JP6386080B2 - マイトフュージン抑制剤を含む、細胞のリプログラミング促進用組成物及びその用途 - Google Patents
マイトフュージン抑制剤を含む、細胞のリプログラミング促進用組成物及びその用途 Download PDFInfo
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Description
本発明は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、分化した細胞から全分化能幹細胞の脱分化/リプログラミング促進用組成物、前記組成物を用いて分化した細胞からリプロブラミングされた全分化能幹細胞の製造方法、前記製造方法により製造された全分化能幹細胞、マイトフュージン遺伝子の発現又はタンパク質の活性を抑制する段階を含む全分化能幹細胞のリプロブラミング方法及び前記リプロブラミング方法により製造された全分化能幹細胞に関するものである。
細胞運命の転換は（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）、胚発生、老化、組織再生、がんの発生及び進行を含む様々な発達学的、生理学的及び病理学的な条件下で起きる。細胞運命の転換に関する細胞及び分子メカニズムを解明し、前記メカニズムを調節することで、誤った細胞運命の決定による病理学的に非正常的状態を治療することができる。最近解明されたリプログラミング因子を用いて体細胞を、全分化能幹細胞へリプロブラミングする人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）技術の発達に伴い、未来のバイオ医療及び再生医学の発展に効果的に適用し得る様々な細胞を生産できる細胞運命の転換技術に対する需要範囲が急激に拡大されつつある(非特許文献１)。全般的に、体細胞のリプログラミング過程の間、遺伝的、後成的及び代謝的レベルで複雑な分子的変化が同時に又は順次に発生する。よって、多くの部分を確率に依存するリプログラミングの初期段階における全分化能を獲得する成功率を高めるためには、細胞の安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）と可塑性(ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ)のバランスを保つことが重要である。従って、細胞周期のチェックポイント、ＭＥＴ(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ)及び代謝リプロブラミングのようなリプログラミング障壁を効果的に克服する戦略的、かつ技術的な方法を適用することが非常に重要である(非特許文献２)。
ｐ５３は、リプログラミングの誘導過程において自然に発生する細胞のストレスからゲノムを守るために誘導される細胞周期の抑制、老化、死滅に関わるシグナル伝達の調節に関与する主要因子であって、ｐ５３シグナル伝達の阻害は、リプログラミング過程を促進する。また、ｐ５３は、リプログラミングの初期過程でＫ１ｆ４を介して上皮遺伝子の発現を抑制することでＭＥＴを阻害し、解糖作用(Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ)への代謝リプログラミングを抑制することで腫瘍の発達を抑制する。
ミトコンドリアダイナミックスのバランスは、細胞の恒常性を保つのに必須であり、ミトコンドリアダイナミックスの異常は、様々な疾病をもたらす。ｉＰＳＣ及びがん細胞のような増殖性の強い細胞では、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ生産の依存度が低下しているため、ミトコンドリアの酸化ストレスを軽減させることができ、高分子の生合成に容易な解糖作用によりエネルギーを獲得することを好む。
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、２００６、１２６(４)、６６３-６７６
Ｂｕｇａｎｉｍ Ｙ、ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、２０１２、１５０(６)、１２０９-１２２２
本発明者らは、全分化能細胞へのリプログラミング過程において、リプログラミング効率を増加させる技術を開発する上で、ミトコンドリアの代謝リプログラミング過程を改善する方法論を確保するために鋭意努力した結果、リプログラミング効率の高いｐ５３欠損及びｐ２１欠損細胞では、マイトフュージン１及び２の発現レベルが低く、前記マイトフュージンを抑制又は遺伝的に除去すると、分化した細胞から全分化能細胞へのリプログラミング効率が画期的に増加すると共に、全分化能幹細胞の全分化能状態の維持においても陽性効果があることを確認し、マイトフュージンプロモーター活性を抑制する化合物が、前記リプログラミング効率を増加させ、全分化能を維持させるのに効果的に作用することを確認し、本発明を完成するに至った。
本発明の目的は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、未分化状態の全分化能幹細胞の維持及び培養用の培地組成物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、（ａ）分化した細胞に１つ以上のリプログラミング因子を伝達する段階；及び（ｂ）分化した細胞を本発明のリプログラミング促進用組成物を含有する培地で培養する段階を含む、分化した細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞への製造方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記製造方法により製造された全分化能幹細胞を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、分離した分化細胞におけるマイトフュージン遺伝子の発現又はタンパク質の活性を抑制する段階を含む、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング方法を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、前記リプログラミング方法により製造された全分化能幹細胞を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物を製造するためのマイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物の用途を提供することである。
本発明の組成物は、全分化能幹細胞を作製するためのリプログラミングの誘導過程において、リプログラミングの誘導効率を増加させるだけでなく、リプログラミングの誘導にかかる所要時間を減少させることにより、全分化能幹細胞の産業化に求められる高効率の全分化能幹細胞の作製技術及び安定的な大量培養システムを開発するのに有効に活用することができる。また、全分化能幹細胞を維持し、全分化能幹細胞へのリプログラミングを促進できる化合物をスクリーニングするのに有効に活用することができる。
本発明の一様態として、マイトフュージン抑制剤を有効成分として含む、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物を提供する。具体的には、本発明は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物を提供する。
本発明における用語「マイトフュージン（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ）」とは、ミトコンドリア外膜に存在するＧＴＰ-結合タンパク質の一種であって、ミトコンドリア間の結合を誘導する構造タンパク質を意味する。具体的には、前記マイトフュージンは、マウス又はヒト由来であってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記マイトフュージンは、具体的には、マイトフュージン１（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ１、Ｍｆｎ１）又はマイトフュージン２（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ２、Ｍｆｎ２）であってもよく、より具体的には、配列番号１（マウス由来）又は配列番号３（ヒト由来）のアミノ酸配列を持つＭｆｎ１又はＭｆｎ２（マウス由来）又は配列番号４（ヒト由来）のアミノ酸配列を持つＭｆｎ２であってもよく、最も具体的には、配列番号２１又は２２のプライマーで増幅され得る塩基配列でコードされるＭｆｎ１、又は配列番号２３又は２４のプライマーで増幅され得る塩基配列でコードされるＭｆｎ２であってもよいが、これらに限定されるものではない。
分化した細胞からマイトフュージンを抑制又は遺伝的に除去すると、全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されることが本発明者らにより初めて解明された。
このようなＭｆｎ１及び２の配列を基に、Ｍｆｎ１及び２遺伝子の発現抑制剤又はタンパク質活性抑制剤を設計することができ、前記配列は、設計おいてある程度変更可能である。本技術分野の当業者であれば、このような人為的な変更によって８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、最も具体的には９８％の相同性を維持する配列もまた使用できることは自明である。
本発明の具体的な一実施例では、Ｍｆｎ１/２の減少が体細胞のリプログラミングに寄与するか否かを確認するために、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）染色により分析した結果、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、マウス（図6A）及びヒト細胞システム（図6B）において、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合に比べてリプログラミングされた細胞数が著しく増加したことが確認された。また、マウスにおいてもｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、対照群ｓｈＲＮＡを処理した場合に比べてリプログラミングにかかる所要時間が短縮されることが確認された（図6G）。
また、分化条件である非条件培地（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＵＭ）を使用した培養条件の下、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｈＥＳＣ）では分化が起きていたが、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制したｈＥＳＣでは、未分化状態が維持された（図6C）。また、ＵＭ培養条件の下、ｈＥＳＣｓにおいてＭｆｎ１及び２が抑制されている間に、Ｏｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連マーカーの発現が維持されていた（図6D及び７）。
さらに、Ｍｆｎ１及び２を遺伝的除去により完全に抑制した場合、正常なマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＭＥＦｓ）に比べてリプログラミング効率が著しく高く（図6E）、ミトコンドリアは断片化された形態（図6F）を示した。特に、Ｍｆｎ１-/-（Ｍｆｎ１-ＫＯ）では、ＷＴに比べて約５００倍以上、Ｍｆｎ２-/-（Ｍｆｎ２-ＫＯ）では約２００倍以上、ＡＰ+コロニー数が著しく増加したことが確認されたことから（図6E）、Ｍｆｎ１及び２の除去により体細胞のリプログラミング効率が著しく増加されることができることが確認された。しかし、このような効果は、ミトコンドリア分裂阻害剤であるＭｄｉｖｉ１の処理によって抑制されることが確認された（図6E及び6F）。
よって、ミトコンドリアの構造タンパク質であるＭｆｎを抑制又は遺伝的に除去すると、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されることが分かった。
本発明のおける用語「マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤」とは、前記マイトフュージンの発現を減少させる物質を総称するものであり、より具体的には、マイトフュージンの発現を転写レベル又はタンパク質レベルで減少させる全ての物質を含むことができる。
前記マイトフュージンの発現を抑制する物質は、マイトフュージンを標的にしてマイトフュージンの発現又は活性を抑制できる化合物、核酸、ペプチド、ウイルス又は前記核酸を含むベクターなどその形態に限定されることなく使用可能である。具体的には、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤は、マイトフュージン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡからなる群より選択される１つ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記マイトフュージン遺伝子の発現を抑制すると、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されるため、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率を増加させる用途として使用することができる。
本発明の具体的な一実施例では、Ｍｆｎ１/２の減少が体細胞のリプログラミングに寄与するか否かを確認するために、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合に比べてリプログラミング効率が著しく増加したことが確認された（図6A及び6B）。また、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制させたｈＥＳＣｓでは、ＵＭ培養条件下で未分化状態が維持された（図6C）。また、ＵＭ培養条件の下、ｈＥＳＣｓにおいてＭｆｎ１及び２が抑制されている間に、Ｏｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連マーカーの発現が維持されていた（図6D及び７）。
また、具体的には、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤は、マイトフュージンのプロモーター活性を抑制するものであってもよく、その例として、ピセアタンノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ)、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４-ピリミジニル)-１-ピペリジニル]プレグナ-１,４,９[１１]- トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ)、パルミチン酸レチニル（ｒｅｔｉｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）及びＤ-α-トコフェリルキノン（Ｄ-α-Ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌｑｕｉｎｏｎｅ）からなる群より選択される１種以上であってもよいが、マイトフュージン遺伝子の発現を阻害し、分化した細胞をリプログラミングさせ得る物質であれば、限定されることなく含むことができる。マイトフュージンのプロモーター活性を抑制すると、マイトフュージン遺伝子の発現が抑制され、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し全分化能が維持されるため、前記マイトフュージンのプロモーター活性抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率を増加させる用途として使用することができる。
本発明の具体的な一実施例では、８４個の酸化還元ライブラリーの化合物を用いてマウス又はヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を変化させ得る化学物質をスクリーニングした結果、マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させる上位３つの化合物（ピセアタンノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ）、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）及び２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４-ピリミジニル)-１-ピペリジニル]プレグナ-１,４,９[１１]- トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ、Ｕ７４３８９Ｇ ｍａｌｅａｔｅ））と、増加させる上位２つの化合物（タンシノンＩＩＡ、テルビナフィン塩酸塩）の新たな用途を解明した（図１2D）。前記マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を抑制する化合物はマウスだけでなく、ヒト体細胞のリプログラミング効率も増加させ（図１2F及び１3A）、マウスＥＳＣｓ（図１2G）と、ヒトＥＳＣｓ（図１3B）の未分化状態を維持させることが確認された。
また、ヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を最もよく抑制する３つの化合物（Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩、パルミチン酸レチニル及びＤ-α-トコフェリルキノン）の新たな用途を解明した（図１2H）。Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩は、マウスとヒト細胞の両方でＭｆｎ１のプロモーター活性を抑制させることが確認された。
よって、Ｍｆｎ１又は２の抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを著しく促進し、全分化能を維持させるので、従来のリプログラミング条件に比べて著しく改善されたことが分かった（図１４）。
また、本発明のリプログラミング促進用組成物は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを促進できるものであれば、様々な濃度で前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤を含んでもよく、具体的には１ｎＭ以上、１００μＭ以下、より具体的には１０ｎＭ以上、１０μＭ以下の濃度で含んでもよい。
本発明の具体的な一実施例では、マウス及びヒトＭｆｎ１のプロモーターレポーター（ジーンコピア、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）細胞を、それぞれＭｆｎ１-/-ＭＥＦｓと２９３Ｔ細胞を用いて作製し、８４個の化合物を含むＳｃｒｅｅｎ-ＷｅｌｌＴＭＲＥＤＯＸライブラリーを１０μＭの濃度で４８時間処理した。その結果、ピセアタンノール、テトラメチルピラジン及びＵ７４３８９Ｇマレイン酸塩は、マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させ（図１2D）、Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩、パルミチン酸レチニル及びＤ-α-トコフェリルキノンは、ヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させることが確認された（図１2H）。
よって、前記濃度範囲でマイトフュージンのプロモーター活性抑制剤を処理した場合、リプログラミング効率が著しく増加したことから、従来のリプログラミング条件に比べて著しく改善されたことが分かった。
本発明における用語「マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤」とは、前記マイトフュージンタンパク質の活性を減少させる物質を称する意味として使用されており、具体的には、マイトフュージン遺伝子から発現するタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は抗原結合性を持つものであれば、前記抗体の断片も本発明の抗体に含まれる。
さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体及びヒト抗体なども含み、新規抗体の他に、既に該技術分野に公知の抗体も含むことができる。前記抗体は、マイトフュージン遺伝子から発現するタンパク質を特異的に認識して結合する特性を持つものであれば、２つの重鎖と２つの軽鎖の全体の長さを持つ完全な形態のものだけでなく、抗体分子の機能的な断片をも含む。機能的な抗体分子の断片とは、少なくとも抗原結合機能を保持する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明における用語「分化」とは、細胞が分裂して増殖し、全体の個体が成長する間に細胞の構造や機能が特殊化される現象を意味する。すなわち、生物の細胞、組織などが、それぞれの与えられた役割を全うするために適合する形態及び機能に変化する過程を言い、例えば、胚性幹細胞のような全分化能幹細胞が外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞に変化していく過程のみならず、造血母細胞から赤血球、白血球、血小板などに変化する過程、すなわち、前駆細胞が特定の分化形質を発現するのも全て分化に含まれ得る。
本発明における用語「分化した細胞」とは、前記分化過程が進み、一定の形態及び機能を持つようになった細胞を意味する。本発明の分化した細胞は、特に限定されるものではないが、具体的には、生殖細胞、体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）又は前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）であってもよい。その例として、ヒト由来の細胞であってもよいが、様々な個体由来の細胞もまた本発明の範囲内に属する。
また、本発明の分化した細胞には、生体内又は生体外の分化した細胞を全て含んでもよく、ヒトを除いた動物の分化した細胞であってもよく、生体から分離した分化細胞であってもよい。
前記「体細胞」とは、生殖細胞を除いた動・植物を構成する分化が完了した全ての細胞を意味し、「前駆細胞」とは、子孫に該当する細胞が特定分化形質を発現することが明らかになった場合、分化形質を発現しないが、その分化運命（ｆａｔｅ）を有する親細胞を意味する。例えば、神経細胞（ニューロン）に対しては、神経芽細胞（ニューロン幹細胞）が前駆細胞に該当し、筋管細胞に対しては、筋芽細胞が前駆細胞に該当する。
本発明における用語「全分化能又は多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、個体における全ての組織の細胞に分化できる全分化能又は多能性であり、自己再生能力を有する幹細胞を意味する。その例として、胚性幹細胞と人工多能性幹細胞を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の全分化能幹細胞は、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどの全てに由来する全分化能幹細胞を含んでもよく、具体的には、ヒト由来の全分化能幹細胞であってもよい。
前記「人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）」とは、分化した細胞を、人為的なリプログラミング過程によって全分化能を持つように誘導した細胞を意味する。人為的なリプログラミング過程は、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いたウイルスを介したり、又は非ウイルス性ベクターを利用、タンパク質及び細胞抽出物などを利用する非ウイルスを介したリプログラミング因子の導入によって行ったり、幹細胞の抽出物、化合物などによるリプログラミング過程を含むことができる。人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほとんど同じ特性を持つ。具体的には、類似した細胞の形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似しており、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において全分化能を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入した場合、キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成でき、遺伝子のジャームライン・トランスミッション（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。本発明の人工多能性幹細胞は、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどの全てに由来する人工多能性幹細胞を含んでもよく、具体的には、ヒト由来の人工多能性幹細胞であってもよい。
本発明における用語「胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣ）」とは、受精卵が母体の子宮に着床する直前である胞胚期の胚芽から、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）を抽出して体外で培養したもので、個体の全ての組織の細胞に分化できる全分化能を有し、自己再生能力を有する細胞を意味し、胚性幹細胞由来の胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｉｅｓ）をも含んでもよい。本発明の胚性幹細胞としては、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどの全てに由来する胚性幹細胞を含んでもよく、具体的には、ヒト由来の胚性幹細胞であってもよい。
本発明における用語「脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」とは、分化した細胞が新たな類型へ分化する潜在力を持つ状態に戻るプロセスを意味する。また、前記脱分化は、本発明で細胞リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）と同じ意味として使用され得る。このような細胞のリプログラミング機構は、核内における後成遺伝学（ヌクレオチド配列の変化を伴わない機能的な面における遺伝的変化をもたらすことに関連したＤＮＡ状態）的マークが削除された後、相違するセットの後成遺伝学的マークを樹立することを意味し、相違する細胞及び組織は、多細胞生物が分化及び成長する間に相違する遺伝子発現のプログラムを獲得することになる。
本発明における用語「リプログラミングの促進」とは、リプログラミングが行われる過程において、リプログラミング過程が迅速に行われたり、リプログラミング効率を増加させることを意味し、リプログラミング効率の速度又は比率の面において向上するという意味を含むことができる。
本発明の具体的な一実施例では、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合に比べてリプログラミング効率が著しく増加したことが確認された（図6A及び6B）。また、Ｍｆｎ１及び２を遺伝的除去によって完全に抑制した場合には、正常なマウス胚性線維芽細胞に比べて非常に高いリプログラミング効率（図6E）及びミトコンドリアが断片化された形態（図6F）を示した。特に、Ｍｆｎ１-/-（Ｍｆｎ１-ＫＯ）は、ＷＴに比べて約５００倍以上、Ｍｆｎ２-/-（Ｍｆｎ２-ＫＯ）は約２００倍以上、ＡＰ+コロニー数が増加したことが確認されたことから（図6E）、Ｍｆｎ１及び２の除去により体細胞のリプログラミング効率が著しく増加したことが分かった。
結果的に、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を含む組成物を用いてリプログラミングが効果的、かつ迅速に行われるようにすることができ、前記組成物を用いて製造された全分化能（人工多能性）幹細胞が正常に全分化能を獲得することが確認された。
具体的には、本発明のリプログラミング促進用組成物は、培養培地又は培養培地の添加剤の形態であってもよい。よって、本発明の組成物には、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを妨害しないものであれば、一般的に細胞培養培地に含まれる物質をさらに含んでもよい。
また、本発明において、分化した細胞から全分化能を有する幹細胞へのリプログラミングを促進する組成物には、１つ以上のリプログラミング因子を含んでもよい。
本発明における用語「リプログラミング因子」とは、最終的に分化した細胞が新たな類型に分化する潜在力を持つ全分化能幹細胞へとリプログラミングするように誘導する物質である。本発明において、前記リプログラミング因子は、リプログラミングの誘導因子と混用して使用してもよい。前記リプログラミング因子は、最終的に分化した細胞のリプログラミングを誘導する物質であれば、限定されることなく含むことができ、分化させる細胞の種類によって選択してもよい。これらに限定されるものではないが、具体的には、リプログラミングの誘導因子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ-２８及びＲｅｘ１からなる群より選択されるタンパク質又はこれらのタンパク質をコードする核酸分子をさらに含んでもよい。
本発明における用語「タンパク質をコードする核酸分子」とは、細胞内に伝達されると、それ自体が該タンパク質を発現できるようにプロモーターなどに作動可能に連結された形態であってもよく、また、細胞内の染色体に挿入されて該タンパク質を発現できる核酸分子をも幅広く含む。例えば、リプログラミングの誘導因子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ-２８及びＲｅｘ１からなる群より選択されるいずれか１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子が発現ベクター内で作動可能に連結されて細胞内に伝達されることができ、宿主細胞の染色体内に挿入されるという形で細胞内に伝達され得る。
本発明の具体的な一実施例では、リプログラミングの誘導因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４及びｃ-Ｍｙｃをコードするレトロウイルスの１ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、感染多重度）を体細胞に感染させて形質導入することで、マウス又はヒト線維芽細胞のリプログラミングを誘導した(実験例３)。
前記組成物は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを促進するのに充分な量で含んでもよい。
本発明の他の一態様は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、未分化状態の全分化能幹細胞の維持及び培養用の培地組成物を提供する。本発明において、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤又はマイトフュージンタンパク質の活性抑制剤は、全分化能幹細胞を未分化状態に維持する機能を含むことができるので、前記組成物に使用することができる。一方、本発明の全分化能幹細胞の維持及び培養用の培地組成物は、未分化状態の維持/培養を妨害しない限り、一般的に細胞培養培地に含まれる物質をさらに含んでもよい。
前記「マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤」、「マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤」、「全分化能幹細胞」とは、前述のとおりである。
本発明の具体的な一実施例では、ＵＭを用いた培養条件の下、ｈＥＳＣｓでは分化が起きているが、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制したｈＥＳＣｓでは、未分化状態が維持されることが確認された（図6C）。また、ＵＭ培養条件の下、ｈＥＳＣｓにおいてＭｆｎ１及び２が抑制されている間に、Ｏｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連マーカーの発現が維持されることが確認された（図6D及び７）。これらのことから、マイトフュージンを抑制又は遺伝的に除去すると、未分化状態の全分化能幹細胞が維持されることが分かった。
本発明のさらに他の一態様は、（ａ）分化した細胞に１つ以上のリプログラミング因子を伝達する段階；及び（ｂ）分化した細胞を前記リプログラミング促進用組成物を含有する培地で培養する段階を含む、分化した細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞への製造方法を提供する。本発明の分化した細胞において、マイトフュージンを抑制してリプログラミングされた全分化能幹細胞を製造する方法は、既存のリプログラミングされた全分化能幹細胞を製造する方法に比べて、リプログラミングされた細胞数が著しく増加し、リプログラミングにかかる所要時間が大幅に短縮されるため、リプログラミング効率が著しく増加する。
前記「分化した細胞」、「リプログラミング因子」及び「全分化能幹細胞」とは、前述のとおりである。
前記（ａ）段階のリプログラミング因子を分化した細胞に伝達する方法は、当業界で通常使用される細胞に核酸分子又はタンパク質を提供する方法を限定されることなく使用することができ、具体的には、リプログラミング因子を分化した細胞の培養液に投与する方法、リプログラミング因子を分化した細胞に直接注入する方法又はリプログラミング因子の遺伝子を挿入したウイルスベクターでトランスフェクションしたパッケージング細胞から取得したウイルスを用いて分化した細胞に感染させる方法を使用することができる。
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）、トリ肉腫・白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ/ｌｅｕｋｏｓｉｓ、ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、マウス乳がんウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ、ｍＭＴＶ）など、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）などに由来するベクターを含むことができ、これらに限定されるものではないが、具体的には、レトロウイルスベクターを使用することができ、より具体的には、レトロウイルスベクターであるｐＭＸｓを使用することができる。
前記リプログラミング因子を分化した細胞に直接注入する方法は、当業界に公知の任意の方法を選択して使用することができ、これらに限定されるものではないが、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接筋肉に注入する方法、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びトランスポゾンを用いた方法の中から適宜選択して適用することができる。
また、前記（ａ）及び（ｂ）の段階は、同時、順次又は逆順に行うことができ、前記方法は、段階（ｂ）より得られた培養物から胚性幹細胞様コロニーを分離する段階をさらに含むことができる。
また、具体的には、前記分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングは、分化した細胞に比べてリプログラミングされた細胞において解糖作用の副産物である乳酸産生が増加したり、Ｒａｓ-Ｒａｆ-ＨＩＦ１αシグナルが活性化されたり、酸素消費量が減少したり、又はリプログラミングの誘導時間の短縮及びリプログラミングされた細胞数の増加によりリプログラミング効率が増加され得る。
本発明の具体的な一実施例では、解糖作用に関与する主な酵素をエンコードする遺伝子の発現及び解糖作用の各段階における代謝物の相対的な量は、対照群に比べてＭｆｎ１及び２の抑制細胞において著しく増加したことが確認されており（図8A及び8B）、細胞内の乳酸産生も増加したことが確認された（図8C）。
また、リプログラミングの初期段階の間、Ｍｆｎ１/２及びｐ５３/２１機構における相互抑制は、Ｒａｓ-Ｒａｆシグナルを活性化させ、これは、連続的にＨＩＦ１αの安定化をもたらすので（図10F）、効率的なリプログラミングを可能にする低酸素条件を模倣できることが確認された。また、低酸素条件下で、ｉＰＳＣの発生が著しく増加したことが確認されており（図１2A）、ＨＩＦ１αとＬＤＨＡタンパク質の発現増加との相関性が確認された（図１2B）。同じ条件の下、Ｍｆｎ１のプロモーター活性は、著しく減少し（図１2C）、Ｍｆｎ１及び２タンパク質の発現も著しく減少した（図１2B）。
本発明のさらに他の一態様は、前記分化した細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞への製造方法により製造された全分化能幹細胞を提供する。具体的には、前記全分化能幹細胞は人工多能性幹細胞であってもよい。
前記「全分化能幹細胞」及び「人工多能性幹細胞」は、前述のとおりである。
本発明の具体的な一実施例では、本発明における極めて高いリプログラミング効率を持つ全分化能幹細胞の製造方法によって、マウス及びヒト線維芽細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞を取得した（図6A、6B、6E）。
本発明のさらに他の一態様は、分離した分化細胞におけるマイトフュージン遺伝子の発現又はタンパク質の活性を抑制する段階を含む、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング方法を提供する。具体的には、前記分離した分化細胞におけるマイトフュージン遺伝子の発現又はタンパク質の活性を抑制する段階は、前記リプログラミング促進用組成物を分化した細胞に処理することにより行うことができる。
前記「分化した細胞」、「マイトフュージン遺伝子の発現」、「タンパク質活性の抑制」、「全分化能幹細胞」及び「リプログラミング」とは、前述のとおりである。
本発明のさらに他の一態様は、前記リプログラミング方法により製造された全分化能幹細胞を提供する。具体的には、前記全分化能幹細胞は人工多能性幹細胞あってもよい。
前記「全分化能幹細胞」及び「人工多能性幹細胞」とは、前述のとおりである。
本発明のさらに他の一態様は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物を製造するためのマイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物の用途を提供する。具体的には、前記全分化能幹細胞は人工多能性幹細胞であってもよい。
前記「全分化能幹細胞」、「人工多能性幹細胞」、「分化した細胞」、「マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤」、「マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤」及び「リプログラミング」とは、前述のとおりである。
本発明における用語「マイトフュージン（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ）」とは、ミトコンドリア外膜に存在するＧＴＰ-結合タンパク質の一種であって、ミトコンドリア間の結合を誘導する構造タンパク質を意味する。具体的には、前記マイトフュージンは、マウス又はヒト由来であってもよいが、これらに限定されるものではない。また、前記マイトフュージンは、具体的には、マイトフュージン１（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ１、Ｍｆｎ１）又はマイトフュージン２（ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ２、Ｍｆｎ２）であってもよく、より具体的には、配列番号１（マウス由来）又は配列番号３（ヒト由来）のアミノ酸配列を持つＭｆｎ１又はＭｆｎ２（マウス由来）又は配列番号４（ヒト由来）のアミノ酸配列を持つＭｆｎ２であってもよく、最も具体的には、配列番号２１又は２２のプライマーで増幅され得る塩基配列でコードされるＭｆｎ１、又は配列番号２３又は２４のプライマーで増幅され得る塩基配列でコードされるＭｆｎ２であってもよいが、これらに限定されるものではない。
分化した細胞からマイトフュージンを抑制又は遺伝的に除去すると、全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されることが本発明者らにより初めて解明された。
このようなＭｆｎ１及び２の配列を基に、Ｍｆｎ１及び２遺伝子の発現抑制剤又はタンパク質活性抑制剤を設計することができ、前記配列は、設計おいてある程度変更可能である。本技術分野の当業者であれば、このような人為的な変更によって８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、最も具体的には９８％の相同性を維持する配列もまた使用できることは自明である。
本発明の具体的な一実施例では、Ｍｆｎ１/２の減少が体細胞のリプログラミングに寄与するか否かを確認するために、アルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）染色により分析した結果、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、マウス（図6A）及びヒト細胞システム（図6B）において、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合に比べてリプログラミングされた細胞数が著しく増加したことが確認された。また、マウスにおいてもｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、対照群ｓｈＲＮＡを処理した場合に比べてリプログラミングにかかる所要時間が短縮されることが確認された（図6G）。
また、分化条件である非条件培地（ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＵＭ）を使用した培養条件の下、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ｈＥＳＣ）では分化が起きていたが、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制したｈＥＳＣでは、未分化状態が維持された（図6C）。また、ＵＭ培養条件の下、ｈＥＳＣｓにおいてＭｆｎ１及び２が抑制されている間に、Ｏｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連マーカーの発現が維持されていた（図6D及び７）。
さらに、Ｍｆｎ１及び２を遺伝的除去により完全に抑制した場合、正常なマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＭＥＦｓ）に比べてリプログラミング効率が著しく高く（図6E）、ミトコンドリアは断片化された形態（図6F）を示した。特に、Ｍｆｎ１-/-（Ｍｆｎ１-ＫＯ）では、ＷＴに比べて約５００倍以上、Ｍｆｎ２-/-（Ｍｆｎ２-ＫＯ）では約２００倍以上、ＡＰ+コロニー数が著しく増加したことが確認されたことから（図6E）、Ｍｆｎ１及び２の除去により体細胞のリプログラミング効率が著しく増加されることができることが確認された。しかし、このような効果は、ミトコンドリア分裂阻害剤であるＭｄｉｖｉ１の処理によって抑制されることが確認された（図6E及び6F）。
よって、ミトコンドリアの構造タンパク質であるＭｆｎを抑制又は遺伝的に除去すると、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されることが分かった。
本発明のおける用語「マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤」とは、前記マイトフュージンの発現を減少させる物質を総称するものであり、より具体的には、マイトフュージンの発現を転写レベル又はタンパク質レベルで減少させる全ての物質を含むことができる。
前記マイトフュージンの発現を抑制する物質は、マイトフュージンを標的にしてマイトフュージンの発現又は活性を抑制できる化合物、核酸、ペプチド、ウイルス又は前記核酸を含むベクターなどその形態に限定されることなく使用可能である。具体的には、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤は、マイトフュージン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡからなる群より選択される１つ以上であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記マイトフュージン遺伝子の発現を抑制すると、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されるため、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率を増加させる用途として使用することができる。
本発明の具体的な一実施例では、Ｍｆｎ１/２の減少が体細胞のリプログラミングに寄与するか否かを確認するために、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合に比べてリプログラミング効率が著しく増加したことが確認された（図6A及び6B）。また、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制させたｈＥＳＣｓでは、ＵＭ培養条件下で未分化状態が維持された（図6C）。また、ＵＭ培養条件の下、ｈＥＳＣｓにおいてＭｆｎ１及び２が抑制されている間に、Ｏｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連マーカーの発現が維持されていた（図6D及び７）。
また、具体的には、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤は、マイトフュージンのプロモーター活性を抑制するものであってもよく、その例として、ピセアタンノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ)、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４-ピリミジニル)-１-ピペリジニル]プレグナ-１,４,９[１１]- トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ)、パルミチン酸レチニル（ｒｅｔｉｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）及びＤ-α-トコフェリルキノン（Ｄ-α-Ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌｑｕｉｎｏｎｅ）からなる群より選択される１種以上であってもよいが、マイトフュージン遺伝子の発現を阻害し、分化した細胞をリプログラミングさせ得る物質であれば、限定されることなく含むことができる。マイトフュージンのプロモーター活性を抑制すると、マイトフュージン遺伝子の発現が抑制され、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率が著しく増加し全分化能が維持されるため、前記マイトフュージンのプロモーター活性抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング効率を増加させる用途として使用することができる。
本発明の具体的な一実施例では、８４個の酸化還元ライブラリーの化合物を用いてマウス又はヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を変化させ得る化学物質をスクリーニングした結果、マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させる上位３つの化合物（ピセアタンノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ）、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）及び２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４-ピリミジニル)-１-ピペリジニル]プレグナ-１,４,９[１１]- トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ、Ｕ７４３８９Ｇ ｍａｌｅａｔｅ））と、増加させる上位２つの化合物（タンシノンＩＩＡ、テルビナフィン塩酸塩）の新たな用途を解明した（図１2D）。前記マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を抑制する化合物はマウスだけでなく、ヒト体細胞のリプログラミング効率も増加させ（図１2F及び１3A）、マウスＥＳＣｓ（図１2G）と、ヒトＥＳＣｓ（図１3B）の未分化状態を維持させることが確認された。
また、ヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を最もよく抑制する３つの化合物（Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩、パルミチン酸レチニル及びＤ-α-トコフェリルキノン）の新たな用途を解明した（図１2H）。Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩は、マウスとヒト細胞の両方でＭｆｎ１のプロモーター活性を抑制させることが確認された。
よって、Ｍｆｎ１又は２の抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを著しく促進し、全分化能を維持させるので、従来のリプログラミング条件に比べて著しく改善されたことが分かった（図１４）。
また、本発明のリプログラミング促進用組成物は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを促進できるものであれば、様々な濃度で前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤を含んでもよく、具体的には１ｎＭ以上、１００μＭ以下、より具体的には１０ｎＭ以上、１０μＭ以下の濃度で含んでもよい。
本発明の具体的な一実施例では、マウス及びヒトＭｆｎ１のプロモーターレポーター（ジーンコピア、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）細胞を、それぞれＭｆｎ１-/-ＭＥＦｓと２９３Ｔ細胞を用いて作製し、８４個の化合物を含むＳｃｒｅｅｎ-ＷｅｌｌＴＭＲＥＤＯＸライブラリーを１０μＭの濃度で４８時間処理した。その結果、ピセアタンノール、テトラメチルピラジン及びＵ７４３８９Ｇマレイン酸塩は、マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させ（図１2D）、Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩、パルミチン酸レチニル及びＤ-α-トコフェリルキノンは、ヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させることが確認された（図１2H）。
よって、前記濃度範囲でマイトフュージンのプロモーター活性抑制剤を処理した場合、リプログラミング効率が著しく増加したことから、従来のリプログラミング条件に比べて著しく改善されたことが分かった。
本発明における用語「マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤」とは、前記マイトフュージンタンパク質の活性を減少させる物質を称する意味として使用されており、具体的には、マイトフュージン遺伝子から発現するタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。このような抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体又は抗原結合性を持つものであれば、前記抗体の断片も本発明の抗体に含まれる。
さらに、本発明の抗体には、ヒト化抗体などの特殊抗体及びヒト抗体なども含み、新規抗体の他に、既に該技術分野に公知の抗体も含むことができる。前記抗体は、マイトフュージン遺伝子から発現するタンパク質を特異的に認識して結合する特性を持つものであれば、２つの重鎖と２つの軽鎖の全体の長さを持つ完全な形態のものだけでなく、抗体分子の機能的な断片をも含む。機能的な抗体分子の断片とは、少なくとも抗原結合機能を保持する断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ')、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖなどがあるが、これらに限定されるものではない。
本発明における用語「分化」とは、細胞が分裂して増殖し、全体の個体が成長する間に細胞の構造や機能が特殊化される現象を意味する。すなわち、生物の細胞、組織などが、それぞれの与えられた役割を全うするために適合する形態及び機能に変化する過程を言い、例えば、胚性幹細胞のような全分化能幹細胞が外胚葉、中胚葉及び内胚葉細胞に変化していく過程のみならず、造血母細胞から赤血球、白血球、血小板などに変化する過程、すなわち、前駆細胞が特定の分化形質を発現するのも全て分化に含まれ得る。
本発明における用語「分化した細胞」とは、前記分化過程が進み、一定の形態及び機能を持つようになった細胞を意味する。本発明の分化した細胞は、特に限定されるものではないが、具体的には、生殖細胞、体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ）又は前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ）であってもよい。その例として、ヒト由来の細胞であってもよいが、様々な個体由来の細胞もまた本発明の範囲内に属する。
また、本発明の分化した細胞には、生体内又は生体外の分化した細胞を全て含んでもよく、ヒトを除いた動物の分化した細胞であってもよく、生体から分離した分化細胞であってもよい。
前記「体細胞」とは、生殖細胞を除いた動・植物を構成する分化が完了した全ての細胞を意味し、「前駆細胞」とは、子孫に該当する細胞が特定分化形質を発現することが明らかになった場合、分化形質を発現しないが、その分化運命（ｆａｔｅ）を有する親細胞を意味する。例えば、神経細胞（ニューロン）に対しては、神経芽細胞（ニューロン幹細胞）が前駆細胞に該当し、筋管細胞に対しては、筋芽細胞が前駆細胞に該当する。
本発明における用語「全分化能又は多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」とは、個体における全ての組織の細胞に分化できる全分化能又は多能性であり、自己再生能力を有する幹細胞を意味する。その例として、胚性幹細胞と人工多能性幹細胞を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の全分化能幹細胞は、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどの全てに由来する全分化能幹細胞を含んでもよく、具体的には、ヒト由来の全分化能幹細胞であってもよい。
前記「人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）」とは、分化した細胞を、人為的なリプログラミング過程によって全分化能を持つように誘導した細胞を意味する。人為的なリプログラミング過程は、レトロウイルス及びレンチウイルスを用いたウイルスを介したり、又は非ウイルス性ベクターを利用、タンパク質及び細胞抽出物などを利用する非ウイルスを介したリプログラミング因子の導入によって行ったり、幹細胞の抽出物、化合物などによるリプログラミング過程を含むことができる。人工多能性幹細胞は、胚性幹細胞とほとんど同じ特性を持つ。具体的には、類似した細胞の形態を示し、遺伝子及びタンパク質の発現パターンが類似しており、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）において全分化能を有し、テラトーマ（ｔｅｒａｔｏｍａ）を形成し、マウスの胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔ）に挿入した場合、キメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）マウスを形成でき、遺伝子のジャームライン・トランスミッション（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が可能である。本発明の人工多能性幹細胞は、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどの全てに由来する人工多能性幹細胞を含んでもよく、具体的には、ヒト由来の人工多能性幹細胞であってもよい。
本発明における用語「胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣ）」とは、受精卵が母体の子宮に着床する直前である胞胚期の胚芽から、内部細胞塊（ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）を抽出して体外で培養したもので、個体の全ての組織の細胞に分化できる全分化能を有し、自己再生能力を有する細胞を意味し、胚性幹細胞由来の胚様体（ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｉｅｓ）をも含んでもよい。本発明の胚性幹細胞としては、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス、ウサギなどの全てに由来する胚性幹細胞を含んでもよく、具体的には、ヒト由来の胚性幹細胞であってもよい。
本発明における用語「脱分化（ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」とは、分化した細胞が新たな類型へ分化する潜在力を持つ状態に戻るプロセスを意味する。また、前記脱分化は、本発明で細胞リプログラミング（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）と同じ意味として使用され得る。このような細胞のリプログラミング機構は、核内における後成遺伝学（ヌクレオチド配列の変化を伴わない機能的な面における遺伝的変化をもたらすことに関連したＤＮＡ状態）的マークが削除された後、相違するセットの後成遺伝学的マークを樹立することを意味し、相違する細胞及び組織は、多細胞生物が分化及び成長する間に相違する遺伝子発現のプログラムを獲得することになる。
本発明における用語「リプログラミングの促進」とは、リプログラミングが行われる過程において、リプログラミング過程が迅速に行われたり、リプログラミング効率を増加させることを意味し、リプログラミング効率の速度又は比率の面において向上するという意味を含むことができる。
本発明の具体的な一実施例では、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合に比べてリプログラミング効率が著しく増加したことが確認された（図6A及び6B）。また、Ｍｆｎ１及び２を遺伝的除去によって完全に抑制した場合には、正常なマウス胚性線維芽細胞に比べて非常に高いリプログラミング効率（図6E）及びミトコンドリアが断片化された形態（図6F）を示した。特に、Ｍｆｎ１-/-（Ｍｆｎ１-ＫＯ）は、ＷＴに比べて約５００倍以上、Ｍｆｎ２-/-（Ｍｆｎ２-ＫＯ）は約２００倍以上、ＡＰ+コロニー数が増加したことが確認されたことから（図6E）、Ｍｆｎ１及び２の除去により体細胞のリプログラミング効率が著しく増加したことが分かった。
結果的に、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を含む組成物を用いてリプログラミングが効果的、かつ迅速に行われるようにすることができ、前記組成物を用いて製造された全分化能（人工多能性）幹細胞が正常に全分化能を獲得することが確認された。
具体的には、本発明のリプログラミング促進用組成物は、培養培地又は培養培地の添加剤の形態であってもよい。よって、本発明の組成物には、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを妨害しないものであれば、一般的に細胞培養培地に含まれる物質をさらに含んでもよい。
また、本発明において、分化した細胞から全分化能を有する幹細胞へのリプログラミングを促進する組成物には、１つ以上のリプログラミング因子を含んでもよい。
本発明における用語「リプログラミング因子」とは、最終的に分化した細胞が新たな類型に分化する潜在力を持つ全分化能幹細胞へとリプログラミングするように誘導する物質である。本発明において、前記リプログラミング因子は、リプログラミングの誘導因子と混用して使用してもよい。前記リプログラミング因子は、最終的に分化した細胞のリプログラミングを誘導する物質であれば、限定されることなく含むことができ、分化させる細胞の種類によって選択してもよい。これらに限定されるものではないが、具体的には、リプログラミングの誘導因子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ-２８及びＲｅｘ１からなる群より選択されるタンパク質又はこれらのタンパク質をコードする核酸分子をさらに含んでもよい。
本発明における用語「タンパク質をコードする核酸分子」とは、細胞内に伝達されると、それ自体が該タンパク質を発現できるようにプロモーターなどに作動可能に連結された形態であってもよく、また、細胞内の染色体に挿入されて該タンパク質を発現できる核酸分子をも幅広く含む。例えば、リプログラミングの誘導因子としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ-２８及びＲｅｘ１からなる群より選択されるいずれか１つ以上のタンパク質をコードする核酸分子が発現ベクター内で作動可能に連結されて細胞内に伝達されることができ、宿主細胞の染色体内に挿入されるという形で細胞内に伝達され得る。
本発明の具体的な一実施例では、リプログラミングの誘導因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｋｌｆ４及びｃ-Ｍｙｃをコードするレトロウイルスの１ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、感染多重度）を体細胞に感染させて形質導入することで、マウス又はヒト線維芽細胞のリプログラミングを誘導した(実験例３)。
前記組成物は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを促進するのに充分な量で含んでもよい。
本発明の他の一態様は、マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、未分化状態の全分化能幹細胞の維持及び培養用の培地組成物を提供する。本発明において、前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤又はマイトフュージンタンパク質の活性抑制剤は、全分化能幹細胞を未分化状態に維持する機能を含むことができるので、前記組成物に使用することができる。一方、本発明の全分化能幹細胞の維持及び培養用の培地組成物は、未分化状態の維持/培養を妨害しない限り、一般的に細胞培養培地に含まれる物質をさらに含んでもよい。
前記「マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤」、「マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤」、「全分化能幹細胞」とは、前述のとおりである。
本発明の具体的な一実施例では、ＵＭを用いた培養条件の下、ｈＥＳＣｓでは分化が起きているが、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制したｈＥＳＣｓでは、未分化状態が維持されることが確認された（図6C）。また、ＵＭ培養条件の下、ｈＥＳＣｓにおいてＭｆｎ１及び２が抑制されている間に、Ｏｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連マーカーの発現が維持されることが確認された（図6D及び７）。これらのことから、マイトフュージンを抑制又は遺伝的に除去すると、未分化状態の全分化能幹細胞が維持されることが分かった。
本発明のさらに他の一態様は、（ａ）分化した細胞に１つ以上のリプログラミング因子を伝達する段階；及び（ｂ）分化した細胞を前記リプログラミング促進用組成物を含有する培地で培養する段階を含む、分化した細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞への製造方法を提供する。本発明の分化した細胞において、マイトフュージンを抑制してリプログラミングされた全分化能幹細胞を製造する方法は、既存のリプログラミングされた全分化能幹細胞を製造する方法に比べて、リプログラミングされた細胞数が著しく増加し、リプログラミングにかかる所要時間が大幅に短縮されるため、リプログラミング効率が著しく増加する。
前記「分化した細胞」、「リプログラミング因子」及び「全分化能幹細胞」とは、前述のとおりである。
前記（ａ）段階のリプログラミング因子を分化した細胞に伝達する方法は、当業界で通常使用される細胞に核酸分子又はタンパク質を提供する方法を限定されることなく使用することができ、具体的には、リプログラミング因子を分化した細胞の培養液に投与する方法、リプログラミング因子を分化した細胞に直接注入する方法又はリプログラミング因子の遺伝子を挿入したウイルスベクターでトランスフェクションしたパッケージング細胞から取得したウイルスを用いて分化した細胞に感染させる方法を使用することができる。
前記ウイルスベクターは、レトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ、ＨＩＶ）、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）、トリ肉腫・白血病ウイルス（Ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ/ｌｅｕｋｏｓｉｓ、ＡＳＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（Ｓｐｌｅｅｎ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ、ＳＮＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ、ＲＳＶ）、マウス乳がんウイルス（Ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ、ｍＭＴＶ）など、レンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、アデノ関連ウイルス（Ａｄｅｎｏ-ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、単純ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）などに由来するベクターを含むことができ、これらに限定されるものではないが、具体的には、レトロウイルスベクターを使用することができ、より具体的には、レトロウイルスベクターであるｐＭＸｓを使用することができる。
前記リプログラミング因子を分化した細胞に直接注入する方法は、当業界に公知の任意の方法を選択して使用することができ、これらに限定されるものではないが、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、直接筋肉に注入する方法、インシュレーター（ｉｎｓｕｌａｔｏｒ）及びトランスポゾンを用いた方法の中から適宜選択して適用することができる。
また、前記（ａ）及び（ｂ）の段階は、同時、順次又は逆順に行うことができ、前記方法は、段階（ｂ）より得られた培養物から胚性幹細胞様コロニーを分離する段階をさらに含むことができる。
また、具体的には、前記分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングは、分化した細胞に比べてリプログラミングされた細胞において解糖作用の副産物である乳酸産生が増加したり、Ｒａｓ-Ｒａｆ-ＨＩＦ１αシグナルが活性化されたり、酸素消費量が減少したり、又はリプログラミングの誘導時間の短縮及びリプログラミングされた細胞数の増加によりリプログラミング効率が増加され得る。
本発明の具体的な一実施例では、解糖作用に関与する主な酵素をエンコードする遺伝子の発現及び解糖作用の各段階における代謝物の相対的な量は、対照群に比べてＭｆｎ１及び２の抑制細胞において著しく増加したことが確認されており（図8A及び8B）、細胞内の乳酸産生も増加したことが確認された（図8C）。
また、リプログラミングの初期段階の間、Ｍｆｎ１/２及びｐ５３/２１機構における相互抑制は、Ｒａｓ-Ｒａｆシグナルを活性化させ、これは、連続的にＨＩＦ１αの安定化をもたらすので（図10F）、効率的なリプログラミングを可能にする低酸素条件を模倣できることが確認された。また、低酸素条件下で、ｉＰＳＣの発生が著しく増加したことが確認されており（図１2A）、ＨＩＦ１αとＬＤＨＡタンパク質の発現増加との相関性が確認された（図１2B）。同じ条件の下、Ｍｆｎ１のプロモーター活性は、著しく減少し（図１2C）、Ｍｆｎ１及び２タンパク質の発現も著しく減少した（図１2B）。
本発明のさらに他の一態様は、前記分化した細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞への製造方法により製造された全分化能幹細胞を提供する。具体的には、前記全分化能幹細胞は人工多能性幹細胞であってもよい。
前記「全分化能幹細胞」及び「人工多能性幹細胞」は、前述のとおりである。
本発明の具体的な一実施例では、本発明における極めて高いリプログラミング効率を持つ全分化能幹細胞の製造方法によって、マウス及びヒト線維芽細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞を取得した（図6A、6B、6E）。
本発明のさらに他の一態様は、分離した分化細胞におけるマイトフュージン遺伝子の発現又はタンパク質の活性を抑制する段階を含む、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング方法を提供する。具体的には、前記分離した分化細胞におけるマイトフュージン遺伝子の発現又はタンパク質の活性を抑制する段階は、前記リプログラミング促進用組成物を分化した細胞に処理することにより行うことができる。
前記「分化した細胞」、「マイトフュージン遺伝子の発現」、「タンパク質活性の抑制」、「全分化能幹細胞」及び「リプログラミング」とは、前述のとおりである。
本発明のさらに他の一態様は、前記リプログラミング方法により製造された全分化能幹細胞を提供する。具体的には、前記全分化能幹細胞は人工多能性幹細胞あってもよい。
前記「全分化能幹細胞」及び「人工多能性幹細胞」とは、前述のとおりである。
本発明のさらに他の一態様は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物を製造するためのマイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物の用途を提供する。具体的には、前記全分化能幹細胞は人工多能性幹細胞であってもよい。
前記「全分化能幹細胞」、「人工多能性幹細胞」、「分化した細胞」、「マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤」、「マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤」及び「リプログラミング」とは、前述のとおりである。
以下、本発明の理解を助けるために、実施例などを挙げて詳細に説明する。しかし、本発明による実施例は、様々な他の形態に変更してもよいが、本発明の範囲が下記実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。本発明の実施例は、当業界で平均的な知識を持つ者に本発明をより正確に説明するために提供されるものである。
実験例１．試薬
Ｍｄｉｖｉ１、２- デオキシ-Ｄ-グルコース（２-ｄｅｏｘｙ-Ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ、２-ＤＧ）及び遺伝子抑制のためのそれぞれのｓｈＲＮＡを発現させるレンチウイルスベクターをシグマ社（ＳＩＧＭＡ）より購入した。マイトフュージン１又は２（Ｍｆｎ１/２）の抑制のためのｓｉＲＮＡはダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）より購入した。Ｎｕｔｌｉｎ３ａはケイマンケミカル社（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）より購入した。Ａ Ｓｃｒｅｅｎ-ＷｅｌｌＴＭ ＲＥＤＯＸライブラリーはエンゾライフサイエンス社（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より購入した。本発明で使用したＭｆｎ１/２の抑制のためのｓｈＲＮＡ（ｓｈＭｆｎ１又はｓｈＭｆｎ２）の塩基配列及びＭｆｎ１/２の抑制のためのｓｉＲＮＡ（ｓｉＭｆｎ１又はｓｉＭｆｎ２）の塩基配列を下記表１に示した。
実験例１．試薬
Ｍｄｉｖｉ１、２- デオキシ-Ｄ-グルコース（２-ｄｅｏｘｙ-Ｄ-ｇｌｕｃｏｓｅ、２-ＤＧ）及び遺伝子抑制のためのそれぞれのｓｈＲＮＡを発現させるレンチウイルスベクターをシグマ社（ＳＩＧＭＡ）より購入した。マイトフュージン１又は２（Ｍｆｎ１/２）の抑制のためのｓｉＲＮＡはダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）より購入した。Ｎｕｔｌｉｎ３ａはケイマンケミカル社（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ）より購入した。Ａ Ｓｃｒｅｅｎ-ＷｅｌｌＴＭ ＲＥＤＯＸライブラリーはエンゾライフサイエンス社（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）より購入した。本発明で使用したＭｆｎ１/２の抑制のためのｓｈＲＮＡ（ｓｈＭｆｎ１又はｓｈＭｆｎ２）の塩基配列及びＭｆｎ１/２の抑制のためのｓｉＲＮＡ（ｓｉＭｆｎ１又はｓｉＭｆｎ２）の塩基配列を下記表１に示した。
実験例２．マウス及び細胞培養
全ての動物実験のプロトコールは、ＫＲＩＢＢの生命倫理委員会の承認を受けた。ＷＴ、ｐ５３欠損（ｐ５３-/-）及びｐ２１欠損（ｐ２１-/-）マウス（Ｔｈｅ ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から得られた１２．５日目の胚芽からマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＭＥＦｓ）を分離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのβ-メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持させた。マウス胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣ）ラインＪ１（ＡＴＣＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）ラインを１５％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ-グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１％ペニシリン/ストレプトマイシン及び１,０００Ｕ/ｍＬのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、γ-照射したＭＥＦｓ又はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたプレートで維持させた。培養培地は、二日に一回培地交換した。ヒトＨ９ ＥＳＣライン（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、γ-照射したＭＥＦｓ上でｈＥＳＣｓの培養培地（分化条件、ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＵＭ）で培養したり、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングしたプレートでＭＥＦ-ＣＭ（未分化条件、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭ）培養培地で維持させた。培養培地は毎日培地交換し、細胞は５〜６日ごとにＩＶ型コラゲナーゼ（１ｍｇ/ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はディスパーゼ（１ｍｇ/ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理して継代した。ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦｓ；ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭのＬ-グルタミン及び０．１ｍＭのβ-メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭで培養した。
実験例３．ウイルス産生及びｉＰＳＣ作製
リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＧＰ２-２９３パッケージング細胞を、Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ-Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ、Ａｄｄｇｅｎｅ）のヒトｃＤＮＡｓを含むｐＭＸベクター及びＶＳＶ-Ｇエンベロープベクターに一緒に感染させた。ウイルスを含む上清液を感染後の４８及び７２時間後に回収し、超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により２５,０００ｒｐｍで９０分間濃縮した。ｉＰＳＣ作製のために、形質導入の前日、６ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞にＭＥＦｓを播種し、その後、ポリブレン（８μｇ/ｍＬ）の存在下で１ＭＯＩに濃縮したウイルスをＭＥＦｓに導入した。導入４日後にＭＥＦｓをトリプシン処理し、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングした１２ウェルプレートにウェル当たり３×１０４密度で再び播種した。次の日にマウスＥＳＣ培地に培地交換し、その後は培地を２日に１回培地交換した。
実験例４．アルカリホスファターゼ染色
アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）キットを使用してプロトコール（ＳＩＧＭＡ）に従って行った。細胞をクエン酸塩-アセトン-ホルムアルデヒド溶液で３０秒間固定し、暗条件で１５分間ＡＰ染色溶液（ナフトール/ファストレッドバイオレット）で染色した。ＡＰ+細胞のイメージをＨＰ Ｓｃａｎｊｅｔ Ｇ４０１０（Ｈｅｗｌｅｔｔ-Ｐａｃｋａｒｄ）より得た。
実験例５．ＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲ及びマイクロアレイ解析
トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して細胞から分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、プロトコールに従い逆転写した。７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＦａｓｔ ＳＹＢＲ(R) Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量的リアルタイムＰＣＲを行った。本発明で使用したプライマーのシークエンスを下記表２に示した。トランスクリプトーム解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４４ｋアレイにより行った。
全ての動物実験のプロトコールは、ＫＲＩＢＢの生命倫理委員会の承認を受けた。ＷＴ、ｐ５３欠損（ｐ５３-/-）及びｐ２１欠損（ｐ２１-/-）マウス（Ｔｈｅ ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から得られた１２．５日目の胚芽からマウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＭＥＦｓ）を分離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのβ-メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ）及び１％ペニシリン/ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で維持させた。マウス胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＥＳＣ）ラインＪ１（ＡＴＣＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ｉＰＳＣ）ラインを１５％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１％Ｌ-グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭのβ-メルカプトエタノール、１％ペニシリン/ストレプトマイシン及び１,０００Ｕ/ｍＬのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において、γ-照射したＭＥＦｓ又はＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングしたプレートで維持させた。培養培地は、二日に一回培地交換した。ヒトＨ９ ＥＳＣライン（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、γ-照射したＭＥＦｓ上でｈＥＳＣｓの培養培地（分化条件、ｕｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＵＭ）で培養したり、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングしたプレートでＭＥＦ-ＣＭ（未分化条件、ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ ｍｅｄｉｕｍ、ＣＭ）培養培地で維持させた。培養培地は毎日培地交換し、細胞は５〜６日ごとにＩＶ型コラゲナーゼ（１ｍｇ/ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はディスパーゼ（１ｍｇ/ｍＬ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を処理して継代した。ヒト包皮線維芽細胞（ｈＦＦｓ；ＡＴＣＣ）を１０％ＦＢＳ、１％ＮＥＡＡ、１ｍＭのＬ-グルタミン及び０．１ｍＭのβ-メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭで培養した。
実験例３．ウイルス産生及びｉＰＳＣ作製
リポフェクタミン２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＧＰ２-２９３パッケージング細胞を、Ｏｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ-Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ、Ａｄｄｇｅｎｅ）のヒトｃＤＮＡｓを含むｐＭＸベクター及びＶＳＶ-Ｇエンベロープベクターに一緒に感染させた。ウイルスを含む上清液を感染後の４８及び７２時間後に回収し、超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により２５,０００ｒｐｍで９０分間濃縮した。ｉＰＳＣ作製のために、形質導入の前日、６ウェルプレートにウェル当たり１×１０５細胞にＭＥＦｓを播種し、その後、ポリブレン（８μｇ/ｍＬ）の存在下で１ＭＯＩに濃縮したウイルスをＭＥＦｓに導入した。導入４日後にＭＥＦｓをトリプシン処理し、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングした１２ウェルプレートにウェル当たり３×１０４密度で再び播種した。次の日にマウスＥＳＣ培地に培地交換し、その後は培地を２日に１回培地交換した。
実験例４．アルカリホスファターゼ染色
アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＰ）キットを使用してプロトコール（ＳＩＧＭＡ）に従って行った。細胞をクエン酸塩-アセトン-ホルムアルデヒド溶液で３０秒間固定し、暗条件で１５分間ＡＰ染色溶液（ナフトール/ファストレッドバイオレット）で染色した。ＡＰ+細胞のイメージをＨＰ Ｓｃａｎｊｅｔ Ｇ４０１０（Ｈｅｗｌｅｔｔ-Ｐａｃｋａｒｄ）より得た。
実験例５．ＲＮＡ抽出、リアルタイムＰＣＲ及びマイクロアレイ解析
トータルＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して細胞から分離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ-Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓシステムキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、プロトコールに従い逆転写した。７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＦａｓｔ ＳＹＢＲ(R) Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量的リアルタイムＰＣＲを行った。本発明で使用したプライマーのシークエンスを下記表２に示した。トランスクリプトーム解析は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ ４４ｋアレイにより行った。
実験例６．メタボローム解析
細胞を５％マンニトール溶液（Ｗａｋｏ）で洗浄し、内部の標準物質を含むメタノール（Ｗａｋｏ）を用いてスクラップ（ｓｃｒａｐ）した。その後、３２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して水層を分離した。代謝物抽出物を９１００ｇで２．５時間、５ｋＤａ-ｃｕｔｏｆｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて分離した後、遠心蒸発濃縮機（ＳＣＡＮＶＡＣ）を使用して蒸発させ、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロトコールに従い、ＣＥ-ＴＯＦＭＳによりメタボローム解析を行った。
実験例７：乳酸及びＡＴＰ解析
製造業者のプロトコールに従い、Ｌａｃｔａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてタンパク質１０μｇから細胞内の乳酸含有量を定量した。ＡＤＰ/ＡＴＰ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ(Ａｂｃａｍ)を用いてタンパク質０．１μｇからＡＴＰを測定した。発光強度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。
実験例８．ミトコンドリアの染色
細胞を常温で１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定した後、-２０℃で１５分間メタノールで固定し、０．３％トリトンＸ-１００を含有するＰＢＳで３０分間処理することで透過性を高めた後、４％ＢＳＡ用いて常温で２時間ブロッキングした。試料は、ブロッキングバッファーで希釈した抗Ｔｏｍ２０抗体で４℃で一晩染色した。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ４８８が結合した２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて常温で４５分間染色した。核を１０μｇ/ｍＬのＤＡＰＩにより対比染色した。生細胞のイメージングのために、細胞を２００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ(R) Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で３０分間培養した。蛍光イメージをＩＸ５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）又はＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて分析した。前記分析に使用された抗体を表３に示した。
細胞を５％マンニトール溶液（Ｗａｋｏ）で洗浄し、内部の標準物質を含むメタノール（Ｗａｋｏ）を用いてスクラップ（ｓｃｒａｐ）した。その後、３２００ｒｐｍで１０分間遠心分離して水層を分離した。代謝物抽出物を９１００ｇで２．５時間、５ｋＤａ-ｃｕｔｏｆｆ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ ｔｉｐｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて分離した後、遠心蒸発濃縮機（ＳＣＡＮＶＡＣ）を使用して蒸発させ、Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のプロトコールに従い、ＣＥ-ＴＯＦＭＳによりメタボローム解析を行った。
実験例７：乳酸及びＡＴＰ解析
製造業者のプロトコールに従い、Ｌａｃｔａｔｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）を用いてタンパク質１０μｇから細胞内の乳酸含有量を定量した。ＡＤＰ/ＡＴＰ Ｒａｔｉｏ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ(Ａｂｃａｍ)を用いてタンパク質０．１μｇからＡＴＰを測定した。発光強度をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。
実験例８．ミトコンドリアの染色
細胞を常温で１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定した後、-２０℃で１５分間メタノールで固定し、０．３％トリトンＸ-１００を含有するＰＢＳで３０分間処理することで透過性を高めた後、４％ＢＳＡ用いて常温で２時間ブロッキングした。試料は、ブロッキングバッファーで希釈した抗Ｔｏｍ２０抗体で４℃で一晩染色した。洗浄後、細胞をＡｌｅｘａ４８８が結合した２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて常温で４５分間染色した。核を１０μｇ/ｍＬのＤＡＰＩにより対比染色した。生細胞のイメージングのために、細胞を２００ｎＭのＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ(R) Ｒｅｄ ＣＭＸＲｏｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて３７℃で３０分間培養した。蛍光イメージをＩＸ５１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）又はＡｘｉｏｖｅｒｔ２００Ｍ顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて分析した。前記分析に使用された抗体を表３に示した。
実験例９．細胞分離及びミトコンドリアの形態分析
リプログラミングの培養１１日目に、単一細胞の懸濁液を抗-Ｔｈｙ１-ＰＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて常温で２０分間標識した後、抗-ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に、４℃で１５分間培養し、ＭＡＣＳ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により分離した。Ｔｈｙ１-陰性集団を抗-ＳＳＥＡ１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて常温で２０分間標識し、ＭＡＣＳにより分離した。分離した集団の純度を高めるために、２つの分離カラムを連続的に使用した。分離した細胞をＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングした１２ウェルプレートにウェル当たり３×１０４細胞の密度に再び分注したり、ミトコンドリア分離に使用した。再播種の３日後に、ミトコンドリアを蛍光顕微鏡の下でＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色により可視化し、分裂/中間状態/融合などが観察されたミトコンドリアの形態によって細胞数を係数した。分離したサブグループ当たり３０個以上の細胞をスコア化した。
実験例１０：ミトコンドリアの分離及びウェスタンブロッティング解析
ミトコンドリア分離キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＭＡＣＳにより分離した各サブグループからミトコンドリアを分離した。ウェスタンブロッティング解析のために、全細胞溶解物をＲＩＰＡバッファーを用いて回収し、タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレーン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気移動させた。使用した抗体は表２に示した。
実験例１１．プロモーター解析及び化学物質のスクリーニング
マウス及びヒトＭｆｎ１のプロモーターレポーター（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）細胞を、それぞれＭｆｎ１-/-ＭＥＦｓと２９３Ｔ細胞（ヒト胎児由来腎臓上皮細胞）を用いて作製し、８４個の化合物を含むＳｃｒｅｅｎ-ＷｅｌｌＴＭ ＲＥＤＯＸライブラリーを１０ｎＭ〜１０μＭの濃度で４８時間処理した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダーを利用し、Ｓｅｃｒｅｔｅ-ＰａｉｒＴＭＤｕａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ及びＧａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）により培養上清液におけるＭｆｎ１のプロモーター活性を測定した。
実験例１２．統計
データを平均±標準誤差（ｎ＝３）で表した。２つのグループ間の比較を測定するために、Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ-ｔｅｓｔを適用した。ｐ＜０．０５値を有意差のあるものとして見なした。
リプログラミングの培養１１日目に、単一細胞の懸濁液を抗-Ｔｈｙ１-ＰＥ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて常温で２０分間標識した後、抗-ＰＥマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）と共に、４℃で１５分間培養し、ＭＡＣＳ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）により分離した。Ｔｈｙ１-陰性集団を抗-ＳＳＥＡ１マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて常温で２０分間標識し、ＭＡＣＳにより分離した。分離した集団の純度を高めるために、２つの分離カラムを連続的に使用した。分離した細胞をＭａｔｒｉｇｅｌＴＭでコーティングした１２ウェルプレートにウェル当たり３×１０４細胞の密度に再び分注したり、ミトコンドリア分離に使用した。再播種の３日後に、ミトコンドリアを蛍光顕微鏡の下でＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色により可視化し、分裂/中間状態/融合などが観察されたミトコンドリアの形態によって細胞数を係数した。分離したサブグループ当たり３０個以上の細胞をスコア化した。
実験例１０：ミトコンドリアの分離及びウェスタンブロッティング解析
ミトコンドリア分離キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いてＭＡＣＳにより分離した各サブグループからミトコンドリアを分離した。ウェスタンブロッティング解析のために、全細胞溶解物をＲＩＰＡバッファーを用いて回収し、タンパク質をＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分離し、ＰＶＤＦメンブレーン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に電気移動させた。使用した抗体は表２に示した。
実験例１１．プロモーター解析及び化学物質のスクリーニング
マウス及びヒトＭｆｎ１のプロモーターレポーター（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）細胞を、それぞれＭｆｎ１-/-ＭＥＦｓと２９３Ｔ細胞（ヒト胎児由来腎臓上皮細胞）を用いて作製し、８４個の化合物を含むＳｃｒｅｅｎ-ＷｅｌｌＴＭ ＲＥＤＯＸライブラリーを１０ｎＭ〜１０μＭの濃度で４８時間処理した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘマイクロプレートリーダーを利用し、Ｓｅｃｒｅｔｅ-ＰａｉｒＴＭＤｕａｌ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ及びＧａｕｓｓｉａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔｓ（Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａ）により培養上清液におけるＭｆｎ１のプロモーター活性を測定した。
実験例１２．統計
データを平均±標準誤差（ｎ＝３）で表した。２つのグループ間の比較を測定するために、Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ ｔ-ｔｅｓｔを適用した。ｐ＜０．０５値を有意差のあるものとして見なした。
実施例１．ｐ５３-/-及びｐ２１-/-体細胞のリプログラミングの初期におけるミトコンドリアの機能解析
アルカリホスファターゼ染色によりｉＰＳＣ生成のリプログラミング効率をｐ５３-/-及びｐ２１-/-マウス胚性線維芽細胞を用いて測定した結果、リプログラミング効率が増加した（図１A）。リプログラミングの初期段階〜７日まで（Ｄ７（７日目）；図１B）、正常対象群と比較した場合、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞で形態の変化と共に、細胞数の著しい増加が確認された（図１C）。リプログラミングの初期段階における根本的なメカニズムを確認するために、リプログラミング７日目におけるＷＴ、ｐ５３-/-、ｐ２１-/-ＭＥＦｓを用いてマイクロアレイに基づいたトランスクリプトーム及び質量分析法に基づいたトランスクリプトーム解析を行った。トランスクリプトーム解析によってリプログラミング段階の区別を可能にするマーカーの発現レベルを比較した結果（図2A）、リプログラミングされたｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞が、７日間リプログラミングの初期と成熟の中間段階にあることが分かった。
また、細胞成長、付着、ＲＮＡスプライシング及び細胞周期に関与する遺伝子セットの発現が著しく増加し、対照的に、分化関連の遺伝子は正常細胞に比べてｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングにおいて減少した（図2B）。しかし、中心炭素経路（ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｒｂｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）において、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミング過程における解糖作用では顕著な差が見られなかった（図１D及び2C）。また、解糖作用（Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）に関与する主な酵素をエンコードする遺伝子の発現は変化しなかったが、解糖作用の各段階における代謝物の相対的な量は、正常細胞に比べてｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミング中間物において減少した（図１D）。しかし、解糖作用の最終産物である細胞内における乳酸産生は、リプログラミングの後期には増加しており、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-によって促進され（図3A）、解糖系阻害剤である２-ＤＧによって細胞のリプログラミングが著しく減少した（図3B）。
対照的に、ミトコンドリアの機能に関与する遺伝子の発現は正常対照群に比べて、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの中間物において著しく抑制された。しかし、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）回路関連遺伝子の発現レベルは変化しなかった（図１E）。特に、ミトコンドリアによってエンコードされるＮＤ１(複合体I)及びＡｔｐ６ａｐ１（複合体VのＡＴＰ６のファミリー）を含む酸化的リン酸化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、ＯＸＰＨＯＳ）複合体サブユニットの発現は著しく減少した反面（図１F）、核によってエンコードされる遺伝子（複合体ＩＩのＳｄｈｂ、Ｕｑｃｒｃ１及び複合体VのＡＴＰ５のファミリー）は減少しなかった（図4A及び4B）。特に、Ｍｆｎ１/２及びＣｈｃｈｄ３のようなミトコンドリア結合遺伝子は、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの中間物において著しく減少した反面、Ｄｎｍ１、Ｄｎｍ１Ｌ（Ｄｒｐ１）、Ｆｉｓ１及びＭｆｆのような分裂遺伝子は増加するものの変化はなかった（図１E及び１F）。
また、ＡＤＰ/ＡＴＰ比（エネルギー転換指標）は、正常細胞に比べてｐ５３-/-細胞のリプログラミングの中間物において減少した（図4C）。これらの結果は、正常細胞に比べて、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの間における代謝過程が、ミトコンドリア依存から比依存的に迅速に転換することを意味する。
実施例２．ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞と、全分化能のリプログラミングの中間段階におけるミトコンドリア結合タンパク質の発現解析
リプログラミング後の７日目において、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞におけるリプログラミングの中間物では全分化能幹細胞の特徴である、ミトコンドリアが断片化された形態を示す反面、正常細胞におけるリプログラミングの中間物では観察されなかった（図5A）。リプログラミングの前に、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓ自体が正常ＭＥＦｓに比べて、ミトコンドリアが断片化された形態を示し（図5B）、細胞成長は増加したことが確認された（図5C）。正常なＭＥＦｓ、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓと、人工多能性幹細胞[ＰＳＣｓ（ＥＳＣｓ及びｉＰＳＣｓ）]間においてミトコンドリア構造関連タンパク質の発現に大きな差が見られた。サイクリンＢ１依存性Ｄｒｐ１のリン酸化及びＤｒｐ１タンパク質の発現は、ＷＴのＭＥＦｓよりｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓと、ＰＳＣｓでより高かったが、反対に、Ｍｆｎ１及び２の発現は、ＷＴのＭＥＦｓよりｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓと、ＰＳＣｓにおいて著しく低かった（図5D）。全分化能の誘導と、ミトコンドリアダイナミックス間の関連性を解明するために、リプログラミング後の１１日目にＭＡＣＳによって体細胞のマーカーであるＴｈｙ１及び初期段階の全分化能のマーカーであるＳＳＥＡ１の発現を基に、リプログラミングの中間物を分離した（図5E）。Ｔｈｙ１+/ＳＳＥＡ１-（体細胞）、Ｔｈｙ１-/ＳＳＥＡ１-（初期の中間物）及びＴｈｙ１-/ＳＳＥＡ１+（後期の中間物）のサブ集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分け、ミトコンドリアの形態を融合（体細胞）/中間状態/分裂（全分化能細胞）に分けて定量した。Ｔｈｙ１-/ＳＳＥＡ１+のサブグループで断片化された形態のミトコンドリアが著しく増加し、融合した形態は減少した（図5E）。Ｄｒｐ１発現及びリン酸化レベルは、Ｔｈｙ1-/ＳＳＥＡ１+のサブ集団のミトコンドリア分画において著しく増加した反面、Ｍｆｎ１及び２の発現は減少した（図5F）。前記結果より、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞は、全分化能のリプログラミングの中間物と同様にＭｆｎの発現レベルが低く、リプログラミングに有利な状態であることが分かった（図5G）。
実施例３．Ｍｆｎ１及び２の除去による全分化能の獲得及び維持
Ｍｆｎ１/２の減少が体細胞のリプログラミングに寄与するか否かを確認した（図６）。ＡＰ染色による解析の結果、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、マウス（図6A）及びヒト細胞システム（図6B）においてリプログラミング効率が著しく増加した反面、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合はそうではなかった。また、ＵＭを使用した培養条件下ではｈＥＳＣｓは分化したが、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制したｈＥＳＣｓでは未分化状態が維持された。ＵＭを使用した培養条件の下、ｈＥＳＣｓではＭｆｎ１及び２が抑制されている間にＯｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連のマーカーの発現が維持されていた（図6D及び７）。
また、Ｍｆｎ１及び２を遺伝的除去により完全に抑制した場合には、正常なＭＥＦｓに比べて著しく高いリプログラミング効率（図6E）、及びミトコンドリアが 断片化された形態を示した（図6F）。特に、Ｍｆｎ１-/-はＷＴに比べて、約５００倍以上、Ｍｆｎ２-/-は約２００倍以上、ＡＰ+コロニー数が著しく増加したことが確認されたことから（図6E）、Ｍｆｎ１及び２の除去により体細胞のリプログラミング効率を著しく増加させ得ることが分かった。ただし、このような効果は、ミトコンドリア分裂阻害剤であるＭｄｉｖｉ１の処理により抑制された（図6E及び6F）。
よって、ミトコンドリアの構造タンパク質であるＭｆｎを抑制又は遺伝的に除去すると、分化した細胞から全分化能幹細胞のリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されることが分かった。
実施例４．リプログラミングの初期段階におけるＭｆｎ１及び２の抑制による解糖作用への転換促進
Ｍｆｎ１/２の抑制により誘導される全分化能への細胞運命の変化を促進するメカニズムを明らかにするために、Ｍｆｎ１及び２のｓｈＲＮＡ導入細胞の７日目のリプログラミング培養におけるトランスクリプトーム及びメタボローム解析を行った（図８）。その結果、Ｍｆｎ１及び２の抑制によるＯＸＰＨＯＳ複合体遺伝子の発現プロファイルにおいてミトコンドリアエネルギー代謝を特定する遺伝子の全般的な減少が見られた（図9A）。しかし、解糖作用に関与する主な酵素をエンコードする遺伝子の発現及び解糖作用の各段階における代謝物の相対的な量は、対照群に比べてＭｆｎ１及び２抑制細胞において著しく増加し（図8A及び8B）、細胞内の乳酸産生も増加した（図8C）。これは、Ｍｆｎ１/２の除去によってミトコンドリアの機能を抑制すると、全分化能幹細胞のように非常に速く成長する細胞のエネルギー需要を満たすために、解糖作用へのエネルギー転換が促進されることを示す。
実施例５．ｐ５３及びｐ２１の相互抑制によるＲａｓ-Ｒａｆ-ＨＩＦ１αシグナルの活性化
遺伝子発現のプロファイルによってｐ５３（Ｔｒｐ５３）、ｐ２１（Ｃｄｋｎ１ａ）及びｐ１６（Ｃｄｋｎ２ａ）の発現が正常細胞に比べてＭｆｎ１及び２の抑制細胞において著しく減少したことが確認された（図9B及び9C）。また、ｐ５３及びｐ２１タンパク質の発現は、正常細胞に比べてＭｆｎ１-/-及びＭｆｎ２-/-細胞において減少し（図10A）、Ｍｆｎ１の発現は正常細胞に比べてｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの間に抑制された（図10B）。
また、Ｍｆｎ１/２（図6A、6B及び6E）又はｐ５３/ｐ２１（図１A〜１C）を抑制すると、体細胞のｉＰＳＣｓへの効率的なリプログラミングが促進し、反対に、ｐ５３を薬学的に再活性させたり、又はＭｆｎ１を過剰発現させると、Ｍｆｎ１及び２（図10C）、又はｐ５３及びｐ２１の除去（図10D）によって促進された人工多能性幹細胞のリプログラミングが効率的に抑制された。
よって、リプログラミング過程の間、Ｍｆｎ１/２及びｐ５３/ｐ２１のシグナルの間に相互作用が存在することが分かった。Ｍｆｎ２が直接的なｐ５３-誘導標的遺伝子であり、Ｍｆｎ２と高い相同性を持つＭｆｎ１及びＭｆｎ２が直接的にＲａｓ及びＲａｆに結合し、Ｒａｓ-Ｒａｆ-ＥＲＫシグナルシステムによって細胞成長を抑制することは既に知られている。また、本発明の条件の下、リプログラミング７日目に、Ｍｆｎ１及び２の抑制細胞におけるリプログラミングの中間物において、リン酸化されたＲａｆ、ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ及びｍＴＯＲタンパク質のレベルが著しく増加したことが確認された（図10E）。また、ｍＴＯＲの下流エフェクターであると同時に解糖作用への転換において重要な代謝ターゲットであるＨＩＦ１αの発現をリプログラミングの初期過程の間に確認し、ＨＩＦ１α下流ターゲットであるＬＤＨＡのタンパク質レベルがリプログラミング７日目にＭｆｎ１及び２の抑制細胞におけるリプログラミング中間物において著しく増加したことが確認された（図10E）。また、リプログラミング７日目に、Ｍｆｎ１及び２の抑制細胞におけるリプログラミング中間物においてＨＩＦ１α及びそのターゲットであるＧｌｕｔ１の遺伝子発現が増加したことが確認された（図8B）。対象的に、ｓｈＲＮＡを使用してＨＩＦ１αを抑制すると、Ｍｆｎ１及び２の抑制細胞においてＬＤＨＡの発現が増加し（図１１A）、乳酸産生（図１１B）及びリプログラミング効率（図１１C）が強く抑制したことが確認された。前記結果をまとめると、リプログラミングの初期段階においてＭｆｎ１/２及びｐ５３/ｐ２１の相互抑制は、Ｒａｓ-Ｒａｆシグナルを活性化させ、これは、連続的にＨＩＦ１αの安定化をもたらすことによって（図10F）、効率的なリプログラミングを可能にする低酸素条件を模倣できることが示唆された。
実施例６．低酸素症におけるＭｆｎ１及び２発現の減少効果
本発明において、低酸素条件の下、ｉＰＳＣの発生が著しく増加したことが確認されており（図１2A）、ＨＩＦ１αとＬＤＨＡタンパク質の発現増加との相関性が確認された（図１2B）。同様の条件下で、Ｍｆｎ１のプロモーター活性は著しく減少し（図１2C）、Ｍｆｎ１及び２タンパク質の発現も著しく減少した（図１2B）。リプログラミングの過程において、Ｍｆｎ１/２はＨＩＦ１α依存的な低酸素状態の誘導と関連し、ｐ５３と解糖作用への代謝変化を調節する主要因子間のクローストークによって調節されるものと予想される。従って、Ｍｆｎ１/２を減少させることは、細胞を全分化能へと転換させる上で、効率的、かつ容易な方法である。
実施例７．Ｍｆｎ１発現抑制化合物
８４個の酸化還元ライブラリーの化合物を用いて、マウス又はヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させ得る化合物をスクリーニングした。まず、マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させる上位３つの化合物（ピセアタンノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ）、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）及び２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４- ピリミジニル)-１-ピペラジニル]プレグナ-１,４,９[１１]-トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ、Ｕ７４３８９Ｇ ｍａｌｅａｔｅ）と、増加させる上位２つの化合物（タンシノンＩＩＡ、テルビナフィン塩酸塩）の新たな用途を解明した（図１2D）。リプログラミングの間に、前記選択された化合物を処理した場合、Ｍｆｎ１タンパク質の発現が減少するか、増加した（図１2E）。Ｍｆｎ１のプロモーター活性に影響を示さない化合物は、Ｍｆｎ１タンパク質の発現を変化させなかった。
また、前記Ｍｆｎ１のプロモーター活性を抑制する化合物は、マウス及びヒト体細胞のリプログラミング効率を増加させる反面、Ｍｆｎ１のプロモーター活性を促進する化合物は、リプログラミングを抑制した（図１2F及び１3A）。また、Ｍｆｎ１のプロモーター活性抑制剤は、マウスＥＳＣｓ（図１2G）と、ヒトＥＳＣｓ（図１3B）の未分化状態を維持させた。
また、ヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を最もよく抑制する３つの化合物（Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩、パルミチン酸レチニル及びＤ-α-トコフェリルキノン）の新たな用途を解明した（図１2H）。Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩は、マウスとヒト細胞の両方においてＭｆｎ１のプロモーター活性を抑制することが確認された。
よって、Ｍｆｎ１及び２の抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを著しく促進し、全分化能を維持させることを確認し、本発明のリプログラミング方法が、従来のリプログラミング方法に比べて著しく改善されたことが分かった（図１４）。
以上の説明より、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解し得るであろう。それと関連して、以上で技術した実施例は、全ての面において例示的なものであって、限定的ではないものとして理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する請求範囲の意味及び範囲、そしてその等値概念から導出される全ての変更又は変更された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解析されるべきである。
アルカリホスファターゼ染色によりｉＰＳＣ生成のリプログラミング効率をｐ５３-/-及びｐ２１-/-マウス胚性線維芽細胞を用いて測定した結果、リプログラミング効率が増加した（図１A）。リプログラミングの初期段階〜７日まで（Ｄ７（７日目）；図１B）、正常対象群と比較した場合、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞で形態の変化と共に、細胞数の著しい増加が確認された（図１C）。リプログラミングの初期段階における根本的なメカニズムを確認するために、リプログラミング７日目におけるＷＴ、ｐ５３-/-、ｐ２１-/-ＭＥＦｓを用いてマイクロアレイに基づいたトランスクリプトーム及び質量分析法に基づいたトランスクリプトーム解析を行った。トランスクリプトーム解析によってリプログラミング段階の区別を可能にするマーカーの発現レベルを比較した結果（図2A）、リプログラミングされたｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞が、７日間リプログラミングの初期と成熟の中間段階にあることが分かった。
また、細胞成長、付着、ＲＮＡスプライシング及び細胞周期に関与する遺伝子セットの発現が著しく増加し、対照的に、分化関連の遺伝子は正常細胞に比べてｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングにおいて減少した（図2B）。しかし、中心炭素経路（ｃｅｎｔｒａｌ ｃａｒｂｏｎ ｐａｔｈｗａｙ）において、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミング過程における解糖作用では顕著な差が見られなかった（図１D及び2C）。また、解糖作用（Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）に関与する主な酵素をエンコードする遺伝子の発現は変化しなかったが、解糖作用の各段階における代謝物の相対的な量は、正常細胞に比べてｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミング中間物において減少した（図１D）。しかし、解糖作用の最終産物である細胞内における乳酸産生は、リプログラミングの後期には増加しており、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-によって促進され（図3A）、解糖系阻害剤である２-ＤＧによって細胞のリプログラミングが著しく減少した（図3B）。
対照的に、ミトコンドリアの機能に関与する遺伝子の発現は正常対照群に比べて、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの中間物において著しく抑制された。しかし、トリカルボン酸回路（ＴＣＡ）回路関連遺伝子の発現レベルは変化しなかった（図１E）。特に、ミトコンドリアによってエンコードされるＮＤ１(複合体I)及びＡｔｐ６ａｐ１（複合体VのＡＴＰ６のファミリー）を含む酸化的リン酸化（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ、ＯＸＰＨＯＳ）複合体サブユニットの発現は著しく減少した反面（図１F）、核によってエンコードされる遺伝子（複合体ＩＩのＳｄｈｂ、Ｕｑｃｒｃ１及び複合体VのＡＴＰ５のファミリー）は減少しなかった（図4A及び4B）。特に、Ｍｆｎ１/２及びＣｈｃｈｄ３のようなミトコンドリア結合遺伝子は、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの中間物において著しく減少した反面、Ｄｎｍ１、Ｄｎｍ１Ｌ（Ｄｒｐ１）、Ｆｉｓ１及びＭｆｆのような分裂遺伝子は増加するものの変化はなかった（図１E及び１F）。
また、ＡＤＰ/ＡＴＰ比（エネルギー転換指標）は、正常細胞に比べてｐ５３-/-細胞のリプログラミングの中間物において減少した（図4C）。これらの結果は、正常細胞に比べて、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの間における代謝過程が、ミトコンドリア依存から比依存的に迅速に転換することを意味する。
実施例２．ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞と、全分化能のリプログラミングの中間段階におけるミトコンドリア結合タンパク質の発現解析
リプログラミング後の７日目において、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞におけるリプログラミングの中間物では全分化能幹細胞の特徴である、ミトコンドリアが断片化された形態を示す反面、正常細胞におけるリプログラミングの中間物では観察されなかった（図5A）。リプログラミングの前に、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓ自体が正常ＭＥＦｓに比べて、ミトコンドリアが断片化された形態を示し（図5B）、細胞成長は増加したことが確認された（図5C）。正常なＭＥＦｓ、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓと、人工多能性幹細胞[ＰＳＣｓ（ＥＳＣｓ及びｉＰＳＣｓ）]間においてミトコンドリア構造関連タンパク質の発現に大きな差が見られた。サイクリンＢ１依存性Ｄｒｐ１のリン酸化及びＤｒｐ１タンパク質の発現は、ＷＴのＭＥＦｓよりｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓと、ＰＳＣｓでより高かったが、反対に、Ｍｆｎ１及び２の発現は、ＷＴのＭＥＦｓよりｐ５３-/-及びｐ２１-/-ＭＥＦｓと、ＰＳＣｓにおいて著しく低かった（図5D）。全分化能の誘導と、ミトコンドリアダイナミックス間の関連性を解明するために、リプログラミング後の１１日目にＭＡＣＳによって体細胞のマーカーであるＴｈｙ１及び初期段階の全分化能のマーカーであるＳＳＥＡ１の発現を基に、リプログラミングの中間物を分離した（図5E）。Ｔｈｙ１+/ＳＳＥＡ１-（体細胞）、Ｔｈｙ１-/ＳＳＥＡ１-（初期の中間物）及びＴｈｙ１-/ＳＳＥＡ１+（後期の中間物）のサブ集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に分け、ミトコンドリアの形態を融合（体細胞）/中間状態/分裂（全分化能細胞）に分けて定量した。Ｔｈｙ１-/ＳＳＥＡ１+のサブグループで断片化された形態のミトコンドリアが著しく増加し、融合した形態は減少した（図5E）。Ｄｒｐ１発現及びリン酸化レベルは、Ｔｈｙ1-/ＳＳＥＡ１+のサブ集団のミトコンドリア分画において著しく増加した反面、Ｍｆｎ１及び２の発現は減少した（図5F）。前記結果より、ｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞は、全分化能のリプログラミングの中間物と同様にＭｆｎの発現レベルが低く、リプログラミングに有利な状態であることが分かった（図5G）。
実施例３．Ｍｆｎ１及び２の除去による全分化能の獲得及び維持
Ｍｆｎ１/２の減少が体細胞のリプログラミングに寄与するか否かを確認した（図６）。ＡＰ染色による解析の結果、ｓｈＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制した場合、マウス（図6A）及びヒト細胞システム（図6B）においてリプログラミング効率が著しく増加した反面、対照群ｓｈＲＮＡを使用した場合はそうではなかった。また、ＵＭを使用した培養条件下ではｈＥＳＣｓは分化したが、ｓｉＲＮＡを使用してＭｆｎ１及び２を抑制したｈＥＳＣｓでは未分化状態が維持された。ＵＭを使用した培養条件の下、ｈＥＳＣｓではＭｆｎ１及び２が抑制されている間にＯｃｔ３/４及びＮａｎｏｇのような全分化能関連のマーカーの発現が維持されていた（図6D及び７）。
また、Ｍｆｎ１及び２を遺伝的除去により完全に抑制した場合には、正常なＭＥＦｓに比べて著しく高いリプログラミング効率（図6E）、及びミトコンドリアが 断片化された形態を示した（図6F）。特に、Ｍｆｎ１-/-はＷＴに比べて、約５００倍以上、Ｍｆｎ２-/-は約２００倍以上、ＡＰ+コロニー数が著しく増加したことが確認されたことから（図6E）、Ｍｆｎ１及び２の除去により体細胞のリプログラミング効率を著しく増加させ得ることが分かった。ただし、このような効果は、ミトコンドリア分裂阻害剤であるＭｄｉｖｉ１の処理により抑制された（図6E及び6F）。
よって、ミトコンドリアの構造タンパク質であるＭｆｎを抑制又は遺伝的に除去すると、分化した細胞から全分化能幹細胞のリプログラミング効率が著しく増加し、全分化能が維持されることが分かった。
実施例４．リプログラミングの初期段階におけるＭｆｎ１及び２の抑制による解糖作用への転換促進
Ｍｆｎ１/２の抑制により誘導される全分化能への細胞運命の変化を促進するメカニズムを明らかにするために、Ｍｆｎ１及び２のｓｈＲＮＡ導入細胞の７日目のリプログラミング培養におけるトランスクリプトーム及びメタボローム解析を行った（図８）。その結果、Ｍｆｎ１及び２の抑制によるＯＸＰＨＯＳ複合体遺伝子の発現プロファイルにおいてミトコンドリアエネルギー代謝を特定する遺伝子の全般的な減少が見られた（図9A）。しかし、解糖作用に関与する主な酵素をエンコードする遺伝子の発現及び解糖作用の各段階における代謝物の相対的な量は、対照群に比べてＭｆｎ１及び２抑制細胞において著しく増加し（図8A及び8B）、細胞内の乳酸産生も増加した（図8C）。これは、Ｍｆｎ１/２の除去によってミトコンドリアの機能を抑制すると、全分化能幹細胞のように非常に速く成長する細胞のエネルギー需要を満たすために、解糖作用へのエネルギー転換が促進されることを示す。
実施例５．ｐ５３及びｐ２１の相互抑制によるＲａｓ-Ｒａｆ-ＨＩＦ１αシグナルの活性化
遺伝子発現のプロファイルによってｐ５３（Ｔｒｐ５３）、ｐ２１（Ｃｄｋｎ１ａ）及びｐ１６（Ｃｄｋｎ２ａ）の発現が正常細胞に比べてＭｆｎ１及び２の抑制細胞において著しく減少したことが確認された（図9B及び9C）。また、ｐ５３及びｐ２１タンパク質の発現は、正常細胞に比べてＭｆｎ１-/-及びＭｆｎ２-/-細胞において減少し（図10A）、Ｍｆｎ１の発現は正常細胞に比べてｐ５３-/-及びｐ２１-/-細胞のリプログラミングの間に抑制された（図10B）。
また、Ｍｆｎ１/２（図6A、6B及び6E）又はｐ５３/ｐ２１（図１A〜１C）を抑制すると、体細胞のｉＰＳＣｓへの効率的なリプログラミングが促進し、反対に、ｐ５３を薬学的に再活性させたり、又はＭｆｎ１を過剰発現させると、Ｍｆｎ１及び２（図10C）、又はｐ５３及びｐ２１の除去（図10D）によって促進された人工多能性幹細胞のリプログラミングが効率的に抑制された。
よって、リプログラミング過程の間、Ｍｆｎ１/２及びｐ５３/ｐ２１のシグナルの間に相互作用が存在することが分かった。Ｍｆｎ２が直接的なｐ５３-誘導標的遺伝子であり、Ｍｆｎ２と高い相同性を持つＭｆｎ１及びＭｆｎ２が直接的にＲａｓ及びＲａｆに結合し、Ｒａｓ-Ｒａｆ-ＥＲＫシグナルシステムによって細胞成長を抑制することは既に知られている。また、本発明の条件の下、リプログラミング７日目に、Ｍｆｎ１及び２の抑制細胞におけるリプログラミングの中間物において、リン酸化されたＲａｆ、ＥＲＫ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ及びｍＴＯＲタンパク質のレベルが著しく増加したことが確認された（図10E）。また、ｍＴＯＲの下流エフェクターであると同時に解糖作用への転換において重要な代謝ターゲットであるＨＩＦ１αの発現をリプログラミングの初期過程の間に確認し、ＨＩＦ１α下流ターゲットであるＬＤＨＡのタンパク質レベルがリプログラミング７日目にＭｆｎ１及び２の抑制細胞におけるリプログラミング中間物において著しく増加したことが確認された（図10E）。また、リプログラミング７日目に、Ｍｆｎ１及び２の抑制細胞におけるリプログラミング中間物においてＨＩＦ１α及びそのターゲットであるＧｌｕｔ１の遺伝子発現が増加したことが確認された（図8B）。対象的に、ｓｈＲＮＡを使用してＨＩＦ１αを抑制すると、Ｍｆｎ１及び２の抑制細胞においてＬＤＨＡの発現が増加し（図１１A）、乳酸産生（図１１B）及びリプログラミング効率（図１１C）が強く抑制したことが確認された。前記結果をまとめると、リプログラミングの初期段階においてＭｆｎ１/２及びｐ５３/ｐ２１の相互抑制は、Ｒａｓ-Ｒａｆシグナルを活性化させ、これは、連続的にＨＩＦ１αの安定化をもたらすことによって（図10F）、効率的なリプログラミングを可能にする低酸素条件を模倣できることが示唆された。
実施例６．低酸素症におけるＭｆｎ１及び２発現の減少効果
本発明において、低酸素条件の下、ｉＰＳＣの発生が著しく増加したことが確認されており（図１2A）、ＨＩＦ１αとＬＤＨＡタンパク質の発現増加との相関性が確認された（図１2B）。同様の条件下で、Ｍｆｎ１のプロモーター活性は著しく減少し（図１2C）、Ｍｆｎ１及び２タンパク質の発現も著しく減少した（図１2B）。リプログラミングの過程において、Ｍｆｎ１/２はＨＩＦ１α依存的な低酸素状態の誘導と関連し、ｐ５３と解糖作用への代謝変化を調節する主要因子間のクローストークによって調節されるものと予想される。従って、Ｍｆｎ１/２を減少させることは、細胞を全分化能へと転換させる上で、効率的、かつ容易な方法である。
実施例７．Ｍｆｎ１発現抑制化合物
８４個の酸化還元ライブラリーの化合物を用いて、マウス又はヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させ得る化合物をスクリーニングした。まず、マウスＭｆｎ１のプロモーター活性を減少させる上位３つの化合物（ピセアタンノール（ｐｉｃｅａｔａｎｎｏｌ）、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）及び２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４- ピリミジニル)-１-ピペラジニル]プレグナ-１,４,９[１１]-トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ、Ｕ７４３８９Ｇ ｍａｌｅａｔｅ）と、増加させる上位２つの化合物（タンシノンＩＩＡ、テルビナフィン塩酸塩）の新たな用途を解明した（図１2D）。リプログラミングの間に、前記選択された化合物を処理した場合、Ｍｆｎ１タンパク質の発現が減少するか、増加した（図１2E）。Ｍｆｎ１のプロモーター活性に影響を示さない化合物は、Ｍｆｎ１タンパク質の発現を変化させなかった。
また、前記Ｍｆｎ１のプロモーター活性を抑制する化合物は、マウス及びヒト体細胞のリプログラミング効率を増加させる反面、Ｍｆｎ１のプロモーター活性を促進する化合物は、リプログラミングを抑制した（図１2F及び１3A）。また、Ｍｆｎ１のプロモーター活性抑制剤は、マウスＥＳＣｓ（図１2G）と、ヒトＥＳＣｓ（図１3B）の未分化状態を維持させた。
また、ヒトＭｆｎ１のプロモーター活性を最もよく抑制する３つの化合物（Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩、パルミチン酸レチニル及びＤ-α-トコフェリルキノン）の新たな用途を解明した（図１2H）。Ｕ７４３８９Ｇマレイン酸塩は、マウスとヒト細胞の両方においてＭｆｎ１のプロモーター活性を抑制することが確認された。
よって、Ｍｆｎ１及び２の抑制剤は、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミングを著しく促進し、全分化能を維持させることを確認し、本発明のリプログラミング方法が、従来のリプログラミング方法に比べて著しく改善されたことが分かった（図１４）。
以上の説明より、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須的な特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施できることを理解し得るであろう。それと関連して、以上で技術した実施例は、全ての面において例示的なものであって、限定的ではないものとして理解されるべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明より、後述する請求範囲の意味及び範囲、そしてその等値概念から導出される全ての変更又は変更された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解析されるべきである。
Claims (13)
- マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含み、
前記マイトフュージン遺伝子の発現抑制剤が、マイトフュージン遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、及び、マイトフュージンのプロモーター活性抑制剤からなる群より選択される１つ以上のものであり、
前記マイトフュージンのプロモーター活性抑制剤が、テトラメチルピラジン（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒａｚｉｎｅ）、２１-[４-(２,６-ジ-１-ピロリジニル-４-ピリミジニル)-１-ピペラジニル]プレグナ-１,４,９[１１]- トリエン-３,２０-ジオン・マレイン酸塩（２１-[４-(２,６-Ｄｉ-１-ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｙｌ-４-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ)-１-ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ]ｐｒｅｇｎａ-１,４,９[１１]-ｔｒｉｅｎｅ-３,２０-ｄｉｏｎｅ ｍａｌｅａｔｅ）、パルミチン酸レチニル（ｒｅｔｉｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）及びＤ-α-トコフェリルキノン（Ｄ-α-Ｔｏｃｏｐｈｅｒｙｌｑｕｉｎｏｎｅ）からなる群より選択される１種以上のものであり、又は、
前記マイトフュージンタンパク質の活性抑制剤が、マイトフュージンタンパク質に特異的に結合する抗体である、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング促進用組成物。 - 前記マイトフュージンが、ヒト又はマウス由来のものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記マイトフュージンが、マイトフュージン１又はマイトフュージン２である、請求項１に記載の組成物。
- 前記マイトフュージン１が、配列番号１又は３のアミノ酸配列として定義され、マイトフュージン２は、配列番号２又は４のアミノ酸配列として定義されるものである、請求項３に記載の組成物。
- 前記組成物が、マイトフュージンのプロモーター活性抑制剤を１ｎＭ以上、１００μＭ以下で含むものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記分化した細胞が、生殖細胞、体細胞又は前駆細胞である、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、培養培地又は培養培地の添加剤である、請求項１に記載の組成物。
- 前記組成物が、１つ以上のリプログラミング因子を含むものである、請求項１に記載の組成物。
- 前記リプログラミング因子が、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ-Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ-２８及びＲｅｘ１からなる群より選択される１つ以上のタンパク質又は前記タンパク質をコードする核酸分子である、請求項８に記載の組成物。
- 請求項１記載のマイトフュージン遺伝子の発現抑制剤、請求項１記載のマイトフュージンタンパク質の活性抑制剤、又はその混合物を有効成分として含む、未分化状態における全分化能幹細胞の維持及び培養用培地の組成物。
- （ａ）分化した細胞に１つ以上のリプログラミング因子をin vitroで伝達する段階；及び（ｂ）分化した細胞を請求項１〜９のいずれか１項による組成物を含有する培地で培養する段階を含む、分化した細胞からリプログラミングされた全分化能幹細胞への製造方法。
- 前記リプログラミングが、分化した細胞に比べて全分化能幹細胞で、解糖作用（Ｇｌｙｃｏｌｙｓｉｓ）の副産物である乳酸産生が増加したり、Ｒａｓ-Ｒａｆ-ＨＩＦ１αシグナルが活性化されたり、酸素の消費量が減少したり、又はリプログラミングの誘導時間が短縮及びリプログラミングされた細胞数の増加によるリプログラミング効率が向上されたものである、請求項１１に記載の方法。
- 分離した分化細胞におけるマイトフュージン遺伝子の発現又はマイトフュージンタンパク質の活性を抑制する段階を含み、
前記マイトフュージン遺伝子の発現又はマイトフュージンタンパク質の活性を抑制する段階は、請求項１〜９のいずれか１項の組成物を、分離した分化細胞に処理して行うことである、分化した細胞から全分化能幹細胞へのリプログラミング方法。
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