KR20100138023A

KR20100138023A - 산화티타늄 나노튜브 표면에서 로 연관 키나제 억제에 의한 중간엽줄기세포 세포증식 증진방법

Info

Publication number: KR20100138023A
Application number: KR1020090056359A
Authority: KR
Inventors: 김현만
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-06-24
Filing date: 2009-06-24
Publication date: 2010-12-31

Abstract

본 발명은 산화티타늄 표면에 구현된 나노튜브 표면에서 조골세포의 증식을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 티타늄 나노튜브 표면에서 조골세포는 분화도는 증가하나, 증식률이 저하된다. 이에 본 발명은 티타늄 나노튜브 표면에서 조골세포의 증식률이 낮은 현상을 개선하기 위해 Rho-associated kinase를 사용하여 세포의 증식을 증진시킨다.

Description

산화티타늄 나노튜브 표면에서 로 연관 키나제 억제에 의한 중간엽줄기세포 세포증식 증진방법 {Method of Enhancing Proliferation of Mesenchymal Stem Cell by Rho-associated Kinase Inhibition}

본 발명은 티타늄 표면에 구현된 산화티타늄 나노튜브 생체재료표면에서 중간엽줄기세포로부터 세포증식을 증대시키므로서 더 많은 조골세포를 얻을 수 있고, 산화티타늄 나노튜브 생체재료 표면에서 더 많은 조골세포를 증식시켜 산화티타늄 나노튜브 생체재료 표면의 뼈형성 효율을 높이는 기술에 관한 것이다.

산화티타늄 막을 가진 티타늄소재는 치과 및 정형외과에서 치아 및 뼈 수복을 위해 가장 널리 사용되는 소재로서, 티타늄의 뼈 재생능력을 높이기 위해 다양한 방법이 시도되고 있다. 산화티타늄 나노튜브는 티타늄 표면에 얇은 막상태로서 구현할 수 있는 표면처리 방법 중 하나인데, 산화티타늄 나노튜브 표면이 티타늄의 뼈재생능력을 높일 수 있음이 알려졌다.

산화타타늄 나노튜브 표면에서 중간엽줄기세포는 조골세포로 분화하는 능력이 증진 된다. 통상 중간엽줄기세포가 조골세포로 분화하는데에는 특별한 분화유도인자가 필요한 것으로 알려져 있다. 그러나 산화티타늄 나노튜브표면에서 중간엽줄기세포는 이러한 분화유도인자의 도움 없이도 조골세포로 분화한다. 따라서 산화티타늄 나노튜브에서 중간엽줄기세포를 배양하는 것은 조골세포 분화유도인자의 도움이 없이도 중간엽줄기세포로 부터 조골세포를 얻을 수 있는 방법을 제공한다. 또한 산화티타늄 나노튜브 표면은 중간엽줄기세포를 조골세포로 분화시키는 능력이 있기 때문에 산화티타늄 표면에 더 많은 뼈조직을 형성시키는 방법을 제공할 수 있어 산화티타늄 나노튜브표면은 뼈수복을 위한 생체재료로서 탁월한 성능을 가진 재료로 간주된다 (Oh et al. Proc Natl Acad Sci USA 2009 Feb 17;106(7):2130-5).

그러나 본 발명에 의하면 산화티타늄 나노튜브표면에서 중간엽줄기세포는 조골세포로의 분화능력은 높지만, 세포증식률은 낮은 단점을 보인다. 따라서 중간엽 줄기세포로부터 많은 양의 조골세포를 얻을 목적이거나, 더 많은 뼈조직을 산화티타늄 나노튜브 표면에 형성시킬 목적을 달성하기 위해서는 산화티타늄 표면에서 중간엽줄기세포의 증식을 높이는 방법이 제공되어야 한다.

이에 본 발명은 산화티타늄 나노튜브표면에서 중간엽줄기세포의 증식을 증진시키기 위해 RhoA - Rho-associated kinase (이하 ROCK이라 함) - PTEN 신호전달체계를 억제하는 방법을 제공한다. ROCK 억제는 배아줄기세포의 세포사멸(apoptosis)를 억제하고 (Watanabe et al. Nat Biotechnol. 2007Jun;25(6):681-6), 소수성 표면에서 조골세포의 세포의 부착, 증식, 이동을 촉진한다. RhoA-ROCK-PTEN 신호전달체계는 다양한 방법에 의해 억제될 수 있는데, 본 발명에서는 널리 알려져 있는 ROCK 특이억제제를 사용하는 방법을 제공한다. 이 방법은 ROCK 억제재를 사용하여 중간엽줄기세포의 증식능력을 증진시키므로서 조골세포 분화능력이 높은 산화티타늄 나노튜브의 성능을 개선하는데 유용하게 사용할 수 있다.

산화티타늄 나노튜브 표면에서 중간엽줄기 세포의 조골세포로의 분화는 촉진되나 중간엽줄기세포의 증식은 억제된다. 이에 본 발명의 목적은 세포신호전달을 조절하여 산화티타늄표면 혹은 산화티타늄 나노튜브 표면에서 중간엽줄기세포의 세포증식을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명에서는 RhoA-ROCK-PTEN 신호전달체계를 억제한다. RhoA - ROCK- PTEN 신호전달체계를 억제하는 방법은 다양한 방법이 있을 수 있으나, 본 발명에서는 ROCK 특이억제제를 사용한다.

본 발명에서 확보할 수 있는 중간엽줄기세포 세포증식 증진방법은 세포치료나 뼈에 삽입하는 임플란트에 사용될 수 있다.

이하, 본 발명에 따른 ROCK을 억제하므로서 중간엽줄기세포 증식을 증진시킬 수 있는 방법에 대해 상세하게 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 다양한 ROCK 억제재를 사용할 수 있으나, 본 발명에서는 (+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride 이하 Y-27632로 칭함)를 사용하여 ROCK을 억제시킨다.

세포증식을 증진시키기위해서 세포를 산화티타늄 나노튜브 표면에 파종하기 전에 Y-27632를 배양액에 첨가하여 사전컨디션닝을 하거나 혹은 파종할 때 Y-27632를 배양액에 첨가하므로서 중간엽줄기세포의 증식을 증진시킬 수 있다. 이후 2 - 3일 마다 세포배양액을 교체할 때 신선한 Y-27632를 배양액에 첨가하므로서 세포증식을 증진시킬 수 있다.

이와같은 ROCK억제에 의한 중간엽줄기세포 세포증식 증진방법은 나노튜브가 형성되어있지않은 산화티타늄 표면에서도 뚜렷이 관찰된다.

본 발명에 의하면 산화티타늄 표면, 특히 나노튜브가 형성된 산화티타늄 표면에서 ROCK 억제재를 처리하므로서 중간엽줄기세포의 세포증식을 증진시킬 수 있다.

다음은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 티타늄산화 나노튜브 표면에서 중간엽줄기세포 활성

<실험예 1> 산화티타늄 나노표면에서 세포증식 감소

10,000개의 골수 중간엽줄기세포를 직경 1.5 cm 산화티타늄 표면을 가진 티타늄 디스크 표면에 파종하고 3일 후 증식된 세포 수를 CCK-8 분석방법으로 분석한다. 세포배양액은 10% fetal bovine serum이 첨가된 D-MEM을 사용한다. 세포배양조건은 5%의 CO₂가 함유된 공기중에서 37^oC 조건으로 배양한다. 그 결과 나노튜브표면에서 중간엽줄기 세포의 세포증식이 감소한다. 도 1은 산화티타늄 나노튜브표면에서 증식이 감소된 정도를 보여준다.

<실험예 2> 산화티타늄 나노표면에서 조골세포 분화 증진

30,000개의 골수 중간엽줄기세포를 직경 1.5 cm 산화티타늄 표면을 가진 티타늄 디스크 표면에 파종하고 2주일 후 조골세포로 분화정도를 염기성인산분해효소 활성을 분석하여 측정한다. 세포배양액은 10% fetal bovine serum이 첨가된 D-MEM을 사용한다. 세포배양조건은 5%의 CO₂가 함유된 공기중에서 37^oC 조건으로 배양한다. 그 결과 나노튜브표면에서 조골세포 분화유도인자의 투입없이 중간엽줄기세포의 조골세포분화가 증가한다. 도 2는 산화티타늄 나노튜브표면에서 조골세포 분화가 증가된 정도를 보여준다.

2. ROCK 활성억제에 의한 중간엽줄기세포 증식 증진

<실시예 1> 산화티타늄 표면에서 ROCK 활성억제에 의한 세포증식 증진

10,000개의 골수 중간엽줄기세포를 직경 1.5 cm 산화티타늄 표면을 가진 티타늄 디스크 표면에 파종하고 6일 후 증식된 세포 수를 CCK-8 분석방법으로 분석한다. 세포배양액은 10% fetal bovine serum이 첨가된 D-MEM을 사용한다. 세포배양조건은 5%의 CO₂가 함유된 공기중에서 37^oC 조건으로 배양한다. ROCK억제를 위해서는 Y-27632를 10 μM 처리한다. Y-27632 처리는 티타늄 표면에 세포를 파종 전 1 - 24시간 내에 계대배양시 처리하거나 티타늄 표면에 파종시 처리한다. 그 결과 세포증식은 Y-27632처리에 의해 증가한다. 도 3은 산화티타늄 표면에서 Y-27632 처리에 의해 증식이 증진된 정도를 보여준다.

<실시예 2> 산화티타늄 나노튜브표면에서 ROCK 활성억제에 의한 세포증식 증진

10,000개의 골수 중간엽줄기세포를 직경 1.5 cm 산화티타늄 나노튜브 표면을 가진 티타늄 디스크 표면에 파종하고 6일 후 증식된 세포 수를 CCK-8 분석방법으로 분석한다. 나노튜브의 직경은 25 - 150 nm이다. 세포배양액은 10% fetal bovine serum이 첨가된 D-MEM을 사용한다. 세포배양조건은 5%의 CO₂가 함유된 공기중에서 37^oC 조건으로 배양한다. ROCK억제를 위해서는 Y-27632를 10 μM 처리한다. Y-27632 처리는 티타늄 표면에 세포를 파종 전 1 - 24시간 내에 계대배양시 처리하거나 티타늄 표면에 파종시 처리한다. 그 결과 세포증식은 Y-27632처리에 의해 증가한다. 도 3은 산화티타늄 표면에서 Y-27632 처리에 의해 증식이 증진된 정도를 보여준다.

도 1은 중간엽줄기세포 배양 후 3일에 분석한 세포증식를 보이는 결과이다. 산화티타늄 나노튜브 표면에서 중간엽줄기세포의 증식은 저하된다.

도 2는 중간엽줄기세포 배양 후 2주일에 분석한 조골세포로의 분화정도를 보이는 결과이다. 산화티타늄 나노튜브 표면에서 중간엽줄기세포의 분화는 증대된다.

도 3은 중간엽줄기세포 배양 후 6일에 분석한 세포증식를 보이는 결과이다. Y-27632처리는 티타늄 표면에서 중간엽줄기세포의 증식을 증가시킨다. 반면에 세포배양접시 표면에서 Y-27632의 효과는 없다.

Claims

산화티타늄 표면에서 중간엽줄기세포의 세포증식을 증진시킬 목적으로 Rho-associated kinase 억제재를 사용하는 방법
제 1항에서, 산화티타늄 표면은 티타늄 금속 혹은 티타늄합금 표면에 형성된 산화티타늄 막을 가진 표면
제 1항에서, 산화티타늄 표면은 티타늄 금속 혹은 티타늄합금 표면에 형성된 산화티타늄 나노튜브막을 가진 표면
제 1항에서, Rho-associated kinase 억제재의 종류는 (+)-(R)-trans-4-(1-aminoethyl)-N-(4-pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride 혹은

1-(1-Hydroxy-5-isoquinolinesulfonyl)homopiperazine monohydrochloride를 단독 혹은 혼합하여 사용하는 방법