTACACTCAAT
(서열번호 17) 		GCCAGTGGTAAGGAGCTCTG
(서열번호 18)
Pfk ATGGCAAAGCTATCGGTGTC
(서열번호 19) 		ACACAGTCCCATTTGGCTTC
(서열번호 20)
Pam1 GCCTGATCACCCCTTCTACA
(서열번호 21) 		TCAAGACCCTTTTCCCCTCT
(서열번호 22)
Eno1 AGTACGGGAAGGACGCCACCA
(서열번호 23) 		GCGGCCACATCCATGCCGAT
(서열번호 24)
Pkm CTGCAGGTGAAGGAGAAAGG
(서열번호 25) 		AGATGCAAACACCATGTCCA
(서열번호 26)
Ldha TGGCAGCCTCTTCCTTAAAA
(서열번호 27) 		CAGCTTGCAGTGTGGACTGT
(서열번호 28)
β- actin AGCCATGTACGTAGCCATCC
(서열번호 29) 		CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA
(서열번호 30)
산화적 인산화
ND132 CCCATTCGCGTTATCTT
(서열번호 31) 		AAGTTGATCGTAACGGAAGC
(서열번호 32)
Atp6ap1 GCCATGGAACGACTTGAAAT
(서열번호 33) 		CGGAGAGAAGAAACCAGCAC
(서열번호 34)
Sdhb ACTGGTGGAACGGAGACAAG
(서열번호 35) 		TTAAGCCAATGCTCGCTTCT
(서열번호 36)
Uqcrc1 CCTACAGCACTCGAGAGCAC
(서열번호 37) 		AGGTGTGCCCTGGAATGCTG
(서열번호 38)
실험예 6. 대사체 분석
세포를 5% 만니톨 용액(Wako)으로 세척하였고, 내부 표준 물질을 포함하는 메탄올(Wako)을 이용하여 스크랩하였다. 3200rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수층을 분리하였다. 대사물질 추출물을 2.5시간 동안 9,100 x g로 5kDa-cutoff ultrafilter tips(Millipore)을 이용하여 분리한 후, 원심증발농축기(SCANVAC)를 사용하여 증발시켰고, Human Metabolome Technologies사의 프로토콜에 따라 CE-TOFMS를 이용하여 대사체 분석을 수행하였다.
실험예 7. 젖산 및 ATP 분석
제조업자의 프로토콜에 따라 Lactate Assay Kit(BioVision)를 이용하여 10μg의 단백질로부터 세포 내 젖산 함량을 정량하였다. ADP/ATP Ratio Assay Kit(Abcam)를 이용하여 0.1μg의 단백질로부터 ATP를 측정하였다. 발광 강도를 SpectraMax microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 측정하였다.
실험예 8. 미토콘드리아 염색
세포를 상온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정한 후 -20℃에서 15분 동안 메탄올로 고정하였고, 30분 동안 PBS에서 0.3% 트립톤 X-100으로 투과성을 높이고, 상온에서 2시간 동안 4% BSA로 블록킹하였다. 샘플을 블록킹 버퍼에 희석시킨 항-Tom20 항체로 하룻밤 동안 4℃에서 염색하였다. 세척 후, 세포를 Alexa 488이 결합된 2차 항체(Invitrogen)로 상온에서 45분 동안 염색하였다. 핵을 10μg/ml DAPI로 대비염색하였다. 생세포 이미징을 위해, 세포를 200nM MitoTracker® Red CMXRos(Invitrogen)로 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 형광 이미지를 IX51 현미경(Olympus) 또는 Axiovert 200M 현미경(Carl Zeiss)으로 분석하였다. 상기 분석에서 사용된 항체를 표 2에 나타내었다.
항체 카탈로그 번호 회사 희석
anti-Tom20 sc-17764 SantaCruz 1:70
anti-HSP60 4870 Cell Signaling 1:500
anti-Cyclin B1 sc-245 Santacruz 1:1000
anti-p-Drp1 3455 Cell signaling 1:1000
anti-Drp1 8570 Cell signaling 1:1000
anti-Mfn1 ABC41 Millpore 1:2000
anti-Mfn2 ab50843 abcam 1:1000
anti- β-acin A1978 Sigma 1:500000
anti- mNanog A300-397A Bethyl Lab 1:5000
anti- Nanog AF1997 R&D 1:200
anti- Oct3/4 sc-8628 Santacruz 1:500
anti-Thy1.1 551401 BD 1:50
anti-p53 2524 Cell signaling 1:1000
anti-p21 sc-397 SantaCruz 1:4000
anti-Ras 3965 Cell signaling 1:1000
anti-p-Raf 9427 Cell signaling 1:1000
anti-Raf 9422 Cell signaling 1:1000
anti-p-ERK 9101 Cell signaling 1:1000
anti-ERK 9102 Cell signaling 1:2000
anti-p-PI3K 4228 Cell signaling 1:1000
anti-p-Akt 9271 Cell signaling 1:1000
anti-p-mTOR 2971 Cell signaling 1:1000
실험예 9. 세포 분리 및 미토콘드리아 모양 분석
리프로그래밍 배양 11일째에 단일 세포 현탁액을 항-Thy1-PE 항체(BD Biosciences)로 상온에서 20분 동안 표지 한 후, 항-PE 마이크로비드(Miltenyi Biotec)와 함께 4℃에서 15분 동안 배양하였고, MACS 분리 시스템(Miltenyi Biotec)을 이용하여 분리하였다. Thy1-음성 집단을 항-SSEA1 마이크로비드(Miltenyi Biotec)로 상온에서 20분 동안 표지하였고, MACS를 이용하여 분리하였다. 분리된 집단의 순도를 높이기 위하여, 두 개의 분리 컬럼을 연속적으로 사용하였다. 분리된 세포들을 Matrigel™로 코팅된 12-웰 플레이트에 웰 당 3 × 104 세포 밀도로 다시 분주하거나 미토콘드리아 분리에 사용하였다. 재시딩 3일 후에, 미토콘드리아를 형광 현미경 하에서 MitoTracker 염색을 통해 시각화하였고, 절단/중간/결합과 같이 관측된 미토콘드리아 모양에 따라서 세포 수를 계수하였다. 분리된 하위 집단 당 30개 이상의 세포를 점수화하였다.
실험예 10. 미토콘드리아 분리 및 웨스턴 블랏 분석
미토콘드리아 분리 키트(Thermo)를 이용하여 MACS로 분리된 각 하위집단으로부터 미토콘드리아를 분리하였다. 웨스턴 블랏 분석을 위해, 세포 용해물 전체를 RIPA 버퍼를 이용하여 수득하였고, 단백질을 SDS-PAGE를 통해 분리하고, PVDF 멤브레인(Millipore)으로 전기이동시켰다. 사용한 항체를 표 2에 나타내었다.
실험예 11. 프로모터 분석 및 화학물질 스크리닝
생쥐 및 인간의 Mfn1 프로모터 리포터(Genecopoeia) 세포를 각각 Mfn1-/- MEFs와 293T 세포(인간 배아 신장 세포)를 이용하여 제작하고, 84개의 화합물을 포함하는 Screen-Well™ REDOX 라이브러리를 10nM~10μM 농도에서 48시간 동안 처리하였다.
SpectraMax 마이크로플레이트 리더를 이용하여 Secrete-Pair™ Dual Luminescence 및 Gaussia Luciferase Assay Kits(Genecopoeia)를 통해 배양 상층액에서 Mfn1 프로모터 활성을 측정하였다.
실험예 12. 통계
데이터를 평균±표준오차(n=3)로 나타내었다. 두 그룹 간 비교를 측정하기 위하여 Student's t-test를 적용하였다. p < 0.05의 값을 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 1. p53 -/- 및 p21 -/- 체세포의 초기 리프로그래밍 동안 미토콘드리아 기능 분석
알칼리포스파타제 염색을 통해 iPSC 생성 리프로그래밍 효율을 p53-/- 및 p21-/- 생쥐의 배아섬유아세포에서 측정한 결과, 리프로그래밍 효율이 증가하였다(도 1a). 리프로그래밍의 초기 단계에서 7일까지(D7; 도 1b), 정상 대조군과 비교할 때 p53-/- 및 p21-/- 세포에서 모양 변화와 함께 세포 수의 상당한 증가를 확인하였다(도 1c). 리프로그래밍의 초기 단계 근본적인 메커니즘을 확인하기 위하여, 리프로그래밍 D7에서의 WT, p53-/-, p21-/- MEFs를 이용하여 마이크로어레이-기반 전사체 및 질량 분석법-기반 대사체 분석을 수행하였다. 전사체 분석을 통해 리프로그래밍 단계의 구별을 가능하게 하는 마커의 발현 수준을 비교한 결과(도 2a), 7일 동안 리프로그래밍된 p53-/- 및 p21-/- 세포는 리프로그래밍 초기 및 성숙 중간 단계에 있음을 알 수 있었다.
또한, 세포 성장, 부착, RNA 스플라이싱 및 세포주기에 관련된 유전자 세트의 발현은 눈에 띄게 증가하였고, 대조적으로, 분화 관련 유전자는 정상 세포에 비해 p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍에서 감소되었다(도 2b). 그러나, central carbon pathway에서, p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 과정에서 해당과정은 현저한 차이를 보이지 않았다(도 1d 및 2c). 해당과정에 관여하는 주요 효소를 인코딩하는 유전자의 발현은 변화되지 않았고, 해당과정의 각 단계에서의 대사 물질의 상대적인 양은 정상 세포에 비해 p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 중간물에서 감소하였다(도 1d). 그러나 해당과정의 최종 산물인 젖산의 세포 내 생성은 리프로그래밍 후기에는 증가하였고, p53-/- 및 p21-/-에 의해 촉진되었으며(도 3a), 해당과정 억제제인 2-DG에 의해 세포 리프로그래밍이 상당히 감소하였다(도 3b).
대조적으로, 미토콘드리아 기능에 관련된 유전자의 발현은 정상 대조군에 비해 p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 중간물에서 매우 억제되었다. 그러나, 트리카르복시산(TCA) 회로와 관련된 유전자의 발현 수준은 변화하지 않았다(도 1e). 특히, 미토콘드리아에 의해 인코딩되는 ND1(complexⅠ) 및 Atp6ap1(complex Ⅴ의 ATP6 family)를 포함하는 산화적 인산화(oxidative phosphorylation, OXPHOS) 콤플렉스의 발현은 매우 감소된 반면(도 1f), 핵에 의해 인코딩되는 유전자(complex II의 Sdhb, Uqcrc1 및 complex V의 ATP5 family)는 감소되지 않았다(도 4a 및 4b). 특히, Mfn1/2 and Chchd3과 같은 미토콘드리아 결합 유전자는 p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 중간물에서 현저하게 감소된 반면, Dnm1, Dnm1l(Drp1), Fis1 및 Mff와 같은 분열 유전자는 증가하거나 변화가 없었다(도 1e 및 1f).
또한, ADP/ATP 비(에너지 전환 지표)가 정상 세포에 비해 p53-/- 세포의 리프로그래밍 중간물에서 감소하였다(도 4c). 이러한 결과들은 정상 세포에 비해 p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 동안 대사과정이 미토콘드리아 의존에서 비의존적으로 빠르게 전환됨을 의미한다.
실시예 2. p53-/- 및 p21-/- 세포 및 전분화능 리프로그래밍 중간단계에서의 미토콘드리아 결합 단백질의 발현 분석
리프로그래밍 후 D7일에, p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 중간물은 전분화능 줄기세포의 특징인, 끊어진 형태의 미토콘드리아 형태를 나타낸 반면 정상 세포의 리프로그래밍 중간물은 그렇지 않았다(도 5a). 리프로그래밍 이전에 p53-/- 및 p21-/- MEFs 자체가 정상 MEFs 에 비해 끊어진 형태의 미토콘드리아 형태를 가지며(도 5b) 세포 성장은 증가함을 확인하였다(도 5c). 정상 MEFs, p53-/- 및 p21-/- MEFs와 만능줄기세포 [PSCs(ESCs 및 iPSCs)] 사이에서 미토콘드리아 구조 관련 단백질 발현이 큰 차이를 보였다. 사이클린 B1-의존성 Drp1 인산화 및 Drp1 단백질 발현은 WT MEFs에서보다 p53-/- 및 p21-/- MEFs 및 PSCs에서 더 높았지만, 반대로, Mfn 1 및 2 발현은 WT MEFs에서보다 p53-/-, p21-/- MEFs 및 PSCs에서 현저하게 낮았다(도 5d). 전분화능 유도와 미토콘드리아 다이나믹스 사이의 관련성을 규명하기 위해, 리프로그래밍 후 D11일에 MACS를 통하여 체세포 마커인 Thy1 및 초기 단계 전분화능 마커인 SSEA1의 발현을 기반으로 리프로그래밍 중간물을 분리하였다(도 5e). Thy1+/SSEA1-(체세포), Thy1-/SSEA1-(초기 중간물) 및 Thy1-/SSEA1+(후기 중간물) 하위그룹으로 나누고 미토콘드리아 모양을 결합(체세포)/중간/끊어진 형태(전분화능 세포)로 나누어 정량하였다. Thy1-/SSEA1+ 하위그룹에서 끊어진 형태의 미토콘드리아가 현저하게 증가하였고, 결합된 형태는 감소하였다(도 5e). Drp1 발현 및 인산화 수준은 Thy1-/SSEA1+ 하위집단의 미토콘드리아 분획에서 현저히 증가한 반면, Mfn 1 및 2 발현은 감소하였다(도 5f). 상기의 결과를 통해, p53-/- 및 p21-/- 세포는 전분화능 리프로그래밍 중간물과 유사하게 Mfn의 발현 수준이 낮으며, 리프로그래밍에 유리한 상태에 있음을 알 수 있었다(도 5g).
실시예 3. Mfn1 및 2 제거를 통한 전분화능 획득 및 유지
Mfn1/2 감소가 체세포 리프로그래밍에 기여하는지 확인하였다(도 6). AP 염색을 통해 분석한 결과, shRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 경우 생쥐(도 6a) 및 인간 세포 시스템(도 6b)에서 리프로그래밍 효율을 현저하게 증가시킨 반면, 대조군 shRNA를 사용한 경우 그렇지 않았다. 또한, UM을 사용한 배양 조건에서 hESC는 분화가 일어났지만, siRNA를 사용하여 Mfn1 및 2를 억제시킨 hESCs는 미분화 상태로 유지되었다(도 6c). UM 배양 조건 하 hESCs에서 Oct3/4 및 Nanog와 같은 전분화능 관련 마커의 발현은 Mfn1 및 2가 억제될 때 유지되었다(도 6d 및 7).
또한, Mfn1 및 2의 유전적 제거를 통해 완벽히 억제한 경우에는 정상 MEFs에 비하여 현저하게 높은 리프로그래밍 효율(도 6e) 및 끊어진 형태의 미토콘드리아 모양(도 6f)을 나타내었다. 특히, Mfn1-/-은 WT에 비해 약 500배 이상 Mfn2-/-는 약 200배 이상 AP+ 콜로니 수가 현저하게 증가함을 확인한 바(도 6e), Mfn1 및 2의 제거를 통해 체세포의 리프로그래밍 효율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다. 다만, 이러한 효과는 미토콘드리아 분열 저해제인 Mdivi1 처리에 의해 억제되었다(도 6e 및 6f).
이를 통해, 미토콘드리아의 구조 단백질인 Mfn을 억제 또는 유전적으로 제거하면 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 효율이 현저하게 증가되며, 전분화능이 유지됨을 알 수 있었다.
실시예 4. 초기 리프로그래밍 단계에서 Mfn1 및 2 억제를 통한 해당과정 전환 촉진
Mfn1/2 억제에 의해 유도되는 전분화능으로의 세포 운명 변화를 촉진하는 메커니즘을 밝히기 위하여, Mfn1 및 2 shRNA-도입 세포의 D7 리프로그래밍 배양에서 전사체 및 대사체 분석을 수행하였다(도 8). 그 결과, Mfn1 및 2의 억제에 따른 OXPHOS 콤플렉스의 유전자 발현 프로파일에서 미토콘드리아 에너지 대사를 특정하는 유전자의 전반적인 감소가 나타났다(도 9a). 그러나, 해당과정에 관여하는 주요 효소를 인코딩하는 유전자의 발현 및 해당과정의 각 단계에서의 대사물질의 상대적인 양은 대조군에 비하여 Mfn1 및 2 억제 세포에서 현저하게 증가하였고(도 8a 및 8b), 세포 내 젖산 생성도 증가하였다(도 8c). 이는 Mfn1/2 제거를 통해 미토콘드리아의 기능을 억제하면 전분화능 줄기세포와 같이 매우 빠르게 성장하는 세포의 에너지 수요를 충족하기 위하여 해당과정으로의 에너지 전환이 촉진됨을 나타낸다.
실시예 5. p53 / p21 및 Mfn1 /2의 상호 억제를 통한 Ras - Raf - HIF1 α 신호 활성화
유전자 발현 프로파일을 통해 p53(Trp53), p21(Cdkn1a) 및 p16(Cdkn2a)의 발현이 정상 세포에 비해 Mfn1 및 2 억제 세포에서 현저히 감소됨을 확인하였다(도 9b 및 9c). 또한, p53 및 p21 단백질 발현은 정상 세포에 비해 Mfn1-/- 및 Mfn2-/- 세포에서 감소하였고(도 10a), Mfn1 발현은 정상 세포에 비해 p53-/- 및 p21-/- 세포의 리프로그래밍 동안에 억제되었다(도 10b).
또한, Mfn1/2(도 6a, 6b 및 6e) 또는 p53/p21(도 1a 내지 1c)를 억제하면 체세포의 iPSCs로의 효율적인 리프로그래밍이 촉진되었고, 반대로 p53를 약학적으로 재활성시키거나 또는 Mfn1을 과발현시키면 Mfn1 및 2(도 10c), 또는 p53 및 p21 제거(도 10d)로 인해 촉진된 유도만능줄기세포 리프로그래밍이 효율적으로 억제되었다.
이를 통해 리프로그래밍 과정 동안 Mfn1/2 및 p53/p21 신호 사이에 상호작용이 존재함을 알 수 있었다. Mfn2가 직접적인 p53-유도 타깃 유전자이고, Mfn2와 높은 상동성을 갖는 Mfn1 및 Mfn2가 직접적으로 Ras 및 Raf에 결합하여, Ras-Raf-ERK 신호 체계를 통해 세포 성장을 억제함은 이미 알려져 있다. 또한, 본 발명의 조건 하에 리프로그래밍 D7일 때 Mfn1 및 2 억제 세포의 리프로그래밍 중간물에서 인산화된 Raf, ERK, PI3K, Akt 및 mTOR 단백질의 수준이 현저하게 증가함을 확인하였다(도 10e). 또한, mTOR의 하위 이펙터(effector)이자, 해당과정 전환의 중요한 대사 타깃인 HIF1α의 발현을 초기 리프로그래밍 과정 동안 확인하였고, HIF1α하위 타깃인 LDHA의 단백질 수준이 리프로그래밍 D7일 때 Mfn1 및 2 억제 세포의 리프로그래밍 중간물에서 현저히 증가함을 확인하였다(도 10e). 또한, 리프로그래밍 D7일 때 Mfn1 및 2 억제 세포의 리프로그래밍 중간물에서 HIF1α 및 이의 타깃인 Glut1의 유전자 발현이 증가함을 확인하였다(도 8b). 대조적으로, shRNA를 이용하여 HIF1α를 억제하면 Mfn1 및 2 억제 세포에서 LDHA의 증가된 발현(도 11a), 젖산 생성(도 11b) 및 리프로그래밍 효율(도 11c)이 강하게 억제됨을 확인하였다. 상기 결과를 종합하면, 초기 리프로그래밍 단계에서 Mfn1/2 및 p53/p21의 상호 억제는 Ras-Raf 신호를 활성화시키고, 이는 연속적으로 HIF1α의 안정화를 가져옴으로써(도 10f), 효율적인 리프로그래밍을 가능하게 하는 저산소 조건을 모방할 수 있음을 시사하였다.
실시예 6. 저산소증의 Mfn1 및 2 발현 감소 효과
본 발명에서 저산소 조건 하에 iPSC 발생이 현저하게 증가함을 확인하였으며(도 12a), HIF1α와 LDHA 단백질의 발현 증가에 상관성을 확인하였다(도 12b). 동일한 조건 하에, Mfn1의 프로모터 활성은 현저하게 감소하였고(도 12c), Mfn1 및 2의 단백질 발현도 매우 감소하였다(도 12b). 리프로그래밍 과정에서 Mfn1/2는 HIF1α-의존적인 저산소 상태 유도와 관련 있으며, p53과 해당과정으로의 대사변화를 조절하는 핵심 인자들간의 cross-talk을 통해 조절될 것으로 예상된다. 그러므로, Mfn1/2 감소시키는 것은 세포를 전분화능으로 전환하기에 효율적이고 쉬운 방법이다.
실시예 7. Mfn1 발현 억제 화합물
84개의 산화환원 라이브러리 화합물을 이용하여 생쥐 또는 인간 Mfn1의 프로모터 활성을 변화시킬 수 있는 화학 물질을 스크리닝하였다.
먼저, 생쥐 Mfn1 프로모터 활성을 감소시키는 상위 3개 화합물(피세아타놀(piceatannol), 테트라메틸피라진(tetramethylpyrazine) 및 21-[4-(2,6-디-1-피롤리디닐-4-피리미디닐)-1-피페라지닐]프레그나-1,4,9[11]-트리엔-3,20-디온 말레이트(21-[4-(2,6-Di-1-pyrrolidinyl-4-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]pregna-1,4,9 [11]-triene-3,20-dione maleate), U74389G maleate)와 증가시키는 상위 2개 화합물(Tanshinone IIA, erbinafine·HCl)의 새로운 용도를 규명하였다(도 12d). 리프로그래밍 동안에 선택된 화합물을 처리하였을 때, Mfn1 단백질 발현이 감소하거나 증가하였다(도 12e). Mfn1 프로모터 활성에 영향을 나타내지 않는 화합물은 Mfn1 단백질 발현을 변화시키지 않았다.
또한, 상기 Mfn1 프로모터 활성을 억제하는 화합물은 생쥐와 인간의 체세포 리프로그래밍 효율을 증가시켰고, 반면에 Mfn1 프로모터 활성을 촉진하는 화합물은 리프로그래밍을 억제하였다(도 12f 및 13a). 또한, Mfn1 프로모터 활성 억제제는 생쥐 ESCs(도 12g)와 인간 ESCs(도 13b)의 미분화 상태를 유지시켰다.
또한, 인간 Mfn1 프로모터 활성을 가장 잘 억제하는 3가지 화합물(U74389G maleate, 레티닐 팔미테이트(Retinyl palmitate) 및 D-α-토코페릴퀴논(D-α-Tocopherylquinone))의 새로운 용도를 규명하였다(도 12h). U74389G maleate는 생쥐와 인간 세포 모두에서 Mfn1 프로모터 활성을 억제시키는 것으로 확인되었다.
이를 통해 Mfn1 및 2의 억제제는 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍을 현저하게 촉진시키며, 전분화능을 유지시킴을 확인한 바, 본 발명의 리프로그래밍 방법은 종래의 리프로그래밍 방법에 비해 현저히 개선되었음을 알 수 있었다(도 14).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Compositions comprising a mitofusin inhibitor for promoting cell reprogramming and the use thereof <130> KPA141076KR <160> 38 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 741 <212> PRT <213> mouse <400> 1 Met Ala Glu Thr Val Ser Pro Leu Lys His Phe Val Leu Ala Lys Lys 1 5 10 15 Ala Ile Thr Ala Ile Phe Gly Gln Leu Leu Glu Phe Val Thr Glu Gly 20 25 30 Ser His Phe Val Glu Ala Thr Tyr Arg Asn Pro Glu Leu Asp Arg Ile 35 40 45 Ala Ser Glu Asp Asp Leu Val Glu Ile Gln Gly Tyr Arg Asn Lys Leu 50 55 60 Ala Val Ile Gly Glu Val Leu Ser Arg Arg His Met Lys Val Ala Phe 65 70 75 80 Phe Gly Arg Thr Ser Ser Gly Lys Ser Ser Val Ile Asn Ala Met Leu 85 90 95 Trp Asp Lys Val Leu Pro Ser Gly Ile Gly His Thr Thr Asn Cys Phe 100 105 110 Leu Ser Val Glu Gly Thr Asp Gly Asp Lys Ala Tyr Leu Met Thr Glu 115 120 125 Gly Ser Asp Glu Lys Lys Ser Val Lys Thr Val Asn Gln Leu Ala His 130 135 140 Ala Leu His Met Asp Lys Asp Leu Lys Ala Gly Cys Leu Val His Val 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Val Thr Ala Lys Lys Lys Ile Asn Gly Ile Phe Glu Gln Leu Gly Ala 35 40 45 Tyr Ile Gln Glu Ser Ala Ser Phe Leu Glu Asp Thr His Arg Asn Thr 50 55 60 Glu Leu Asp Pro Val Thr Thr Glu Glu Gln Val Leu Asp Val Lys Gly 65 70 75 80 Tyr Leu Ser Lys Val Arg Gly Ile Ser Glu Val Leu Ala Arg Arg His 85 90 95 Met Lys Val Ala Phe Phe Gly Arg Thr Ser Asn Gly Lys Ser Thr Val 100 105 110 Ile Asn Ala Met Leu Trp Asp Lys Val Leu Leu Ser Gly Ile Gly His 115 120 125 Thr Thr Asn Cys Phe Leu Arg Val Gly Gly Thr Asp Gly His Glu Ala 130 135 140 Phe Leu Leu Thr Glu Gly Ser Glu Glu Lys Lys Ser Val Lys Thr Val 145 150 155 160 Asn Gln Leu Ala His Ala Leu His Gln Asp Glu Gln Leu His Ala Gly 165 170 175 Ser Met Val Ser Val Met Trp Pro Asn Ser Lys Cys Pro Leu Leu Lys 180 185 190 Asp Asp Leu Val Leu Met Asp Ser Pro Gly Ile Asp Val Thr Thr Glu 195 200 205 Leu Asp Ser Trp Ile Asp Lys Phe Cys Leu Asp Ala Asp Val Phe Val 210 215 220 Leu Val Ala Asn Ser Glu Ser Thr Leu Met Gln Thr Glu Lys Gln Phe 225 230 235 240 Phe His Lys Val Ser Glu Arg Leu Ser Arg Pro Asn Ile Phe Ile Leu 245 250 255 Asn Asn Arg Trp Asp Ala Ser Ala Ser Glu Pro Glu Tyr Met Glu Glu 260 265 270 Val Arg Arg Gln His Met Glu Arg Cys Thr Ser Phe Leu Val Asp Glu 275 280 285 Leu Gly Val Val Asp Arg Ala Gln Ala Gly Asp Arg Ile Phe Phe Val 290 295 300 Ser Ala Lys Glu Val Leu Ser Ala Arg Val Gln Lys Ala Gln Gly Met 305 310 315 320 Pro Glu Gly Gly Gly Ala Leu Ala Glu Gly Phe Gln Val Arg Met Phe 325 330 335 Glu Phe Gln Asn Phe Glu Arg Gln Phe Glu Glu Cys Ile Ser Gln Ser 340 345 350 Ala Val Lys Thr Lys Phe Glu Gln His Thr Val Arg Ala Lys Gln Ile 355 360 365 Ala Glu Ala Val Arg Leu Ile Met Asp Ser Leu His Ile Ala Ala Gln 370 375 380 Glu Gln Arg Val Tyr Cys Leu Glu Met Arg Glu Glu Arg Gln Asp Arg 385 390 395 400 Leu Arg Phe Ile Asp Lys Gln Leu Glu Leu Leu Ala Gln Asp Tyr Lys 405 410 415 Leu Arg Ile Lys Gln Ile Thr Glu Glu Val Glu Arg Gln Val Ser Thr 420 425 430 Ala Met Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ser Val Leu Val Asp Glu Tyr 435 440 445 Gln Met Asp Phe His Pro Ser Pro Val Val Leu Lys Val Tyr Lys Asn 450 455 460 Glu Leu His Arg His Ile Glu Glu Gly Leu Gly Arg Asn Leu Ser Asp 465 470 475 480 Arg Cys Ser Thr Ala Ile Ala Ser Ser Leu Gln Thr Met Gln Gln Asp 485 490 495 Met Ile Asp Gly Leu Lys Pro Leu Leu Pro Val Ser Met Arg Asn Gln 500 505 510 Ile Asp Met Leu Val Pro Arg Gln Cys Phe Ser Leu Ser Tyr Asp Leu 515 520 525 Asn Cys Asp Lys Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Ile Glu Phe His 530 535 540 Phe Ser Leu Gly Trp Thr Met Leu Val Asn Arg Phe Leu Gly Pro Lys 545 550 555 560 Asn Ser Arg Arg Ala Leu Leu Gly Tyr Ser Asp Gln Val Gln Arg Pro 565 570 575 Leu Pro Leu Thr Pro Ala Asn Pro Ser Met Pro Pro Leu Pro Gln Ser 580 585 590 Ser Leu Thr Gln Glu Glu Leu Met Val Ser Met Val Thr Gly Leu Ala 595 600 605 Ser Leu Thr Ser Arg Thr Ser Met Gly Ile Leu Val Val Gly Gly Val 610 615 620 Val Trp Lys Ala Val Gly Trp Arg Leu Ile Ala Leu Ser Phe Gly Leu 625 630 635 640 Tyr Gly Leu Leu Tyr Val Tyr Glu Arg Leu Thr Trp Thr Thr Lys Ala 645 650 655 Lys Glu Arg Ala Phe Lys Arg Gln Phe Val Glu Tyr Ala Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Gln Leu Ile Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Cys Ser His Gln Val 675 680 685 Gln Gln Glu Leu Ser Gly Thr Phe Ala His Leu Cys Gln Gln Val Asp 690 695 700 Ile Thr Arg Asp Asn Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala Met Asn Lys Lys 705 710 715 720 Val Glu Ala Leu Asp Ser Leu Gln Ser Arg Ala Lys Leu Leu Arg Asn 725 730 735 Lys Ala Gly Trp Leu Asp Ser Glu Leu Asn Met Phe Thr His Gln Tyr 740 745 750 Leu Gln Pro Ser Arg 755 <210> 3 <211> 741 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Glu Pro Val Ser Pro Leu Lys His Phe Val Leu Ala Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ile Thr Ala Ile Phe Asp Gln Leu Leu Glu Phe Val Thr Glu Gly 20 25 30 Ser His Phe Val Glu Ala Thr Tyr Lys Asn Pro Glu Leu Asp Arg Ile 35 40 45 Ala Thr Glu Asp Asp Leu Val Glu Met Gln Gly Tyr Lys Asp Lys Leu 50 55 60 Ser Ile Ile Gly Glu Val Leu Ser Arg Arg His Met Lys Val Ala Phe 65 70 75 80 Phe Gly Arg Thr Ser Ser Gly Lys Ser Ser Val Ile Asn Ala Met Leu 85 90 95 Trp Asp Lys Val Leu Pro Ser Gly Ile Gly His Ile Thr Asn Cys Phe 100 105 110 Leu Ser Val Glu Gly Thr Asp Gly Asp Lys Ala Tyr Leu Met Thr Glu 115 120 125 Gly Ser Asp Glu Lys Lys Ser Val Lys Thr Val Asn Gln Leu Ala His 130 135 140 Ala Leu His Met Asp Lys Asp Leu Lys Ala Gly Cys Leu Val Arg Val 145 150 155 160 Phe Trp Pro Lys Ala Lys Cys Ala Leu Leu Arg Asp Asp Leu Val Leu 165 170 175 Val Asp Ser Pro Gly Thr Asp Val Thr Thr Glu Leu Asp Ser Trp Ile 180 185 190 Asp Lys Phe Cys Leu Asp Ala Asp Val Phe Val Leu Val Ala Asn Ser 195 200 205 Glu Ser Thr Leu Met Asn Thr Glu Lys His Phe Phe His Lys Val Asn 210 215 220 Glu Trp Leu Ser Lys Pro Asn Ile Phe Ile Leu Asn Asn Arg Trp Asp 225 230 235 240 Ala Ser Ala Ser Glu Pro Glu Tyr Met Glu Asp Val Arg Arg Gln His 245 250 255 Met Glu Arg Cys Leu His Phe Leu Val Glu Glu Leu Lys Val Ala Asn 260 265 270 Ala Leu Glu Ala Gln Asn Arg Ile Phe Phe Val Ser Ala Lys Glu Val 275 280 285 Leu Ser Ala Arg Lys Gln Lys Ala Gln Gly Met Pro Glu Ser Gly Val 290 295 300 Ala Leu Ala Glu Gly Phe His Ala Arg Leu Gln Glu Phe Gln Asn Phe 305 310 315 320 Glu Gln Ile Phe Glu Glu Cys Ile Ser Gln Ser Ala Val Lys Thr Lys 325 330 335 Phe Glu Gln His Thr Ile Arg Ala Lys Gln Ile Leu Ala Thr Val Lys 340 345 350 Asn Ile Met Asp Ser Val Asn Leu Ala Ala Glu Asp Lys Arg His Tyr 355 360 365 Ser Val Glu Glu Arg Glu Asp Gln Ile Asp Arg Leu Asp Phe Ile Arg 370 375 380 Asn Gln Met Asn Leu Leu Thr Leu Asp Val Lys Lys Lys Ile Lys Glu 385 390 395 400 Val Thr Glu Glu Val Ala Asn Lys Val Ser Cys Ala Met Thr Asp Glu 405 410 415 Ile Cys Arg Leu Ser Val Leu Val Asp Glu Phe Cys Ser Glu Phe His 420 425 430 Pro Asn Pro Asp Val Leu Lys Ile Tyr Lys Ser Glu Leu Asn Lys His 435 440 445 Ile Glu Asp Gly Met Gly Arg Asn Leu Ala Asp Arg Cys Thr Asp Glu 450 455 460 Val Asn Ala Leu Val Leu Gln Thr Gln Gln Glu Ile Ile Glu Asn Leu 465 470 475 480 Lys Pro Leu Leu Pro Ala Gly Ile Gln Asp Lys Leu His Thr Leu Ile 485 490 495 Pro Cys Lys Lys Phe Asp Leu Ser Tyr Asn Leu Asn Tyr His Lys Leu 500 505 510 Cys Ser Asp Phe Gln Glu Asp Ile Val Phe Arg Phe Ser Leu Gly Trp 515 520 525 Ser Ser Leu Val His Arg Phe Leu Gly Pro Arg Asn Ala Gln Arg Val 530 535 540 Leu Leu Gly Leu Ser Glu Pro Ile Phe Gln Leu Pro Arg Ser Leu Ala 545 550 555 560 Ser Thr Pro Thr Ala Pro Thr Thr Pro Ala Thr Pro Asp Asn Ala Ser 565 570 575 Gln Glu Glu Leu Met Ile Thr Leu Val Thr Gly Leu Ala Ser Val Thr 580 585 590 Ser Arg Thr Ser Met Gly Ile Ile Ile Val Gly Gly Val Ile Trp Lys 595 600 605 Thr Ile Gly Trp Lys Leu Leu Ser Val Ser Leu Thr Met Tyr Gly Ala 610 615 620 Leu Tyr Leu Tyr Glu Arg Leu Ser Trp Thr Thr His Ala Lys Glu Arg 625 630 635 640 Ala Phe Lys Gln Gln Phe Val Asn Tyr Ala Thr Glu Lys Leu Arg Met 645 650 655 Ile Val Ser Ser Thr Ser Ala Asn Cys Ser His Gln Val Lys Gln Gln 660 665 670 Ile Ala Thr Thr Phe Ala Arg Leu Cys Gln Gln Val Asp Ile Thr Gln 675 680 685 Lys Gln Leu Glu Glu Glu Ile Ala Arg Leu Pro Lys Glu Ile Asp Gln 690 695 700 Leu Glu Lys Ile Gln Asn Asn Ser Lys Leu Leu Arg Asn Lys Ala Val 705 710 715 720 Gln Leu Glu Asn Glu Leu Glu Asn Phe Thr Lys Gln Phe Leu Pro Ser 725 730 735 Ser Asn Glu Glu Ser 740 <210> 4 <211> 757 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Leu Leu Phe Ser Arg Cys Asn Ser Ile Val Thr Val Lys Lys 1 5 10 15 Asn Lys Arg His Met Ala Glu Val Asn Ala Ser Pro Leu Lys His Phe 20 25 30 Val Thr Ala Lys Lys Lys Ile Asn Gly Ile Phe Glu Gln Leu Gly Ala 35 40 45 Tyr Ile Gln Glu Ser Ala Thr Phe Leu Glu Asp Thr Tyr Arg Asn Ala 50 55 60 Glu Leu Asp Pro Val Thr Thr Glu Glu Gln Val Leu Asp Val Lys Gly 65 70 75 80 Tyr Leu Ser Lys Val Arg Gly Ile Ser Glu Val Leu Ala Arg Arg His 85 90 95 Met Lys Val Ala Phe Phe Gly Arg Thr Ser Asn Gly Lys Ser Thr Val 100 105 110 Ile Asn Ala Met Leu Trp Asp Lys Val Leu Pro Ser Gly Ile Gly His 115 120 125 Thr Thr Asn Cys Phe Leu Arg Val Glu Gly Thr Asp Gly His Glu Ala 130 135 140 Phe Leu Leu Thr Glu Gly Ser Glu Glu Lys Arg Ser Ala Lys Thr Val 145 150 155 160 Asn Gln Leu Ala His Ala Leu His Gln Asp Lys Gln Leu His Ala Gly 165 170 175 Ser Leu Val Ser Val Met Trp Pro Asn Ser Lys Cys Pro Leu Leu Lys 180 185 190 Asp Asp Leu Val Leu Met Asp Ser Pro Gly Ile Asp Val Thr Thr Glu 195 200 205 Leu Asp Ser Trp Ile Asp Lys Phe Cys Leu Asp Ala Asp Val Phe Val 210 215 220 Leu Val Ala Asn Ser Glu Ser Thr Leu Met Gln Thr Glu Lys His Phe 225 230 235 240 Phe His Lys Val Ser Glu Arg Leu Ser Arg Pro Asn Ile Phe Ile Leu 245 250 255 Asn Asn Arg Trp Asp Ala Ser Ala Ser Glu Pro Glu Tyr Met Glu Glu 260 265 270 Val Arg Arg Gln His Met Glu Arg Cys Thr Ser Phe Leu Val Asp Glu 275 280 285 Leu Gly Val Val Asp Arg Ser Gln Ala Gly Asp Arg Ile Phe Phe Val 290 295 300 Ser Ala Lys Glu Val Leu Asn Ala Arg Ile Gln Lys Ala Gln Gly Met 305 310 315 320 Pro Glu Gly Gly Gly Ala Leu Ala Glu Gly Phe Gln Val Arg Met Phe 325 330 335 Glu Phe Gln Asn Phe Glu Arg Arg Phe Glu Glu Cys Ile Ser Gln Ser 340 345 350 Ala Val Lys Thr Lys Phe Glu Gln His Thr Val Arg Ala Lys Gln Ile 355 360 365 Ala Glu Ala Val Arg Leu Ile Met Asp Ser Leu His Met Ala Ala Arg 370 375 380 Glu Gln Gln Val Tyr Cys Glu Glu Met Arg Glu Glu Arg Gln Asp Arg 385 390 395 400 Leu Lys Phe Ile Asp Lys Gln Leu Glu Leu Leu Ala Gln Asp Tyr Lys 405 410 415 Leu Arg Ile Lys Gln Ile Thr Glu Glu Val Glu Arg Gln Val Ser Thr 420 425 430 Ala Met Ala Glu Glu Ile Arg Arg Leu Ser Val Leu Val Asp Asp Tyr 435 440 445 Gln Met Asp Phe His Pro Ser Pro Val Val Leu Lys Val Tyr Lys Asn 450 455 460 Glu Leu His Arg His Ile Glu Glu Gly Leu Gly Arg Asn Met Ser Asp 465 470 475 480 Arg Cys Ser Thr Ala Ile Thr Asn Ser Leu Gln Thr Met Gln Gln Asp 485 490 495 Met Ile Asp Gly Leu Lys Pro Leu Leu Pro Val Ser Val Arg Ser Gln 500 505 510 Ile Asp Met Leu Val Pro Arg Gln Cys Phe Ser Leu Asn Tyr Asp Leu 515 520 525 Asn Cys Asp Lys Leu Cys Ala Asp Phe Gln Glu Asp Ile Glu Phe His 530 535 540 Phe Ser Leu Gly Trp Thr Met Leu Val Asn Arg Phe Leu Gly Pro Lys 545 550 555 560 Asn Ser Arg Arg Ala Leu Met Gly Tyr Asn Asp Gln Val Gln Arg Pro 565 570 575 Ile Pro Leu Thr Pro Ala Asn Pro Ser Met Pro Pro Leu Pro Gln Gly 580 585 590 Ser Leu Thr Gln Glu Glu Phe Met Val Ser Met Val Thr Gly Leu Ala 595 600 605 Ser Leu Thr Ser Arg Thr Ser Met Gly Ile Leu Val Val Gly Gly Val 610 615 620 Val Trp Lys Ala Val Gly Trp Arg Leu Ile Ala Leu Ser Phe Gly Leu 625 630 635 640 Tyr Gly Leu Leu Tyr Val Tyr Glu Arg Leu Thr Trp Thr Thr Lys Ala 645 650 655 Lys Glu Arg Ala Phe Lys Arg Gln Phe Val Glu His Ala Ser Glu Lys 660 665 670 Leu Gln Leu Val Ile Ser Tyr Thr Gly Ser Asn Cys Ser His Gln Val 675 680 685 Gln Gln Glu Leu Ser Gly Thr Phe Ala His Leu Cys Gln Gln Val Asp 690 695 700 Val Thr Arg Glu Asn Leu Glu Gln Glu Ile Ala Ala Met Asn Lys Lys 705 710 715 720 Ile Glu Val Leu Asp Ser Leu Gln Ser Lys Ala Lys Leu Leu Arg Asn 725 730 735 Lys Ala Gly Trp Leu Asp Ser Glu Leu Asn Met Phe Thr His Gln Tyr 740 745 750 Leu Gln Pro Ser Arg 755 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mfn1 forward primer <400> 5 tgaaagctgg ctgtcttgtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mfn1 reverse primer <400> 6 agagccgctc attcacctta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mfn2 forward primer <400> 7 cctcacagag ggctcagaag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mfn2 reverse primer <400> 8 gtccagctcc gtggtaacat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 forward primer <400> 9 agagaccgcc gtacagaaga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 reverse primer <400> 10 ctgtagcatg ggcatccttt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 forward primer <400> 11 cggtggaact ttgacttcgt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p21 reverse primer <400> 12 cagggcagag gaagtactgg 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut1 forward primer <400> 13 gatcctgggc cgcttcat 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glut1 reverse primer <400> 14 acatgggcac gaagcctg 18 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hif1alpha forward primer <400> 15 tcaagtcagc aacgtggaag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hif1alpha reverse primer <400> 16 tatcgaggct gtgtcgactg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hk2 forward primer <400> 17 gggacgacgg tacactcaat 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hk2 reverse primer <400> 18 gccagtggta aggagctctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfk forward primer <400> 19 atggcaaagc tatcggtgtc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pfk reverse primer <400> 20 acacagtccc atttggcttc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pam1 forward primer <400> 21 gcctgatcac cccttctaca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pam1 reverse primer <400> 22 tcaagaccct tttcccctct 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eno1 forward primer <400> 23 agtacgggaa ggacgccacc a 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Eno1 reverse primer <400> 24 gcggccacat ccatgccgat 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pkm forward primer <400> 25 ctgcaggtga aggagaaagg 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Pkm reverse primer <400> 26 agatgcaaac accatgtcca 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ldha forward primer <400> 27 tggcagcctc ttccttaaaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ldha reverse primer <400> 28 cagcttgcag tgtggactgt 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 29 agccatgtac gtagccatcc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse primer <400> 30 ctctcagctg tggtggtgaa 20 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ND132 forward primer <400> 31 cccattcgcg ttatctt 17 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ND132 reverse primer <400> 32 aagttgatcg taacggaagc 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atp6ap1 forward primer <400> 33 gccatggaac gacttgaaat 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Atp6ap1 reverse primer <400> 34 cggagagaag aaaccagcac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sdhb forward primer <400> 35 actggtggaa cggagacaag 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sdhb reverse primer <400> 36 ttaagccaat gctcgcttct 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uqcrc1 forward primer <400> 37 cctacagcac tcgagagcac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Uqcrc1 reverse primer <400> 38 aggtgtgccc tggaatgctg 20

Claims (20)

  1. 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 분화된 세포에서 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 미토푸신은 인간 또는 생쥐 유래인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미토푸신은 미토푸신 1 또는 미토푸신 2인 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 미토푸신 1은 서열번호 1 또는 3의 아미노산 서열로 정의되고, 미토푸신 2는 서열번호 2 또는 4의 아미노산 서열로 정의되는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 억제제는 미토푸신 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오타이드, siRNA, shRNA 및 microRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유전자의 발현 억제제는 미토푸신의 프로모터 활성 억제제인 것인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 미토푸신의 프로모터 활성 억제제는 피세아타놀(piceatannol), 테트라메틸피라진(tetramethylpyrazine), 21-[4-(2,6-디-1-피롤리디닐-4-피리미디닐)-1-피페라지닐]프레그나-1,4,9[11]-트리엔-3,20-디온 말레이트(21-[4-(2,6-Di-1-pyrrolidinyl-4-pyrimidinyl)-1-piperazinyl]pregna-1,4,9[11]-triene-3,20-dione maleate), 레티닐 팔미테이트(Retinyl palmitate) 및 D-α-토코페릴퀴논(D-α-Tocopherylquinone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 조성물은 미토푸신의 프로모터 활성 억제제를 1nM 이상 100μM 이하로 포함하는 것인, 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단백질의 활성 억제제는 미토푸신 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것인, 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 분화된 세포는 생식세포, 체세포 또는 전구세포인 것인, 조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 배양 배지 또는 배양 배지 첨가제인 것인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 하나 이상의 리프로그래밍 유도인자를 포함하는 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 리프로그래밍 유도인자는 Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog, Lin-28 및 Rex1로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자인 것인 조성물.
  14. 미토푸신 유전자의 발현 억제제, 미토푸신 단백질의 활성 억제제, 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는, 미분화 상태의 전분화능 줄기세포 유지 및 배양용 배지 조성물.
  15. (a) 분화된 세포에 리프로그래밍 유도인자를 전달하는 단계; 및
    (b) 분화된 세포를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 함유하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는,
    분화된 세포에서 리프로그래밍된 전분화능 줄기세포로의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 리프로그래밍은, 분화된 세포 대비 리프로그래밍된 세포에서 해당과정의 부산물인 젖산의 생성이 증가하거나, Ras-Raf-HIF1α 신호가 활성화되거나, 산소 소비량이 감소하거나, 또는 리프로그래밍 유도 시간 단축 및 리프로그래밍된 세포수 증가로 인해 리프로그래밍 효율이 증진된 것인, 방법.
  17. 삭제
  18. 분리된 분화된 세포의 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계를 포함하는, 분화된 세포의 전분화능 줄기세포로의 리프로그래밍 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 미토푸신 유전자의 발현 또는 단백질의 활성을 억제하는 단계는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물을 분화된 세포에 처리하여 수행하는 것인, 방법.
  20. 삭제
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