KR20210003574A

KR20210003574A - cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR20210003574A
Application number: KR1020190079547A
Authority: KR
Inventors: 김계성; 임정진; 김형준; 최명준; 김수진
Original assignee: 한양대학교 산학협력단; 주식회사 엑세쏘바이오파마
Priority date: 2019-07-02
Filing date: 2019-07-02
Publication date: 2021-01-12
Also published as: CN114127264A; WO2021002554A1; KR102276781B1; JP7387115B2; EP3995570A1; US20220380724A1; EP3995570A4; JP2022540579A

Abstract

본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 전분화능 줄기세포 증식 촉진용 조성물 및 줄기세포 배양액 첨가용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 줄기세포 증식 촉진용 조성물 및 줄기세포 배지 첨가용 조성물을 사용하여 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포특성 (stemness)을 강화하고 증식을 촉진하며, 세포 사멸을 저해할 수 있다.

Description

cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물{Composition for stimulating stem cell proliferation comprising cP1P or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient}

본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 증식 촉진 및 기능 강화용 조성물 및 줄기세포 배양액 첨가용 조성물에 관한 것이다.

전분화능 줄기세포(Pluripotent Stem Cells, PSCs)는 무한대로 증식할 수 있을 뿐만 아니라 인체를 구성하고 있는 모든 종류의 세포 및 조직으로 분화 가능한 특징을 가지고 있고, 이를 기능성 세포로 분화유도하여 배양 접시 내 질환모델 생산 및 난치성 질환 치료 등에 활용이 가능하다.

현재까지 PSCs는 전 세계적으로 1,000 여종 이상의 인간 배아줄기세포(human Embryonic Stem Cells, hESCs)와 1,200 여종의 유도만능줄기세포(induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)가 확립된 것으로 알려져 있으나, 이러한 PSCs의 확립에서부터 유지 배양, 저장, 특정세포로의 분화유도 등 줄기세포 기반 연구의 대부분이 실험실 환경에서 동물 유래원이 첨가된 배양액을 이용한 배양 방법으로 이루어지고 있고, PSCs 본연의 naive state의 기준 또한 연구실 별로 다양하게 존재하여 그 기준이 모호한 상태이다.

세계 각국에서는 기 수립된 연구등급 PSCs를 임상등급으로 전환하기 위해 xeno-비의존 및 GMP 등급의 줄기세포를 확보하고자 노력 중이며, 외국에서는 이미 임상등급 전분화능 세포치료제를 개발하기 위한 사전작업을 진행하고 있고 다양한 임상용 연구단계 배양액을 개발하여 시판하고 있다. 하지만, 세계 각국에서 xeno-비의존 및 GMP 등급의 무혈청 배양액 개발을 진행 중이지만 대부분의 연구가 항체 등 생물학적 제제 생산용 배양액에 집중되어 있다. 현재 시판중인 임상용 연구단계 배양액들은 혈청배양액에 비해 세포증식 효과가 떨어지며 혈청을 완전히 대체할만한 첨가물질이 거의 없는 실정이다. 또한, 시판중인 임상용 연구단계 배양액들에는 산업계에서 쓰기에는 매우 고가의 성장인자가 첨가되어 생산단가가 상당히 높다는 문제가 있어서 현재까지 임상등급으로써 상용화된 PSCs 배양용 배양액은 없는 실정이다.

최근에는 미국, 일본을 중심으로 임상적용이 가능한 줄기세포용 무혈청 배양액 개발이 활발히 진행 중이다. 국내에서도 다수의 기업 및 연구소에서 PSCs 배양용 배양액을 개발하고 있으나 시제품 제작 및 상용화에 성공한 곳이 없어 100% 수입에 의존하고 있고, 수입된 연구용 줄기세포 배양용 무혈청 배양액의 가격은 500 mL 기준 40만원~150만원으로 매우 고가이다. 인간 PSCs의 경우 serum-free, feeder-free의 defined된 배양 시스템을 지향하게 되면서 naive state의 줄기세포를 유지, 증식하는데 어려움이 더욱 증가되고 있다. 현재까지 생쥐 모델의 2i(GSK3b and MEK inhibitors) 시스템에 다양한 종류의 성장인자와 저해제를 첨가하여 인간 PSCs를 배양 및 유지하고 있으나, 완전하게 naive한 상태의 PSCs는 확립되어 있지 않다.

본 발명의 목적은 cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양액 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 배양 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 포함하는 체외 환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양액 첨가용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 포함하는 체외환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 PSCs (hPSCs)에 cP1P를 처리한 경우 P1P(Phytosphingosine-1-phosphate), 또는 S1P(Sphingosine-1-phosphate)를 처리한 경우에 비해서 세포 증식능이 현저히 증가함을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 미분화능이 잘 유지됨을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 콜로니 수가 증가하고 콜로니 크기가 증가함을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 계대가 지날수록 전체 세포수가 유의하게 증가함을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 세포주기를 조절하는 유전자(CDK1, Cyclin B)의 발현이 증가함을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 세포사멸이 줄어들었고, 세포독성도 현저하게 낮았음을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 세포의 전분화 특성이 증가함을 확인하였다.

또 다른 실시예에서는 cP1P를 hPSCs에 장기적으로 처리한 경우 대조구에 비해서 세포의 전분화 특성이 증가함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.

본 발명의 하나의 양태는 cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에 기재된 cP1P, S1P(Sphingosine-1-phosphate) 및 P1P(Phytosphingosine-1-phosphate)는 공지된 물질로 그 화학적 구조는 도 1에 개시되어 있다.

본원에 따른 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물은 유기화학 분야에 공지되어 있는 통상의 지식을 이용하여 제조할 수 없으며, 예를 들어 (S. Li, W.K. Wilson, G.J. Schroepfer, Chemical synthesis of D-ribo-phytosphingosine-1-phosphate, potential modulator of cellular processes. J. Lipid Res. 40: 117-125, 1999)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 P1P를 제조할 수는 있지만, 이는 본원의 cP1P를 합성하는 기술과 상이하고, 본원의 cP1P는 본 발명자의 등록특허 "신규한 피토스핑고신-1-포스페이트 유도체, 그 제조방법 및 그것을 포함하는 탈모의 예방, 치료 또는 육모용 조성물"(대한민국 등록특허 제10-1340556호)에 개시된 방법에 의해서만 합성이 가능하다.

상기 염은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여 시 통상적인 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말하고, 상기 염으로는 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탄산 및 아스파르트산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 따른 일 구현예에서 약학적으로 허용 가능한 염은 상기 cP1P, S1P, 또는 P1P 화합물이 유리산과 함께 염을 형성하는 산부가염으로 존재할 수 있다. 또한, 본원에 따른 상기 cP1P, S1P, 또는 P1P 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 수화물, 용매화물을 모두 포함할 수 있다.

본원의 용어 "줄기세포"는 한 개의 세포가 여러 종류의 다른 세포를 생산해 낼 수 있는 다중 분화능을 가진 세포로서, 우리 몸의 손상받은 부위의 세포들을 새로 재생할 수 있는 세포들을 통칭한다. 줄기세포는 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 자가 재생산 능력, 특정 환경에서 기능성 특정 세포로 분화할 수 있는 분화능, 면역세포와 반응하여 면역반응을 조절하는 면역 조절능을 갖는다. 줄기세포의 종류는 분화되는 세포의 영역에 따라 인체를 구성하는 200여 가지의 세포로 모두 분화할 능력을 가진 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell)와 특정 종류의 세포로 분화할 수 있도록 특화된 조직-특이적 줄기세포(tissue-specific stem cell)로 나눌 수 있다. 또한 줄기세포를 획득하기 위한 공급원에 따라 수정란에서 출발한 배아 또는 배반포(blastocyte)에서 얻어지는 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 발생 과정이 끝난 신생아 또는 성인의 신체 각 조직에서 얻어지는 성체줄기세포(adult stem cell)로 분류될 수 있다.

본원에서 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)일 수 있고, 상기 줄기세포는 통상적으로 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 획득할 수 있다.

본원에서 용어 "배아줄기세포(embryonic stem cell)"는 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것으로서, 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나 전능성(totipotent)일 수 있는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다. 배아체는 배아줄기세포의 다양한 조직 형태로의 자발적 분화 과정에서 줄기세포에 의해 형성된 중간구조이며, 배아 줄기 세포의 배양 중에 형성된 응집물(aggregate) 형태이다. 한편, 본 발명의 배아줄기세포는 인간을 포함한 포유동물로부터 유래할 수 있고, 바람직하게는 인간 배아줄기세포이다.

배아줄기세포는 외배엽, 중배엽 및 내배엽성 줄기세포로 분화할 수 있다.

본원에서 용어“분화(differentiation)”란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다. 다능성 베아줄기세포는 계통이 한정된 전구세포(예컨대, 외배엽성 세포, 중배엽성 세포 또는 내배엽성 세포 등)로 분화한 후, 다른 형태의 전구세포로 더 분화될 수 있고(예컨대, 혈관모세포 등), 그 뒤 특정 조직(예컨대, 혈관 등)에서 특징적인 역할을 수행하는 말기 분화세포(예컨대, 혈관내피세포 및 혈관평활근세포 등)로 분화될 수 있다.

본원에서 용어 "유도만능줄기세포" 또는 "iPSC"는 체세포 또는 이미 분화된 세포를 처리하여 만능 분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 여기에서 처리하는 방법은 화합물, 유전적 변환 또는 특정 조건으로 배양하는 방법 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. "인간 유도만능줄기세포" 또는 "hiPSC"는 인간의 체세포 또는 인간의 분화된 세포를 처리하여 만능분화성을 갖게 된 세포를 의미한다. 상기의 인간 유도만능줄기세포는 섬유아세포 유래일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 혈액 등 다양한 기원으로부터 유래할 수 있다. 또한, 상기 인간 유도만능줄기세포는 인간 섬유아세포에 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 등 리프로그래밍 관련 유전자를 발현시켜 제작될 수 있다. 이때, Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 유전자 등의 발현은 레트로바이러스 감염 또는 에피조말 시스템(episomal system)을 통해 유래될 수 있다.

본원에서 cP1P, 이들 유도체 화합물, 또는 이의 염은 줄기세포의 증식 또는 성장 촉진, 또는 본원에 개시된 효과 달성을 위해 상기 물질을 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물 또는 세포배양용 배지 조성물로서, 줄기세포배양에 사용되는 통상의 배지에 첨가되어 사용될 수 있다.

본원에서 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 cP1P, 이들 유도체 화합물 또는 이의 염들을 첨가하면 줄기세포의 증식이 촉진되고, 줄기세포 사멸이 저해되고, 줄기세포 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 줄기세포의 전분화능이 강화되고, 바람직하게는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포의 증식이 촉진되고, 세포 사멸이 저해되고, 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 전분화능(stemness, naive state)이 강화될 수 있다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 포함된 cP1P의 농도 범위는 0.1 nM에서 10,000 nM, 바람직하게는 0.5 내지 200 nM일 수 있고, 상기 농도 범위의 cP1P가 줄기세포 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

상기 따른 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물은 본원의 목적에 부합하는 한, 목적하는 구체적 세포의 종류에 따라 적절한 농도로 포함할 수 있다.

상기 cP1P를 유효성분으로 포함하는 조성물을 세포 배양 용기에 첨가하여 줄기세포를 배양하는 경우, 세포 배양 용기에서 줄기세포가 단일세포로부터 다수의 콜로니(colony, 세포 군집 형성)를 효과적으로 형성하여 성장할 수 있고, 바람직하게는 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포가 콜로니를 형성하여 성장할 수 있다.

줄기세포가 콜로니를 형성하여 성장하는 경우 줄기세포가 생체내에서 성장하는 형태와 유사하므로, cP1P를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용하여 줄기세포를 배양하는 경우 생체내에서 성장하는 것과 유사한 특성을 가지는 줄기세포를 얻을 수 있다.

본원에서 줄기세포 배양에 사용되는 배지는 이 기술분야의 통상의 기술자들에게 널리 알려진 배지라면 제한없이 사용될 수 있다. 상기 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α―MEM(α―Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), 또는 MEF을 예로 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

한편, 본원에 따른 따른 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물을 배지(또는 배양액)에 첨가하는 경우 혈청성분이 없는 무혈청 배지 또는 혈청성분이 감소된 저혈청 배지 상태에서도 줄기세포의 증식이 이루어졌다.

본원 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물은 무혈청 또는 혈청성분을 0.1 내지 3 중량％ 함유하는 것일 수 있다.

상기 무혈청 배지는 인간을 포함한 동물로부터 유래된 혈청(동물 유래 혈청)을 일정 함량 이상 함유하지 않는 임의의 배양 배지를 의미한다. 예를 들어, 무혈청 배지는 동물 유래 혈청을 총 조성물 함량 대비 0.1 중량% 미만 또는 0.01 중량% 미만으로 포함할 수 있으며, 구체적으로 동물 유래 혈청을 함유하지 않을 수 있다.

본원은 줄기세포의 증식 및 배양을 위해 필요한 동물 유래 혈청 대신 cP1P 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 용매화물을 포함하는 줄기세포 배지 첨가용 조성물 또는 무혈청 배지 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 동물 유래 혈청을 대체 가능할 정도로 줄기세포를 안정적으로 증식 및 배양할 수 있고, 재현성 있는 시험 및 생산 공정의 확립이 가능하다.

저혈청 배지에는 세포배양에 통상적으로 사용되는 혈청이 0.1 내지 3 중량％의 우태아혈청(FBS)을 첨가되며, 동물 유래 혈청과 유사한 성분을 가지는 화합물, 예를 들어, BPE(bovine pituitary extract) 등을 사용할 수도 있다.

본원의 상기 "줄기세포"는 상기한 바와 같으며, 골수, 지방조직, 제대혈(cord blood), 말초혈, 신생아 조직(neonatal tissues), 태반 등의 다양한 성체 조직 및 골수 유래 세포에서 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또 하나의 양태로 본 발명은 cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양액 첨가용 조성물에 관한 것이다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 사항은 줄기세포 배양액 첨가용 조성물의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 줄기세포 배양액 첨가용 조성물에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)일 수 있다.

상기 줄기세포 배양액 첨가용 조성물에 포함된 cP1P의 농도 범위는 0.1 nM에서 10,000 nM, 바람직하게는 0.5 내지 200 nM일 수 있고, 상기 농도 범위의 cP1P가 줄기세포 배양용 배지에 첨가될 수 있다.

또 하나의 양태로 본 발명은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 배양 방법에 관한 것이다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 사항은 줄기세포 배양 방법의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 줄기세포 배지 첨가용 조성물에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 경우 줄기세포의 증식이 촉진되고, 줄기세포 사멸이 저해되고, 줄기세포 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 줄기세포의 전분화능이 강화되고, 바람직하게는 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포의 증식이 촉진되고, 세포 사멸이 저해되고, 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 전분화능(stemness, naive state)이 강화될 수 있다.

또한, 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 경우 세포 배양 용기에서 줄기세포가 콜로니(colony, 세포 군집 형성)를 형성하여 성장하게 할 수 있고, 바람직하게는 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포가 콜로니를 형성하여 자랄 수 있다.

또 하나의 양태로 본 발명은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 포함하는 체외환경 (in vitro)에서 줄기세포 사멸 억제용 키트에 관한 것이다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 사항은 체외배양환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 체외환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

본원에 따른 키트에 포함되는 유효성분은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있으며 체외배양환경에서 상기 목적하는 효과를 위한 추가의 성분 및 사용법 등을 포함할 수 있다.

상기 체외배양환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트에 포함된 cP1P의 농도는 0.1 nM 내지 10,000 nM일 수 있으나, 바람직하게는 0.5 내지 200 nM일 수 있고, 상기 농도의 cP1P가 체외배양환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트에 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 포함하는 체외배양환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트에서 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포 사멸이 저해 및 억제되고, 줄기세포 콜로니의 숫자 및 크기가 증가되고, 줄기세포의 전분화능(stemness, naive state)이 강화될 수 있다.

또 하나의 양태로 본 발명은 상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 포함하는 체외배양환경(in vitro)에서 줄기세포 증식 촉진용 키트에 관한 것이다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물에 관한 사항은 체외배양환경에서 줄기세포 증식 촉진용 키트의 본질에 벗어나지 않는 한도에서 체외배양환경에서 줄기세포 증식 촉진용 키트에 대해서도 동일하게 적용될 수 있다.

상기 체외배양환경에서 줄기세포 증식 촉진용 키트에 포함된 cP1P의 농도는 0.1 nM 내지 10,000 nM일 수 있으나, 바람직하게는 0.5 내지 200 nM일 수 있고, 상기 농도의 cP1P가 체외배양환경에서 줄기세포 증식 촉진용 키트에 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 줄기세포 증식 촉진용 조성물을 포함하는 체외배양환경에서 줄기세포 증식 촉진용 키트에서 줄기세포를 배양하는 경우 줄기세포의 증식이 촉진되고 전분화능이 강화될 수 있다.

도 1은 cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate), S1P(Sphingosine-1-phosphate) 및 P1P(Phytosphingosine-1-phosphate)의 화학적 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 hPSCs에 cP1P, P1P, 또는 S1P를 처리한 후 세포 증식능의 변화 현미경으로 확인한 것이다.
도 3는 hPSCs에 1-500nM농도의 cP1P, P1P, 또는 S1P를 처리한 후, 세포의 증식비율을 측정한 결과이다.
도 4는 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 처리한 후 alkaline phosphatase staining 키트를 이용하여 염색한 후 광학현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5은 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 처리한 후 콜로니 수 및 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 처리한 후 계대배양에 따른 전체 세포의 수 변화를 확인한 결과이다.
도 7은 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 처리한 후 세포주기 변화를 확인한 결과이다.
도 8은 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 처리한 후 세포사멸의 변화를 확인한 결과이다.
도 9은 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 처리한 후 전분화 특성 변화를 확인한 결과이다.
도 10은 hPSCs에 대조군(vehicle, DMSO) 또는 cP1P를 장기적으로 처리한 후 유전자 발현의 변화를 확인한 결과이다.
도 11는 hPSCs에 cP1P를 포함하는 배양 첨가제 또는 배양액을 처리하여 전분화성이 강화된 줄기세포를 대량 생산할 수 있음을 도식화하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 참고예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 참고예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

실시예 1. cP1P 농도에 따른 hPSC 세포 증식능 확인

cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 농도에 따른 hPSCs의 증식능 변화를 확인하기 위해서 hPSCs를 배양하고 cP1P를 농도별 처리한 후 hPSCs의 증식 변화를 확인하였다.

hPSCs를 배양하기 전, 배양접시를 10 μg/ml vitronectin XF (STEMCELL)으로 2시간 동안 상온에서 코팅하고, 그리고 나서 상기 코팅용액을 제거하고 배양접시의 세포부착능을 향상시키기 위해 10 uM Y27632(ROCK inhibitor, TOCRIS)이 포함된 Essential 8 배양액(E8, STEMCELL)를 넣었다. 배양접시에 2000 cells/cm² 밀도로 hPSCs(CHA-ESC15; 차의과학대학교) 세포를 심고, 상하좌우로 흔들어 세포를 골고루 분산시킨 후 37℃ CO₂ 배양기에서 24시간 이내 배양하고, 배양액을 Y27632가 제거된 E8 배양액으로 교체한 후 다음 계대까지 매일 배양액을 교체하여 세포를 배양하였다.

상기와 같이 계대배양한 hPSCs에 50 nM, 100 nM, 또는 500 nM의 cP1P(대한민국 공개특허 제10-2017-0129460호, 주식회사 엑세쏘바이오 제조), S1P(Sigma-Aldrich US, 73914), 또는 P1P(주식회사 엑세쏘바이오 제조)를 2일 마다 교체하여 처리하여 6일동안 배양하고 7일째 되는 날에 세포를 광학현미경을 이용하여 100배의 배율로 관찰하였다.

또한, 세포 수를 측정하기 위해서 배양 7일째에 세포의 배양액을 제거하고 PBS로 한번 씻어낸 후, PBS가 제거된 세포에 Cell dissociation buffer (STEMCELL)을 사용하여 단일세포화 시켜 분리된 세포를 1000 rpm, 2분 조건으로 원심분리하여 buffer를 제거한 후, E8 배지에 현탁하고 EVE™ Automated Cell Counter(NanoEnTek)를 사용하여 세포 수를 측정하였다.

한편, 대조군은 상기와 동일한 방식으로 실험을 하되 hPSCs에 DMSO (AppliChem GE, A3672,0100)를 처리하였다.

그 결과 도 2에 나타난 것과 같이, hPSCs에 cP1P를 처리한 경우 P1P, 또는 S1P를 처리한 경우에 비해서 세포 증식능이 현저히 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 양성대조군으로 사용한 S1P 또는 P1P를 처리한 경우 세포사멸이 발생함을 현미경 사진으로 확인할 수 있었다.

실시예 2. cP1P 처리에 따른 hPSCs 증식능 확인

hPSCs 증식능을 나타내는 cP1P의 최적 농도를 결정하기 위해 1-500nM 농도에서 세포 증식능을 확인하였다.

실시예 1과 같은 방법으로 실험을 수행하되, 계대배양한 hPSC 세포에 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100nM, 또는 500 nM의 P1P, cP1P, 또는 S1P를 2일 마다 교체하여 처리하거나 대조군(vehicle, DMSO)을 2일마다 교체하여 처리하여 6일동안 배양하고 hPSCs를 7일째 되는 날에 관찰하였다. 증식비율은 {(P1P, cP1P, 또는 S1P 처리군의 전체 세포수)/(대조군의 전체 세포수)} X 100 하여 계산하였다.

그 결과 도 3에 나타난 것과 같이, 10 nM의 S1P를 처리한 경우 세포증식률이 대조구에 비해 1.25배 정도 증가했고, 10 nM의 P1P를 처리한 경우 세포증식률이 대조구에 비해 1.55배 정도 증가되었을 뿐이지만, 10 nM의 cP1P를 처리한 경우 세포증식률이 대조구에 비해 1.78배 정도 증가 되었다.

따라서, 10 nM의 낮은 농도에서도 양성대조군으로 사용한 약물에 비해 cP1P를 hPSC 세포에 처리하는 경우 세포증식률이 현저히 높아지는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. cP1P 처리에 의한 분화능 변화 확인

cP1P 처리에 의한 hPSCs의 분화능 변화 여부를 확인하기 위해서 실시예 2와 같은 방법으로 10 nM cP1P를 hPSC 세포에 처리하거나, 대조군(vehicle, DMSO)을 처리한 후 alkaline phosphatase staining 키트(Sigma-Aldrich US, SCR004)를 이용하여 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과 도 4에 나타난 것과 같이, cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조구에 비해서 미분화능이 잘 유지됨을 확인할 수 있었다.

실시예 4. cP1P 처리에 의한 콜로니 수 및 크기 변화 확인

cP1P 처리에 의한 콜로니 수 및 크기 변화를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1과 같은 방법으로 hPSCs에 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1,000 nM, 또는 10,000 nM cP1P를 처리하고 6일동안 배양하고 7일째 되는 날에 광학현미경 하에서 콜로니(colony) 수 및 크기를 확인하였다.

그 결과 도 5에 나타난 것과 같이 10 nM 이상의 cP1P를 hPSCs에 처리하는 경우 대조군에 비하여 크기가 150 mm 이상인 콜로니의 수가 유의적으로 증가하였다(P<0.01).

실시예 5 cP1P 처리에 의한 hPSCs 증식능 변화가 계대배양 시 지속되는지 여부 확인

cP1P 처리에 의한 hPSCs 증식능 변화가 계대배양 시 지속되는지 여부를 확인하기 위해서 실시예 1와 같은 방법으로 10 nM cP1P를 hPSCs에 지속적으로 처리하면서 3번의 계대배양을 한 후 hPSCs의 증식 변화를 확인하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 것과 같이, cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 계대가 지날수록 전체 세포 수가 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(P<0.01).

실시예 6 cP1P 처리에 의한 hPSC 세포주기 변화 확인

cP1P 처리에 의한 hPSC 세포주기 변화를 확인하기 위해서 유세포 분석(flow cytometer), 세포사멸 분석 및 세포주기 조절 유전자의 발현 분석을 수행하였다.

유세포 분석을 위해서 실시예 1와 같은 방법으로 10 nM cP1P를 hPSCs에 처리하고 hPSCs를 cell dissociation buffer(Thermo Fisher Scientific US, A1110501)를 이용하여 세포 분리하여 수확한 세포를 DPBS(pH 7.4)로 3회 washing한 후 상층액을 제거하고, washing 하는 동안 세포 pellet에 차가운(cold) 70%(v/v) 에탄올을 한 방울씩 추가하고 4℃에서 1시간 동안 고정 후 DPBS (pH 7.4)로 3회 washing하고 2,000 rpm, 5 min 조건으로 원심분리 한 후 100 μg/ml RNase(Sigma-Aldrich US, R4642) 50 uL를 첨가하고 잘 혼합하고 200μl 의 PI(propidium iodide)(Sigma-Aldrich US, P4170) (50μg/ml)를 첨가하여 DNA를 염색한 후 flow cytometry(BD)를 이용하여 DNA 함량(content)을 측정하였다.

세포사멸을 확인하기 위해서 실시예 1과 같은 방법으로 10 nM cP1P를 hPSC 세포에 처리하고 hPSCs를 cell dissociation buffer(Thermo Fisher Scientific US, A1110501)를 이용하여 세포 분리하여 수확한 세포를 DPBS(pH 7.4)로 2회 washing한 후 2,000 rpm, 5 min 조건으로 원심분리 한 후 10x binding buffer(0.1M HEPES, 1.4M NaCl, 25mM CaCl2, pH7.4)를 1x로 희석한 binding buffer 100 ul 당 1x10⁵ 세포로 현탁(resuspension)하고 Annexin V(BD bioscience US,556422)와 7-AAD(BD bioscience US,1559925)를 각각 5 ul씩 넣어 천천히 섞어주고 실온의 암실에서 15분간 배양하고 400 ul의 1x binding buffer를 추가한 후, Annexin V apoptosis detection kit (BD Pharmingen US, 556547)를 이용하여 분석하였다.

세포주기 조절 유전자의 발현 분석을 위해서 실시예 1와 같은 방법으로 10 nM cP1P를 hPSCs에 처리하고 hPSCs를 PBS washing한 후 4%(w/v) PFA(Santa Cruz Biotechnology US, 30525-89-4)에 5분간 고정하거나, hPSC 세포의 단백질을 회수한 후 전기영동한 후에 anti-REX1(Abcam UK, ab50828), anti-OCT4(Santa Cruz Biotechnology US, sc-5279), anti-SOX2(Abcam UK, ab97959), anti-NANOG(Cell signaling US, 4893s), anti-E-cadherin(Cell signaling US, 24E10), 또는 anti-SSEA4(Merck millipore US, 90231) 항체를 이용하여 전분화능 유전자의 발현을 분석(면역형광분석 또는 웨스턴 블롯 분석)하였다.한편, 대조군은 상기와 동일한 방식으로 실험을 하되 hPSCs에 DMSO(AppliChem GE, A3672,0100)를 처리하였다.

그 결과 도 7A에 나타난 것과 같이 10 nM cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조군 대비 약 12% 이상 세포증식이 증가(대조군 (48%), 실험군(60%))함을 확인 할 수 있었고, 도 7B에 나타난 것과 같이 10 nM cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조군에 비해서 세포증식이 활발히 일어나고 있는 G2/M phase에 속하는 세포의 수가 유의적으로 증가하였고 (P<0.01), 10 nM cP1P를 hPSC 세포에 처리한 경우 대조군에 비해서 세포사멸(apoptosis)된 세포에 해당하는 sub-G0 phase에 속하는 세포의 수가 유의적으로 감소하였다(P>0.05),

또한, 도 7C 내지 E에 나타난 것과 같이 10 nM cP1P를 hPSCs에 처리한 경우 대조군 대비 세포주기를 조절하는 유전자(CDK1, Cyclin B)의 발현이 증가하였다.

실시예 7. 세포사멸 및 세포독성 분석

cP1P를 hPSCs에 처리하는 경우 세포사멸 및 세포독성이 유도되는지 여부를 확인하기 위해서 실시예 6과 같은 방법으로 10 nM 또는 100 nM cP1P를 hPSCs에 5일간 처리한 후 Annexin V apoptosis detection kit(BD Pharmingen US, 556547)를 사용하여 분석하였다.

그 결과 도 8에 나타난 것과 같이 세포사멸 초기마커인 annexin V와 후기마커인 7-AAD를 통해 cP1P를 hPSCs에 처리하는 경우(cP1P 10 nM:0.9%/3.9%, 100 nM:1.9%/5.3%) 대조군(DMSO:0.5%/6.2%)에 비해서 세포사멸이 줄어들고, 세포독성도 현저하게 낮아 짐을 확인할 수 있었다.

실시예 8. cP1P 처리에 의한 hPSCs의 전분화 특성 증가 확인

cP1P 처리에 의해서 hPSCs의 전분화 특성이 증가하는지 여부를 하기와 같은 방법으로 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1와 같은 방법으로 100 nM cP1P를 hPSCs에 처리하고 실시예 6과 같은 방법으로 면역형광 분석을 하고, pluripotent array kit(R&D System US, ARY101)를 이용하여 전분화 관련 유전자의 발현을 분석하고, 실시예 6과 같은 방법으로 유세포 분석을 하였다.

그 결과 도 9A에 나타난 것과 같이 대조군에 비해사 cP1P를 처리한 실험군에서 전분화능 마커유전자인 REX1, E-Cadherin, OCT4 및 SOX2의 발현이 증가하였고, 도 9B에 나타난 것과 같이 대조군에 비해서 cP1P를 처리한 경우 전분화능 관련 유전자인 OCT4, NANOG, SOX2 및 E-Cadherin의 spot이 높게 검출되었고, 도 9D에 나타난 것과 같이 대조군에 비해서 cP1P를 처리한 경우 전분화능 관련 유전자인 OCT4 및 및 E-Cadherin의 단백질 발현이 증가하였고, 도 9C에 나타난 것과 같이 대조군에 비해서 cP1P를 처리한 실험군에서 전분화능 관련 유전자인 REX1 (86.8% -> 95.7%), E-Cadherin (81.8% ->85.6%), OCT4 (95.2% -> 96.5%) 및 SSEA-4 (68.8% -> 82.2%)의 단백질 발현이 증가하였다.

실시예 9. hPSCs에 cP1P 장기 처리에 의한 영향 분석

인간 PSCs 를 장기 배양할 경우, 증식속도가 감소하거나 줄기세포의 성질이 미세하게 바뀌는 등의 변화가 초래될 수 있기 때문에, hPSCs에 cP1P를 장기적으로 처리하는 경우 hPSCs의 특성에 변화가 발생하는지 여부를 확인하였다.

구체적으로, 실시예 1와 같은 방법으로 10 nM cP1P를 hPSCs에 처리하거나 대조군으로서 DMSO를 처리하고 배양하고 cP1P를 최초 처리한 계대를 0으로 하여 총 15 계대까지 배양하고, 세포를 회수하여 RNA를 추출한 후 DGIST(대구경북과학기술원)에 의뢰하여 차세대 염기서열 분석기(Illumina HiSeq 2500)로 RNA sequencing 분석을 실시하였다.

그 결과 도 10에 나타난 것과 같이 초기 계대 (0계대)의 유전자 발현과 비교해 볼 때 cP1P를 처리한 경우에서는 197개의 유전자발현 변화(DEG)가 확인되었고 cP1P를 처리하지 않은 경우에는 575개의 유전자 발현 변화가 확인되었다.

상기 유전자 발현 변화 집단을 15계대 배양 후 발현이 증가하는 군과 (C2) 발현이 감소하는 군 (C5)로 나누고 이의 gene ontology를 분석했다(도 10 B, C). cP1P를 처리하지 않은 대조군에서는 세포사멸 과정(apoptotic process) 및 산화적 스트레스(oxidative stress)에 반응하는 유전자 군인 cluster 2(C2) 유전자 발현이 증가되었으나, cP1P를 장기적으로 처리하는 경우 C2 유전자 발현이 감소되었으므로, 이를 통해 cP1P를 장기적으로 처리하는 경우 세포사멸을 억제하고, 장기 배양 시 증가하는 산화적 스트레스를 감소시키는 효과가 있는 것으로 판단된다. 또한, cP1P를 처리하지 않은 대조군에서는 세포 발달(cell development), 배아 발달(embryo development) 및 세포 증식(cell proliferation) 관련 유전자군인 cluster 5(C5) 유전자 발현이 감소되어 발생기능에 부전에 생기는 것으로 판단되지만, cP1P를 장기적으로 처리하는 경우 C5 유전자 발현이 감소되지 않고 안정적으로 유지되어 정상적인 발생과정을 개시할 수 있는 유전자군 발현을 유지하는 효과가 있는 것으로 판단된다.

즉, cP1P를 인간 PSCs 장기계대 시 처리해 주면 세포사멸을 억제하고, 장기 배양 시 증가하는 산화적 스트레스를 감소시키며, 전분화능을 강화하고 증식 능력을 유지시켜 주는 현저한 효과가 있는 것으로 판단된다.

Claims

cP1P(o-cyclic phytosphingosine-1-phosphate) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 cP1P은 0.1 nM 내지 10,000 nM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell), 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포의 증식을 촉진하고, 세포 사멸을 저해하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포 콜로니의 숫자를 증가시키고, 콜로니의 크기를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 줄기세포의 전분화능(stemness, naive state)을 강화하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포 배양용 조성물은 무혈청 또는 혈청성분을 0.1 내지 3 중량％ 함유하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포 증식 촉진용 조성물.
cP1P 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 줄기세포 배양액 첨가용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 cP1P은 0.1 nM 내지 10,000 nM의 농도인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양액 첨가용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양액 첨가용 조성물.
제1항에 따른 조성물을 줄기세포에 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포 배양 방법.
제11항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는, 줄기세포 배양 방법.
제1항에 따른 조성물을 포함하는 체외배양환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트.
제13항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아줄기세포(Embryonic stem cell) 또는 유도만능줄기세포(induced Pluripotent stem cell)인 것을 특징으로 하는, 체외배양환경에서 줄기세포 사멸 억제용 키트.
제1항에 따른 조성물을 포함하는 체외배양환경에서 줄기세포 증식 촉진용 키트.