CN102083981A - 通过使用hdac调节剂诱导复能基因而重编程细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重编程细胞的方法、组合物和试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及包括诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达的方法。在又一实施方案中，方法包括用HDAC抑制剂抑制HDAC的活性，并诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达。在又一实施方案中，本发明涉及重编程的方法，该方法包括将细胞暴露于抑制多于一种类型的调节蛋白的多于一种的剂。在又一实施方案中，本发明涉及重编程的细胞或富集的重编程的细胞群，该重编程的细胞或富集的重编程的细胞群可以具有ES样细胞的特征，它可以再分化或转分化为多种分化的细胞类型。

Description

通过使用HDAC调节剂诱导复能基因而重编程细胞
相关专利申请的交叉引用
本申请是2006年8月1日提交的美国专利申请第11/497,064号的部分继续申请，它根据35U.S.C.§119(e)要求2005年8月1日提交的美国临时专利申请60/704,465的权益，并且还根据35U.S.C.§119(e)要求2008年4月7日提交的美国临时专利申请61/042,890的权益；2008年4月7日提交的美国临时专利申请61/043,066的权益；2008年4月7日提交的美国临时专利申请61/042,995的权益；以及2008年11月12日提交的美国临时专利申请61/113,971的权益，它们的每一个均通过引用如同整体描述一样并入本文。
发明领域
本发明的实施方案涉及细胞生物学、干细胞、细胞分化、体细胞核转移和基于细胞的治疗法的领域。更具体地，本发明的实施方案涉及用于重编程细胞以及基于细胞的治疗法的方法、组合物和试剂盒。
发明背景
再生医学作为许多人疾病的治疗极具潜力，但是还伴随着一些困难的技术挑战，这些挑战包括低克隆效率、可能的复能(pluripotent)组织供应不足、和对于如何控制细胞分化和哪种类型的胚胎干细胞可用于选择的治疗的知识的普遍缺乏。尽管ES细胞具有极大的可塑性，但是未分化的ES细胞可以形成含有组织类型混合物的畸胎瘤(良性肿瘤)。此外，从一种来源向另一来源移植ES细胞将可能需要施用药物来防止新细胞的排斥。
已经进行了尝试来鉴定由非胎儿来源的组织产生干细胞的新途径。一种方法包括操纵自体的成体干细胞。使用自体的成体干细胞用于再生医学的优点在于它们来源于并返回同一患者，并且因此不会经受免疫介导的排斥。缺点是这些细胞缺乏ES细胞的可塑性和复能性，并且因此它们的潜能是不确定的。另一方法着眼于将来自成体组织的体细胞重编程以产生复能ES样细胞。然而，这种方法是困难的，因为多细胞生物体中的每种细胞类型具有独特的表观遗传学标记，认为该标记在细胞分化之后或从细胞周期退出之后是固定的。
细胞DNA一般以染色质的形式存在，染色质是由核酸和蛋白质构成的复合体。事实上，大部分的细胞RNA分子还以核蛋白复合体的形式存在。如本领域技术人员已知的，染色质的核蛋白结构已成为广泛的研究主题。一般而言，染色体DNA被包装成核小体。核小体包含核心和连接区。核小体核心包含核心组蛋白(H2A、H2B、H3和H4各两个)八聚体，约150个碱基对的染色体DNA缠绕在该八聚体周围。此外，约50个碱基对的连接区DNA区段与连接区组蛋白H1缔合。核小体被组织成更高阶的染色质纤维并且染色质纤维被组织成染色体。参见，例如，Wolffe″Chromatin：Structure and Function(染色质：结构和功能)″第3版，Academic Press，San Diego，1998。
染色质的结构不是静态的，而是易于经受统称为染色质重建的过程的修饰。染色质重建可以用于：例如，从DNA区清除核小体；将核小体从一个DNA区移到另一个DNA区；改变核小体之间的间距；或添加核小体到染色体中的DNA区。染色质重建还可以导致更高阶结构的改变，从而影响转录活性的染色质(开放染色质(open chromatin)或常染色质)与无转录活性的染色质(闭合染色质(closed chromatin)或异染色质)之间的平衡。
染色体蛋白易经受大量类型的化学修饰。这些核心组蛋白的翻译后修饰的一种机制是高度保守的碱性N-末端赖氨酸残基的ε-氨基的可逆乙酰化。组蛋白乙酰化的稳态是由竞争性的组蛋白乙酰基转移酶与组蛋白脱乙酰酶之间的动态平衡建立的，组蛋白脱乙酰酶在本文称为HDAC。
HDAC依据序列同一性和结构域组织被分为至少四类：I类：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8；II类：HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAC10；III类：哺乳动物中的sirtuin(SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6、SIRT7)；以及IV类：HDAC11。I类HDAC是最类似于酵母转录调节蛋白RPD3的那些HDAC。II类HDAC是最类似于酵母HDA1酶的那些HDAC。
早已将组蛋白乙酰化和脱乙酰化与转录控制联系起来。可逆的组蛋白乙酰化可以导致染色体重建并且如此可以作为基因转录的控制机制起作用。一般而言，组蛋白的高度乙酰化有利于基因表达，而组蛋白脱乙酰化则与转录抑制相关联。据显示组蛋白乙酰基转移酶充当转录辅激活蛋白，而脱乙酰酶则被发现是属于转录抑制途径的。
组蛋白乙酰化与脱乙酰化之间的动态平衡是正常细胞生长所必需的。组蛋白脱乙酰化的抑制导致细胞周期停滞、细胞分化、凋亡和转化的表型逆转。
复能细胞或全能(totipotent)细胞向分化的、特化的表型的发育是由发育期间表达的特定组的基因决定的。基因表达是由可以实现正调节或负调节的基因调节蛋白的序列特异性结合直接介导的。然而，这些调节蛋白的任一种直接介导基因表达的能力至少部分取决于它们在细胞DNA内的结合位点的可接近性。如上面所讨论的，细胞DNA中序列的可接近性通常取决于在其中包装细胞DNA的细胞染色质的结构。
因此，鉴定可以诱导复能性所需的基因表达的方法、组合物和试剂盒，包括可以抑制参与阻抑转录的HDAC活性的方法、组合物和试剂盒将是有用的。
发明简述
本发明涉及重编程细胞的方法、组合物和试剂盒。本发明的实施方案涉及包括诱导复能基因或多能(multipotent)基因表达的方法。在又一实施方案中，本发明还涉及制备重编程的细胞。在再一实施方案中，本发明涉及包括通过使用HDAC抑制剂抑制至少一种HDAC的活性、表达、或活性和表达的方法。在又一实施方案中，本发明涉及包括通过使用HDAC调节剂改变至少一种HDAC的活性、表达、或活性和表达的方法。方法还包括诱导至少一种复能基因或多能基因的表达以及重编程细胞。
本发明的实施方案还涉及重编程细胞的方法，所述方法包括使细胞、细胞群、细胞培养物、来自细胞培养物的细胞亚群、同质细胞培养物或异质细胞培养物接触HDAC调节剂；诱导至少一种复能基因或多能基因表达；以及重编程细胞。所述方法还包括使重编程的细胞再分化。
在另一实施方案中，本发明涉及使用剂以抑制HDAC的表达、活性、或表达和活性。所述剂可以是可以抑制HDAC的表达、活性、或表达和活性的任何分子或化合物，包括但不限于：HDAC抑制剂、小分子、核酸序列、DNA序列、RNA序列、shRNA序列以及RNA干扰。
在另一实施方案中，本发明涉及使用剂以诱导抑制HDAC活性的蛋白的活性、表达、或活性和表达。所述剂可以是可以诱导抑制HDAC的蛋白的表达、活性、或表达和活性的任何分子或化合物，包括但不限于：小分子、核酸序列、DNA序列、RNA序列、shRNA序列以及RNA干扰。
HDAC抑制剂可以用于抑制HDAC的活性，并且其包括但不限于：TSA、丁酸钠、丙戊酸、沃瑞诺斯特(vorinostat)、LBH-589、apicidin、TPX-HA类似物、CI-994、MS-275、MGCD0103以及上面所提及的物质的衍生物或类似物。
在一些实施方案中，至少一种HDAC抑制剂可以抑制至少一种HDAC。在又一实施方案中，多于一种的HDAC抑制剂可以同时或顺序地抑制至少一种HDAC。HDAC抑制剂可以针对于I类、II类、III类、IV类的HDAC或未知的或未分类的HDAC。HDAC抑制剂可以针对于多于一类的HDAC或所有类的HDAC。HDAC抑制剂的组合可以抑制多于一种的HDAC，并且可以同时或顺序地使用。
在另一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞群暴露于抑制组蛋白脱乙酰酶的活性、表达、或活性和表达的剂；诱导复能基因或多能基因的表达；选择表达指示复能细胞或多能细胞的细胞表面标记物的细胞；以及扩增所述选择的细胞以制备细胞群，其中所述细胞已恢复分化潜能。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞暴露于抑制HDAC的活性、表达、或表达和活性的第一剂；将所述细胞暴露于抑制第二调节蛋白的活性、表达、或表达和活性的第二剂，其中所述第二调节蛋白具有与HDAC不同的功能；诱导复能基因或多能基因的表达；以及选择细胞，其中所述细胞已恢复分化潜能。在另一实施方案中，细胞或细胞群可以同时或顺序地暴露于第一剂和第二剂。
在又一实施方案中，本发明涉及包括下列的方法：将具有第一表型的细胞暴露于抑制至少一种HDAC的活性、表达、或活性和表达的剂；比较细胞的所述第一表型与将所述细胞暴露于所述剂后所获得的表型；以及选择已被重编程的细胞。在又一实施方案中，方法包括比较在将细胞暴露于所述剂之前细胞的基因型与将所述细胞暴露于所述剂之后所获得的细胞基因型。在再一实施方案中，方法包括比较在将细胞暴露于抑制至少一种HDAC的活性、表达、或活性和表达的剂之前细胞的表型和基因型与将所述细胞暴露于所述剂之后细胞的表型和基因型。
在又一实施方案中，方法包括将选择的细胞培养或扩增为细胞群。在又一实施方案中，方法包括使用与由复能基因或多能基因所编码的蛋白结合的抗体或使用与多能标记物或复能标记物结合的抗体分离细胞，所述多能标记物或复能标记物包括但不限于：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。还可以使用有效分离细胞的任何方法分离细胞，包括但不限于荧光细胞激活的分选仪、免疫组织化学和ELISA。在另一实施方案中，方法包括选择与原始细胞相比具有较低分化状态的细胞。
在又一实施方案中，本发明还包括比较暴露于所述剂之前复能基因或多能基因的染色质结构与暴露于所述剂之后所获得的染色质结构。
在另一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括：将具有第一转录模式的细胞暴露于抑制HDAC的活性、表达、或活性和表达的剂；诱导复能基因或多能基因的表达；比较细胞的所述第一转录模式与暴露于所述剂之后所获得的转录模式；选择细胞，其中所述细胞已恢复分化潜能。
在又一实施方案中，选择细胞包括鉴定转录模式至少5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-94％、95％或95-99％类似于分析的胚胎干细胞的转录模式的细胞。不需要比较胚胎干细胞的整个转录模式，尽管这是可以的。相反，可以比较的胚胎基因的亚组包括但不限于：1-5个、5-10个、10-25个、25-50个、50-100个、100-200个、200-500个、500-1,000个、1,000-2,000个、2,000-2,500个、2,500-5,000个、5,000-10,000个和多于10,000个基因。转录模式可以以二元形式比较，即，可以进行比较来确定基因是转录的还是未转录的。在另一实施方案中，可以比较每种基因或基因亚组的转录速率和/或程度。可以使用本领域中已知的任何方法来确定转录模式，包括但不限于RT-PCR、定量PCR、微阵列、DNA印迹和杂交。
本发明的实施方案还包括包含使用根据本文所公开的方法产生的重编程的细胞治疗多种疾病的方法。在又一实施方案中，本发明还涉及重编程的细胞和再分化的重编程的细胞的治疗用途。
本发明的实施方案还涉及由本发明的方法制备的重编程的细胞。重编程的细胞可以再分化为单个谱系或多于一种谱系。重编程的细胞可以是多能的或复能的。
在又一实施方案中，本发明涉及根据包括下列步骤的方法制备的富集的重编程的细胞群：将细胞群暴露于抑制组蛋白脱乙酰酶的活性、表达、或活性和表达的剂；诱导复能基因或多能基因的表达；选择表达指示复能细胞或多能细胞的细胞表面标记物的细胞；以及扩增所述选择的细胞以制备细胞群，其中所述细胞已恢复分化潜能。
在又一实施方案中，重编程的细胞表达指示复能细胞的细胞表面标记物，所述细胞表面标记物选自由下列组成的组：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。在又一实施方案中，重编程的细胞表达复能基因，所述复能基因包括但不限于Oct-4、Sox-2和Nanog。在又一实施方案中，重编程的细胞占富集的细胞群的至少5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％、96-98％；或至少99％。
本发明的实施方案还涉及用于制备本发明的方法和组合物的试剂盒。该试剂盒尤其可用于重编程细胞和产生ES样细胞和干细胞样细胞。
附图简述
图1是报道在用丙戊酸(VPA)处理的原代人肺细胞中Oct-4的上调的柱形图。
图2是报道在用HDAC抑制剂(VPA)处理的原代人肺细胞中赋予干细胞样特征的几种基因的上调的柱形图。
图3是报道在用VPA处理的细胞中Oct-4的第一外显子中的两个胞嘧啶脱甲基化的图解。
图4A是报道在成人皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Nanog的作用的图。图4B是报道在人新生儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Nanog的作用的图。图4C是报道在人胎儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Nanog的作用的图。
图5A是报道在成人皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Oct-4的作用的图。图5B是报道在人新生儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Oct-4的作用的图。图5C是报道在人胎儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Oct-4的作用的图。
图6是报道在人胎儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7或HDAC11shRNA干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Sox-2的作用的图。
图7是报告在人皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7shRNA干扰期间的mRNA表达而测量的对各种HDAC和SIRT基因的作用的图。
图8是报道在成人皮肤成纤维细胞(HDFa)、人新生儿皮肤成纤维细胞(HDFn)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)中如通过在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Nanog的作用的图。
图9是报道在成人皮肤成纤维细胞(HDFa)、人新生儿皮肤成纤维细胞(HDFn)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)中如通过在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Oct-4的作用的图。
图10是报道在成人皮肤成纤维细胞(HDFa)、人新生儿皮肤成纤维细胞(HDFn)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)中如通过在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对基因Sox-2的作用的图。
图11是报道在成人皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对多种HDAC基因和SIRT基因的作用的图。
图12是报道在人胎儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对多种HDAC基因和SIRT基因的作用的图。
图13是报道在人新生儿皮肤成纤维细胞中如通过在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间mRNA表达的倍数改变而测量的对多种HDAC基因和SIRT基因的作用的图。
图14A是报道在成人皮肤成纤维细胞中HDAC7a shRNA对HSAC7a和HDAC11表达的作用的图。报道了在不存在和存在嘌呤霉素两种情况下细胞生长的数据。
图14B是报道在人新生儿皮肤成纤维细胞中HDAC7a shRNA对HSAC7a和HDAC11表达的作用的图。报道了在不存在和存在嘌呤霉素两种情况下细胞生长的数据。
图14C是报道在人胎儿皮肤成纤维细胞中HDAC7a shRNA对HSAC7a和HDAC11表达的作用的图。
图15A是人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图15B是用DNMT1shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图15C是用HDAC7shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图15D是用DNMT1和HDAC7shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图15E是用DNMT1和HDAC11shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图15F是用HDAC11和HDAC7shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图15G是人胚胎干细胞的照片。
图16A是人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图16B是用DNMT1shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图16C是用DNMT1和HDAC7shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图16D是用DNMT1和HDAC11shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图16E是用HDAC7shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图16F是用HDAC11和HDAC7shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞的照片。
图16G是人胚胎干细胞的照片。
优选实施方案详述
定义
除非另外指明，否则本公开内容中的数字范围是近似的，并且因此可以包括该范围之外的值。数字范围包括来自以一个单位递增的下限值和上限值之间的所有值并且包括下限值和上限值，前提条件是在任何下限值和任何上限值之间存在至少两个单位的分隔。作为实例，如果成分特征、物理特征或其他特征诸如分子量、粘度、熔化指数等是100至1,000，则旨在清楚地列举所有单个的值，例如100、101、102等，和子范围，例如100至144、155至170、197至200等。对于含有小于1的值或含有大于1的分数数字(例如，1.1、1.5等)的范围，一个单位视情况被认为是0.0001、0.001、0.01或0.1。对于含有小于10的单数字的范围(例如，1至5)，通常认为一个单位是0.1。这些仅是具体意指的实例，认为在所列举的最低值和最高值之间的所有可能的数值组合均清楚地在本公开内容中陈述。在本公开内容中尤其提供的数字范围是混合物中组分的相对量和方法中所引用的各种温度以及其他参数范围。
除非明确限制为相反的情况，否则细胞(“cell”或“cells”)包括任何体细胞、胚胎干(ES)细胞、成体干细胞、器官特异性干细胞、核转移(NT)单位以及干样细胞(stem-like cell)。细胞可以由任何器官或组织获得。细胞可以是人或其他动物的。例如，细胞可以是小鼠的、豚鼠的、大鼠的、牛的、马的、猪的、绵羊的、山羊的等。细胞还可以来自非人的灵长类。
“培养基”或“生长培养基”意指能够支持细胞生长的合适的培养基。
“分化”意指在胚胎发育期间细胞变得在结构和功能上特化的过程。
“表观遗传学”意指关于在不改变核苷酸序列的条件下功能上的可遗传改变的DNA状态。表观遗传学改变可以是由诸如甲基化和脱甲基化等DNA修饰引起的，而没有任何DNA核苷酸序列改变。
“组蛋白”意指存在于染色体中的一类蛋白质分子，它负责将DNA压缩得足以使DNA适于在核内。
“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”和“组蛋白脱乙酰酶的抑制剂”意指能够与组蛋白脱乙酰酶相互作用并抑制其酶活性的化合物。“抑制组蛋白脱乙酰酶活性”意指降低组蛋白脱乙酰酶从合适的底物例如组蛋白或其他蛋白移除乙酰基的能力。在一些实施方案中，组蛋白脱乙酰酶活性的这种降低是至少约10-25％，在另一实施方案中，至少约50％，在其他实施方案中，至少约75％，并且还在其他的实施方案中，至少约90％。还在其他实施方案中，组蛋白脱乙酰酶活性降低了至少95％，并且在其他实施方案中降低至少99％。
“敲低(knock down)”意指以基因特异性方式阻抑基因的表达。具有一种或多种基因被“敲低”的细胞被称为敲低生物体或简单称为“敲低”。
“复能”意指能够分化成3胚层细胞类型或基本组织类型。
“复能基因”意指促使细胞为复能的基因。
“复能细胞培养物”在表现出将它们与胚胎或成体来源的分化的细胞明显区别开的形态时被称为是“基本上未分化的”。复能细胞通常具有高的核/胞质比、突出的核仁以及具有差的辨识度的细胞连接的紧密集落形成，并且容易被本领域技术人员识别。认识到未分化的细胞集落可以被分化的邻近细胞环绕。然而，当在适当的条件下培养时，基本上未分化的集落继续存在，并且在分离培养的细胞后，未分化的细胞构成了大部分的细胞。本公开内容中描述的可用的细胞群含有任何比例的具有这些标准的基本上未分化的复能细胞。基本上未分化的细胞培养物可以含有至少约20％、40％、60％或甚至80％未分化的复能细胞(以群中总细胞的百分比计)。
“调节蛋白”意指调节生物过程的任何蛋白，包括正向和负向的调节。调节蛋白可以对生物过程具有直接或间接的作用，并且可以直接施加影响或通过参与到复合体中来施加影响。
“重编程”意指移除核中的表观遗传学标记，然后建立不同组的表观遗传学标记。在多细胞生物体的发育期间，不同的细胞和组织获得不同的基因表达程序。这些不同的基因表达模式表现为实际上由诸如DNA甲基化、组蛋白修饰和其他染色质结合蛋白等表观遗传学修饰调节。因此多细胞生物体中的每种细胞类型具有独特的表观遗传学标志，常规上认为该标志在细胞分化后或退出细胞周期之后变成“固定的”且不变的。然而，一些细胞在正常发育或某些疾病期间会进行主要的表观遗传学“重编程”。
“全能”意指能够发育成整个胚胎或器官。
本发明的实施方案涉及包括诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达的方法。在另一实施方案中，本发明涉及包括诱导促使细胞为多能的至少一种基因表达的方法。在一些实施方案中，方法包括诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达；和制备能够定向分化成至少一个谱系的重编程的细胞。
本发明的实施方案还涉及包括下列的方法：修饰染色质结构和将细胞重编程为复能或多能的。在又一实施方案中，修饰染色质结构包括抑制HDAC的活性。
在另一实施方案中，方法包括抑制HDAC的活性，以及诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达。在又一实施方案中，方法包括抑制HDAC的活性和制备重编程的细胞。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞暴露于抑制HDAC的活性、表达、或活性和表达的剂；诱导复能基因或多能基因表达；以及选择细胞，其中所述细胞已恢复分化潜能。复能基因或多能基因可以被诱导为表达增加任何倍数，包括但不限于0.25-0.5、0.5-1、1.0-2.5、2.5-5、5-10、10-15、15-20、20-40、40-50、50-100、100-200、200-500和大于500。在另一实施方案中，方法包括铺板分化的细胞；将所述分化的细胞暴露于抑制HDAC的活性、表达、或活性和表达的剂；培养所述细胞；以及鉴定已被重编程的细胞。
在另一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括将细胞暴露于诱导抑制HDAC活性的调节蛋白的表达、活性、或表达和活性的剂，诱导复能基因或多能基因的表达；以及选择细胞，其中所述细胞已恢复分化潜能。调节蛋白的活性或表达可以增加任何量，包括但不限于：1-5％、5-10％、10-20％、20-30％、30-40％、40-50％、50-60％、60-70％、70-80％、80-90％、90-95％和95-99％、99-200％、200-300％、300-400％、400-500％以及大于500％。
在又一实施方案中，方法还包括使用针对由复能基因或多能基因编码的蛋白或蛋白片段的抗体或针对复能表面标记物的抗体选择细胞。可以使用任何类型的抗体，包括但不限于：单克隆的、多克隆的、抗体片段、肽模拟物、活性区域的抗体以及蛋白保守区域的抗体。
在又一实施方案中，方法还包括使用由复能基因或多能基因驱动的报道分子或复能或多能表面标记物选择细胞。可以使用任何类型的报道分子，包括但不限于：荧光蛋白、绿色荧光蛋白、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、细菌萤光素酶、水母发光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、dsRED、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。
在又一实施方案中，方法还包括使用抗性作为选择标记来选择细胞，所述抗性包括但不限于：抗生素抗性、杀真菌剂抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、二氢叶酸还原酶抗性、胸苷激酶抗性、新霉素抗性(neo)、G418抗性、麦考酚酸抗性(gpt)、博来霉素(zeocin)抗性蛋白和链霉素抗性。
在又一实施方案中，方法还包括比较在将细胞暴露于抑制HDAC的活性、表达、或活性和表达的剂之前所述细胞的复能基因或多能基因的染色质结构与用所述剂处理之后所获得的复能基因或多能基因的染色质结构。可以比较染色质结构的任何方面，包括但不限于：常染色质、异染色质、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化、组蛋白或组蛋白组分的存在和不存在、组蛋白的定位、组蛋白的排列以及与染色质缔合的调节蛋白的存在或不存在。可以比较基因任一区域的染色质结构，包括但不限于：增强子元件、激活子元件、启动子、TATA盒、转录起始位点的上游区域、转录起始位点的下游区域、外显子和内含子。
在又一实施方案中，方法包括抑制至少一种HDAC的活性；去甲基化CpG二核苷酸中的至少一个胞嘧啶；以及诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因的表达。
在又一实施方案中，方法包括使细胞接触HIDAC抑制剂；抑制HDAC的活性；以及诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达。在又一实施方案中，方法还包括制备重编程的细胞。重编程的细胞可以是复能或多能的。
本发明的方法、组合物和试剂盒的HDAC抑制剂可以与任何HIDAC相互作用。例如，本发明的HDAC抑制剂可以与来自HDAC的四种已知类之一的HDAC相互作用。本发明的HDAC抑制剂可以与I类、II类、III类或IV类的HDAC相互作用。HDAC抑制剂可以与一种特定类的HDAC、所有类的HDAC或与多类HDAC相互作用，所述多类HDAC包括但不限于：I类和II类；I类和III类；I类和IV类；II类和III类；II类和IV类；III类和IV类；I、II和III类；II、III和IV类；以及I、II、III和IV类。HDAC抑制剂还可以与不属于已知类之一的HDAC相互作用。
HDAC抑制剂可以具有不可逆的作用机制或可逆的作用机制。HDAC抑制剂可以具有任何结合亲和力，包括但不限于：毫摩尔(mM)、微摩尔(μM)、纳摩尔(nM)、皮摩尔(pM)和分摩尔(fentamolar，fM)。
优选地，这种抑制是特异性的，即，组蛋白脱乙酰酶抑制剂降低组蛋白脱乙酰酶从组蛋白移除乙酰基的能力所用的浓度低于该抑制剂产生另一不相关的生物作用所需的浓度。优选地，组蛋白脱乙酰酶抑制活性所需的抑制剂浓度比产生不相关的生物作用所需的浓度低至少2倍、更优选低至少5倍，甚至更优选低至少10倍，并且最优选低至少20倍。
在另一实施方案中，HDAC抑制剂可以通过与含锌的HDAC催化结构域结合而起作用。具有这种作用机制的HDAC抑制剂属于几组：(i)氧肟酸，例如曲古抑菌素A；(ii)环四肽；(iii)苯甲酰胺；(iv)亲电子的酮；和(v)化合物的脂肪酸基团，例如苯丁酸盐和丙戊酸。
在又一实施方案中，HDAC抑制剂可针对于sertuin III类HDAC，它们是NAD+依赖性的，并且包括但不限于：烟酰胺、NAD的衍生物、二氢香豆素、萘吡喃酮和2-羟基萘醛。
在又一实施方案中，HDAC抑制剂可以改变非组蛋白效应分子的乙酰化程度并从而增加基因的转录。本发明的方法、组合物和试剂盒的HDAC抑制剂不应被认为是仅作为HDAC的酶抑制剂起作用。已知大量非组蛋白转录因子和转录辅调蛋白通过乙酰化被修饰，包括但不限于：ACTR、cMyb、p300、CBP、E2F1、EKLF、FEN 1、GATA、HNF-4、HSP90、Ku70、NFκB、PCNA、p53、RB、Runx、SF1、Sp3、STAT、TFIIE、TCF和YY1。可以用本发明的方法增加参与激活转录的被乙酰化的任何转录因子或蛋白的活性。
表I提供了可以充当HDAC抑制剂的化合物的代表性列表。表I中“同种型”的含义是指仅提供了关于化合物对于特定类的HDAC是否具有偏爱的理解。列出特定同种型或类的HDAC不应解释为意指化合物仅对该同种型或类具有亲和力。本发明的HDAC抑制剂包括本文所提及的任何HDAC抑制剂的衍生物和类似物。
丁酸或丁酸盐是被鉴定的首个HDAC抑制剂。然而，毫摩尔浓度的丁酸盐可能对HDAC不是特异性的，它还可以抑制核蛋白的磷酸化和甲基化以及DNA甲基化。类似物苯基丁酸盐以类似方式起作用。更具体的是曲古抑菌素A(TSA)和trapoxin(TPX)。TPX和TSA已作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂出现。TSA可逆地抑制HDAC酶，而TPX不可逆地结合并灭活HDAC酶。与丁酸盐不同，还没有报道TSA或TPX对其他酶系统的非特异性抑制。
丙戊酸也抑制组蛋白脱乙酰酶活性。VPA是依据不同的分子作用机制而具有多种生物活性的已知药物。VPA是抗癫痫药物。VPA是致畸的。当在妊娠期间用作抗癫痫药物时，VPA可以在少数百分比的出生儿中诱导出生缺陷(神经管闭合缺陷和其他畸形)。在小鼠中，VPA在正确给药时在大多数小鼠胚胎中是致畸的。VPA激活核激素受体(PPAR-δ)。
表I.可以充当HDAC抑制剂的化合物的代表性列表。
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许多HDAC抑制剂还可从Sigma Aldrich(St.Louis，MO)获得，它们包括但不限于APHA化合物；Apicidin；Depudecin；Scriptaid；Sirtinol和曲古抑菌素A。此外，另外的HDAC抑制剂可从Vinci-Biochem(意大利)获得，它们包括但不限于：5-氮杂-2′-脱氧胞苷；CAY10398；CAY10433；6-氯-2，3，4，9-四氢-1H-咔唑-1-羧酰胺；HC毒素；ITSA1；M344；MC 1293；MS-275；Oxamflatin；PXD101；SAHA；Scriptaid；Sirtinol；Splitomicin。还可以使用地塞米松与任何HDAC抑制剂组合。例如，可以使用包含地塞米松和5-氮杂-2′-脱氧胞苷的组合物。
可以使用任何数目、任何组合和任何浓度的HDAC抑制剂，包括但不限于1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11-15种、16-20种和21-25种HDAC抑制剂。可以抑制一个家族或多于一个家族的抑制蛋白。可以使用一种或多于一种的抑制机制，包括但不限于：小分子抑制剂、HDAC抑制剂、shRNA、RNA干扰和小干扰RNA。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括抑制在补偿途径中起作用的两种或更多种抑制蛋白。在另一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括抑制在冗余途径(redundant pathway)中起作用的两种或更多种蛋白。在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括抑制一种或多种HDAC蛋白和抑制功能为补偿抑制的HDAC的一种或多种蛋白。一种抑制蛋白如HDAC的抑制可以导致一种或多种其他抑制蛋白表达的增加。抑制冗余蛋白、补偿蛋白、或冗余蛋白和补偿蛋白的表达可以使用任何合适的方法来完成，包括但不限于：shRNA、RNA干扰、HDAC抑制剂和小分子抑制剂。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括抑制抑制蛋白的表达、活性、或表达和活性，其中所述抑制蛋白的抑制不引起其他抑制蛋白的表达、活性、或表达和活性增加。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括抑制抑制蛋白的表达、活性、或表达和活性，其中所述抑制蛋白的抑制不引起补偿蛋白的表达、活性、或表达和活性增加。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括抑制抑制蛋白的表达、活性、或表达和活性，其中所述抑制蛋白的抑制不引起冗余蛋白的表达、活性、或表达和活性增加。
在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞暴露于抑制多于一种调节蛋白的活性、表达、或表达和活性的剂。调节蛋白可以是同一家族的或不同的蛋白家族的成员。在又一实施方案中，本发明涉及重编程细胞的方法，该方法包括：将细胞暴露于抑制第一调节蛋白的活性、表达、或表达和活性的剂；将所述细胞暴露于抑制第二调节蛋白的活性、表达、或表达和活性的第二剂，其中所述第二调节蛋白具有与第一调节蛋白不同的功能。第一调节蛋白和第二调节蛋白可以是参与调节或改变蛋白表达的任何蛋白，包括但不限于：组蛋白脱乙酰酶、组蛋白乙酰基转移酶、赖氨酸甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、曲古抑菌素A、组蛋白脱甲基酶、赖氨酸脱甲基酶、sirtuin和sirtuin激活蛋白、核受体、孤儿核受体、Esrrβ和Esrrγ。
通过本发明的方法制备的重编程的细胞可以是复能的或多能的。由本发明的方法制备的重编程的细胞可以具有多种不同的特性，包括胚胎干细胞样特性。例如，重编程的细胞可以能够以未分化的状态增殖至少10代、15代、20代、30代或更多代。换言之，重编程的细胞可以增殖超过一年而不分化。重编程的细胞还可以在增殖和/或分化时维持正常的核型。一些重编程的细胞还可以是能够在体外以未分化的状态无限增殖的细胞。一些重编程的细胞还可以在延长培养中维持正常的核型。一些重编程细胞甚至在延长培养后也可以维持分化为所有三个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的潜能。一些重编程的细胞可以形成生物体中的任何细胞类型。一些重编程的细胞可以在某些条件下如在不维持未分化的生长的培养基上生长的条件下形成胚状体。例如，一些重编程的细胞可以通过与胚泡融合而形成嵌合体。
重编程的细胞可以通过多种标记物来限定。例如，一些重编程的细胞表达碱性磷酸酶。一些重编程的细胞表达SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些重编程的细胞表达Oct 4、Sox2和Nanog。应理解一些重编程的细胞将在mRNA水平表达这些标记物，而其他的将还在蛋白水平表达它们，例如在细胞表面上或在细胞内。
重编程细胞可以具有本文所讨论的任何重编程细胞的特性或种类、或种类和特性的任何组合。例如，重编程的细胞可以表达碱性磷酸酶，不表达SSEA-1，增殖至少20代，并能够分化成任何细胞类型。另一重编程细胞可以例如在细胞表面上表达SSEA-1，并且能够形成内胚层、中胚层和外胚层组织，并且培养超过一年而不分化。
重编程的细胞可以是碱性磷酸酶(AP)阳性、SSEA-1阳性和SSEA-4阴性的。重编程的细胞还可以是Nanog阳性、Sox2阳性和Oct-4阳性的。重编程的细胞还可以是Tcl1阳性和Tbx3阳性的。重编程的细胞还可以是Cripto阳性、Stellar阳性和Daz1阳性的。重编程的细胞可以表达细胞表面抗原，该细胞表面抗原与具有单克隆抗体TRA-1-60(ATCC HB-4783)和TRA-1-81(ATCC HB-4784)的结合特异性的抗体结合。此外，如本文所公开的，重编程的细胞可以在没有饲养层的条件下维持至少10代、11代、12代、13代、14代、15代、16代、17代、18代、19代、20代或超过一年。
重编程的细胞可以具有分化成不同谱系的广泛的细胞类型的潜能，所述细胞类型包括成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌、内皮、间质、平滑肌、心肌、神经细胞、造血细胞、胰岛或实际上机体的任何细胞。重编程的细胞可以具有分化成所有细胞谱系的潜能。重编程的细胞可以具有分化成任何数目的谱系的潜能，包括1种、2种、3种、4种、5种、6-10种、11-20种、21-30种和多于30种谱系。
可以通过本发明的方法诱导促使细胞为复能或多能的任何基因，包括但不限于：甘氨酸N-甲基转移酶(Gnmt)、八聚体-4(Oct4)、Nanog、SRY(性别决定区Y)-盒2(也称为Sox2)、Myc、REX-1(也称为Zfp-42)、整联蛋白α-6、Rox-1、LIF-R、TDGF1(CRIPTO)、Fragilis、SALL4(sal样4)、GABRB3、LEFTB、NR6A1、PODXL、PTEN、白细胞源趋化因子1(LECT1)、BUB1和Krüppe1样因子(K1f)如Klf4和K1f5。可以通过本发明的方法诱导促使细胞为复能或多能的任何数目的基因，包括但不限于：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11-20种、21-30种、31-40种、41-50种和多于50种基因。
此外，Ramalho-Santos等人(Science 298，597(2002))、Ivanova等人(Science 298，601(2002))和Fortunel等人(Science 302，393b(2003))各自比较了三种类型的干细胞并且鉴定了常规表达的“干(stemness)”基因列表，认为“干”基因对于赋予干细胞功能特征是重要的。可以通过本发明的方法诱导在上面所提及的研究中所鉴定的任何基因。表II提供了被认为参与赋予干细胞功能特征的基因列表。除了表II中所列的基因外，Ramalho-Santos等人和Ivanova等人还鉴定了与已知基因具有极小或没有同源性的93种表达的序列标签(EST)集簇，并且它们也包括在本发明的方法中。
表II.参与赋予干细胞特征的基因
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本发明的实施方案还涉及重编程细胞的方法，该方法包括修饰基因的染色质结构，和诱导所述基因的表达。在另一实施方案中，方法包括修饰复能基因或多能基因的染色质结构。在再一实施方案中，方法还包括通过修饰组蛋白来修饰染色质结构。修饰组蛋白包括但不限于乙酰化；甲基化；脱甲基化；磷酸化；泛素化；苏素化；ADP-核糖基化；脱亚胺化(deimination)和脯氨酸异构化。
本发明的实施方案还包括使用根据本文所公开的方法制备的重编程的细胞治疗多种疾病的方法。本领域技术人员根据本文所提供的公开内容将了解再生医学在治疗大量疾病中的价值和潜能，所述疾病包括但不限于：心脏病、糖尿病、皮肤病和皮肤移植、脊髓损伤、帕金森病、多发性硬化、阿尔茨海默病以及类似疾病。本发明涵盖将重编程的细胞施用给包括人的动物以便治疗疾病的方法，其中新的未损伤的细胞的引入将提供某种形式的治疗减轻。
本领域技术人员将理解重编程的细胞可以作为再分化的细胞如神经元施用给动物，并且它们将可用于替代动物中患病的或损伤的神经元。此外，重编程的细胞可以施用给动物，并且它们在接收到来自周围环境的信号和指令之后可以再分化为邻近的细胞环境所要求的期望细胞类型。可选择地，细胞可以在体外再分化并且可以将分化的细胞施用给需要其的哺乳动物。
可以制备重编程的细胞来用于移植以确保在体内环境中长期存活。例如，细胞可以在适于该细胞的生长和维持的培养基如祖细胞培养基中繁殖并容许其生长至汇合。用例如缓冲液将使细胞从培养基底上离开，所述缓冲液例如含有0.05％胰蛋白酶的补充有下列物质的磷酸盐缓冲盐水(PBS)：1mg/ml葡萄糖、0.1mg/ml MgCl2、0.1mg/ml CaCl2(完全PBS)，加上5％血清以灭活胰蛋白酶。可以使用离心来用PBS洗涤细胞，然后将细胞重悬在没有胰蛋白酶的完全PBS中并以为注射所选择的密度。
适于肠胃外施用的药物组合物的制剂包含与诸如无菌水或无菌等渗盐水等药学上可接受的载体组合的活性成分。这种制剂可以适于推注施用或适于连续施用的形式制备、包装或出售。注射制剂可以单位剂型制备、包装或出售，例如在安瓿中或在含有防腐剂的多剂量容器中。用于肠胃外施用的制剂包括但不限于：悬浮液、溶液、在油性或水性媒介物中的乳液、糊剂和可植入的持续释放制剂或可生物降解制剂。这种制剂还可以包含一种或多种另外的成分，包括但不限于：悬浮剂、稳定剂或分散剂。
本发明还涵盖移植重编程的细胞与其他治疗方法组合来治疗机体中的疾病或创伤，包括CNS、PNS、皮肤、肝、肾、心、胰腺以及类似物的疾病或创伤。因此，本发明的重编程的细胞可以与其他细胞共移植，所述其他细胞是对患者发挥有益作用的遗传上被修饰的和遗传上未被修饰的细胞，例如来自肾上腺的嗜铬细胞、胎儿脑组织细胞和胎盘细胞。因此，如本领域技术人员在具备了本文的教导之后将理解的，本文所公开的方法可以与其他治疗方法组合。
可以使用本领域中已知的技术将本发明的重编程细胞“裸(naked)”移植到患者中，例如在美国专利第5,082,670号和5,618,531号(它们每一个均通过引用并入本文中)中所描述的那些技术，或者将其移植到机体的任何其他合适部位中。
重编程的细胞可以作为主要由单细胞组成的混合物/溶液或作为包含细胞聚集体悬浮液的溶液移植。这种聚集体可以是直径为大约10-500微米，并且更优选地，直径为约40-50微米。重编程的细胞聚集体可以包含每个球体约5-100个细胞，更优选每个球体约5-20个细胞。移植的细胞的密度可以介于约10,000个细胞/微升至1,000,000个细胞/微升，更优选约25,000个细胞/微升至500,000个细胞/微升。
本发明的重编程的细胞的移植可以使用本领域中熟知的技术以及以后开发的那些技术来完成。本发明包括移植(transplanting)、移植(grafting)、输注或以其他方式将重编程的细胞引入动物，优选人中的方法。
还可以根据已知的囊化技术将重编程的细胞囊化并用于递送生物活性分子，所述囊化技术包括微囊化(参见，例如，美国专利第4,352,883号；4,353,888号；以及5,084,350号，通过引用并入本文)或巨囊化(macroencapsulation)(参见，例如，美国专利第5,284,761号；5,158,881号；4,976,859号；和4,968,733号；以及国际公布第WO 92/19195号；WO95/05452号，它们所有均通过引用并入本文)。对于巨囊化，装置中的细胞数目可以变化；优选地，每个装置含有103-109个细胞，更优选地，约105至107个细胞。几种巨囊化装置可以被植入患者体内。用于细胞的巨囊化和植入的方法是本领域中熟知的，并且描述于例如美国专利第6,498,018号中。
本发明的重编程的细胞还可以用于表达外来蛋白或分子以用于治疗目的或用于示踪它们在患者组织中的整合和分化的方法。因此，本发明涵盖将外源DNA引入重编程的细胞中，并且同时在重编程的细胞中表达该外源DNA的表达载体和方法，如在例如Sambrook等人(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)中和在Ausubel等人(1997，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验方案)，John Wiley&Sons，New York)中所描述的。
本发明的实施方案还涉及包含由本发明的方法制备的细胞的组合物。在另一实施方案中，本发明涉及包含通过抑制至少一种HDAC的活性而已被重编程的细胞的组合物。在又一实施方案中，本发明涉及包含通过诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达而已被重编程的细胞的组合物。
本发明的实施方案还涉及通过使细胞接触至少一种HDAC抑制剂而制备的重编程的细胞。
本发明的实施方案还涉及用于制备本发明的方法和组合物的试剂盒。该试剂盒尤其可用于制备重编程细胞和产生ES样细胞和干细胞样细胞、诱导促使细胞为复能或多能的至少一种基因表达、以及抑制至少一种HDAC的活性。试剂盒可以包含至少一种HDAC抑制剂。试剂盒可以包含多种HDAC抑制剂。HDAC抑制剂可以在单个容器中或在多个容器中提供。
试剂盒还可以包含确定细胞是否已被重编程所需的试剂，包括但不限于：测试促使细胞为复能或多能的基因的诱导的试剂、测试HDAC的抑制的试剂、以及测试重建染色质结构的试剂。
试剂盒还可以包含可用于将重编程的细胞分化为特定的谱系或多种谱系的试剂，所述谱系包括但不限于：神经元、成骨细胞、肌细胞、上皮细胞和肝细胞。
试剂盒还可以含有说明材料，其描述试剂盒中所提供的组分的用途。如本文所用，“说明材料”包括印刷物、记录、图表或可用于传达试剂盒中本发明的方法的有用性的任何其他表达介质，该有用性尤其是用于实现分化的细胞的重编程。任选地或可选地，说明材料可以描述将本发明的细胞再分化和/或转分化的一种或多种方法。本发明试剂盒的说明材料可以例如粘贴到含有HDAC抑制剂的容器上。可选地，说明材料可以与容器分别运输，目的是使接受者协调地使用说明材料和HDAC抑制剂或其组分。
现在参考下列实施例描述本发明。这些实施例仅为了示例的目的提供，并且本发明绝不应被理解为限制于这些实施例，而是应被理解为涵盖由本文所提供的教导而变得明显的任何的和所有的改变。包括但不限于美国专利、容许的美国专利申请或公布的美国专利申请的所有参考文献均通过引用整体并入本说明书中。
实施例
下列实施例仅是示例性的，并且不旨在限制如由权利要求书所限定的本发明的范围。
实施例1：
已显示组蛋白脱乙酰酶抑制剂使组蛋白乙酰化并使DNA脱甲基化，从而以至少两种方式修饰染色质结构。在存在和不存在组蛋白脱乙酰酶抑制剂的情况下测试促使细胞为复能的基因的表达水平。在本实施例中，使用的是丙戊酸(VPA)，但是可以使用任何组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
方法
细胞培养.原代人肺细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)，并且在37℃、95％湿度和5％CO2中在含有下列物质的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Hyclone)中维持：10％胎牛血清(FBS，Hyclone)和0.5％青霉素和链霉素。使细胞在存在1mM VPA、5mM VPA或不存在VPA的情况下生长3天。
定量RT-PCR.通过每种培养条件(0mM VPA、1mM VPA和5mM VPA)下的实时RT-PCR确定Oct-4和Nanog的表达。简言之，根据厂家的方法，使用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)，用DNA酶I消化而从培养物制备总RNA。将来自每种样品的总RNA(1μg)进行以寡聚(dT)引发的反转录(Invitrogen；Carlsbad，CA)。用PCR预混合液(master mix)在7300实时PCR系统(Applied Biosystems；Foster City，CA)上进行实时PCR反应。对于每种样品，将1μl稀释的cDNA(1∶10)作为模板添加到PCR反应中。将Oct-4和Nanog的表达水平相对于GAPD标准化。
胚胎Taqman低密度阵列分析.促使细胞为复能的(pluripotentail)的几种基因(“干基因”)的表达水平使用人胚胎Taqman低密度阵列分析(TLDA)来确定。分析了几种干基因：GABRB3、LEFTB、NR6A1、PODXL和PTEN。此外，确定了DNA甲基转移酶DNMT3B的表达水平。使用含有90种胚胎肝细胞和发育基因以及6种内源对照基因的Applied Biosystems人胚胎TLDA进行实时定量RT-PCR以定量相对表达水平(Applied Biosytems，Foster City，CA)。简言之，在使用ABI高容量cDNA反转录试剂盒(ABI；Foster City，CA)进行RNA反转录之后，将在50μl无核酸酶的水加上50μl ABI通用Taqman 2×PCR预混合液中的150ng样品cDNA移液到TLDA微流卡的各口中，并在ABI 7900HT快速实时PCR系统上进行分析。使用ΔΔCT方法来计算处理的细胞相对于未处理的对照细胞中的基因表达水平的相对量(倍数改变)。还可以将处理的细胞与联邦批准的人胚胎干细胞比较。
亚硫酸氢盐测序.亚硫酸氢盐测序是使用亚硫酸盐处理DNA来确定甲基化的模式的。亚硫酸氢盐测序是基于如下的事实：用亚硫酸氢盐处理DNA会将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但是留下5-甲基胞嘧啶残基不受影响。因此亚硫酸氢盐处理依据单个胞嘧啶残基的甲基化状态而在DNA序列中引入特定的改变，从而产生关于DNA区段的甲基化状态的极高辨别率的信息。
通过亚硫酸氢盐测序来分析复能基因启动子的甲基化。简言之，通过苯酚氯仿-异戊醇萃取来纯化DNA。根据厂家的方法(Zymo Research；Orange，CA)使用EZ DNA甲基化试剂盒来进行亚硫酸氢盐转化。在非CpG二核苷酸中所有胞嘧啶向尿嘧啶转化的转化率是100％。使用人Oct3/4、Nanog和SOX2的引物通过PCR扩增转化的DNA。通过TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen；Carlsbad，CA)将PCR产物克隆到大肠杆菌(E.coli)中。通过用SP6和T7引物测序来验证每种样品的10个克隆。比较各细胞群之间所感兴趣的每种启动子的总体甲基化百分比和给定的CpG的甲基化的胞嘧啶数。
结果
如在图1中所显示的，与对照细胞(MC)相比，在用5mM VPA处理的原代人肺细胞中Oct4的表达被上调(约2.7倍；p＜0.01)。这些结果证明，HDAC抑制剂可以导致促使细胞为复能的基因的诱导或表达增加。
还使用在5mM VPA中生长3天的细胞分析了几种“干”基因的表达水平。如在图2中所显示的，胚胎Taqman低密度阵列分析揭示了下列干基因的上调：GABRB3(p＜0.05)；LEFTB(p＜0.05)；NR6A1(p＜0.03)；PODXL(p＜0.05)；PTEN(p＜0.01)(n＝每组三个重复)。此外，DNA甲基转移酶、DNMT3B被下调。在对照细胞中未检测到的几种其他干相关基因(stemness-related gene)在VPA处理的细胞中被诱导，包括：FOXD3、NR5A2、TERT、LIFR、SFRP2、TFCP2L1、LIN28、SOX2和XIST。
通过亚硫酸氢盐测序来分析Oct-4基因的第一外显子。亚硫酸氢盐测序揭示了在未处理的(-)和处理的(+)细胞中甲基化的胞嘧啶在Oct4的上游(3F-3R)(参见图3)。此外，在处理的细胞中Oct4启动子/第一外显子区的CpG二核苷酸中的两个胞嘧啶被脱甲基化(参见图3)。这些模式在几个克隆之间是一致的(数据未显示)。
这些结果证明，HDAC抑制剂可以诱导促使细胞为复能或多能的基因表达、可以降低DNA甲基转移酶的表达并且使DNA中的胞嘧啶脱甲基化。此外，HDAC抑制剂可以导致促使细胞为复能或多能的基因的启动子区中的胞嘧啶脱甲基化。
实施例2：
测试了HDAC7shRNA慢病毒感染对Oct-4.、Nanog和Sox 2的mRNA表达水平的作用。此外，在独立的实验组中，还测试了HDAC11shRNA慢病毒感染对Oct-4.、Nanog和Sox 2的mRNA表达水平的作用。使用3种类型的人皮肤成纤维细胞：成人皮肤成纤维细胞(HDFa)、人新生儿皮肤成纤维细胞(HDFn)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)。
方法：
用shRNA慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(HDFa、HDFn和HDFf)以干扰HDAC7。在独立的实验组中，用shRNA慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(HDFa、HDFn和HDFf)以干扰HDAC11。从HDF(包括嘌呤霉素选择)分离RNA并将其应用于RT-PCR以分析下列靶基因的表达：例如Oct-4、Nanog、Sox2、多种HDAC和多种SIRT基因。已经成功地用shRNA转染了包括嘌呤霉素(抗生素)抗性作为一种选择细胞的方法的shRNA构建体。转染之后，将嘌呤霉素添加到培养物中，并且无抗性的(因此未被转染的)细胞死亡，从而在培养物中仅保留转染的细胞。
细胞培养.人皮肤成纤维细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)并且在37℃、95％湿度和5％CO2中在成纤维细胞生长培养基(Cell Applications，San Diego，CA)中维持。
慢病毒感染.用shRNA构建体感染人皮肤成纤维细胞。shRNA构建体是从Dharmacon获得的。针对于HDAC7a的shRNA构建体具有下列序列：
SEQ ID NO.1：GCTTTCAGGATAGTCGTGA
具有下列序列的shRNA构建体针对于HDAC11：
SEQ ID NO.2：AGCGAGACTTCATGGACGA
此外，具有下列序列的shRNA构建体针对于HDAC11：
SEQ ID.NO.3：TGGTGGTATACAATGCAGG
根据厂家的说明用shRNA感染人皮肤成纤维细胞。在基质胶(BD Biosciences，San Jose CA)上用或不用嘌呤霉素选择并且在hES培养条件(mTesR培养基，Stem Cell Technology，Vancouver，BC，Canada)下培养HDF。在这些实验组中，用针对于HDAC7或HDAC11的shRNA构建体感染细胞。
定量RT-PCR.通过实时RT-PCR确定Oct-3/4和Nanog的表达。简言之，根据厂家的方法使用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)用DNA酶I消化而从培养物制备总RNA。将来自每种样品的总RNA(1μg)进行以寡聚(dT)引发的反转录(Invitrogen；Carlsbad，CA)。用PCR预混合液在7300实时PCR系统(Applied Biosystems；Foster City，CA)上进行实时PCR反应。对于每种样品，将1μl稀释的cDNA(1∶10)作为模板添加到PCR反应中。将Oct-3/4和Nanog的表达水平相对于甘油醛3-磷酸-脱氢酶(GAPD)标准化。
结果：
HDAC7和HDAC 11shRNA慢病毒感染对基因Nanog的mRNA水平的作用显示在图4A(HDFa)、图4B(HDFn)和图4C(HDFf)中。对于所有三种细胞类型，在存在或不存在嘌呤霉素的情况下，HDAC7和HDAC11敲低二者均增加基因Nanog的mRNA水平(显示了成人皮肤成纤维细胞和人新生儿皮肤成纤维细胞)。对于细胞类型HDFa和HDFn，Nanog的表达随时间增加了至少6倍。在用或不用嘌呤霉素选择的情况下观察到了Nanog mRNA水平的增加。如在图4A中报道的，用HDAC7干扰与用HDAC11干扰相比导致了Nanog mRNA表达的快速增加。然而，随着时间继续增加，基因Nanog的mRNA水平增加似乎是相等的，与是HDAC7干扰还是HDAC11干扰无关。在HDFf中观察到了基因Nanog的mRNA水平增加，但是不如在HDFa和HDFn中观察到的强烈。
HDAC7和HDAC 11shRNA慢病毒感染对基因Oct-4的mRNA水平的作用显示在图5A(HDFa)、图5B(HDFn)和图5C(HDFf)中。HDAC7和HDAC11敲低二者均增加了在细胞类型HDFa和HDFn中的基因Nanog的mRNA水平。在存在和不存在嘌呤霉素的情况下均观察到了Oct-4表达的增加(图5A和图5B)。与基因Nanog相比，观察到了基因Oct-4mRNA水平的更中度的增加。
图6报道了在人胎儿皮肤成纤维细胞中HDAC7和HDAC11shRNA慢病毒感染对Sox-2的mRNA水平的作用。没有观察到Sox-2基因的mRNA水平的诱导。
图7报道了HDAC7shRNA慢病毒感染对多种HDAC基因和SIRT基因的mRNA表达水平的作用。如图7中所显示的，在HDAC7shRNA感染之后三天诱导了HDAC 9、HDAC5和HDAC11mRNA的表达。HDAC7mRNA的水平在慢病毒感染后3天左右降低了基础水平的约50％。
一种HDAC的抑制(在这种情况下是HDAC7)导致几种其他HDAC基因表达的增加。HDAC是极度相近的，并且可能已演变为具有冗余的或至少相似的功能。如果一种家族成员被抑制，则其他家族成员的表达可能会增加以补偿被抑制的成员。HDAC发挥着关键的作用，并且因此可能已演变出冗余途径和/或补偿途径。重编程细胞的一种机制可以是同时或顺序地靶向负责冗余途径和/或补偿途径的多个家族成员。重编程细胞的另一机制可以是同时或顺序地靶向同一家族中的抑制蛋白或靶向调节蛋白的不同家族中的抑制蛋白。
实施例4：
测试了HDAC7和HDAC11shRNA慢病毒感染对Oct-4、Nanog和Sox2的mRNA表达水平的作用。在同一实验中，干扰HDAC7和HDAC11并确定对多种基因的表达的作用。使用3种类型的人皮肤成纤维细胞：成人皮肤成纤维细胞(HDFa)、人新生儿皮肤成纤维细胞(HDFn)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)。
方法：
用shRNA慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(HDFa、HDFn和HDFf)以干扰HDAC7和HDAC11。从HDF(包括嘌呤霉素选择)分离RNA并将其应用于RT-PCR以分析下列靶基因的表达：例如Oct-4、Nanog、Sox2、多种HDAC和多种SIRT基因。已经成功地用shRNA转染了包括嘌呤霉素(抗生素)抗性作为一种选择细胞的方式的shRNA构建体。转染之后，将嘌呤霉素添加到培养物中，并且无抗性的(因此未被转染的)细胞死亡，从而在培养物中仅保留转染的细胞。
细胞培养.人皮肤成纤维细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)并且在37℃、95％湿度和5％CO2中在成纤维细胞生长培养基(Cell Applications，San Diego，CA)中维持。
慢病毒感染.用shRNA构建体感染人皮肤成纤维细胞。shRNA构建体是从Dharmacon获得的。针对于HDAC7a的shRNA构建体具有下列序列：
SEQ ID NO.1：GCTTTCAGGATAGTCGTGA
具有下列序列的shRNA构建体针对于HDAC11：
SEQ ID NO.2：AGCGAGACTTCATGGACGA
此外，具有下列序列的shRNA构建体针对于HDAC11：
SEQ ID.NO.3：TGGTGGTATACAATGCAGG
根据下列厂家的说明用shRNA感染人皮肤成纤维细胞。在基质胶(BD Biosciences，San Jose CA)上用或不用嘌呤霉素选择并且在hES培养条件(mTesR培养基，Stem Cell Technology，Vancouver，BC，Canada)下培养HDF。
定量RT-PCR.通过实时RT-PCR确定Oct-3/4和Nanog的表达。简言之，根据厂家的方法，使用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)，用DNA酶I消化而从培养物制备总RNA。将来自每种样品的总RNA(1μg)进行以寡聚(dT)引发的反转录(Invitrogen；Carlsbad，CA)。用PCR预混合液在7300实时PCR系统(Applied Biosystems；Foster City，CA)上进行实时PCR反应。对于每种样品，将1μl稀释的cDNA(1∶10)作为模板添加到PCR反应中。将Oct-3/4、Nanog和Sox-2的表达水平相对于甘油醛3-磷酸-脱氢酶(GAPD)标准化。
结果：
如在图8中报道的，在存在和不存在嘌呤霉素的两种情况下，对于细胞类型HDFf和HDFn两者，HDAC7和HDAC11的双敲低增加了Nanog表达。在细胞类型HDFf中Nanog表达迅速增加，并且至第5天观察到了一致的反应。在细胞类型HDFa中观察到了中度的作用。
图9报道了在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰或同时干扰期间对Oct-4的mRNA表达的作用。在存在和不存在嘌呤霉素的情况下均观察到了Oct-4表达的增加。对于细胞类型HDFn，观察到了强烈的作用，并且与HDAC7或HDAC11的单敲低相比，Oct-4的mRNA表达增加。
如在图10中报道的，在人胎儿皮肤成纤维细胞中一致地出现Sox-2表达。HDAC7和HDAC11的双敲低维持Sox-2的表达。
图11报道了在成人皮肤成纤维细胞中在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间对多种HDAC基因的mRNA表达的作用。观察到了HDAC9表达的强烈增加。HDAC5的表达也增加。观察到了对其他基因的中度的作用(参见图11)。
图12报道了在人胎儿皮肤成纤维细胞中在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间对多种HDAC基因的mRNA表达的作用。在用嘌呤霉素选择的第7天观察到了HDAC9表达的强烈增加。在用嘌呤霉素选择的第7天，多种其他HDAC基因的表达降低(参见图12)。
图13报道了在人新生儿皮肤成纤维细胞中在HDAC7和HDAC11shRNA双干扰期间对多种HDAC基因的mRNA表达的作用。在不用嘌呤霉素选择的第天和用嘌呤霉素选择的第5天观察到了HDAC9表达的强烈增加。HDAC5的表达也增加。观察到了对其他基因的中度的作用(参见图13)。
这些结果证明，可以使用shRNA构建体来抑制编码HDAC的基因的表达并且可以诱导复能基因如Oct-4和Nanog的表达，Oct-4和Nanog是参与重编程细胞的两种基因。此外，这些结果证明，HDAC的抑制在恢复细胞的分化潜能中发挥着基本作用。本发明的方法可用于抑制任何HDAC或者结构或功能上的HDAC相关蛋白。
为了解决任何补偿途径、冗余途径、或补偿途径和冗余途径，可以抑制参与沉默复能基因的多于一种的HDAC或任何其他蛋白。可以抑制来自同一抑制蛋白家族的一种或多种蛋白、或来自两种不同的抑制蛋白家族的两种或更多种蛋白。重编程细胞的一个有效机制可以抑制在补偿途径、冗余途径、或补偿途径和冗余途径内的多种蛋白。在这种抑制途径中起作用的蛋白可以被shRNA、HDAC抑制剂、小分子抑制剂或上述的任何组合抑制。
实施例5：
测试了HDAC7shRNA慢病毒感染对HDAC11表达的作用。使用3种类型的人皮肤成纤维细胞：成人皮肤成纤维细胞(HDFa)、人新生儿皮肤成纤维细胞(HDFn)和人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)。
方法
细胞培养.人皮肤成纤维细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)并且在37℃、95％湿度和5％CO2中在成纤维细胞生长培养基(Cell Applications，San Diego，CA)中维持。
慢病毒感染.用shRNA构建体感染人皮肤成纤维细胞。shRNA构建体是从Dharmacon获得的。针对于HDAC7a的shRNA构建体具有下列序列：
SEQ ID NO.1：GCTTTCAGGATAGTCGTGA
根据厂家的说明用shRNA感染人皮肤成纤维细胞。在基质胶(BD Biosciences，San Jose CA)上用或不用嘌呤霉素选择并且在hES培养条件(mTesR培养基，Stem Cell Technology，Vancouver，BC，Canada)下培养HDF。
定量RT-PCR.通过实时RT-PCR确定HDAC7a和HDAC11的表达。简言之，根据厂家的方法，使用Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和RNeasy Mini试剂盒(Qiagen；Valencia，CA)，用DNA酶I消化而从培养物制备总RNA。将来自每种样品的总RNA(1μg)进行以寡聚(dT)引发的反转录(Invitrogen；Carlsbad，CA)。用PCR预混合液在7300实时PCR系统(AppliedBiosystems；Foster City，CA)上进行实时PCR反应。对于每种样品，将1μl稀释的cDNA(1∶10)作为模板添加到PCR反应中。将HDAC7a和HDAC11的表达水平相对于甘油醛3-磷酸-脱氢酶(GAPD)标准化。
结果
在用HDAC7a shRNA感染的人胎儿皮肤成纤维细胞中HDAC11的表达增加，而HDAC7a的表达降低(图14A)。对人新生儿皮肤成纤维细胞(图14B)和人胎儿皮肤成纤维细胞(图14C)获得了相似的结果。在存在和不存在嘌呤霉素的情况下均观察到了表达的增加。在测试的所有三种细胞类型中HDAC11表达以补偿方式被上调。抑制编码参与降低复能基因表达的调节蛋白的基因表达可以导致编码调节蛋白的其他基因的表达增加。靶向单个调节蛋白家族或多个调节蛋白家族的多种剂可能是重编程细胞的有效方式。所述剂包括但不限于小分子抑制剂和shRNA构建体。
实施例6
用针对于HDAC7、HDAC11或DNMT1的慢病毒shRNA感染细胞，染色并对复能基因的表达显像。在此实施例中分析了Oct-4和Sox-2的蛋白表达，但是本领域的普通技术人员应理解，本发明的方法可用于增加参与重编程细胞或恢复细胞分化潜能的任何基因的表达。
方法
细胞培养.人胎儿皮肤成纤维细胞购自Cell Applications(San Diego，CA)并且在37℃、95％湿度和5％CO2中在成纤维细胞生长培养基(Cell Applications，San Diego，CA)中维持。
慢病毒感染.用下列组合物之一感染人胎儿皮肤成纤维细胞：(1)针对于DNMT1的shRNA慢病毒；(2)针对于HDAC7的shRNA慢病毒；(3)针对于DNMT1和HDAC7的shRNA慢病毒；以及(4)针对于HDAC7a和HDAC11的shRNA慢病毒。shRNA构建体是从Dharmacon获得的。针对于HDAC7a的shRNA构建体具有下列序列：
SEQ ID NO.1：GCTTTCAGGATAGTCGTGA
具有下列序列的shRNA构建体针对于HDAC11：
SEQ ID NO.2：AGCGAGACTTCATGGACGA
此外，具有下列序列的shRNA构建体针对于HDAC11：
SEQ ID.NO.3：TGGTGGTATACAATGCAGG
针对于DNMT1的shRNA构建体具有下列序列：
SEQ ID NO.4：GTCTACCAGATCTTCGATA
根据厂家的说明用shRNA感染人皮肤成纤维细胞。在基质胶(BD Biosciences，San Jose CA)上用或不用嘌呤霉素选择并且在hES培养条件(mTesR培养基，Stem Cell Technology，Vancouver，BC，Canada)下培养HDF。
免疫组织化学.对于免疫组织化学，使靶shRNA感染的细胞和对照细胞在腔室玻片(chambered slides)(LabTek，Napersville，IL)上生长。然后将细胞用4％多聚甲醛固定，并根据厂家的方法用针对复能性标记物Oct3/4的特异性抗体(Abeam，Cambridge，MA)孵育。Oct3/4的染色显像为红色。用DAPI染色(Vectorshield)使核显像，DAPI显示为蓝色。
结果
在人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)中Oct-4蛋白表达被shRNA干扰增加。图15A是没感染的HDFf(阴性对照)的照片。图15G是人胚胎干细胞(阳性对照)的照片。在阴性对照细胞中，检测到极少量的Oct-4蛋白表达。图15B是用针对DNMT1的shRNA感染的HDFf细胞的照片。在细胞暴露于DNMT1shRNA时，Oct-4蛋白表达清楚地增加。用HDAC7shRNA感染的HDFf细胞显示极微的Oct-14蛋白检测(图15C)。这可能是由于这种特定样品的处理所致的。
用DNMT1和HDAC7shRNA感染的细胞显示了Oct-4蛋白表达的显著增加(图15D)。用DNMT1和HDAC7shRNA二者处理的细胞产生了与人胚胎干细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)极为相似的表达模式(图15E)。这些数据确证了本文所呈现的Oct-4基因表达的增加导致Oct-4蛋白表达增加的数据。DNMT和HDAC11在关于转录激活和染色质重建的调节方面具有不同的功能。来自两个独立的调节组的成员的抑制导致Oct-4表达的显著增加。Oct-4蛋白表达在用DNMT1和HDAC11感染的细胞中也是增加的(图15E)。DNMT1和多种HDAC的抑制导致Oct-4蛋白表达的增加。
在用HDAC7和HDAC11shRNA感染的细胞中Oct-4的表达没有可检测的增加(图15F)。这可能是由于实验系统的局限所致。可选择地，这种结果可能表明为了复能基因表达的最佳增加，应抑制多条途径。抑制编码在不同的调节复合体中起作用的蛋白的基因的表达可能导致复能基因的更高表达水平。可以抑制任何调节复合体的任何成员。
在人胎儿皮肤成纤维细胞(HDFf)中Sox-2蛋白表达被shRNA干扰增加。图16A是没有感染的HDFf(阴性对照)的照片。图16G是人胚胎干细胞的照片(图16G)。在阴性对照细胞中，检测到了Sox-2蛋白的极少量表达。图16B是用针对DNMT1的shRNA感染的HDFf细胞的照片。核染色是可见的，然而，仅检测到中度量的Sox-2蛋白。用HDAC7和DNMT1shRNA感染的HDFf细胞显示出Sox-2蛋白的极微检测(图16C)。这可能是由于这种特定样品的处理所致的。
用DNMT1和HDAC11shRNA感染的细胞显示出Sox-2蛋白表达的显著增加(图16D)。来自两个独立的调节组的成员的抑制导致Sox-2表达的显著增加。用HDAC7shRNA感染的细胞显示极微的Sox-2蛋白表达(图16E)。Sox-2蛋白表达在用HDAC7和HDAC11感染的细胞中也是增加的(图16F)。DNMT1和多种HDAC的抑制导致Sox-2蛋白表达的增加。
这些结果证明，组蛋白脱乙酰酶和DNA甲基转移酶的抑制增加了参与重编程细胞的复能基因的表达。将两种不同的shRNA构建体靶向两种独立的调节蛋白，这导致了Oct-4和Sox-2蛋白表达的显著增加。抑制参与抑制或阻抑复能基因转录的多于一种的调节蛋白可能是重编程细胞和恢复细胞分化潜能的有效机制。
组蛋白脱乙酰酶和相关家族成员的抑制可用于增加复能基因的表达，并且可用于重编程分化的细胞。这些重编程方法不依赖于卵、胚胎或胚胎干细胞。此外，这些方法不依赖于可能具有有害作用的病毒载体。这些方法还不依赖于癌基因，如c-myc和k1f4。
此外，本发明的方法可用于在不存在体细胞核转移(SCNT)的情况下重编程分化的细胞。SCNT是极为低效的并且在重编程领域中引起了显著的局限。本发明方法减少了对SCNT的需要。
如与测量对具有强的报道元件的人工载体的作用相反的，本发明方法证明了内源复能基因和蛋白的表达的增加。人工载体不具有与内源基因相同的染色质结构，也不具有其他基因和产生基因组环境的启动子元件。人工载体不具有重演天然基因组环境所需的许多天然元件。本文所呈现的结果表示从处理人细胞所获得的作用并且测量对内源基因的作用。
最后，本文所呈现的数据证明，抑制或改变组蛋白脱乙酰酶的功能是参与重编程分化的细胞和恢复分化潜能的一个步骤。
尽管本文已经示例和描述了具体的实施方案，但是本领域普通技术人员将了解，适于达成相同目的的任何安排均可以取代所显示的具体实施方案。本申请旨在涵盖根据所述的本发明的原理操作的任何改造或变化。因此，本发明旨在仅受权利要求和其等同物的限制。本申请中所引用的专利、参考文献和出版物的公开内容均通过引用并入本文。

Claims (20)

1.一种重编程细胞的方法，所述方法包括：将细胞群暴露于抑制组蛋白脱乙酰酶的活性、表达、或活性和表达的剂；诱导复能基因的表达；选择表达指示复能细胞的细胞表面标记物的细胞；以及扩增所述选择的细胞以制备细胞群，其中所述细胞已恢复分化潜能。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述选择细胞还包括比较所述细胞在暴露于所述剂之前和之后的表型，以及鉴定具有与复能细胞一致的表型的细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述选择细胞还包括使用针对由复能基因编码的蛋白的抗体或针对细胞表面标记物的抗体。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述细胞表面标记物选自由下列组成的组：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。
5.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：在扩增所述细胞之前，比较所述细胞在暴露于所述剂之前存在的复能基因的染色质结构与暴露于所述剂之后获得的染色质结构。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述比较染色质结构包括比较组蛋白的乙酰化状态。
7.如权利要求5所述的方法，其中所述复能基因选自由下列组成的组：Oct-4、Sox-2和Nanog。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述剂选自由下列组成的组：小分子抑制剂、核酸序列和shRNA构建体。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述组蛋白脱乙酰酶选自由下列组成的组：HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7A、HDAC9、HDAC10、HDAC11、SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6和SIRT7。
10.一种重编程细胞的方法，所述方法包括：将细胞暴露于抑制HDAC的活性、表达、或表达和活性的第一剂；将所述细胞暴露于抑制第二调节蛋白的活性、表达、或表达和活性的第二剂，其中所述第二调节蛋白具有与HDAC不同的功能；诱导复能基因的表达；以及选择细胞，其中所述细胞已恢复分化潜能。
11.如权利要求10所述的方法，其中将所述细胞同时暴露于所述第一剂和所述第二剂。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述选择细胞包括使用针对由复能基因编码的蛋白的抗体或针对细胞表面标记物的抗体来分离细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述细胞表面标记物选自由下列组成的组：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。
14.如权利要求10所述的方法，其中选择所述细胞包括比较所述细胞在暴露于所述第一剂和所述第二剂之前和之后的表型。
15.如权利要求10所述的方法，其中所述第一剂和第二剂选自由下列组成的组：小分子抑制剂、核酸序列和shRNA构建体。
16.如权利要求10所述的方法，其中所述第二调节蛋白选自由下列组成的组：组蛋白脱乙酰酶、组蛋白乙酰基转移酶、赖氨酸甲基转移酶、组蛋白甲基转移酶、组蛋白脱甲基酶、赖氨酸脱甲基酶、sirtuin和sirtuin激活蛋白。
17.一种富集的重编程的细胞群，所述重编程的细胞群根据包括下列步骤的方法制备：将细胞群暴露于抑制组蛋白脱乙酰酶的活性、表达、或活性和表达的剂；诱导复能基因的表达；选择表达指示复能细胞的细胞表面标记物的细胞；以及扩增所述选择的细胞以制备细胞群，其中所述细胞已恢复分化潜能。
18.如权利要求17所述的富集的重编程的细胞群，其中所述重编程的细胞表达选自由下列组成的组的细胞表面标记物：SSEA3、SSEA4、Tra-1-60和Tra-1-81。
19.如权利要求17所述的富集的重编程的细胞群，其中所述复能基因选自由下列组成的组：Oct-4、Nanog和Sox-2。
20.如权利要求17所述的富集的重编程的细胞群，其中所述重编程的细胞占所述群的至少60％。
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