JP7162537B2 - 幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導用培地および中胚葉系細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本開示は、幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導用培地、および該培地を用いて幹細胞から中胚葉系細胞を製造する方法に関する。

従来の技術では、例えば、浮遊培養によって、幹細胞から分化誘導を経て所望の細胞を得るためには、前段階として、胚葉体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ ｂｏｄｙ：ＥＢ）の形成が必要とされている。このような前段階操作を行った後、種々の細胞に応じた分化誘導を行うことで、幹細胞を目的細胞へと分化させる（非特許文献１～７）。山中らは、一旦ＥＢを形成し、得られたＥＢを解離し、再凝集させることで、幹細胞から効率良く心筋細胞を製造する方法を開発している（特許文献１）。

国際公開第２０１４／１８５３５８号

Ｉｚｈａｋ Ｋｅｈａｔ ｅｔ．ａｌ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ． ２００１ Ａｕｇ；１０８（３）：４０７－１４ Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ Ｍｕｍｍｅｒｙ ｅｔ．ａｌ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ． ２００３ Ｊｕｎ ３；１０７（２１）：２７３３－４０ Ｂｙｕｎｇ Ｓｕｎ Ｙｏｏｎ ｅｔ．ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ． ２００６ Ａｐｒ；７４（４）：１４９－５９ Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ Ｌａｆｌａｍｍｅ ｅｔ．ａｌ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００７ Ｓｅｐ；２５（９）：１０１５－２４ Ｋａｔｓｕｈｉｓａ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ ｅｔ．ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１５ Ｊｕｎ １９；４６２（１）：５２－７ Ｈｅｎｎｉｎｇ Ｋｅｍｐｈ ｅｔ．ａｌ． Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ． ２０１４ Ｄｅｃ ９；３（６）：１１３２－４６ Ｓｈｏｇｏ Ｔｏｈｙａｍａ ｅｔ．ａｌ． Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ． ２０１６ Ａｐｒ １２；２３（４）：６６３－７４

幹細胞を目的細胞へ分化誘導するにあたっては、可能な限り高効率で目的細胞へ分化させることが望ましい。また、浮遊培養によって幹細胞を目的細胞へ分化誘導する場合には、従来法では、最適なＥＢ形成期間を予め検討する必要や、ＥＢ形成に必要な時間を要するという課題がある。したがって、迅速かつ簡便な、効率の高い幹細胞の分化誘導方法が求められている。

本発明者らは、鋭意研究を行った結果、Ｒｈｏ結合キナーゼ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ：ＲＯＣＫ）阻害剤、骨形成因子（ＢＭＰ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびアクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）を含む培地で培養することで、高効率で幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は以下を提供する：
［１］ＲＯＣＫ阻害剤、骨形成因子（ＢＭＰ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、およびアクチビンを含む、幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導用培地；
［２］ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ－２７６３２である、［１］に記載の培地；
［３］ＢＭＰが、ＢＭＰ４である、［１］または［２］に記載の培地；
［４］ＦＧＦが、ＦＧＦ－２である、［１］～［３］のいずれか一つに記載の培地；
［５］アクチビンが、アクチビンＡである、［１］～［４］のいずれか一つに記載の培地；
［６］中胚葉系細胞が、心筋前駆細胞または心筋細胞である、［１］～［５］のいずれか一つに記載の培地；
［７］幹細胞が、多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、［１］～［６］のいずれか一つに記載の培地；
［８］幹細胞から中胚葉系細胞を製造する方法であって、幹細胞を［１］～［７］のいずれか一つに記載の培地で培養する段階を含む、方法；
［９］幹細胞から心筋前駆細胞または心筋細胞を製造する方法であって、
（１）幹細胞を［１］～［７］のいずれか一つに記載の培地で培養する段階、次いで
（２）Ｗｎｔ阻害剤を含む培地で培養する段階を含む、方法；
［１０］Ｗｎｔ阻害剤が、ＩＷＲ－１およびＩＷＰ－２である、［９］に記載の方法；
［１１］培養が、浮遊培養である、［８］～［１０］のいずれか一つに記載の方法；
［１２］幹細胞が、多能性幹細胞または間葉系幹細胞である、［８］～［１１］のいずれか一つに記載の方法；
［１３］ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、ＦＧＦ、およびアクチビンを含む、幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導を補助するための組成物；ならびに
［１４］［８］～［１２］のいずれか一つに記載の方法によって得られる細胞群であって、９０％以上が中胚葉系細胞である、細胞群。

本発明によれば、高効率で幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導することができる。さらに、浮遊培養を用いる場合は、ＥＢ形成期間を経ることなく、迅速かつ簡便に、大量の幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導することができる。

図１は実施例１の培養条件を示す（条件１～４）。 図２は条件１～４での生細胞密度の推移を示す。 図３は条件１～４でのｃＴｎＴ陽性細胞の比率を示す。 図４は実施例２の培養条件を示す（条件Ａ～Ｆ）。 図５は条件Ａ～Ｆでの生細胞密度の推移を示す。 図６は条件Ａ、Ｄ及びＥでのｃＴｎＴ陽性細胞の比率を示す。

本発明は、幹細胞から中胚葉系細胞を製造するための培地であって、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、アクチビン、およびＦＧＦを含む、幹細胞から中胚葉系細胞への分化誘導用培地（以下、「本発明の培地」ともいう）、該培地で幹細胞を培養することにより、中胚葉系細胞を製造する方法（以下、「本発明の方法」ともいう）、幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導を補助するための組成物（以下、「本発明の組成物」ともいう）、および本発明の方法によって得られる細胞群（以下、「本発明の細胞群」ともいう）、を提供する。

１．本発明の培地
本発明の培地は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、ＦＧＦ、およびアクチビンを含む、幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導用培地である。本発明の培地は、幹細胞用基礎培地に、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、ＦＧＦ、およびアクチビンを含む成分を添加した培地である。

本明細書において、「幹細胞」とは、自己複成能および分化増殖能を有する未熟な細胞をいう。幹細胞には階層（ｈｉｅｒａｒｃｈｙ）があり、上位の未分化の幹細胞は自己複製能が高く、さまざまな細胞系列に分化できる多能性も高いが、下位になるほど自己複製能は失われていき特定の細胞系列にしか分化できないようになることが知られている。

本発明の培地を適用可能な幹細胞の由来種は特に限定されず、例えば、ラット、マウス、ハムスターおよびモルモット等のげっ歯類、ウサギ等のウサギ目、ブタ、ウシ、ヤギおよびヒツジ等の有蹄目、イヌおよびネコ等のネコ目、並びにヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータンおよびチンパンジー等の霊長類等が挙げられる。

幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、複能性幹細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)、単能性幹細胞(ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ)等が含まれる。

本明細書において、「多能性幹細胞」は、生体に存在しうる全ての細胞に分化可能であり（すなわち多能性を有し）、かつ増殖能を有する幹細胞を意味する。多能性幹細胞の例としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。用いられる多能性幹細胞は、従来公知の方法によって作製されてもよいし、一般に入手可能な細胞株であってもよい。ＥＳ細胞の例としては、ＫｈＥＳ１、ＫｈＥＳ３等が挙げられるが、これらに限定されない。

一つの実施形態では、本発明で用いられる多能性幹細胞はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は、体細胞に特定の初期化因子を核酸またはタンパク質の形態で導入することにより作製される、多能性および増殖能を有する、体細胞由来の人工幹細胞である。

初期化因子に含まれる遺伝子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３およびＧｌｉｓ１等が挙げられる。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。

初期化因子の組み合わせとしては、例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ２６： ７９５－７９７、Ｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ２： ５２５－５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２６：２４６７－２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２６：１２６９－１２７５、Ｓｈｉ Ｙ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３， ５６８－５７４、Ｚｈａｏ Ｙ， ｅｔ ａｌ． （２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３：４７５－４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ， （２００８）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ， ３， １３２－１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ， ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１：１９７－２０３、Ｒ．Ｌ． Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， （２００９）， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９－４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ， ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． １０６：８９１２－８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ， ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ｎａｔｕｒｅ． ４６１：６４９－６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ， ｅｔ ａｌ． （２００９）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ５：４９１－５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）， Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ． ６：１６７－７４、Ｈａｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）， Ｎａｔｕｒｅ． ４６３：１０９６－１００、Ｍａｌｉ Ｐ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）， Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２８：７１３－７２０、Ｍａｅｋａｗａ Ｍ， ｅｔ ａｌ． （２０１１）， Ｎａｔｕｒｅ． ４７４：２２５－９．等に記載の組み合わせが挙げられる。

本発明に用いられるｉＰＳ細胞は、従来公知の方法によって作製されてもよいし、一般に入手可能な細胞株であってもよい。ヒト由来ｉＰＳ細胞の例示的な株として、２５３Ｇ１（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７７）、６０６Ａ１（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０３２８）、６１０Ｂ１（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０３３１）、６４８Ａ１（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０３６０）、ＭＹＨ（特許文献１）、４２７Ｆ１（特許文献１）、４５７Ｃ１（特許文献１）、６０４Ａ１（特許文献１）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００２９）、Ｎｉｐｓ－Ｂ２（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０２２３）等が挙げられるが、これらに限定されない。ヒト以外の動物由来のｉＰＳ細胞の例示的な株として、ｉＰＳ－ＭＥＦ－Ｎｇ－２０Ｄ－１７、ｉＰＳ－ＭＥＦ－Ｎｇ－１７８Ｂ－５、ｉＰＳ－ＭＥＦ－Ｆｂ／Ｎｇ－４４０Ａ－３、ｉＰＳ－ＭＥＦ－Ｎｇ－４９２Ｂ－４、ｉＰＳ－Ｓｔｍ－ＦＢ／ｇｆｐ－９９－１、ｉＰＳ－Ｓｔｍ－ＦＢ／ｇｆｐ－９９－３、ｉＰＳ－Ｈｅｐ－ＦＢ／Ｎｇ／ｇｆｐ－１０３Ｃ－１、ｉＰＳ－Ｌ１、ｉＰＳ－Ｓ１等が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、疾患特異的ｉＰＳ細胞を用いてもよい。かかる疾患の例としては、血液系疾患、免疫系疾患、内分泌系疾患、代謝系疾患、視覚系疾患、循環器系疾患、呼吸器系疾患、皮膚・結合組織疾患、骨・関節系疾患、腎・泌尿器系疾患、染色体または遺伝子に変化を伴う症候群などが挙げられるが、これらに限定されない（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｊａ／ｈｐｓ／ｈｐｓ＿ｄｉｓｅａｓｅｌｉｓｔ＿ｉｎｄｅｘを参照のこと）。上述の細胞株は、例えば、理化学研究所バイオリソースセンター（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌ．ｂｒｃ．ｒｉｋｅｎ．ｊｐ／ｅｎ／を参照のこと）やＪＣＲＢ細胞バンク（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｂａｎｋ．ｎｉｂｉｏｈｎ．ｇｏ．ｊｐ／ｅｎｇｌｉｓｈ／）より入手可能である。

本発明で用いられるｉＰＳ細胞は、フィーダー細胞上で培養して得てもよい。あるいは、フィーダーフリーの状態で培養して得てもよい。これらの培養方法は、当業者によく知られている。

上述した多能性幹細胞の調製方法、培養方法、および保存方法などは、当業者によく知られている。例えば、国際公開第２０１４／１８５３５８号（特許文献１）（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載の方法を用いることができる。

前記「複能性幹細胞」としては、例えば、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞および生殖幹細胞等の体性幹細胞等が挙げられる。複能性幹細胞は、好ましくは間葉系幹細胞である。

間葉系幹細胞とは、成体の骨髄、脂肪組織、胎盤組織、臍帯血、歯髄等に存在する未分化細胞（体性幹細胞）であり、増殖能と多分化能（特に骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、腱細胞、脂肪細胞等への分化能）を有する幹細胞あるいはその前駆細胞の集団を広義に意味する。間葉系幹細胞としては、例えば、ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＢＭ、Ｔａｋａｒａ社製）、ヒト臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＵＣ、Ｔａｋａｒａ社製）またはヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ－ＡＴ、Ｔａｋａｒａ社製）等が挙げられる。

本発明においては、いずれの幹細胞も好適に使用することができるが、好ましくは、多能性幹細胞または間葉系幹細胞、より好ましくは多能性幹細胞が使用できる。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が好ましく、より好ましくはｉＰＳ細胞であり、特に好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。

本明細書において、「中胚葉系細胞」とは、中胚葉由来の組織を構成する細胞を指す。中胚葉由来の組織としては、骨、軟骨、脾臓、骨髄、歯象牙質、腹膜上皮、腎臓、尿管、胸膜上皮、副腎皮質、筋肉（瞳孔括約筋および瞳孔散大筋以外）、卵巣、子宮、精巣、および結合組織が挙げられるが、これらに限定されない。また、中胚葉系細胞としては、神経小膠細胞、心筋前駆細胞、心筋細胞、血管内皮前駆細胞、血管内皮細胞、血液細胞、および間葉系幹細胞も挙げられるが、これらに限定されない。

前記「幹細胞用基礎培地」としては、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、ＦＧＦおよびアクチビンを添加することにより、幹細胞の中胚葉系細胞への分化を誘導できる培地であれば、特に制限されない。前記幹細胞用基礎培地は、１種類以上の糖（類）、１種類以上の無機塩（類）、１種類以上のアミノ酸（類）、１種類以上のビタミン（類）、および１種類以上の微量成分（類）を含むことが好ましい。また、薬剤感受性試験に使用するためにカナマイシン等の抗生物質を適宜含むこともできる。

前記糖（類）としては、例えば、グルコース、ラクトース、マンノース、フルクトースおよびガラクトース等の単糖類、並びにスクロース、マルトースおよびラクトース等の二糖類等が挙げられる。これらの中でもグルコースが特に好ましい。これら糖類は、１または２以上組み合わせて添加することもできる。

前記無機塩（類）としては、例えば、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅五水和物、硝酸鉄（ＩＩＩ）九水和物、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム二水和物および硫酸亜鉛七水和物等が挙げられる。幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導に有利に作用する成分であればいずれの無機塩類またはその組合せも用いることができる。

前記アミノ酸（類）としては、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、シスチン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、グルタミン酸、ヒドロキシプロリン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン等が挙げられ、Ｌ－体のアミノ酸が好ましい。前記アミノ酸（類）には、これらの誘導体、塩および水和物等の派生物を含めることができる。

アルギニンの派生物としては、例えば、Ｌ－塩酸アルギニンおよびＬ－アルギニン一塩酸塩等が挙げられる。アスパラギン酸の派生物としては、例えば、Ｌ－アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物、Ｌ－アスパラギン酸一水和物、Ｌ－アスパラギン酸カリウムおよびＬ－アスパラギン酸マグネシウム等が挙げられる。システインの派生物としては、例えば、Ｌ－システイン二塩酸塩およびＬ－システイン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ－リジン塩酸塩等が挙げられる。グルタミン酸の派生物としては、例えば、Ｌ－グルタミン酸一ナトリウム塩等が挙げられる。アスパラギンの派生物としては、例えば、Ｌ－アスパラギン一水和物等が挙げられる。チロシンの派生物としては、例えば、Ｌ－チロシン二ナトリウム二水和物等が挙げられる。ヒスチジンの派生物としては、例えば、ヒスチジン塩酸塩およびヒスチジン塩酸塩一水和物等が挙げられる。リジンの派生物としては、例えば、Ｌ－リジン塩酸塩等が挙げられる。

前記ビタミン（類）としては、例えば、アスコルビン酸、ビオチン、コリン、葉酸、イノシトール、ナイアシン、パントテン酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＢ１２およびパラアミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）等が挙げられる。これらの中でも、アスコルビン酸は添加されることが好ましい。前記ビタミン（類）には、これらの誘導体、塩および水和物等の派生物を含めることができる。

アスコルビン酸の派生物としては、例えば、アスコルビン酸２－リン酸エステル（Ａｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ ２－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸硫酸ナトリウム、リン酸アスコルビルアミノプロピルおよびアスコルビン酸リン酸ナトリウム等が挙げられる。コリンの派生物としては、例えば、塩化コリン等が挙げられる。ナイアシンの派生物としては、例えば、ニコチン酸、ニコチン酸アミドおよびニコチニックアルコール等が挙げられる。パントテン酸の派生物としては、例えば、パントテン酸カルシウム、パントテン酸ナトリウムおよびパンテノール等が挙げられる。ピリドキシンの派生物としては、例えば、ピリドキシン塩酸塩、ピリドキサール塩酸塩、リン酸ピリドキサールおよびピリドキサミン等が挙げられる。チアミンの派生物としては、例えば、塩酸チアミン、硝酸チアミン、硝酸ビスチアミン、チアミンジセチル硫酸エステル塩、塩酸フルスルチアミン、オクトチアミンおよびベンフォチアミン等が挙げられる。

前記微量成分（類）は幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導に有利に作用する成分であることが好ましい。前記微量成分（類）としては、例えば、グルタチオン、ヒポキサンチン、リポ酸、リノレン酸、フェノールレッド、プトレシン、ピルビン酸、チミジンおよびＮａＨＣＯ_３等通常培地成分として用いられている成分が挙げられる。前記微量成分（類）には、これらの誘導体、塩および水和物等の派生物を含めることができる。派生物としては、例えば、プトレシン二塩酸を挙げることができる。

幹細胞用基礎培地としては、当業者に公知の基礎培地を使用することができ、例えば、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ｍＥＳＦ Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（和光純薬）などの市販の培養培地の他、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ）、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍａｌ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＧＭＥＭ（Ｇｌａｓ－ｇｏｗ’ｓ ＭＥＭ）、Ｆ１２（Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＤＭＥＭとＦ１２培地を１：１で混合した培地）、ＲＰＭＩ１６４０、ＲＤ、ＢＭＯＣ－３（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ’ｓ ＢＭＯＣ－３ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＣＭＲＬ－１０６６、Ｌ－１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５ ｍｅｄｉｕｍ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｍｅｄｉａ １９９、ＭＥＭ αＭｅｄｉａ、ＭＣＤＢ１０５、ＭＣＤＢ１３１、ＭＣＤＢ１５３、ＭＣＤＢ２０１、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、およびＥＳＦ等が挙げられる。

幹細胞用基礎培地には、必要に応じて、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐlａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＳＳＲ）（和光純薬）、ＰｌｕｒｉＱ（商標）Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（コスモバイオ）等の血清代替物、Ｂ２７ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）等の無血清サプリメントを添加してもよい。

その様な培地としては、例えば、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＲＰＭＩ１６４０にＫＳＲを添加した培地、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＲＰＭＩ１６４０にＢ２７ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを添加した培地、並びにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４を、好ましくは、ＭＥＭ、ＢＭＥ、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２及びＲＰＭＩ１６４０にＢ２７ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを添加した培地、並びにＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４を、より好ましくは、ＲＰＭＩ１６４０にＢ２７ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔを添加した培地、及びＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４を、最も好ましくは、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４を挙げることができる。

幹細胞用基礎培地には、細胞培養に通常用いられる添加物をさらに加えてもよい。そのような添加物の例としては、Ｌ－アスコルビン酸２－リン酸三ナトリウム、Ｌ－グルタミン、１－チオグリセロールなどが挙げられるが、これらに限定されない。

用いる培地の種類および量は、培養される細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。

本発明で用いられるＲＯＣＫ阻害剤の例としては、（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ_２Ｏ（Ｙ－２７６３２）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ピペラジン塩酸塩（ＨＡ１００）、１－（５－イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン二塩酸塩（Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ－１０７７）、（Ｓ）－（＋）－２－メチル－４－グリシル－１－（４－メチルイソキノリニル－５－スルホニル）ホモピペリジン二塩酸塩（Ｈ－１１５２）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－２－メチルピペラジン（Ｈ－７）、１－（５－イソキノリンスルホニル）－３－メチルピペラジン（イソＨ－７）、Ｎ－２－（メチルアミノ）エチル－５－イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ－８）、Ｎ－（２－アミノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ－９）、Ｎ－［２－（ｐ－ブロモシンナミルアミノ）エチル］－５－イソキノリンスルホンアミド二塩酸塩（Ｈ－８９）、Ｎ－（２－グアニジノエチル）－５－イソキノリンスルホンアミド塩酸塩（ＨＡ－１００４）、Ｎ－［（ＬＳ）－２－ヒドロキシ－ｌ－フェニルエチル］－Ｎ－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－ウレア（ＡＳ１８９２８０２）、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２）、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－２－メチル－６－オキソ－４－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１，４，５，６－テトラヒドロピリジン－３－カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６）、ヒドロキシファスジル（ＨＡ１１００）、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミン（ＯＸＡ０６）、Ｎ－［（３－ヒドロキシフェニル）メチル］－Ｎ’－［４－（４－ピリジニル）－２－チアゾリル］ウレア（ＲＫＩ１４４７）、４－（７－｛［（３Ｓ）－３－アミノ－１－ピロリジニル］カルボニル｝－１－エチル－１Ｈイミダゾール［４，５－ｃ］ピリジン－２－イル）－１，２，５－オキサジアゾール－３－アミン（ＳＢ７７２０７７Ｂ）、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキシアミドジヒドロクロライド（ＳＲ３６７７）、６－クロロ－Ｎ４－［３，５－ジフルオロ－４－［（３－メチル－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）オキシ］フェニル］－２，４－ピリミジンジアミン（ＴＣ－Ｓ７００１）が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、用いられるＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２である。

本発明で用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、約０．２～約１００μＭ、例えば、約１～約７５μＭ、約２～約５０μＭ、または約５～約２０μＭである。例示的な実施形態では、用いられるＲＯＣＫ阻害剤の濃度は約１０μＭである。

本発明で用いられるＢＭＰの例としては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、用いられるＢＭＰはＢＭＰ４である。本発明で用いられるＢＭＰの濃度は、約０．５～約５００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２～約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５～約２０ｎｇ／ｍＬである。例示的な実施形態では、用いられるＢＭＰの濃度は約１０ｎｇ／ｍＬである。

本発明で用いられるＦＧＦの例としては、ＦＧＦ－１、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ－３、ＦＧＦ－４、ＦＧＦ－５、ＦＧＦ－６、ＦＧＦ－７、ＦＧＦ－８、ＦＧＦｖ９が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、用いられるＦＧＦはＦＧＦ－２である。本発明で用いられるＦＧＦの濃度は、約０．１～約２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約０．５～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１～約２５ｎｇ／ｍＬ、または約２．５～約１０ｎｇ／ｍＬである。例示的な実施形態では、用いられるＦＧＦの濃度は約５ｎｇ／ｍＬである。

本発明で用いられるアクチビンの例としては、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な実施形態では、用いられるアクチビンはアクチビンＡである。本発明で用いられるアクチビンの濃度は、約０．１２～約３００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約０．６～約６０ｎｇ／ｍＬ、約１．２～約３０ｎｇ／ｍＬ、または約３～約１２ｎｇ／ｍＬである。例示的な実施形態では、用いられるアクチビンの濃度は約６ｎｇ／ｍＬである。

２．本発明の方法
本発明の方法は、幹細胞から中胚葉系細胞を製造する方法であって、幹細胞を前記１の本発明の培地で培養する段階を含む、方法である。

本発明の方法における、培養温度および培養時間などの培養条件については、培養される細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、フィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を用いた場合は、多能性幹細胞を前記本発明の培地中で、３４～４０℃／２～８％ＣＯ_２下で、１２時間～７日間培養する。好ましくは、３５～３９℃／３～７％ＣＯ_２下で１～４日間培養する。より好ましくは、上記の４因子（ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、ＦＧＦ、およびアクチビン）を含む本発明の培地中で３６～３８℃／４～６％ＣＯ_２下で６時間～４２時間、好ましくは１２時間～３６時間、より好ましくは１８時間～３０時間培養した後、ＲＯＣＫ阻害剤を除く３因子（ＢＭＰ、ＦＧＦ、およびアクチビン）を含む培地中で３６～３８℃／４～６％ＣＯ_２下で１２時間～４日間、好ましくは１～３日間、より好ましくは３６～６０時間、最も好ましくは４２～５４時間培養する。フィーダーフリーの状態で培養した多能性幹細胞を用いた場合は、多能性幹細胞を前記本発明の培地中で、３４～４０℃／２～８％ＣＯ_２下で、１２時間～７日間培養する。好ましくは、３５～３９℃／３～７％ＣＯ_２下で１～４日間、より好ましくは２～４日間培養する。培地中に含まれるＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、ＦＧＦ、およびアクチビンの種類、濃度等については、前記１のとおりである。例示的な実施形態では、用いられるＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２、ＢＭＰはＢＭＰ４、ＦＧＦはＦＧＦ－２、アクチビンはアクチビンＡである。

本発明の方法における培養形態としては、接着培養または浮遊培養を用いることができ、好ましい形態としては、浮遊培養を用いることができる。浮遊培養は、細胞を浮遊状態に保つことができる手段、方法、または装置を用いて実施することができる。例えば、シングルユースバイオリアクター（株式会社バイオット）、シングルユースバイオリアクター（サーモフィッシャー）、シングルユースバイオリアクター（ザルトリウス・ステディウム）、シングルユースバイオリアクター（ＧＥヘルスケアライフサイエンス）などの撹拌翼を備える培養器を用いることで、実施することができる。用いる培養器の種類および撹拌速度は、培養される細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。撹拌速度の例として、例えば、０～１００ｒｐｍ、２０～８０ｒｐｍ、または４５～６５ｒｐｍが挙げられるが、これらに限定されない。

中胚葉系細胞については、前記１のとおりである。幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導するにあたっては、本発明の培地で幹細胞を培養した後、中胚葉から中胚葉由来の組織を分化誘導するために当業者によく知られている方法を用いることができる。例えば、所望の中胚葉由来の組織への分化に適した分化培地で培養することで、所望の中胚葉系細胞へと分化誘導することができる（Ｎａｔｈａｎ Ｊ Ｐａｌｐａｎｔ ｅｔ．ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１６ Ｄｅｃ；１２（１）：１５－３１、Ｃｙｎｔｈｉａ Ａ．Ｂａｔｃｈｅｌｄｅｒ ｅｔ．ａｌ．２００９ Ｊｕｌ；７８（１）：４５－５６等）。

あるいは、幹細胞を間葉系幹細胞へと分化誘導させ、得られた間葉系幹細胞を中胚葉系細胞に分化させてもよい。間葉系幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導する方法は当業者によく知られている。例えば、所望の細胞への分化に適した分化培地で間葉系幹細胞を培養することで、間葉系幹細胞を中胚葉系細胞へと分化誘導することができる（Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ．ａｌ．２００７ Ａｕｇ；２５（８）：２０１７－２０２４等）。

別の実施態様では、本発明は、幹細胞から心筋前駆細胞または心筋細胞を製造する方法を提供する。当該方法は、（１）幹細胞を上述した本発明の培地で培養する段階、次いで（２）Ｗｎｔ阻害剤を含む培地で培養する段階、を含む方法である。段階（２）に次いで、（３）血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびＦＧＦを含む培地で培養する段階、を含んでもよい。

一つの実施形態では、上述の段階（２）が、ＩＷＲ－１およびＩＷＰ－２を含む培地で培養する段階であり、上記の段階（３）が、ＶＥＧＦおよびＦＧＦ－２を含む培地で培養する段階である。Ｗｎｔ阻害剤とは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を阻害する物質のことをいう。Ｗｎｔ阻害剤としては、ＩＷＲ－１（４－［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）－１，３，３ａ，４，７，７ａ－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１，３－ｄｉｏｘｏ－４，７－ｍｅｔｈａｎｏ－２Ｈ－ｉｓｏｉｎｄｏｌ－２－ｙｌ］－Ｎ－８－ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ－ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ－２（Ｎ－（６－Ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［（３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－４－ｏｘｏ－３－ｐｈｅｎｙｌｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ）ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＷｎｔＣ５９（４－（２－ｍｅｔｈｙ１－４－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）－Ｎ－（４－（３－ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）－ｂｅｎｚｅｎｅａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＩＷＰ４（Ｎ－（６－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｙｌ）－２－［［３，４，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－３－（２－ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－ｏｘｏｔｈｉｅｎｏ［３，２－ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｙｌ］ｔｈｉｏ］－ａｃｅｔａｍｉｄｅ）、ＫＹ０２１１等を挙げることができるが、これらに限定されない。

Ｗｎｔ阻害剤としてＩＷＲ－１を用いる場合、用いられるＩＷＲ－１の濃度は、例えば、約０．４～約４０μＭ、約０．８～約２０μＭ、または約２～約８μＭである。例示的な実施形態では、用いられるＩＷＲ－１の濃度は約４μＭである。Ｗｎｔ阻害剤としてＩＷＰ－２を用いる場合、用いられるＩＷＰ－２の濃度は、例えば、約１～約１００μＭ、約２～約５０μＭ、または約５～約２０μＭである。例示的な実施形態では、用いられるＩＷＰ－２の濃度は約１０μＭである。

用いられるＶＥＧＦの濃度は、約０．１～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約０．５～約５０ｎｇ／ｍＬ、約１～約２５ｎｇ／ｍＬ、または約２．５～約１０ｎｇ／ｍＬである。例示的な実施形態では、用いられるＶＥＧＦの濃度は約５ｎｇ／ｍＬである。ＦＧＦとしてＦＧＦ－２を用いる場合、用いられるＦＧＦ－２の濃度は、約０．１～約２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１～約１００ｎｇ／ｍＬ、約２～約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５～約２０ｎｇ／ｍＬである。ＦＧＦの具体例としては、前記１のＦＧＦが挙げられるが、例示的な実施形態では、ＦＧＦとしてＦＧＦ－２を用い、用いられるＦＧＦ－２の濃度は約１０ｎｇ／ｍＬである。

培養温度および培養時間などの培養条件については、所望の細胞の種類に応じて、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、段階（２）は、３５～３９℃／３～７％ＣＯ_２下で１～７日間の培養であってもよい。また、段階（３）は、３５～４２℃／３～７％ＣＯ_２下で１～２０日間の培養であってもよい。より好ましくは、段階（２）が３６～３８℃／４～６％ＣＯ_２下で２～４日間の培養であり、段階（３）が３６～４０℃／４～６％ＣＯ_２下で７～１５日間の培養である。

３．本発明の組成物
本発明の組成物は、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、アクチビン、およびＦＧＦを含む、幹細胞の中胚葉系細胞への分化誘導を補助するための組成物である。上記の組成物に含まれるＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ、アクチビン、およびＦＧＦの種類、濃度等については、前記１のとおりである。例示的な実施形態では、用いられるＲＯＣＫ阻害剤はＹ－２７６３２、ＢＭＰはＢＭＰ４、アクチビンはアクチビンＡ、ＦＧＦはＦＧＦ－２である。上記の組成物は、液体組成物であってもよく、凍結乾燥品などの粉末状組成物であってもよい。

４．本発明の細胞群
本発明の細胞群は、上述した本発明の方法によって得られる細胞群であって、約９０％以上が分化誘導により得られた中胚葉系細胞である、細胞群である。当該細胞群では、約９０％以上、例えば約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上が、中胚葉系細胞である。

本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同一の意味を有する。用語「約」は、当業者により理解され、それが使用されている文脈に応じてある程度変化する。「約」は、典型的に、当該用語が付されている数値の±１０％、より典型的には±５％、より典型的には±４％、より典型的には±３％、より典型的には±２％、さらにより典型的には±１％の範囲の数値を意味する。

以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

幹細胞および培養方法
幹細胞として、多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を用いた（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ． ｅｔ． ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６： １０１－１０６ （２００８））。ＭＥＦ細胞（ＣＦ－１ ＭＥＦ）をフィーダー細胞として用いた。ｉＰＳ細胞用の培地にて維持培養を行った。ｉＰＳ細胞用の培地として、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） ＤＭＥＭ／Ｆ１２に、ＫｎｏｃｋＯｕｔ（商標） Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（終濃度２０％）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１ｍＭ Ｌ－グルタミン、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、４ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を添加したものを用いた。培養したｉＰＳ細胞を１ｍｇ／ｍｌディスパーゼとセルスクレーパーで剥離した後に継代を行った（Ｓｐｌｉｔ Ｒａｔｉｏ＝１：５～１：６）。

生細胞の計数
ＡｃｃｕｔａｓｅまたはＡｃｃｕＭａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて細胞を剥離した。トリパンブルーで染色後、血球算定盤を用いて生細胞を計数した。

ｃＴｎＴ陽性細胞のＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒによる解析
ＡｃｃｕＭａｘを用いて細胞塊を剥離した後、０．５～２×１０^６個の細胞をＦｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎで懸濁し、静置した（４℃、３０分または一晩）。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）バッファーで細胞を２回洗浄した。次いで、Ａｎｔｉ－Ｔｒｏｐｏｎｉｎ， Ｃａｒｄｉａｃ Ｉｓｏｆｏｒｍ Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（１３－１１）， Ａｂ－１（１：１００）、またはＰｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１， ｋ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｔｒｌを一次抗体として添加し、静置した（４℃、３０分または一晩）。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）バッファーで細胞を２回洗浄した。次いで、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（１：１００）を二次抗体として添加した。Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ（商標）バッファーで細胞を２回洗浄した。２％ ＦＢＳ ｉｎ ＰＢＳで細胞を１回洗浄後、再懸濁し、Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ＳＨ８００（Ｓｏｎｙ）を用いてサンプルの測定と解析を行った。

実施例１：ＥＢ形成の有無による心筋細胞の分化誘導に対する影響
ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）－３４ ＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＬ－アスコルビン酸２－リン酸三ナトリウム（終濃度５０μｇ／ｍＬ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、および４００μＭ １－チオグリセロールを添加した培地を用いた（以下、「基礎培地」という）。図１に概説される培養条件（条件１～４）に従って、ｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導させた。

予め培養しておいたｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ処理にて剥離して回収した後、遠心分離に供して上清を除去した。回収したｉＰＳ細胞を培地で懸濁した。条件１～３については、１０μＭ Ｙ－２７６３２を含む基礎培地でｉＰＳ細胞を懸濁した。条件４については、１０μＭ Ｙ－２７６３２、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ－４、５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２、および６ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡを含む基礎培地でｉＰＳ細胞を懸濁した。懸濁したｉＰＳ細胞を、Ｓｉｎｇｌｅ ｕｓｅ ｂｉｏ－ｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ３０ｍＬ（株式会社バイオット）へ、４．０×１０^６細胞／リアクターで播種した。撹拌速度５５ｒｐｍ、３７℃／５％ＣＯ_２下で培養した。
条件１～３については、１０μＭ Ｙ－２７６３２を含む基礎培地で１日間培養した（条件１：Ｄａｙ－３～－２、条件２：Ｄａｙ－２～－１、条件３：Ｄａｙ－１～０）。培養後、条件１、２については、さらに、基礎培地でそれぞれ２日間、１日間培養した（条件１：Ｄａｙ－２～０、条件２：Ｄａｙ－１～０）。その後、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ－４、５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２、および６ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡを含む基礎培地で３日間培養した（条件１～３：Ｄａｙ０～３）。
条件４については、１０μＭ Ｙ－２７６３２、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ－４、５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２、および６ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡを含む基礎培地で１日間の撹拌培養の後（条件４：Ｄａｙ０～１）、１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ－４、５ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２、および６ｎｇ／ｍＬ アクチビンＡを含有する基礎培地で２日間培養した（条件４：Ｄａｙ１～３）。
それぞれの条件で培養後、リアクターから細胞塊を回収して遠心管に移した。基礎培地で細胞塊を洗浄した後、４μＭ ＩＷＲ－１および１０μＭ ＩＷＰ－２を含有する基礎培地で再懸濁し、３日間培養した（条件１～４：Ｄａｙ３～６）。その後、培地を５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含有する基礎培地に置換して、最大１０日間培養した（条件１～４：Ｄａｙ６～）。これらの培地での培養では、２日毎に培地交換を行った。

各条件における生細胞密度の最大値は以下の表のとおりであった（図２）。

また、各条件における心筋細胞マーカー（Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ：ｃＴｎＴ）の最大値は以下の表のとおりであった（図３）。

上記の結果から、ＥＢ形成期間がある条件１～３に比べ、ＥＢ形成期間のない条件４の方が、生細胞数が多く、かつｃＴｎＴ陽性細胞が多いことが示された。

実施例２：基礎培地に添加する因子の相違による分化誘導効率への影響
基礎培地に以下の表に示す因子を添加した。

予め培養しておいたｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ処理にて剥離して回収した後、遠心分離に供して上清を除去した。回収したｉＰＳ細胞を条件Ａ～Ｆの培地それぞれで懸濁した後、Ｓｉｎｇｌｅ ｕｓｅ ｂｉｏ－ｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ３０ｍＬへ、５．０７×１０^６細胞／リアクターで播種した。撹拌速度５５ｒｐｍ、３７℃／５％ＣＯ_２下で培養した。各条件の培養の手順は図４に概説される。
条件ＡおよびＣ～Ｅについては、各条件の培地で１日間の培養の後（条件ＡおよびＣ～Ｅ：Ｄａｙ０～１）、各培地を１０μＭ Ｙ－２７６３２を除いた培地に置換して、２日間培養した（条件ＡおよびＣ～Ｅ：Ｄａｙ１～３）。条件ＢおよびＦについては、各条件で１日間培養した後（条件ＢおよびＦ：Ｄａｙ０～１）、培地を交換し、さらに同じ条件で２日間培養した（条件ＢおよびＦ：Ｄａｙ１～３）。
それぞれの条件で培養後、リアクターから細胞塊を回収して遠心管に移した。基礎培地で細胞塊を洗浄した後、４μＭ ＩＷＲ－１および１０μＭ ＩＷＰ－２を含有する基礎培地で再懸濁し、３日間培養した（条件Ａ～Ｆ：Ｄａｙ３～６）。その後、培地を５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含有する基礎培地に置換して、最大１０日間培養した（条件Ａ～Ｆ：Ｄａｙ６～）。

各条件における生細胞密度の最大値は以下の表のとおりであった（図５）。

^*：分化誘導中に細胞が死滅した。
また、細胞が生存した各条件における心筋細胞マーカー（Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ：ｃＴｎＴ）の最大値は以下の表のとおりであった（図６）。

実施例３：細胞の拍動測定
実施例２の条件Ａの条件下で分化誘導して得られた心筋細胞塊を含む培養液（２ｍｌ）を１２ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ（ＩＷＡＫＩ）へ移し、ライカ ＤＭｉ１ 倒立顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）にて観察した。その結果、各々の心筋細胞塊が自律的に一定の周期で拍動していることを確認した。

実施例４：Ｃａ^＋イメージングの測定
Ｃａｌｃｉｕｍ Ｋｉｔ－Ｆｌｕｏ ４（同仁化学研究所）を用いて、細胞塊、ならびに基板上に接着させた細胞のＣａ^＋イメージングを行った。実施例２の条件Ａの条件下で１６日間分化誘導を行って細胞塊を得た。得られた細胞塊をＰＢＳで洗浄した後にＬｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、ＭＡＴＵＮＡＭＩ ＧＬＡＳＳ ＢＯＴＴＯＭ ＤＩＳＨ Ｈｙｄｒｏ ３５ｍｍ ｄｉｓｈ（松浪硝子工業株式会社）に移した。その後、３７℃で１時間インキュベートを行った。インキュベート後に、Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを除去しＰＢＳで洗浄を行った。得られた細胞塊をＲｅｃｏｒｄｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍに移し替え、ＥＣＬＩＰＳＥ Ｔｓ２（Ｎｉｋｏｎ）にて、蛍光観察を行った。同様に、実施例２の条件Ａの条件下で１６日間分化誘導を行って得た細胞塊をＡｃｃｕＭａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、細胞塊を剥離した。剥離した細胞塊をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに懸濁し、４０μｍ ストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に懸濁液を通した。予めヒト組換えラミニン－２２１（０．５μｇ／ｃｍ^２、ベリタス）でコートしたＭＡＴＵＮＡＭＩ ＧＬＡＳＳ ＢＯＴＴＯＭ ＤＩＳＨ Ｈｙｄｒｏ ３５ｍｍ ｄｉｓｈ上に、１×１０^６細胞／ｗｅｌｌとなるよう、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで希釈した細胞を播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で７日間培養した。その後、上記と同様の操作で、基板上に接着させた細胞のＣａ^＋イメージングを行った。その結果、細胞塊、ならびに接着させた細胞について、拍動と同調して、Ｃａ^＋濃度が上昇する様子を確認することができた。

実施例５：心筋マーカーの発現
実施例２の条件Ａの条件下で１６日間分化誘導を行って得た細胞塊をＡｃｃｕＭａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、細胞塊を剥離した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに懸濁し、４０μｍ ストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に懸濁液を通した。予めフィブロネクチン（５μｇ／ｃｍ^２、Ｓｉｇｍａ）でコートした２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ＭＩＣＲＯＰＬＡＴＥ ｗｉｔｈ Ｌｉｄ（ＩＷＡＫＩ）に、４×１０^４細胞／ｗｅｌｌとなるよう、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳで希釈した細胞を播種し、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で６日間培養した。培養上清を除き、ＰＢＳで３回洗浄後、Ｆｉｘａｔｉｏｎ／Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞の固定を行った（４℃、６０分または一晩）。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳ＋３％ＦＢＳでのブロッキングを室温にて、３０分間行った。液を捨て、各種抗体を含むＰＢＳ＋１％ＦＢＳに置換した（４℃、６０分または一晩）。液を捨て、０．１％ＦＢＳ／ＰＢＳＴに置換し、５分間静置して洗浄した（静置洗浄）。この洗浄操作を３回行った。洗浄液を除去後、各種二次抗体を添加した（室温、６０分間）。ＰＢＳで５分間の静置洗浄を３回行った後、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理した（室温、１５分間）。ＰＢＳで３回洗浄後、ＥＶＯＳ ＦＬ Ａｕｔｏ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、蛍光測定を行った。使用した抗体とその濃度を以下に示す。
［使用した抗体とその濃度］
Ａｎｔｉ－Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｃａｒｄｉａｃ Ｉｓｏｆｏｒｍ Ｍｏｕｓｅ－Ｍｏｎｏ（１３－１１），Ａｂ－１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）： ２μｇ/ｍｌ（１００倍希釈）
Ａｎｔｉ－Ｓａｒｃｏｍｅｒｉｃ Ａｌｐｈａ Ａｃｔｉｎｉｎ ａｂ９４６５（ａｂａｃａｍ）：２．５μｇ/ｍｌ（５０倍希釈）
Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１，ｋ Ｉｓｏｔｙｐｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）：２μｇ／ｍｌまたは２．５μｇ/ｍｌ
Ｍｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ（ＭＨＣ） Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）：２．５μｇ/ｍｌ（２００倍希釈）
Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ（Ｄａｋｏ）：２．５μｇ／ｍｌ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ａ２１１２１およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ａ１１００１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：２０μｇ/ｍｌ（１００倍希釈）
その結果、心筋マーカーであるｃＴｎＴ、α－Ａｃｔｉｎｉｎ、およびＭＨＣが、分化誘導させたｉＰＳ由来心筋細胞において発現していることを確認した。

実施例６：細胞外電位の測定
実施例２の条件Ａの条件下で１４日間分化誘導を行って得た細胞塊をＡｃｃｕＭａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で処理し、細胞塊を剥離した。ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳに懸濁し、４０μｍ ストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に懸濁液を通した。予め、ｍｕｌｔｉ－ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ ｄｉｓｈ ＭＥＤ－Ｐ５３０Ａ（アルファメッドサイエンティフィック株式会社）の電極を囲う様にシリコンで枠を作成した後、内部をフィブロネクチン（約５μｇ／ｃｍ^２、Ｓｉｇｍａ）でコートした。枠内に１×１０^５個の細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で１時間静置させた。細胞が沈降、接着した事を確認した後に、培地を補充して４日間培養を行った。細胞外電位の測定はＭＥＤ６４（アルファメッドサイエンティフィック株式会社）で行った。その結果、誘導した心筋細胞で脱分極と再分極が自律的に発生することを確認した。

上述の結果から、上記の４因子（ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰ４、ＦＧＦ－２、およびアクチビンＡ）を添加した培地を用いてｉＰＳ細胞を浮遊培養することで、ＥＢ形成などの準備工程を経ることなく、中胚葉系細胞を誘導することができ、得られた中胚葉系細胞を心筋細胞に誘導できることが示された。また、高い生存率で高効率に心筋細胞を誘導できることが示された。さらに、誘導した心筋細胞が自律的に一定の周期で拍動することが確認された。またさらに、誘導した心筋細胞で脱分極と再分極が自律的に発生することが確認された。すなわち、本発明の方法を用いることで、迅速かつ簡便に、高効率で心筋細胞を誘導できることが示された。この方法は浮遊培養を用いる場合、細胞の大量培養にも適している。

実施例７：フィーダーフリー培養したｉＰＳ細胞を用いた心筋細胞の分化
幹細胞および培養方法
幹細胞として、多能性幹細胞であるｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を用いた（Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ． ｅｔ． ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６： １０１－１０６ （２００８））。フィーダーフリーでのｉＰＳ細胞の培養は以下の条件で行った。ｉＭａｔｒｉｘ（登録商標）５１１で０．５ｎｇ／ｃｍ^２で培養器をコーティングした。 ｉＰＳ細胞用の培地として、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎを使用した。０．５×ＴｒｙｐＬＥ（商標）にて細胞を剥離した後、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２ＮにＹ―２７６３１４を１０μＭ添加した培地にて、４－８×１０^４細胞／Ｔ－２５フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に継代を行った。培養１日以降はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎで培地交換を行い、維持培養した。

培養した細胞をＰＢＳで洗浄した後、０．５×ＴｒｙｐＬＥ（商標）にて細胞を剥離した。その後、遠心分離に供して上清を除去した。回収したｉＰＳ細胞を実施例２の条件Ａの培地で懸濁した後、Ｓｉｎｇｌｅ ｕｓｅ ｂｉｏ－ｒｅａｃｔｏｒ ｆｏｒ ３０ｍＬへ、５．０×１０^６細胞／リアクターで播種した。撹拌速度５５ｒｐｍ、３７℃／５％ＣＯ_２下で培養した。実施例２の条件Ａの培地にて３日間培養を行った。その後、リアクターから細胞塊を回収して遠心管に移した。上清を除去し、基礎培地で細胞塊を１回洗浄した後、４μＭ ＩＷＲ－１および１０μＭ ＩＷＰ－２を含有する基礎培地で再懸濁し、再度リアクターにて３日間培養した。培養後、培地を５ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦおよび１０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含有する基礎培地に置換して、最大１５日間培養を行った。培養中、２日毎に培地交換を実施した。

各分化誘導期間における心筋細胞マーカー（Ｃａｒｄｉａｃ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｔ：ｃＴｎＴ）は以下の表のとおりであった。

上述の結果から、本発明の培地および方法を用いて、フィーダーフリーの状態で培養したｉＰＳ細胞からも、ＥＢ形成などの準備工程を経ることなく、中胚葉系細胞を誘導することができ、得られた中胚葉系細胞を高効率で心筋細胞に誘導できることが示された。

本発明によれば、迅速かつ簡便に、高効率で幹細胞を心筋細胞などの中胚葉系細胞へと分化誘導することができる。この方法は、浮遊培養を用いる場合、中胚葉系細胞の大量培養にも適している。したがって、本発明は、再生医療分野において有用である。本発明はまた、医薬品開発においても有用である。

Claims (5)

1. 人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から心筋細胞を製造する方法であって、培養０日目～
   １日目はＹ－２７６３２、ＢＭＰ－４、ＦＧＦ－２、およびアクチビンＡを含む基礎培地
   で、次いで培養１日目～３日目はＢＭＰ－４、ＦＧＦ－２、およびアクチビンＡを含む基
   礎培地でｉＰＳ細胞を培養する分化誘導段階を含む方法であって、前記分化誘導段階の前に胚葉体（ＥＢ）形成期間を設けない、方法。
2. さらに、Ｗｎｔ阻害剤を含む培地で培養する段階を含む、請求項１に記載の方法。
3. Ｗｎｔ阻害剤が、ＩＷＲ－１およびＩＷＰ－２である、請求項２に記載の方法。
4. 培養が浮遊培養である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
   載の方法。
5. 培地中のＹ－２７６３２の濃度が５～２０μＭ、ＢＭＰ－４の濃度が５～２０ｎｇ／ｍ
   ｌ、ＦＧＦ－２の濃度が２．５～１０ｎｇ／ｍｌ、アクチビンＡの濃度が３～１２ｎｇ／
   ｍｌである、請求項１に記載の方法。

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