JP2023078353A - 多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞直接分化用培地、それを利用して間葉系幹細胞を製造する方法、及びそれによって製造された間葉系幹細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞直接分化用培地、それを利用して間葉系幹細胞を製造する方法、それによって製造された間葉系幹細胞、及びそれを含む細胞治療剤を提供する。【解決手段】ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化誘導用培地組成物を提供する。【効果】培地組成物及び方法によれば、短期間内に高取得率で間葉系幹細胞を製造するだけではなく、胚様体状の段階なしに、製造工程が単純であり、均質性を有する細胞を得ることができ、既存方法よりも短縮された期間でもって細胞治療剤提供が可能であるという効果がある。【選択図】図１
Description
本発明は、多能性幹細胞、例えば、胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞直接分化用培地、それを利用して間葉系幹細胞を製造する方法、それによって製造された間葉系幹細胞、及びそれを含む細胞治療剤に関する。
ヒト胚性幹細胞を利用した間葉系幹細胞を製造する従来技術としては、胚様体形成後、ＴＧＦ－β抑制剤を１４日間処理して製造する方法がある。該ＴＧＦ－β抑制剤は、胚様体の内胚葉系細胞分化を抑制させることにより、中胚葉系細胞の確保を容易にするために処理される。また、一般的に、ヒト胚性幹細胞を利用した間葉系幹細胞の製造時に使用するＴＧＦ－β抑制剤において、ＳＢ４３１５４２の処理用量は、１０μＭ以上で処理する。ＴＧＦ－β抑制剤において、ＳＢ４３１５４２の１μＭ以上の処理は、内胚葉系分化に必要な転写因子の活性を抑制し、中胚葉系分化に必要な転写因子の活性を増大させる効果がある。また、胚様体を経由しない直接分化方法においても、ＴＧＦ－β抑制剤の一つであるＳＢ４３１５４２を処理して分化を誘導した場合があるが、ほとんど１０μＭ以上の高濃度において、１１日以上の長期間薬物処理期間が必要となると報告されている。従って、既存に報告された方法によって製造された間葉系幹細胞が高含量の中胚葉性特性を示すまでには、長期間の時間がかかる実情である。また、大きさと形態とが均一な胚様体を形成させて利用するにしても、胚様体の内部と外部とを構成する細胞における微細環境の差により、処理薬物の効果が均一ではない可能性があり、分化効率、及び分化細胞の性質に影響を及ぼしうる技術的不安定性を有してしまう。
それにより、細胞の増殖現象を基に製造される生物学的治療製剤にもかかわらず、増殖現象によって引き起こされうる細胞老化及び突然変異危険性に対する予防的あるいは補完的な措置が施されていない状態で製造されている状況であり、それを解決するための技術が必要である実情である。
一様相は、ＤＮＡ修復剤（ＤＮＡ repair agent）及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む多能性幹細胞の間葉系幹細胞分化誘導用培地組成物を提供するものである。
他の様相は、多能性幹細胞の間葉系幹細胞分化誘導用培地組成物の製造に使用するためのＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤の用途を提供するものである。
他の様相は、分離された多能性幹細胞を培養する段階と、前記培養された多能性幹細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階と、を含む多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を製造する方法を提供するものである。
さらに他の様相は、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤の存在下で分化誘導された多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を提供するものである。
さらに他の様相は、前記多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を提供するものである。
さらに他の様相は、細胞治療剤の製造に使用するための前記多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞の用途を提供するものである。
さらに他の様相は、前記多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を個体に投与する段階を含む、疾病を治療する方法を提供するものである。
一様相は、ＤＮＡ修復剤（ＤＮＡ repair agent）及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む多能性幹細胞の間葉系幹細胞分化誘導用培地組成物を提供する。
他の様相は、多能性幹細胞の間葉系幹細胞分化誘導用培地組成物の製造に使用するためのＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤の用途を提供する。
本明細書において、「多能性幹細胞」は、自家再生することができ（未分化状態を維持しながら、多数の細胞分裂周期を通過する能力を有し）、１種以上の多重分化能（１種以上の専門化された細胞に分化する性能）を示すことができる細胞を意味する。間葉系幹細胞（ＭＳＣ：mesenchymal stem cell）は、骨、軟骨、脂肪、筋肉細胞を含むさまざまな中胚葉性細胞または神経細胞のような外胚葉性細胞にも分化する能力を有した多分化能幹細胞である。前記多能性幹細胞は、核移植多能性幹細胞（ＮＴ－ｈＰＳＣ）、単為生殖生物由来多能性幹細胞（ｐｎ－ｈＰＳＣ）、逆分化万能幹細胞（人工多能性細胞；ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）でもある。
本発明において、「体細胞」は、性細胞、またはその前駆体を除いた体内の任意組織細胞を意味する。
本明細書で使用された「成熟」は、最終的に分化された細胞種類に向けて導く調和された生化学的段階によって構成された過程を意味する。
本明細書において、「分化」は、特定の形態または機能に対する細胞の適応を意味する。
本明細書において、「分化された細胞」は、本明細書にその用語が定義されているように、その本来形態において多能性ではない任意体細胞を含む。従って、用語「分化された細胞」は、また部分分化された細胞、例えば、多分化能細胞、または本明細書に記載された任意の組成物及び方法を利用して生成された、安定しており、非多能性の部分再プログラミングされているか、あるいは部分分化された細胞である細胞を含む。いくつかの実施様態において、分化された細胞は、安定している中間細胞、例えば、非多能性、部分再プログラミングされた細胞である細胞である。培養物中に、多くの一次細胞を位置させれば、完全分化された特性を若干消失してしまうということに留意しなければならない。従って、そのような分化された細胞または体細胞を単に培養することは、該細胞が非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞にはならせない。分化された細胞（安定している、非多能性部分再プログラミングされた細胞中間体を含む）の全分化能への転移は、培養物中に位置させるとき、分化された特性を部分消失させる刺激を超える再プログラミング刺激を必要とする。再プログラミングされたいくつかの実施様態において、部分再プログラミングされた細胞は、また一般的に、培養物中にただ制限された数の分裂に対する能力を有するさらに低い発生可能性を有する母細胞に比べ、成長可能性の消失なしに延長された継代培養を経る能力を有する特性を有する。いくつかの実施様態において、用語「分化された細胞」は、また（例えば、未分化細胞または再プログラミングされた細胞から）より特殊化されていない細胞類型（すなわち、発生可能性増大）の細胞（ここで、該細胞は、細胞内分化工程を経る）に由来するさらに特殊化された細胞類型（すなわち、発生可能性低減）の細胞を意味する。詳細には、本明細書において、造血幹細胞（造血母細胞）、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、脂肪細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びニューロン細胞からなる群れのうちからも選択される。
一具体例において、前記ＤＮＡ修復剤は、Ｒａｄ５１の活性を増大させる物質（Ｒａｄ５１活性剤）でもある。前記Ｒａｄ５１活性剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミド（3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide）または４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミド（4-bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide）でもある。前記ＤＮＡ修復剤は、５μＭないし２５μＭ、５μＭないし２０μＭ、６μＭないし１８μＭ、８μＭないし１５μＭ、または８μＭないし１２μＭの濃度で含まれてもよい。ＲＡＤ５１活性剤は、損傷されたＤＮＡの修復機能があるＲＡＤ５１タンパク質のｓｓＤＮＡ（single strand ＤＮＡ）あるいはｄｓＤＮＡ（double strand ＤＮＡ）への結合安定性を維持させることにより、ＲＡＤ５１タンパク質の活性を高め、ＤＮＡ修復効果を持続させる機能を有することができる。それにより、特定理論に制限されることなしに、多能性幹細胞から中胚葉性幹細胞への分化ＲＡＤ５１活性剤を処理することにより、細胞増殖と反復継代とによる突然変異確率、及び細胞老化の発生時期を遅延させ、遺伝的安全性を有した細胞治療剤を製造することができる。
一具体例において、前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル（Fasudil）、リパスジル（Ripasudil）、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド（4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide）、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド（4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo(2,3-b)pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamidedihydrochloride）、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド（N-(6-Fluoro-1H-indazol-5-yl)-1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-6-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3-pyridinecarboxamide）、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素（1-(3-Hydroxybenzyl)-3-[4-(pyridin-4-yl)thiazol-2-yl]urea）、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド（2-methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]-hexahydro-1h-1,4-diazepinedihydrochloride）、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド（N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1h-pyrazol-4-yl)phenyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamidedihydrochloride]）、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド（2-fluoro-N-[[4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)phenyl]methyl]benzenemethanamine dihydrochloride）、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド（N-[3-[[2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxy]phenyl]-4-[2-(4-morpholinyl)ethoxy]benzamide）、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド((3S)-1-[[2-(4-amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-7-yl]carbonyl]-3-pyrrolidinaminedihydrochloride）、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ’－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素（N-[(1S)-2-hydroxy-1-phenylethyl]-N’-[4-(4-pyridinyl)phenyl]-urea）、アザインドール－１（azaindole－１）及びナルシクラシン（Narciclasine）からなる群から選択されるいずれか一つでもある。前記ＲＯＣＫ抑制剤は、５μＭないし２５μＭ、５μＭないし２０μＭ、６μＭないし１８μＭ、８μＭないし１５μＭ、または８μＭないし１２μＭの濃度で含まれてもよい。細胞治療剤開発におけるＲＯＣＫ抑制剤の機能は、分子生物学的に活性ＲＨＯタンパク質による中間フィラメント（intermediate filament）瓦解効果、アクチン・膜連結（actin-membrane linkage）効果、細胞死滅メカニズム活性効果及び反復的継代によって生じうる細胞老化関連マーカーＰ１６及び同Ｐ２１の発現誘導をいずれも抑制させる機能を有することができる。そのような機能を基にＲＯＣＫ抑制剤は、細胞分化過程中に生じうる急激な物質代謝変化による細胞ストレス増大抑制効果及び細胞老化遅延効果を有する。従って、特定理論に制限されることなしに、ＲＯＣＫ抑制剤の適正処理用量と処理期間とを再調整することにより、中胚葉性幹細胞への分化に安定性と効率とを向上させることができる。
他の具体例において、前記培地組成物は、ＴＧＦ－β抑制剤をさらに含むものでもある。前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物（4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamidehydrate）、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン（4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline）、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン（2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine）、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物（4-(5-benzol[1,3]dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)-benzamidehydrate）、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物（4-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamidehydrate）、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物（4-[4-(3,4-methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamidehydrate）、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（3-(6-methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide）、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（2-(3-(6-methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine）、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン（4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline）、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１，１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン（2-[4-(1,3-benzodioxol-5-yl)-2-(1,1-dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine）、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン（2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-4-[(4-pyridyl)amino]pteridine）、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン（6-[2-tert-butyl-5-(6-methyl-pyridin-2-yl)-1H-imidazol-4-yl]-quinoxaline）、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物（4-{4-[3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate）、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール（4-[2-fluoro-5-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]phenyl]-1H-pyrazole-1-ethanol）及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミド（3-[[5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]benzamide）からなる群から選択されるいずれか一つでもある。前記ＴＧＦ－β抑制剤は、０．２μＭないし２．０μＭ、０．２μＭないし１．６μＭ、０．４μＭないし１．６μＭ、０．６μＭないし１．４μＭ、０．８μＭないし１．２μＭ、または０．６μＭないし１．０μＭの濃度にも処理される。一具体例において、前記培地組成物を使用すれば、既存に報告されたＴＧＦ－β抑制剤の処理濃度より顕著に低い低濃度のＴＧＦ－β抑制剤を使用することにより、高濃度のＴＧＦ－β抑制剤による副作用を低減させることができ、低濃度のＴＧＦ－β抑制剤を使用しても、高収率の中胚葉性幹細胞を得ることができるという効果がある。
前記培地は、ＭＥＭ（minimal essential medium）、ＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）、Ｋ－ＳＦＭ（Keratinocyte Serum Free Medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、Ｆ１２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２によって構成された群のうちから選択される培地でもある。
また、該培地は、等張液中の中性緩衝剤（例えば、リン酸塩及び／または高濃度重炭酸塩）及びタンパク質栄養分（例えば、血清、例えば、ＦＢＳ（fetal bovine serum）、ＦＣＳ（fetal calf serum）、ウマ血清、血清代替物、アルブミン、あるいは必須アミノ酸（essential amino acid）及び非必須アミノ酸（non-essential amino acid）、例えば、グルタミン、Ｌ－グルタミン）を含んでもよい。さらに、脂質（脂肪酸、コレステロール、血清のＨＤＬ抽出物またはＬＤＬ抽出物）、及びそれら種類のほとんどの保存液培地で見出されるその他成分（例えば、トランスフェリン、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、ピルビン酸塩、任意のイオン化形態または塩である糖源、例えば、グルコース、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン及び／または還元剤、例えば、β－メルカプトエタノール）を含んでもよい。
また、該培地は、細胞が互いに癒着するか、容器壁に癒着するか、あるいは過度に大きい束を形成することを防止する目的で、抗凝集剤（anti-clumping agent）、例えば、Invitrogenが販売するものなど（Ｃａｔ＃００１００５７ＡＥ）を含むことが有益でもある。
そのうちでも、下記の１以上のさらなる添加剤を含んでもよい：
幹細胞因子（ＳＣＦ；steel因子）、ｃキットを二量化する他のリガンドまたは抗体、及び同一信号伝達経路の他の活性剤；他のチロシンキナーゼ関連受容体、例えば、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ：platelet-derived growth factor）・大食細胞コロニー刺激因子・Ｆｌｔ－３リガンド及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）の受容体のためのリガンド；環形ＡＭＰ濃度を高める因子、例えば、フォルスコリン；ｇｐ１３０を誘導する因子、例えば、ＬＩＦまたはオンコスタチンＭ；造血母成長因子、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；変形性成長因子、例えば、ＴＧＦβ１；ニューロトロピン、例えば、ＣＮＴＦ；抗生物質、例えば、ゲンタマイシン（gentamicin）、ペニシリン、ストレプトマイシン。
幹細胞因子（ＳＣＦ；steel因子）、ｃキットを二量化する他のリガンドまたは抗体、及び同一信号伝達経路の他の活性剤；他のチロシンキナーゼ関連受容体、例えば、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ：platelet-derived growth factor）・大食細胞コロニー刺激因子・Ｆｌｔ－３リガンド及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ：vascular endothelial growth factor）の受容体のためのリガンド；環形ＡＭＰ濃度を高める因子、例えば、フォルスコリン；ｇｐ１３０を誘導する因子、例えば、ＬＩＦまたはオンコスタチンＭ；造血母成長因子、例えば、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）；変形性成長因子、例えば、ＴＧＦβ１；ニューロトロピン、例えば、ＣＮＴＦ；抗生物質、例えば、ゲンタマイシン（gentamicin）、ペニシリン、ストレプトマイシン。
一具体例による培地組成物は、前記成分以外に、ＦＢＳ、ＮＡＣ（N-acetyl-L-cysteine）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インシュリンまたはインシュリン類似因子、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン、ｂＦＧＦ（basic fibroblast growth factor）、へパラン硫酸（heparan sulfate）、２－メルカプトエタノール（２－mercaptoethanol）及びＥＧＦ（epidermal growth factor）によって構成された群のうちから選択される１種以上の成分を追加して含んでもよい。
一具体例による前記培地組成物は、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化誘導のために使用されるものでもある。詳細には、前記培地組成物は、培養された多能性幹細胞を中胚葉性細胞に分化させた後（例えば、ＴＧＦ－β抑制剤の処理）、前記中胚葉性細胞を間葉系幹細胞に成熟分化させる前に使用されるものでもある。従って、前記培地組成物は、間葉系幹細胞の成熟分化前の未成熟間葉系幹細胞（中胚葉性細胞）の前処理に使用されるものでもある。
また、一具体例による前記培地組成物は、直接分化誘導培地組成物でもある。
本明細書において、用語「直接分化（direct differentiation）」は、多能性幹細胞を間葉系幹細胞に分化させるにあたり、胚様体を形成せずに、血液・血管形成前駆細胞（hamangioblast）を経由せず、造血幹細胞（造血母細胞）性質を有する未成熟間葉系幹細胞を経由する形態で、最終間葉系幹細胞に分化されることを意味しうる。
他の様相は、分離された多能性幹細胞を培養する段階と、前記培養された多能性幹細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階と、を含む多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を製造する方法を提供する。
前記方法は、詳細には、分離された多能性幹細胞を培養する段階、前記培養された多能性幹細胞を中胚葉性細胞に分化させる段階（例えば、ＴＧＦ－β抑制剤の存在下において）、前記中胚葉性細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階（「培地で培養し、前処理する段階」、または「培地で培養し、未成熟間葉系幹細胞を製造する段階」と互換的に使用される）、前記分化誘導された間葉系幹細胞を間葉系幹細胞成熟培地で培養する段階、及び／または前記成熟培地で培養された間葉系幹細胞を継代培養する段階を含むものでもある。
他の具体例において、前記方法は、胚様体形成段階を実質的に含まないものでもある。
前記分離された多能性幹細胞を培養する段階は、支持細胞の不在下で遂行されるものでもある。また、前記培養する段階は、細胞付着機能強化剤（例えば、ＣＴＳ CellstartＴＭ）がコーティングされた培養容器で培養するものでもある。前記培養は、幹細胞培養液（例えば、ｍＴｅＳＲＴＭ）でも行われ、約１日ないし１０日、または３日ないし１０日の間行われうる。
前記中胚葉性細胞に分化させる段階は、ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で遂行されるものでもある。一具体例において、前記段階は、ＴＧＦ－β抑制剤を含む培地において、１日ないし８日、２日ないし７日、２日ないし６日、または２日ないし４日の間培養する段階を含んでもよい。前記培養が７日以上維持される場合、細胞の老化が起こったり、細胞の形態学的（morphology）特徴の変形が示されたり、細胞の増殖力が低下されたりもする。前述の細胞老化、形態学的特徴または増殖力の側面において、前記培養は、２日ないし６日間培養するものでもある。前記培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）、Ｋ－ＳＦＭ（Keratinocyte Serum Free Medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、Ｆ１２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２によって構成された群のうちから選択される培地でもある。また、培地に対し、本明細書の説明で言及された追加成分をさらに含んでもよい。
前記中胚葉性細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階は、間葉系幹細胞の成熟分化前の前処理する段階、または未成熟間葉系幹細胞に分化誘導する段階を意味しうる。前記培地については、前述の通りである。前記培養は、ＤＮＡ修復剤、ＲＯＣＫ抑制剤、及び／またはＴＧＦ－β抑制剤を含む培地において、１日ないし４日、または１日ないし２日の間分化誘導する段階を含むものでもある。前記間葉系幹細胞に分化誘導する段階において、前記間葉系幹細胞は、未成熟間葉系幹細胞でもある。従って、一具体例による方法は、前記未成熟間葉系幹細胞を経由し、間葉系幹細胞が製造されるものでもある。詳細には、一具体例による方法は、血液・血管形成前駆細胞を経由せず、未成熟間葉系幹細胞を経由し、間葉系幹細胞が製造されるものでもある。前記未成熟間葉系幹細胞は、血液・血管形成前駆細胞のマーカーであるＶＥＧＦＲ２に対し、細胞集団の１０％以下に発現することを確認することにより、一具体例による方法は、血液・血管形成前駆細胞を経由しないということが分かった。
前記分化誘導された間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞成熟培地で培養する段階は、間葉系幹細胞にトリプシン（トリプシン／ＥＤＴＡ溶液）を処理し、単一細胞化する段階、間葉系幹細胞成熟培地で培養する段階、前記成熟培地で培養された細胞を遠心分離する段階、及び／または前記成熟培地で培養された間葉系幹細胞を継代培養する段階を含んでもよい。前記成熟培地で培養する段階は、成熟培地において、１日ないし１５日、１日ないし１２日、または４日ないし１２日の間培養するものでもある。また、前記成熟培地は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ（Dulbecco modified Eagle Medium）、ＲＰＭＩ（Roswell Park Memorial Institute Medium）、Ｋ－ＳＦＭ（Keratinocyte Serum Free Medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、Ｆ１２及びＤＭＥＭ／Ｆ１２によって構成された群のうちから選択される培地でもある。また、該培地につき、本明細書の説明で言及された追加成分をさらに含んでもよい。前記遠心分離以後、遠心分離して得られた細胞を継代培養することができる。前記継代培養は、前記成熟培地と類似しているか、あるいは同一の培地においても行われる。また、前記継代培養は、トリプシン（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液）の存在下で、単一細胞化する方式によっても行われる。また、前記継代培養は、細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器においても行われる。本明細書において、「継代培養」とは、細胞を健康な状態で持続的に長期間培養するために、周期的に細胞の一部を新たな培養容器に移した後、培養培地を変えながら、細胞の代を継代させて培養する方法を意味しうる。限定された空間を有した培養容器内において、細胞の数が増えながら一定時間が経てば、増殖栄養分が消費されたり、汚染物質がたまったりし、細胞が自然死してしまうので、健康な細胞の数を増やすための方法として使用され、一般的に１回培地（培養容器）を替えること、または細胞群を分けて培養することを１継代（１passage）と言う。該継代培養の方法は、当業界に公知された方法を制限なしに使用することができ、例えば、機械的分離または酵素的分離によっても遂行される。前記継代培養は、１ないし２０継代、３ないし２０継代、３ないし１５継代まで行われるものでもある。また、前記継代培養は、脱落した非中胚葉性幹細胞を除去し、中胚葉性幹細胞を分離する段階を含んでもよい。そのような継代培養を介し、最終間葉系幹細胞を製造することができる。
さらに他の様相は、前記方法によって製造された間葉系幹細胞を提供するものである。
一具体例において、前記間葉系幹細胞は、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ抑制剤の存在下で分化誘導された多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞でもある。
本明細書において提供される多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞は、細胞表面に発現される細胞標識子に対し、ＣＤ２９，ＣＤ４４，ＣＤ９０またはＣＤ１０５陽性表面マーカーを、少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または約９９％発現し、ＴＲＡ－１６０，ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２陰性マーカーをおよそ、少なくとも７０％以下、少なくとも６０％以下、少なくとも５０％以下、少なくとも４０％以下、少なくとも３０％以下、少なくとも２０％以下、少なくとも１０％以下、少なくとも５％以下、または少なくとも１％以下に発現するものでもある。本発明において、用語「陽性」は、幹細胞標識と係わり、その標識が基準になる他の非幹細胞と比較したとき、さらに多くの量、またはさらに高い濃度で存在することを意味しうる。すなわち、細胞は、ある標識が細胞の内部または表面に存在するために、その標識を利用し、その細胞を１以上の他の細胞類型と区別することができるならば、その標識について陽性になる。また、細胞が背景値よりさらに大きい値で、信号、例えば、細胞測定装置の信号を出すことができるほどの量でその標識を有しているということを意味しうる。例えば、細胞を、ＣＤ２９に特異的な抗体でもって検出可能に標識することができ、該抗体からの信号が対照群（例えば、背景値）より検出可能にさらに大きければ、その細胞は、「ＣＤ２９＋」である。本発明において、用語「陰性」は、特定細胞表面標識に特異的な抗体を使用しても、背景値に比較し、その標識を検出することができないことを意味する。例えば、ＣＤ３４に特異的な抗体でもって細胞を検出可能に標識することができなければ、その細胞は、「ＣＤ３４－」である。
前記免疫学的特性は、本発明が属する技術分野に公知された一般的な方法によっても決定される。例えば、流細胞分析、免疫組織化学染色またはＲＴ－ＰＣＲなど多様な方法が利用されうる。
また、前記間葉系幹細胞は、造血幹細胞（造血母細胞）、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞及びニューロン細胞からなる群から選択される１種以上の分化能を有するものでもある。
他の様相は、前記方法によって製造された間葉系幹細胞集団を提供する。
さらに他の様相は、前記方法によって製造された間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養液を有効成分として含む細胞治療剤、薬学的組成物または製剤を提供する。
さらに他の様相は、細胞治療剤、薬学的組成物または製剤の製造に使用するための前記方法によって製造された間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養液の用途を提供する。
さらに他の様相は、前記方法によって製造された間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養液の有効量を個体に投与する段階を含む、疾病を治療する方法を提供する。
一具体例による間葉系幹細胞製造方法は、既存に報告された方法より短縮された期間で、細胞治療剤としての提供が可能である。従って、前記細胞治療剤または前記薬学的組成物は、少なくとも３継代以上、例えば、３継代ないし１０継代培養されたものであり、細胞治療剤として適用されるために、多能性幹細胞から、２０日ないし４０日、２２日ないし３８日、２５ないし３５日の間分化誘導及び培養されるものでもある。前記細胞治療剤として適用されるための培養期間は、多能性幹細胞に対し、当日（day ０）から、細胞治療剤適用可能時点に逹するまでにかかる分化時間を意味しうる。
さらに他の様相は、前記方法によって製造された間葉系幹細胞を継代培養する段階を含む間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を製造する方法を提供する。
前記継代培養する段階は、少なくとも３継代以上、例えば、３継代ないし１０継代培養する段階であり、細胞治療剤適用のための分化誘導及び培養期間が、多能性幹細胞（当日）から、２０日ないし４０日目のものである段階を含むものでもある。
また、例えば、前記方法によって製造された間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養液を有効成分として含む、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患の治療または予防のための薬学的組成物を提供する。
また、例えば、該炎症性疾患、該虚血性疾患及び／または該神経退行性疾患の治療または予防のための薬学的組成物の製造に使用するための前記方法によって製造された間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養液の用途を提供する。
さらに他の様相は、前記方法によって製造された間葉系幹細胞、その細胞集団またはその培養液の有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患を予防または治療する方法を提供する。
前記方法によって製造された間葉系幹細胞については、前述の通りである。
前記疾患の例は、炎症性疾患、虚血性疾患及び／または神経退行性疾患を含んでもよい。前記炎症性疾患の例は、気管支炎、胃炎、動脈硬化症、関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ：inflammatory bowel disease）、肝炎、胆嚢炎、真菌性感染症、胃潰瘍、喘息、アトピー性皮膚炎、腱炎または腎臓炎を含んでもよい。前記虚血性疾患の例は、虚血性脳卒中、心筋梗塞、虚血性心臓疾患、虚血性脳疾患、虚血性心不全、虚血性腸炎、虚血性血管疾患、虚血性眼疾患、虚血性網膜証、虚血性緑内障、虚血性腎不全または虚血性下肢疾患を含んでもよい。
前記神経退行性疾患の例は、脊髄損傷、多発性硬化症、アルツハイマー病（Alzheimer’s disease）、前頭側頭葉痴呆（frontotemporal dementia）、進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy）、皮質基底核変性（corticobasal degeneration）、ピック病（Pick’s disease）または拳闘家痴呆（ＤＰ：dementia pugilistica）を含んでもよい。
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物の投与量は、間葉系幹細胞を基準に、１．０Ｘ１０３ないし１．０Ｘ１０１０細胞／ｋｇ（体重）または個体、または１．０Ｘ１０７ないし１．０Ｘ１０８細胞／ｋｇ（体重）または個体でもある。ただし、該投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態、飲食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により、多様にも処方され、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができるであろう。投与回数は、１回、または臨床的に容認可能な副作用の範囲内において、２回以上が可能であり、投与部位についても、１ヵ所または２ヵ所以上に投与することができる。ヒト以外の動物についても、ｋｇ当たりまたは個体当たり、ヒトと同一投与量にするか、あるいは、例えば、目的とする動物とヒトとの器官（心臓など）の容積比（例えば、平均値）などにより、前述の投与量を換算した量を投与することができる。一具体例による治療の対象動物としては、ヒト及びそれ以外の目的とする哺乳動物を例として挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、兎、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物は、有効成分として、前記間葉系幹細胞と薬学的に許容可能な担体及び／または添加物を含んでもよい。例えば、滅菌水、生理食塩水、慣用の緩衝剤（リン酸、クエン酸、それ以外の有機酸など）、安定剤、塩、酸化防止剤（アスコルビン酸など）、界面活性剤、懸濁液剤、等張化剤または保存剤などを含んでもよい。局所投与のために、生体高分子（biopolymer）のような有機物、ヒドロキシアパタイトのような無機物、具体的には、コラーゲンマトリックス、ポリ乳酸重合体またはその共重合体、ポリエチレングリコール重合体またはその共重合体、及びその化学的誘導体などと組み合わせることも望ましい。一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物が注射に適当な剤形に調剤される場合には、細胞集合体が、薬学的に許容可能な担体内に溶解されているか、あるいはまたは溶解されている溶液状態に凍結されたものでもある。
一具体例による間葉系幹細胞は、身体の組織または器官が目的とする細胞群集、例えば、幹細胞または由来細胞群集の生着、移植または注入により、強化、治療または代替される多様な種類の治療プロトコルにも使用される。前記多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞は、存在する組織を代替または強化させ、新たであったり、変化された組織になるようにするか、あるいは生物学的組織または構造と結合させることができる。
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物は、その投与方法や剤形によって必要な場合、懸濁液剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、還元剤、酸化防止剤などを適切に含んでもよい。前述のところに例示されたものなどを含め、本発明に適する、薬学的に許容される担体及び製剤は、文献［Remington’s Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995］に詳細に記載されている。
一具体例による細胞治療剤または薬学的組成物は、当該発明が属する技術分野で当業者が容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形制を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させても製造される。このとき、当該剤形は、オイル内または水性媒質内の溶液、懸濁液または乳化液形態でもあり、粉末、顆粒、錠剤またはカプセル型でもある。また、細胞治療剤は、注射用剤形にも剤形化される。その場合、剤形化するための公知された一般的成分が利用され、一般的な方法によっても剤形化される。
一様相による培地組成物及び方法によれば、短期間内に、高い取得率で間葉系幹細胞を製造するだけではなく、胚様体状の段階なしに、製造工程が単純であり、均質性を有する細胞を得ることができ、既存方法より短縮された期間でもって、細胞治療剤提供が可能であるという効果がある。
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
実施例１．ヒト胚性幹細胞の間葉系幹細胞への直接分化
１．１．ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞を、支持細胞なしに培養するために下記のように遂行した。
１．１．ヒト胚性幹細胞の培養
ヒト胚性幹細胞を、支持細胞なしに培養するために下記のように遂行した。
具体的には、ヒト由来成分だけで構成された細胞付着機能強化剤であるＣＴＳ CellstartＴＭを表面積２．０ｃｍ２である４ウェル組織細胞培養容器（tissue culture dish）に、１６０μｌ／ウェルの濃度で、４℃で２４時間処理した。その後、残っているＣＴＳ CellstartＴＭを常温で組織細胞培養容器路からいずれも除去した後、胚性幹細胞培養液であるｍＴｅＳＲＴＭ（Stemcells、米国）培養液を、５００μｌ／ウェルの濃度で、前記組織細胞培養容器に入れた後、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベータに位置させた。
次に、支持細胞上で増殖されたヒト胚性幹細胞（ＣＨＡ－ｈＥＳ ＮＴ １８、ＣＨＡ University）をマイクロチップ（Micro-tip、Axygen、米国）を利用し、機械的継代（mechanical sub-passage）法で、小さい群集体（small clumps）に切り、それらをインキュベータに位置させた前記組織細胞培養容器に、１５ないし２０群集体／ウェルになるように分注した。その後、５日間毎日新たな胚性幹細胞培養液（ｍＴｅＳＲＴＭ）５００μｌ／ウェルに替えながら、ヒト胚性幹細胞を支持細胞なしに増殖させた。
１．２．ヒト胚性幹細胞の中胚葉性細胞への分化誘導
前記実施例１．１．において、支持細胞なしに増殖させたヒト胚性幹細胞を、中胚葉性細胞に分化させるために、ＴＧＦ－β抑制剤を処理した。
前記実施例１．１．において、支持細胞なしに増殖させたヒト胚性幹細胞を、中胚葉性細胞に分化させるために、ＴＧＦ－β抑制剤を処理した。
具体的には、ＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）を、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide、Sigma、米国）に、１ｍＭストック濃度で溶かした後、最終濃度１μＭになるように、胚性幹細胞分化液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％（ｖ／ｖ）ＳＲ、１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン・ストレプトマイシン）に希釈させた。その後、前記実施例１．１．において、５日間増殖培養されたヒト胚性幹細胞を、ＳＢ４３１５４２を含む前記胚性幹細胞分化液で、４日目まで（当日、翌日、２日目）処理し、中胚葉性細胞に分化させた。
１．３．中胚葉性細胞の前処理
前記実施例１．２．において、胚性幹細胞分化液処理３日目（day ３）に配置を入れ替え、さらに１日培養した。具体的には、該培地は、Ｒａｄ５１促進剤（ＲＳ１）１０μＭ、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）１０μＭ、ＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）１μＭが含有された分化培地に入れ替え、中胚葉性細胞を前処理した。
前記実施例１．２．において、胚性幹細胞分化液処理３日目（day ３）に配置を入れ替え、さらに１日培養した。具体的には、該培地は、Ｒａｄ５１促進剤（ＲＳ１）１０μＭ、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）１０μＭ、ＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）１μＭが含有された分化培地に入れ替え、中胚葉性細胞を前処理した。
１．４．間葉系幹細胞への分化誘導
前記実施例１．３．で前処理した中胚葉性細胞を間葉系幹細胞に成分分化させ、継代培養し、中胚葉性幹細胞を得た。
前記実施例１．３．で前処理した中胚葉性細胞を間葉系幹細胞に成分分化させ、継代培養し、中胚葉性幹細胞を得た。
具体的には、分化４日目（day ４）に、培養培地をいずれも除去した後、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン・ストレプトマイシンを混合したＰＢＳで細胞を洗浄した。その後、０．１２５％トリプシンを常温で処理し、単一細胞化させた後、間葉系幹細胞成熟培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ、１％（ｖ／ｖ）ＮＥＡＡ、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン・ストレプトマイシン）で中性化させた後、１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離させた。次に、遠心分離させて得られた細胞を、ＣＴＳ CellstartＴＭが事前にコーティングされた１ウェル／１２ウェルディッシュにいずれも分注し、その後、８０～９０％の細胞密集度（confluency）に至るたびに、１２ウェルディッシュ（passage ０）→６ウェルディッシュ（passage １）→Ｔ－２５フラスコ（passage ２）→Ｔ－７５フラスコ（passage ３）の順に、０．０５％トリプシンを常温で処理し、単一細胞化させる方式で続けて継代培養した。この過程において、非中胚葉性幹細胞は脱落し、中胚葉性幹細胞が得られた。
一具体例による間葉系幹細胞を製造する方法を図１に図式化して示した。
比較例１．胚様体形成システムを介する間葉系幹細胞の製造
対照群として、胚様体形成システムを介するヒト胚性幹細胞から間葉系幹細胞を製造した。該胚様体形成システムを介する間葉系幹細胞は、下記のように製造した。
対照群として、胚様体形成システムを介するヒト胚性幹細胞から間葉系幹細胞を製造した。該胚様体形成システムを介する間葉系幹細胞は、下記のように製造した。
具体的には、ヒト胚性幹細胞株を、７．５ｘ１０４細胞／ウェル（０．１％ゼラチンコーティングディッシュ、４ウェル）の濃度に事前に準備されたＭＥＦ培養補助細胞上で、コロニー状に共培養した。ＥＢ形成のために、前記ｈＥＳＣを解剖顕微鏡下で滅菌されたチップを使用し、機械的にいくつかの群（２～４の群集体状）に分離し、２０％ ＫＳＲ（knockout-serum replacement、Invitrogen）が添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco’s Modified Eagle Medium、栄養混合物（nutrient mixture）Ｆ－１２）培地の６０ｍｍペトリ皿上で５日間培養した。ＥＢが形成された後、２０％ ＫＳＲ＋ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＥＢ培養液：ｈＥＳＣ培養液からｂＦＧＦだけが除外された培養液）で一日培養した後、前記ＥＢ培養液に、１μＭ ＴＧＦ－beta抑制剤（ＳＢ４３１５４２）を添加し、２週間（１３日間）培養し、培地は、２日に１回入れ替えた。その後、１ウェルに、ＥＢが５ないし７個の密度になるように、０．１％ゼラチン（３０分空気乾燥）でコーティングされた６ウェルプレートに移し、１０％ ＦＢＳ及び１％ Ｐ／Ｓ（ペニシリン・ストレプトマイシン、Invitrogen）が添加されたＤＭＥＭ（低グルコース（low glucose）；５．５ｍＭ Ｄグルコース（１ｇ／Ｌ））で１６日間培養した。培養４８時間後、ＥＢの付着、及びＥＢから出てくる細胞を確認し、培地は、１週間に２回入れ替えた。１６日後、ＥＢにおいて伸びて育った細胞は、ＴｒｙｐＬＥ溶液（Invitrogen；１ウェル当たり５００μｌ ＴｒｙｐＬＥ、２分インキューベーション）で分離し、０．１％ゼラチンがコーティングされた７５Ｔフラスコに移し、１０％ ＦＢＳ及び１％ Ｐ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ（低グルコース；５．５ｍＭＤグルコース（１ｇ／Ｌ））で培養した。翌日、１０％ ＦＢＳ及び１％ Ｐ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ（低グルコース；５．５ｍＭＤグルコース（１ｇ／Ｌ））において、継代培養し、１０％ＦＢＳ、１％ ＮＥＡＡ（非必須アミノ酸、Invitrogen）及び０．１％ β－メルカプトエタノール（Invitrogen）を含むＭＳＣ増殖培地において細胞が当該継代に逹するたびに、０．０５％ トリプシン－ＥＤＴＡ（７５Ｔフラスコ当たり１．５ｍｌ、２分インキュベーション）を利用して継代培養する方式で間葉系幹細胞を製造した。
比較例２．ＤＮＡ修復剤単独処理を介する間葉系幹細胞の製造
前記実施例１．３．において、ＲＯＣＫ抑制剤を使用せず、Ｒａｄ５１促進剤（ＲＳ１）１０μＭ及びＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）１μＭを処理したことだけを除いては、前記実施例１と同一方法で間葉系幹細胞を製造した。
前記実施例１．３．において、ＲＯＣＫ抑制剤を使用せず、Ｒａｄ５１促進剤（ＲＳ１）１０μＭ及びＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）１μＭを処理したことだけを除いては、前記実施例１と同一方法で間葉系幹細胞を製造した。
比較例３．ＲＯＣＫ抑制剤単独処理を介する間葉系幹細胞の製造
前記実施例１．３．において、ＤＮＡ修復剤を使用せず、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）１０μＭ及びＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）１μＭを処理したことだけを除いては、前記実施例１と同一方法で間葉系幹細胞を製造した。
前記実施例１．３．において、ＤＮＡ修復剤を使用せず、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）１０μＭ及びＴＧＦ－β阻害剤（ＳＢ４３１５４２）１μＭを処理したことだけを除いては、前記実施例１と同一方法で間葉系幹細胞を製造した。
実験例．ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の特性分析
１．細胞形態学的特性分析
前記実施例１及び比較例１で得られた間葉系幹細胞の細胞形態学的特性を分析するために、位相差顕微鏡（phase-contrast microscope）（Nikon ＴＥ－２０００）下で、間葉系幹細胞特異的な細胞増殖形態（渦状（spindle-like shape））を形成しつつ増殖されているか否かということを確認し、その結果は、それぞれ図２及び図３に示した。
１．細胞形態学的特性分析
前記実施例１及び比較例１で得られた間葉系幹細胞の細胞形態学的特性を分析するために、位相差顕微鏡（phase-contrast microscope）（Nikon ＴＥ－２０００）下で、間葉系幹細胞特異的な細胞増殖形態（渦状（spindle-like shape））を形成しつつ増殖されているか否かということを確認し、その結果は、それぞれ図２及び図３に示した。
図２は、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞形態学的特性を示した写真である。
図３は、比較例による胚様体形成システムを介するヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞形態学的特性を示した写真である。
図２に示されているように、一具体例による製造方法によって製造されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞は、分化約１０日目から、成体組織由来の間葉系幹細胞と類似した渦状の細胞を形成し、だんだんと増殖され、分化約２４日目に至っては、ほとんどの細胞が間葉系幹細胞類型を有するということを確認することができた。それに反し、図３に示されているように、既存に報告された胚様体形成システムを利用したヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞は、４０日目に渦状を形成し、増殖されることを確認することができた。
これは、一具体例による方法が、既存に報告された方法よりもさらに短期間内に、高純度の間葉系幹細胞特異的な形態を示す細胞を確保することができるということを意味する。
２．細胞取得率分析
前記実施例１の方法による細胞の取得率を分析するために、増殖細胞数を確認した。具体的には、前記実施例１及び比較例１の間葉系幹細胞を製造する過程において、トリプシンによって単一細胞化する段階において、０．４％（ｖ／ｖ）トリパンブルー溶液で細胞を染色した。その後、ヘモサイトメータを利用し、得られた細胞の生存細胞数を分析し、その結果を図４に示した。
前記実施例１の方法による細胞の取得率を分析するために、増殖細胞数を確認した。具体的には、前記実施例１及び比較例１の間葉系幹細胞を製造する過程において、トリプシンによって単一細胞化する段階において、０．４％（ｖ／ｖ）トリパンブルー溶液で細胞を染色した。その後、ヘモサイトメータを利用し、得られた細胞の生存細胞数を分析し、その結果を図４に示した。
また、前記実施例２．１．の細胞形態学的観点において、一具体例による方法によって製造されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の、細胞治療剤として使用可能な適用時点は、間葉系幹細胞特異的な細胞増殖形態である渦形態の増殖特徴を示す３継代数以上からである。それにより、細胞治療に適用するためのヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞株の分化所要時間も、前述のところと同一方法によって分析し、その結果を図５に示した。
図４は、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞取得率（直接分化＋（ＳＢ４３１５４２＋ＲＳ１＋Ｙ２７６３２））を、胚様体形成システムを利用したヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞取得率（胚様体＋ＳＢ４３１５４２））と比較したグラフである。
図５は、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞（直接分化＋（ＳＢ４３１５４２＋ＲＳ１＋Ｙ２７６３２））を細胞治療剤として活用するために必要となる分化期間を、胚様体形成システムを利用したヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞（胚様体＋ＳＢ４３１５４２））と比較したグラフである。
図４に示されているように、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の製造方法は、既存に報告された方法に比べ、さらに短期間内に多数の細胞が得られるということが分かった。
また、図５に示されているように、一具体例による方法は、既存に報告された胚様体形成システムに比べ、細胞治療剤として適用可能な分化期間を、約１．５倍から２倍ほど短縮させたということが分かった。
３．表面発現マーカー分析
前記実施例１．で製造されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の表面マーカー発現分析のために、流細胞分析を行った。
前記実施例１．で製造されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の表面マーカー発現分析のために、流細胞分析を行った。
具体的には、前記ヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞培養（培養３０日目（passage ４））を、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン・ストレプトマイシンが含まれたＰＢＳで水洗いした後、トリプシン（０．０５％、トリプシン／ＥＤＴＡ、Gibco、米国）を使用し、単一細胞化させた。その後、冷たい４％ホルムアルデヒド溶液で、常温で３０分間固定させた後、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＰＢＳで４回水洗いした。その後、ＡＰＣまたはＰＥが標識された抗体を、０．２％ ＦＢＳを含むＰＢＳに、最終的に５～１５μｇの濃度になるように希釈した後、暗いところで３０分間常温で処理した。次に、０．２％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含有されたＰＢＳで４回水洗いした後、流細胞分析器を介し、発現程度を確認した。抗体は、未分化細胞標識子であるＴＲＡ－１－６０（ＰＥ（phycoerythrin）－conjugated mouse anti－human ＴＲＡ－１－６０；Ｃａｔ．５６０１９３、ＢＤ PharmingenＴＭ）、造血幹細胞（造血母細胞）標識子であるＣＤ３４（ＡＰＣ（allophycocyanine）－conjugated mouse anti－human ＣＤ３４；Ｃａｔ．５５５８２４、ＢＤ PharmingenＴＭ）、血液・血管形成前駆細胞標識子であるＶＥＧＦＲ２（ＡＰＣ－conjugated mouse anti－human ＶＥＧＦＲ２；Ｃａｔ．ＢＤ PharmingenＴＭ）、間葉系幹細胞標識子であるＣＤ２９（ＡＰＣ－conjugated mouse anti－human ＣＤ２９；Ｃａｔ．５５９８８３、ＢＤ PharmingenＴＭ）、ＣＤ４４（ＡＰＣ－conjugated mouse anti－human ＣＤ４４；Ｃａｔ．５５９９４２、ＢＤ PharmingenＴＭ））、ＣＤ９０（ＡＰＣ－conjugated mouse anti－human ＣＤ９０；Ｃａｔ．５６１９７１、ＢＤ PharmingenＴＭ）及びＣＤ１０５（ＡＰＣ－conjugated mouse anti－human ＣＤ１０５；Ｃａｔ．５６２４０８、ＢＤ PharmingenＴＭ）に対する抗体を使用した。
前述の流細胞分析結果は、図６に示した。
また、一具体例による方法が、血液・血管形成前駆細胞を経由せずに分化されるか否かということを確認するために、培養４日目（実施例１．３）の細胞の表面マーカー発現を流細胞分析によって分析し、その結果を図７に示した。
同時に、前記培養３０日目（passage ４）と培養４日目との細胞表面マーカー発現分析結果を比較し、その結果を図８に示した。
図６は、一具体例による培養３０日目（passage ４）のヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞表面発現マーカーを、流細胞分析によって分析した結果を示した図面である。
図７は、一具体例による培養４日目のヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞表面発現マーカーを、流細胞分析によって分析した結果を示した図面である。
図８は、一具体例による培養３０日目（passage ４）のヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞と、培養４日目のヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞との細胞表面発現マーカーを比較したグラフである。
図６に示されているように、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の未分化細胞マーカー（pluripotent marker）であるＴＲＡ－１－６０、造血幹細胞（造血母細胞）マーカー（hematopoietic stem cell marker）であるＣＤ３４、そして間葉系幹細胞マーカー（mesenchymal stem cell maker）であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５の発現いかんを確認した結果、未分化細胞標識因子であるＴＲＡ－１－６０は、発現していない一方（ＴＲＡ－１－６０、０．００％）、間葉系幹細胞マーカーは、高比率で発現していることが分かった（ＣＤ２９ ９９．７０％、ＣＤ４４ ９９．４５％、ＣＤ９０ ８７．１５％、ＣＤ１０５ ９６．６０％）。従って、一具体例による方法で誘導されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞は、高い中胚葉性性質を有する細胞であるということを確認した。
また、図７に示されているように、分化４日目に細胞表面マーカーを分析した結果、造血幹細胞（造血母細胞）標識子であるＣＤ３４の発現比率が非常に高く示されながら（ＣＤ３４ ６９．６５％）、血液・血管形成前駆細胞のマーカーであるＶＥＧＦＲ２は、ほとんど発現していないことが分かった（ＶＥＧＦＲ２ ０．７０％）。
また、前述の図６及び図７の結果を総合すれば、図８に示されているように、分化３０日目（passage ４）においては、間葉系幹細胞マーカーが高比率で発現し、分化４日目には、造血幹細胞（造血母細胞）標識子であるＣＤ３４が高比率で発現し、血液・血管形成前駆細胞のマーカーであるＶＥＧＦＲ２が低比率で発現するということが分かった。
以上の結果は、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の製造方法が、血液・血管形成前駆細胞を経由せず、造血幹細胞（造血母細胞）性質を有する未成熟間葉系幹細胞を経由する形態に製造されるということを意味する。
４．細胞分化能分析
前記実施例１で製造されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の脂肪細胞分化能、骨細胞分化能及び軟骨細胞分化能を確認した。
前記実施例１で製造されたヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の脂肪細胞分化能、骨細胞分化能及び軟骨細胞分化能を確認した。
具体的には、脂肪細胞分化誘導剤（StemPro(登録商標) Adipocyte differentiation kit、Gibco）、骨細胞分化誘導剤（StemPro(登録商標) Osteocyte differentiation kit、Gibco）及び軟骨細胞分化誘導剤（StemPro(登録商標) Chondrocyte differentiation kit、Gibco）を利用し、それぞれ脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞に、製造社の指示によって分化誘導した。その後、脂肪細胞（adipocyte）特異的、骨細胞（osteocyte）特異的及び軟骨細胞（chondrocyte）特異的な染色液（それぞれ順にオイルレッドＯ、アリザリンレッドそしてアルシアンブルー）を使用し、細胞分化を最終的に確認し、その結果を図９に示した。
図９は、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞分化能を確認したグラフである。
図９に示されているように、脂肪細胞に分化誘導した場合には、脂質特異的染色液であるオイルレッドＯにより、細胞内脂質成分が赤色に染色される脂質滴（lipid droplet）の形態を確認し、骨細胞に分化誘導した場合には、アリザリンレッド溶液により、細胞内蓄積されたカルシウムが濃オレンジ色を帯びる形態を確認し、軟骨細胞に分化誘導した場合には、軟骨細胞特異的染色液であるアルシアンブルーにより、軟骨細胞の細胞外基質（matrix）物質であるミューシンが青色に染色されることを確認した。前述の結果により、一具体例によって製造された間葉系幹細胞は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞に分化することができ、多分化能があるということが分かる。
５．単独物質処理による期間別細胞形態差分析
ＤＮＡ修復剤とＲＯＣＫ抑制剤との単独処理による期間別細胞形態差を分析するために、前記実施例１、前記比較例２及び前記比較例３の細胞の細胞形態を、前記実験例１と同一方法で分析した。対照群（control）としては、ＤＮＡ修復剤とＲＯＣＫ抑制剤とをいずれも使用せず、ＴＧＦ－β抑制剤であるＳＢ４３１５４２を単独処理したものを使用し、その結果を図１０に示した。
ＤＮＡ修復剤とＲＯＣＫ抑制剤との単独処理による期間別細胞形態差を分析するために、前記実施例１、前記比較例２及び前記比較例３の細胞の細胞形態を、前記実験例１と同一方法で分析した。対照群（control）としては、ＤＮＡ修復剤とＲＯＣＫ抑制剤とをいずれも使用せず、ＴＧＦ－β抑制剤であるＳＢ４３１５４２を単独処理したものを使用し、その結果を図１０に示した。
図１０は、一具体例によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞形態特性を、ＤＮＡ修復剤とＲＯＣＫ抑制剤との単独処理によるヒト胚性幹細胞由来の間葉系幹細胞の細胞形態特性と比較した写真である。
図１０に示されているように、全てのグループにおいて、渦形態の間葉系幹細胞増殖形態が示されているが、最も先に間葉系幹細胞形態を示しながら、高収率を示したのは、一具体例による間葉系幹細胞（ＳＢ４３１５４２＋ＲＳ１＋Ｙ２７６３２）であることが分かった。また、ＳＢ４３１５４２＋Ｙ２７６３２処理時またはＳＢ４３１５４２＋ＲＳ１処理時には、約３０日以上で間葉系幹細胞への均一な増殖がなされ、ＳＢ４３１５４２単独処理した対照群グループにおいては、２３日目ころに大きい細胞増殖が観察されるが、３０日目ことに至っては、ほとんど消滅し、他グループと同じ間葉系幹細胞形態の細胞が示されるが、均一性が落ちるということが分かった。
以上の結果により、一具体例による間葉系幹細胞の製造方法は、短期間内に高取得率で間葉系幹細胞を製造するだけではなく、胚様体状の段階がなく、製造工程が単純であり、均質性を有する細胞を得ることができ、既存方法より短縮された期間で細胞治療剤の提供が可能であるということが分かった。
以上の結果により、一具体例による間葉系幹細胞の製造方法は、短期間内に高取得率で間葉系幹細胞を製造するだけではなく、胚様体状の段階がなく、製造工程が単純であり、均質性を有する細胞を得ることができ、既存方法より短縮された期間で細胞治療剤の提供が可能であるということが分かった。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化誘導用培地組成物。
［実施形態２］前記ＤＮＡ修復剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミドまたは４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミドである、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態３］前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル、リパスジル、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド］、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ'－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素、アザインドール－１及びナルシクラシンからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態１に記載の方法。
［実施形態４］ＴＧＦ－β抑制剤をさらに含む、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態５］前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１、１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミドからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態４に記載の培地組成物。
［実施形態６］前記ＤＮＡ修復剤は、５μＭないし２０μＭの濃度で含まれるものである、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態７］前記ＲＯＣＫ抑制剤は、５μＭないし２０μＭの濃度で含まれるものである、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態８］前記ＴＧＦ－β抑制剤は、０．２μＭないし２．０μＭの低濃度で含まれるものである、実施形態４に記載の培地組成物。
［実施形態９］分離された多能性幹細胞を培養する段階と、
前記培養された多能性幹細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階と、
を含む多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を製造する方法。
［実施形態１０］培養された胚性幹細胞を、ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で中胚葉性細胞に分化させる段階をさらに含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１１］前記分化誘導された間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞成熟培地で培養する段階、または前記成熟培地で培養された間葉系幹細胞を継代培養する段階をさらに含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１２］前記分離された多能性幹細胞を培養する段階は、支持細胞の不在下で細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器で培養する、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１３］胚様体形成段階を含まないものである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１４］前記ＤＮＡ修復剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミドまたは４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミドである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１５］前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル、リパスジル、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド］、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ'－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素、アザインドール－１及びナルシクラシンからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１６］前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１、１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミドからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１７］前記ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で中胚葉性細胞に分化させる段階は、ＴＧＦ－β抑制剤を含む培地で２日ないし７日間培養する段階を含む、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１８］前記培地で分化誘導する段階は、ＤＮＡ修復剤、ＲＯＣＫ抑制剤及びＴＧＦ－β抑制剤を含む培地で１日ないし２日間分化誘導する段階を含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１９］前記成熟培地で培養する段階は、トリプシンで処理する段階と、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium：栄養混合物Ｆ－１２）成熟培地で培養する段階と、前記成熟培地で培養された細胞を遠心分離する段階と、を含む、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態２０］前記継代培養する段階は、細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器において、トリプシン存在下で継代培養する、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態２１］前記継代培養は、１ないし１０継代まで行われる、実施形態２０に記載の方法。
［実施形態２２］前記継代培養は、脱落された非中胚葉性幹細胞を除去し、中胚葉性幹細胞を分離する段階を含む、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態２３］前記多能性幹細胞は、核移植多能性幹細胞（ＮＴ－ｈＰＳＣ）、単為生殖生物由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ－ｈＰＳＣ）、逆分化万能幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２４］前記間葉系幹細胞に分化誘導する段階において、前記間葉系幹細胞は、未成熟間葉系幹細胞であり、前記未成熟間葉系幹細胞を経由して間葉系幹細胞が製造される、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２５］前記未成熟間葉系幹細胞は、細胞集団の１０％以下が、血液・血管形成前駆細胞のマーカーであるＶＥＧＦＲ２を発現し、血液・血管形成前駆細胞を経由しない、実施形態２４に記載の方法。
［実施形態２６］前記製造された間葉系幹細胞は、細胞集団の７０％以上が、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０またはＣＤ１０５に対して陽性であり、細胞集団の１０％以下が、マーカーＴＲＡ－１６０、ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２に対して陰性である、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２７］前記間葉系幹細胞は、造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞及びニューロン細胞からなる群から選択される１種以上への分化能を有する、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２８］ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤の存在下で分化誘導された、多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞。
［実施形態２９］前記間葉系幹細胞は、細胞集団の７０％以上が、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０またはＣＤ１０５に対して陽性であり、細胞集団の１０％以下が、マーカーＴＲＡ－１６０、ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２に対して陰性である、実施形態２８に記載の細胞。
［実施形態３０］実施形態９に記載の方法によって製造された間葉系幹細胞を、少なくとも３継代で継代培養する段階であり、細胞治療剤適用のための多能性幹細胞からの分化誘導及び培養期間が、２０日ないし４０日である段階を含む、間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を製造する方法。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する：
［実施形態１］ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化誘導用培地組成物。
［実施形態２］前記ＤＮＡ修復剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミドまたは４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミドである、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態３］前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル、リパスジル、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド］、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ'－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素、アザインドール－１及びナルシクラシンからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態１に記載の方法。
［実施形態４］ＴＧＦ－β抑制剤をさらに含む、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態５］前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１、１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミドからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態４に記載の培地組成物。
［実施形態６］前記ＤＮＡ修復剤は、５μＭないし２０μＭの濃度で含まれるものである、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態７］前記ＲＯＣＫ抑制剤は、５μＭないし２０μＭの濃度で含まれるものである、実施形態１に記載の培地組成物。
［実施形態８］前記ＴＧＦ－β抑制剤は、０．２μＭないし２．０μＭの低濃度で含まれるものである、実施形態４に記載の培地組成物。
［実施形態９］分離された多能性幹細胞を培養する段階と、
前記培養された多能性幹細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階と、
を含む多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を製造する方法。
［実施形態１０］培養された胚性幹細胞を、ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で中胚葉性細胞に分化させる段階をさらに含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１１］前記分化誘導された間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞成熟培地で培養する段階、または前記成熟培地で培養された間葉系幹細胞を継代培養する段階をさらに含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１２］前記分離された多能性幹細胞を培養する段階は、支持細胞の不在下で細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器で培養する、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１３］胚様体形成段階を含まないものである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１４］前記ＤＮＡ修復剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミドまたは４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミドである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１５］前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル、リパスジル、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド］、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ'－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素、アザインドール－１及びナルシクラシンからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１６］前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１、１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミドからなる群から選択されるいずれか一つである、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１７］前記ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で中胚葉性細胞に分化させる段階は、ＴＧＦ－β抑制剤を含む培地で２日ないし７日間培養する段階を含む、実施形態１０に記載の方法。
［実施形態１８］前記培地で分化誘導する段階は、ＤＮＡ修復剤、ＲＯＣＫ抑制剤及びＴＧＦ－β抑制剤を含む培地で１日ないし２日間分化誘導する段階を含む、実施形態９に記載の方法。
［実施形態１９］前記成熟培地で培養する段階は、トリプシンで処理する段階と、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium：栄養混合物Ｆ－１２）成熟培地で培養する段階と、前記成熟培地で培養された細胞を遠心分離する段階と、を含む、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態２０］前記継代培養する段階は、細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器において、トリプシン存在下で継代培養する、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態２１］前記継代培養は、１ないし１０継代まで行われる、実施形態２０に記載の方法。
［実施形態２２］前記継代培養は、脱落された非中胚葉性幹細胞を除去し、中胚葉性幹細胞を分離する段階を含む、実施形態１１に記載の方法。
［実施形態２３］前記多能性幹細胞は、核移植多能性幹細胞（ＮＴ－ｈＰＳＣ）、単為生殖生物由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ－ｈＰＳＣ）、逆分化万能幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２４］前記間葉系幹細胞に分化誘導する段階において、前記間葉系幹細胞は、未成熟間葉系幹細胞であり、前記未成熟間葉系幹細胞を経由して間葉系幹細胞が製造される、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２５］前記未成熟間葉系幹細胞は、細胞集団の１０％以下が、血液・血管形成前駆細胞のマーカーであるＶＥＧＦＲ２を発現し、血液・血管形成前駆細胞を経由しない、実施形態２４に記載の方法。
［実施形態２６］前記製造された間葉系幹細胞は、細胞集団の７０％以上が、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０またはＣＤ１０５に対して陽性であり、細胞集団の１０％以下が、マーカーＴＲＡ－１６０、ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２に対して陰性である、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２７］前記間葉系幹細胞は、造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞及びニューロン細胞からなる群から選択される１種以上への分化能を有する、実施形態９に記載の方法。
［実施形態２８］ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤の存在下で分化誘導された、多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞。
［実施形態２９］前記間葉系幹細胞は、細胞集団の７０％以上が、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０またはＣＤ１０５に対して陽性であり、細胞集団の１０％以下が、マーカーＴＲＡ－１６０、ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２に対して陰性である、実施形態２８に記載の細胞。
［実施形態３０］実施形態９に記載の方法によって製造された間葉系幹細胞を、少なくとも３継代で継代培養する段階であり、細胞治療剤適用のための多能性幹細胞からの分化誘導及び培養期間が、２０日ないし４０日である段階を含む、間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を製造する方法。
Claims (30)
- ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む、多能性幹細胞の間葉系幹細胞への分化誘導用培地組成物。
- 前記ＤＮＡ修復剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミドまたは４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミドである、請求項１に記載の培地組成物。
- 前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル、リパスジル、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド］、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ’－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素、アザインドール－１及びナルシクラシンからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項１に記載の方法。
- ＴＧＦ－β抑制剤をさらに含む、請求項１に記載の培地組成物。
- 前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１、１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミドからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項４に記載の培地組成物。
- 前記ＤＮＡ修復剤は、５μＭないし２０μＭの濃度で含まれるものである、請求項１に記載の培地組成物。
- 前記ＲＯＣＫ抑制剤は、５μＭないし２０μＭの濃度で含まれるものである、請求項１に記載の培地組成物。
- 前記ＴＧＦ－β抑制剤は、０．２μＭないし２．０μＭの低濃度で含まれるものである、請求項４に記載の培地組成物。
- 分離された多能性幹細胞を培養する段階と、
前記培養された多能性幹細胞を、ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤を含む培地で培養し、間葉系幹細胞に分化誘導する段階と、
を含む多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞を製造する方法。 - 培養された胚性幹細胞を、ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で中胚葉性細胞に分化させる段階をさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 前記分化誘導された間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞成熟培地で培養する段階、または前記成熟培地で培養された間葉系幹細胞を継代培養する段階をさらに含む、請求項９に記載の方法。
- 前記分離された多能性幹細胞を培養する段階は、支持細胞の不在下で細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器で培養する、請求項９に記載の方法。
- 胚様体形成段階を含まないものである、請求項９に記載の方法。
- 前記ＤＮＡ修復剤は、３－［（ベンジルアミノ）スルホニル］－４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）ベンズアミドまたは４－ブロモ－Ｎ－（４－ブロモフェニル）－３－［［（フェニルメチル）アミノ］スルホニル］－ベンズアミドである、請求項９に記載の方法。
- 前記ＲＯＣＫ抑制剤は、ファスジル、リパスジル、４－（（Ｒ）－１－アミノエチル）－Ｎ－（ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミド、４－（１－アミノエチル）－Ｎ－（１Ｈ－ピロロ（２，３－ｂ）ピリジン－４－イル）シクロヘキサンカルボキサミドジヒドロクロリド、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－１，４，５，６－テトラヒドロ－２－メチル－６－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３－ピリジンカルボキサミド、１－（３－ヒドロキシベンジル）－３－［４－（ピリジン－４－イル）チアゾール－２－イル］尿素、２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル）スルホニル］－ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピンジヒドロクロリド、Ｎ－［２－［２－（ジメチルアミノ）エトキシ］－４－（１Ｈ－ピラゾール－４－イル）フェニル－２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－２－カルボキサミドジヒドロクロリド］、２－フルオロ－Ｎ－［［４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）フェニル］メチル］ベンゼンメタンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［３－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ］フェニル］－４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］ベンズアミド、（３Ｓ）－１－［［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－７－イル］カルボニル］－３－ピロリジンアミンジヒドロクロリド、Ｎ－［（１Ｓ）－２－ヒドロキシ－１－フェニルエチル］－Ｎ’－［４－（４－ピリジニル）フェニル］－尿素、アザインドール－１及びナルシクラシンからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項９に記載の方法。
- 前記ＴＧＦ－β抑制剤は、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－１，５－ナフチリジン、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、４－［４－（３，４－メチレンジオキシフェニル）－５－（２－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン、２－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－２－（１、１－ジメチルエチル）－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］－６－メチル－ピリジン、２－（５－クロロ－２－フルオロフェニル）－４－［（４－ピリジル）アミノ］プテリジン、６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－（６－メチル－ピリジン－２－イル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］－キノキサリン、４－｛４－［３－（ピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－ピリジン－２－イル｝－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）ベンズアミド水和物、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール及び３－［［５－（６－メチル－２－ピリジニル）－４－（６－キノキサリニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］メチル］ベンズアミドからなる群から選択されるいずれか一つである、請求項９に記載の方法。
- 前記ＴＧＦ－β抑制剤の存在下で中胚葉性細胞に分化させる段階は、ＴＧＦ－β抑制剤を含む培地で２日ないし７日間培養する段階を含む、請求項１０に記載の方法。
- 前記培地で分化誘導する段階は、ＤＮＡ修復剤、ＲＯＣＫ抑制剤及びＴＧＦ－β抑制剤を含む培地で１日ないし２日間分化誘導する段階を含む、請求項９に記載の方法。
- 前記成熟培地で培養する段階は、トリプシンで処理する段階と、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Dulbecco’s Modified Eagle Medium：栄養混合物Ｆ－１２）成熟培地で培養する段階と、前記成熟培地で培養された細胞を遠心分離する段階と、を含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記継代培養する段階は、細胞付着機能強化剤がコーティングされた培養容器において、トリプシン存在下で継代培養する、請求項１１に記載の方法。
- 前記継代培養は、１ないし１０継代まで行われる、請求項２０に記載の方法。
- 前記継代培養は、脱落された非中胚葉性幹細胞を除去し、中胚葉性幹細胞を分離する段階を含む、請求項１１に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、核移植多能性幹細胞（ＮＴ－ｈＰＳＣ）、単為生殖生物由来ヒト多能性幹細胞（ｐｎ－ｈＰＳＣ）、逆分化万能幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項９に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞に分化誘導する段階において、前記間葉系幹細胞は、未成熟間葉系幹細胞であり、前記未成熟間葉系幹細胞を経由して間葉系幹細胞が製造される、請求項９に記載の方法。
- 前記未成熟間葉系幹細胞は、細胞集団の１０％以下が、血液・血管形成前駆細胞のマーカーであるＶＥＧＦＲ２を発現し、血液・血管形成前駆細胞を経由しない、請求項２４に記載の方法。
- 前記製造された間葉系幹細胞は、細胞集団の７０％以上が、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０またはＣＤ１０５に対して陽性であり、細胞集団の１０％以下が、マーカーＴＲＡ－１６０、ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２に対して陰性である、請求項９に記載の方法。
- 前記間葉系幹細胞は、造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、泌尿器官細胞、腎臓細胞、血管細胞、網膜細胞及びニューロン細胞からなる群から選択される１種以上への分化能を有する、請求項９に記載の方法。
- ＤＮＡ修復剤及びＲＯＣＫ（Ｒｈｏ associated coiled－coil containing protein kinase）抑制剤の存在下で分化誘導された、多能性幹細胞由来の間葉系幹細胞。
- 前記間葉系幹細胞は、細胞集団の７０％以上が、マーカーＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ９０またはＣＤ１０５に対して陽性であり、細胞集団の１０％以下が、マーカーＴＲＡ－１６０、ＣＤ３４またはＶＥＦＧＲ２に対して陰性である、請求項２８に記載の細胞。
- 請求項９に記載の方法によって製造された間葉系幹細胞を、少なくとも３継代で継代培養する段階であり、細胞治療剤適用のための多能性幹細胞からの分化誘導及び培養期間が、２０日ないし４０日である段階を含む、間葉系幹細胞を含む細胞治療剤を製造する方法。
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