KR20200028865A - 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지, 그를 이용하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법, 및 그에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 - Google Patents

다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지, 그를 이용하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법, 및 그에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 Download PDF

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Abstract

배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지, 그를 이용하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법, 그에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 및 그를 포함하는 세포 치료제에 관한 것으로, 일 양상에 따른 배지 조성물 및 방법에 의하면, 짧은 기간 내에 높은 수득률로 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 배상체 형상의 단계가 없어 제조 공정이 단순하고, 균질성을 갖는 세포를 수득할 수 있어 기존 방법보다 단축된 기간으로 세포 치료제의 제공이 가능한 효과가 있다.

Description

다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지, 그를 이용하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법, 및 그에 의해 제조된 중간엽 줄기세포{Differentiation induction culture medium for pluripotent stem cells derived MSCs, method for producing MSCs and MSCs produced using the same}
다능성 줄기세포, 예를 들면, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 직접 분화용 배지, 그를 이용하여 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법, 그에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 및 그를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
인간배아줄기세포를 이용한 중간엽 줄기세포를 제조하는 종래기술로는 배상체 형성 후 TGF-β 억제제를 14일간 처리하여 제조하는 방법이 있다. TGF-β 억제제는 배상체의 내배엽계 세포분화를 억제시킴으로써 중배엽계 세포의 확보를 용이하게 하기 위해 처리된다. 또한, 일반적으로 인간배아줄기세포를 이용한 중간엽 줄기세포 제조시 사용하게 되는 TGF-β 억제제 중 SB431542의 처리 용량은 10 μM 이상에서 처리한다. TGF-β 억제제 중 SB431542의 1 μM 이상의 처리는 내배엽계 분화에 필요한 전사인자의 활성을 억제하고 중배엽계 분화에 필요한 전사인자의 활성을 증가시키는 효과가 있다. 또한 배상체를 경유하지 않는 직접 분화 방법에서도 TGF-β 억제제의 하나인 SB431542를 처리하여 분화를 유도한 경우가 있으나, 대부분 10 μM 이상의 고농도에서 11일 이상의 장시간 약물 처리기간이 소요되는 것으로 보고되고 있다. 따라서, 기존에 보고된 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포가 높은 함량의 중배엽성 특성을 나타내기까지는 장기간의 시간이 소요되는 실정이다. 또한, 크기와 모양이 균일한 배상체를 형성시켜 이용하더라도 배상체의 내부와 외부를 구성하는 세포에서의 미세환경의 차이로 인하여 처리 약물의 효과가 균일하지 않을 가능성이 있어 분화 효율 및 분화 세포의 성질에 영향을 미칠 수 있는 기술적 불안정성을 가질 수 있다.
이에, 세포의 증식 현상을 기반으로 제조되는 생물학적 치료제제임에도 불구하고, 증식 현상으로 인해 야기될 수 있는 세포의 노화 및 돌연변이 위험성에 대한 예방적 혹은 보완적 조치가 시행되지 않은 상태로 제조되고 있는 상황이며, 이를 해결하기 위한 기술이 필요한 실정이다.
일 양상은 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 다능성 줄기세포의 중간엽 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 분리된 다능성 줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 다능성 줄기세포를 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제의 존재하에서 분화 유도된 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공하는 것이다.
일 양상은 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 다능성 줄기세포의 중간엽 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 "다능성 줄기세포"는 자가재생할 수 있고 (미분화된 상태를 유지하면서 다수의 세포 분열 주기를 통과하는 능력을 갖고) 1종 이상의 다중분화능 (1종 이상의 전문화된 세포로 분화하는 성능)을 나타낼 수 있는 세포를 의미한다. 중간엽 줄기세포(MSC, Mesenchymal Stem Cell)는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포이다. 상기 다능성 줄기세포는 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC), 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC), 역분화 만능 줄기세포(iPSC), 또는 배아줄기세포(ESC)일 수 있다.
본 발명에서 "체세포"는 성세포 또는 이의 전구체를 제외한 체내의 임의의 조직세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "성숙"은 최종적으로 분화된 세포 종류를 향하여 인도하는 조화된 생화학적 단계들로 구성된 과정을 의미한다.
본 명세서에서 "분화"는 특정 형태 또는 기능에 대한 세포의 적응을 의미한다.
본 명세서에서 "분화된 세포"는 본 명세서에 그 용어가 정의된 것처럼 이의 원래 형태에서 다능성이 아닌 임의의 체세포를 포함한다. 따라서, 용어 "분화된 세포"는 또한 부분 분화된 세포, 예컨대 다분화능 세포, 또는 본 명세서에 기재된 임의의 조성물 및 방법을 이용하여 생성된 안정한, 비다능성 부분 재프로그래밍된 또는 부분 분화된 세포인 세포를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 분화된 세포는 안정한 중간 세포, 예컨대 비다능성, 부분 재프로그래밍된 세포인 세포이다. 배양물 중에 많은 1차 세포를 위치시키면 완전 분화된 특성을 약간 소실할 수 있는 것에 유의해야 한다. 따라서, 이러한 분화된 또는 체세포를 단순히 배양하는 것은 이 세포가 비분화된 세포(예를 들면 미분화 세포) 또는 다능성 세포가 되게 하지 않는다. 분화된 세포(안정한, 비다능성 부분 재프로그래밍된 세포 중간체를 포함)의 전분화능으로의 전이는 배양물 중에 위치시킬 때 분화된 특성을 부분 소실시키는 자극을 넘는 재프로그래밍 자극을 필요로 한다. 재프로그래밍된, 몇몇 실시양태에서, 부분 재프로그래밍된 세포는 또한 일반적으로 배양물 중에 오직 제한된 수의 분열에 대한 능력을 갖는 더 낮은 발생 가능성을 갖는 모세포에 비해 성장 가능성의 소실 없이 연장된 계대배양을 겪는 능력을 갖는 특성을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 용어 "분화된 세포"는 또한 (예를 들면, 미분화 세포 또는 재프로그래밍된 세포로부터) 덜 특수화된 세포 유형(즉, 발생 가능성 증가)의 세포(여기서, 세포는 세포내 분화 공정을 겪음)로부터 유래한 더 특수화된 세포 유형(즉, 발생 가능성 감소)의 세포를 의미한다. 상세하게는 본 명세서에서 조혈모세포, 근육 세포, 심근 세포, 간 세포, 연골 세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 지방세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포, 중간엽 줄기세포(MSC) 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 DNA 교정제는 Rad51의 활성을 증가시키는 물질(Rad51 활성제)일 수 있다. 상기 Rad51 활성제는 3-[(벤질아미노)설포닐]-4-브로모-N-(4-브로모페닐)벤즈아미드(3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide), 또는 4-브로모-N-(4-브로모페닐)-3-[[(페닐메틸)아미노]설포닐]-벤즈아미드(4-Bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide)일 수 있다. 상기 DNA 교정제는 5 μM 내지 25 μM, 5 μM 내지 20 μM, 6 μM 내지 18 μM, 8 μM 내지 15 μM, 또는 8 μM 내지 12 μM의 농도로 포함되는 것일 수 있다. RAD51 활성제는 손상된 DNA 의 교정기능이 있는 RAD51 단백질의 ssDNA (single strand DNA) 혹은 ds DNA (double strand DNA)에의 결합 안정성을 유지시켜 줌으로써 RAD51 단백질의 활성을 높여 DNA 교정 효과를 지속시키는 기능을 가질 수 있다. 이에, 특정 이론에 제한됨이 없이, 다능성 줄기세포로부터 중배엽성 줄기세포로 분화 RAD51 활성제를 처리함으로써, 세포증식과 반복 계대에 의한 돌연변이 확률 및 세포노화의 발생시기를 지연하여 유전적 안전성을 가진 세포 치료제를 제조할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), 4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥세인카복사마이드(4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide), 4-(1-아미노에틸)-N-(1H-피롤로(2,3-b)피리딘-4-일)시클로헥세인카복사마이드 디히드로클로라이드(4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo(2,3-b)pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride), N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-1,4,5,6-테트라히드로-2-메틸-6-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3-피리딘카복사마이드(N-(6-Fluoro-1H-indazol-5-yl)-1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-6-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3-pyridinecarboxamide), 및 1-(3-히드록시벤질)-3-[4-(피리딘-4-일)티아졸-2-일]요소(1-(3-Hydroxybenzyl)-3-[4-(pyridin-4-yl)thiazol-2-yl]urea), 2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로 -1H-1,4-디아즈핀 디히드로클로라이드(2-Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]-hexahydro-1H-1,4-diazepine dihydrochloride), N-[2-[2-(디메틸아미노)에톡시]-4-(1H-피라졸-4-일)페닐 -2,3-디히드로 -1,4-벤조디옥신 -2-카복사마이드 디히드로클로라이드(N-[2-[2-(Dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide dihydrochloride], 2-플루오로-N-[[4-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)페닐]메틸]벤젠메탄아민 디히드로클로라이드(2-Fluoro-N-[[4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)phenyl]methyl]benzenemethanamine dihydrochloride), N-[3-[[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸 -3-일)-1-에틸 -1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시]페닐]-4-[2-(4-모르포리닐)에톡시]벤즈아마이드(N-[3-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxy]phenyl]-4-[2-(4-morpholinyl)ethoxy]benzamide), (3S)-1-[[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조 [4,5-c]피리딘-7-일]카보닐]-3-피롤리딘아민 디히드로클로라이드((3S)-1-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-7-yl]carbonyl]-3-pyrrolidinamine dihydrochloride), N-[(1S)-2-히드록시-1-페닐에틸]-N'-[4-(4-피리디닐)페닐]-요소(N-[(1S)-2-Hydroxy-1-phenylethyl]-N'-[4-(4-pyridinyl)phenyl]-urea), 아자인돌-1(Azaindole-1), 및 나르시클라신(Narciclasine)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 ROCK 억제제는 5 μM 내지 25 μM, 5 μM 내지 20 μM, 6 μM 내지 18 μM, 8 μM 내지 15 μM, 또는 8 μM 내지 12 μM의 농도로 포함되는 것일 수 있다. 세포치료제 개발에 있어서의 ROCK 억제제의 기능은 분자생물학적으로 활성 RHO 단백질에 의한 중간 필라멘트(Intermediate filament) 와해 효과, 액틴-막 연결(actin-membrane linkage) 효과, 세포사멸기전 활성 효과 및 반복적 계대에 의해 발생되어질 수 있는 세포 노화연관 마커 P16과 P21의 발현 유도 모두를 억제시키는 기능을 가질 수 있다. 그러한 기능을 기반으로 ROCK 억제제는 세포분화 과정 중에 발생되어질 수 있는 급격한 물질 대사 변화에 의한 세포 스트레스 증가 억제 효과 및 세포 노화 지연 효과를 가진다. 따라서, 특정 이론에 제한됨이 없이, ROCK 억제제의 적정 처리 용량과 처리 기간을 재조정 함으로써 중배엽성 줄기세포로의 분화에 안정성과 효율을 향상시킬 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 TGF-β 억제제를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 TGF-β 억제제는 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘(2-[3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물(4-(5-Benzol[1,3]dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)-benzamide hydrate), 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 및 4-[4-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(3,4-Methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide), 2-(3-(6-메틸피리딘 -2-일)-1H-피라졸 -4-일)-1,5-나프티리딘(2-(3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸 -4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-(1,1-디메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-6-메틸-피리딘(2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1- dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine), 2-(5-클로로 -2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프터리딘(2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)-4-[(4-pyridyl)amino]pteridine), 6-[2-터트-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일]-퀴녹살린(6-[2-tert-Butyl-5-(6-methyl-pyridin-2-yl)-1H-imidazol-4-yl]-quinoxaline), 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸 -1-에탄올(4-[2-Fluoro-5-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]phenyl]-1H-pyrazole-1-ethanol), 3-[[5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-(6-퀴녹살리닐)-1H-이미다졸-2-일]메틸]벤즈아마이드(3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]benzamide)로 이루어진 군으로 부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 TGF-β 억제제는 0.2 μM 내지 2.0 μM, 0.2 μM 내지 1.6 μM, 0.4 μM 내지 1.6 μM, 0.6 μM 내지 1.4 μM, 0.8 μM 내지 1.2 μM, 또는 0.6 μM 내지 1.0 μM의 농도로 처리될 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물을 사용하면, 기존에 보고된 TGF-β 억제제의 처리 농도보다 현저하게 낮은 저농도의 TGF-β 억제제를 사용함으로써, 고농도의 TGF-β 억제제에 따른 부작용을 감소시킬 수 있고, 저농도의 TGF-β 억제제를 사용하여도, 높은 수율의 중배엽성 줄기세포를 수득할 수 있는 효과가 있다.
상기 배지는 MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), F12 및 DMEM/F12로 구성된 군에서 선택되는 배지일 수 있다.
또한, 배지는 등장액 중의 중성 완충제(예를 들면 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예를 들면 FBS, FCS (fetal calf serum), horse serum, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예를 들면 글루타민, L-글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예를 들면 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예를 들면 글루코스, 글루코코르티코이드, 예를 들면 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예를 들면 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.
또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예를 들면 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat # 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.
그 중에서도, 하기의 1 이상의 추가의 첨가제를 포함할 수 있다:
줄기 세포 인자(SCF, Steel 인자), c-키트를 이량화하는 다른 리간드 또는 항체, 및 동일한 신호 전달 경로의 다른 활성제; 다른 티로신 키나아제 관련 수용체, 예를 들면 혈소판-유도된 성장; 인자(Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포 콜로니-자극 인자, Flt-3 리간드 및 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF)의 수용체를 위한 리간드; 환형 AMP 농도를 높이는 인자, 예를 들면 포르스콜린; gp130을 유도하는 인자, 예를 들면 LIF 또는 Oncostatin-M; 조혈모 성장 인자, 예를 들면 트롬보포이에틴(TPO); 변형성 성장 인자, 예를 들면 TGF β1; 뉴로트로핀, 예를 들면 CNTF; 항생제, 예를 들면 겐타마이신 (gentamicin), 페니실린, 스트렙토마이신.
일 구체예에 따른 배지 조성물은 상기 성분 이외에, FBS (fetal bovine serum), NAC(N-acetyl-L-cysteine), Non-Essential Amino Acid (NEAA), 섬유아세포 증식인자 (bFGF), 인슐린 또는 인슐린 유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bFGF (basic fibroblast growth factor), 헤파란 황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol) 및 EGF (epidermal growth factor)로 구성된 군에서 선택되는 1가지 이상의 성분을 추가로 함유할 수도 있다.
일 구체예에 따른 상기 배지 조성물은 다능성 줄기세포의 중간엽 줄기세포로의 분화 유도를 위해 사용되는 것일 수 있다. 상세하게는 상기 배지 조성물은 배양된 다능성 줄기세포를 중배엽성 세포로 분화시킨 후(예를 들면, TGF-β 억제제의 처리), 상기 중배엽성 세포를 중간엽 줄기세포로 성숙 분화시키기 전에 사용되는 것일 수 있다. 따라서, 상기 배지 조성물은 중간엽 줄기세포의 성숙 분화 전의 미성숙 중간엽 줄기세포(중배엽성 세포)의 전처리에 사용되는 것일 수 있다.
또한, 일 구체예에 따른 상기 배지 조성물은 직접 분화 유도 배지 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "직접 분화(direct differentiation)"은 다능성 줄기세포를 중간엽 줄기세포로 분화시킴에 있어, 배상체를 형성하지 않으면서, 혈액-혈관형성 전구 세포(Hamangioblast)를 경유하지 않고, 조혈모세포 성질을 갖는 미성숙 중간엽 줄기세포를 경유하는 형태로 최종 중간엽 줄기세포로 분화되는 것을 의미할 수 있다.
다른 양상은 분리된 다능성 줄기세포를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 다능성 줄기세포를 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상세하게는 분리된 다능성 줄기세포를 배양하는 단계; 상기 배양된 다능성 줄기세포를 중배엽성 세포로 분화시키는 단계(예를 들면, TGF-β 억제제의 존재하에서); 상기 중배엽성 세포를 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계("배지에서 배양하여 전처리하는 단계", 또는 "배지에서 배양하여 미성숙 중간엽 줄기세포를 제조하는 단계"와 호환적으로 사용된다); 상기 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 성숙 배지에서 배양하는 단계; 및/또는 상기 성숙 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 방법은 배상체 형성 단계를 실질적으로 포함하지 않는 것일 수 있다.
상기 분리된 다능성 줄기세포를 배양하는 단계는 지지세포의 부재 하에서 수행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 배양하는 단계는 세포 부착 기능 강화제(예를 들면, CTS CellstartTM)가 코팅된 배양 용기에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양은 줄기세포 배양액(예를 들면, mTeSRTM)에서 수행될 수 있으며, 약 1일 내지 10일, 또는 3일 내지 10일 동안 수행될 수 있다.
상기 중배엽성 세포로 분화시키는 단계는 TGF-β 억제제의 존재하에서 수행되는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 단계는 TGF-β 억제제를 함유하는 배지에서 1일 내지 8일, 2 내지 7일, 2일 내지 6일, 또는 2일 내지 4일 동안 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양이 7일 이상으로 유지될 경우 세포의 노화가 일어날 수 있거나, 세포의 형태학적(morphology) 특징의 변형이 나타낼 수 있거나, 또는 세포의 증식력이 저하될 수 있다. 상기의 세포 노화, 형태학적 특징 또는 증식력의 측면에서 상기 배양은 2일 내지 6일 일 수 있다. 상기 배지는 MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), F12 및 DMEM/F12로 구성된 군에서 선택되는 배지일 수 있다. 또한, 배지에 대해 본 명세서의 설명에서 언급된 추가 성분을 더 포함할 수 있다.
상기 중배엽성 세포를 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계는, 중간엽 줄기세포의 성숙 분화 전의 전처리하는 단계, 또는 미성숙 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계를 의미할 수 있다. 상기 배지에 대해서는 상기한 바와 같다. 상기 배양은 DNA 교정제, ROCK 억제제, 및/또는 TGF-β 억제제를 함유하는 배지에서 1일 내지 4일, 또는 1일 내지 2일 동안 분화 유도하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계에서 상기 중간엽 줄기세포는 미성숙 중간엽 줄기세포일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 방법은 상기 미성숙 중간엽 줄기세포를 경유하여 중간엽 줄기세포가 제조되는 것일 수 있다. 상세하게는 일 구체예에 따른 방법은 혈액-혈관 형성 전구세포를 경유하지 않고, 미성숙 중간엽 줄기세포를 경유하여 중간엽 줄기세포가 제조되는 것일 수 있다. 상기 미성숙 중간엽 줄기세포는 혈액-혈관 형성 전구세포(Hemangioblast)의 마커인 VEGFR2에 대하여 세포 집단의 10% 이하로 발현하는 것을 확인함으로써, 일 구체예에 따른 방법은 혈액-혈관 형성 전구세포를 경유하지 않는 것을 알 수 있었다.
상기 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 성숙 배지에서 배양하는 단계는 중간엽 줄기세포에 트립신(트립신/EDTA 용액)을 처리하여 단일세포화하는 단계; 중간엽 줄기세포 성숙 배지에서 배양하는 단계; 상기 성숙 배지에서 배양된 세포를 원심분리하는 단계 및/또는 상기 성숙 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 성숙 배지에서 배양하는 단계는 성숙 배지에서 1일 내지 15일, 1일 내지 12일, 또는 4일 내지 12일 동안 배양하는 것일 수 있다. 또한, 상기 성숙 배지는 MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), F12 및 DMEM/F12로 구성된 군에서 선택되는 배지일 수 있다. 또한, 배지에 대해 본 명세서의 설명에서 언급된 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 원심분리 이후에 원심분리하여 얻어진 세포를 계대 배양할 수 있다. 상기 계대 배양은 상기 성숙 배지와 유사 또는 동일한 배지에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 계대 배양은 트립신(예를 들면, 트립신/EDTA 용액)의 존재하에서 단일 세포화 하는 방식으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 계대 배양은 세포 부착 기능 강화제가 코팅된 배양 용기에서 수행될 수 있다. 본 명세서에서,"계대 배양"이란, 세포를 건강한 상태로 지속적으로 장기간 배양하기 위해 주기적으로 세포의 일부를 새로운 배양용기에 옮긴 후 배양배지를 갈아주면서 세포의 대(代)를 계속 이어서 배양하는 방법을 의미할 수 있다. 한정된 공간을 가진 배양용기 내에서 세포의 수가 늘어나면서 일정시간이 지나면 증식 영양분이 소비되거나 오염 물질이 쌓여 세포가 자연히 죽게 되므로, 건강한 세포의 수를 늘리기 위한 방법으로 사용되며, 통상적으로 한 차례 배지 (배양용기)를 교체하는 것 또는 세포군을 나누어 배양하는 것을 1 계대 (1 passage)라고 한다. 계대 배양의 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있고, 예를 들면 기계적 분리 또는 효소적 분리로 수행될 수 있다. 상기 계대 배양은 1 내지 20 계대, 3 내지 20 계대, 3 내지 15 계대까지 수행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 계대 배양은 탈락된 비중배엽성 줄기세포를 제거하고, 중배엽성 줄기세포를 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 계대 배양을 통해 최종 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포를 제공하는 것이다.
일 구체예에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제의 존재하에서 분화 유도된 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 세포 표면에 발현되는 세포 표지자에 대하여 CD29, CD44, CD90, 또는 CD105 양성 표면 마커를 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 약 99% 발현하고, TRA-160, CD34, 또는 VEFGR2 음성 마커를 약 적어도 70% 이하, 적어도 60% 이하, 적어도 50% 이하, 적어도 40% 이하, 적어도 30% 이하, 적어도 20%이하, 적어도 10% 이하, 적어도 5%이하, 또는 적어도 1%이하로 발현하는 것일 수 있다. 본 발명에서 용어, "양성"은 줄기세포 표지와 관련하여, 그 표지가 기준이 되는 다른 비줄기 세포와 비교하였을 때 더 많은 양, 또는 더 높은 농도로 존재하는 것을 의미할 수 있다. 즉, 세포는 어느 표지가 세포 내부 또는 표면에 존재하기 때문에 그 표지를 이용하여 그 세포를 하나 이상의 다른 세포 유형과 구별할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다. 또한 세포가 배경 값보다 더 큰 값으로 신호, 예를 들어 세포 측정 장치의 신호를 낼 수 있는 만큼의 양으로 그 표지를 가지고 있다는 것을 의미할 수 있다. 예를 들어 세포를 CD29에 특이적인 항체로 검출 가능하게 표지할 수 있고, 이 항체로부터의 신호가 대조군(예를 들어 배경 값)보다 검출 가능하게 더 크면 그 세포는 "CD29+"이다. 본 발명에서 용어, "음성"은 특정 세포 표면 표지에 특이적인 항체를 사용하여도 배경 값에 비교하여 그 표지를 검출할 수 없음을 뜻한다. 예를 들어 CD34에 특이적인 항체로 세포를 검출 가능하게 표지할 수 없으면 그 세포는 "CD34-"이다.
상기 면역학적 특성은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 결정할 수 있다. 예를 들면 유세포분석, 면역조직화학염색, 또는 RT-PCR 등 다양한 방법이 이용될 수 있다.
또한 상기 중간엽 줄기세포는 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 집단을 제공한다.
또 다른 양상은 상기 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포, 그의 세포집단 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 세포 치료제, 약학적 조성물 또는 제제를 제공한다.
일 구체예에 따른 중간엽 줄기세포 제조 방법은 기존에 보고된 방법보다 단축된 기간으로 세포 치료제로서의 제공이 가능하다. 따라서, 상기 세포 치료제, 또는 약학적 조성물은 적어도 3계대 이상, 예를 들면, 3계대 내지 10 계대 배양된 것이고, 세포 치료제로서 적용되기 위해 다능성 줄기세포로부터 20일 내지 40일, 22일 내지 38일, 25 내지 35일 동안 분화 유도 및 배양되는 것일 수 있다. 상기 세포 치료제로서 적용되기 위한 배양 기간은 다능성 줄기세포로(Day 0)부터 세포 치료제 적용 가능 시점에 도달하기 까지의 소요되는 분화 시간을 의미할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 계대 배양하는 단계는 적어도 3계대 이상, 예를 들면, 3계대 내지 10 계대 배양하는 단계로서, 세포 치료제 적용을 위한 분화 유도 및 배양 기간이 다능성 줄기세포(Day 0)로부터 20일 내지 40일인 것인 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한 예를 들면, 상기 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포, 그의 세포집단, 또는 그의 배양액을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물을 제공한다.
상기 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 질환의 예는 염증성 질환, 허혈성 질환, 및/또는 신경퇴행성 질환을 포함할 수 있다. 상기 염증성 질환의 예는 기관지염, 위염, 동맥경화증, 관절염, 염증성 장질환(inflammatory bowel disease; IBD), 간염, 담낭염, 진균성 감염증, 위궤양, 천식, 아토피성 피부염, 건염 또는 신장염을 포함할 수 있다. 상기 허혈성 질환의 예는 허혈성 뇌졸중, 심근경색, 허혈성 심장질환, 허혈성 뇌질환, 허혈성 심부전, 허혈성 장염, 허혈성 혈관질환, 허혈성 안질환, 허혈성 망막증, 허혈성 녹내장, 허혈성 신부전, 또는 허혈성 하지질환을 포함할 수 있다.
상기 신경퇴행성 질환의 예는 척수 손상, 다발성 경화증, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 전두측두엽 치매(Frontotemporal dementia), 진행성 핵상 마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(corticobasal degeneration), 피크병(Pick's disease), 또는 권투선수 치매 (Dementia pugilistica, DP)를 포함할 수 있다.
일 구체예 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물의 투여량은 중간엽 줄기세포를 기준으로 1.0 X 103 내지 1.0 X 1010 세포/kg(체중) 또는 개체, 또는 1.0 X 107 내지 1.0 X 108 세포/kg(체중) 또는 개체일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1회 또는 임상적으로 용인 가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 또는 개체당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 유효성분으로서 상기 중간엽 줄기세포와 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 첨가물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위해, 생체고분자(biopolymer) 등의 유기물, 하이드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 중합체 또는 공중합체, 폴리에틸렌글리콜 중합체 또는 공중합체 및 그의 화학적 유도체 등과 조합시키는 것도 바람직하다. 일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물이 주사에 적당한 제형으로 조제되는 경우에는, 세포집합체가 약학적으로 허용가능한 담체 중에 용해되어 있거나 또는 용해되어 있는 용액상태로 동결된 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 중간엽 줄기세포는, 신체의 조직 또는 기관이 목적하는 세포 군집, 예를 들어 줄기세포 또는 유래세포군집의 생착, 이식 또는 주입에 의해 강화, 치료 또는 대체되는 다양한 종류의 치료 프로토콜에 사용될 수 있다. 상기 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포는 존재하는 조직을 대체 또는 강화시켜, 새롭거나 변화된 조직이 되게 하거나 생물학적 조직 또는 구조와 결합시킬 수 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 그 투여방법이나 제형에 따라 필요한 경우, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성화제, 희석제, 부형제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 환원제, 산화방지제 등을 적절히 포함할 수 있다. 상기에 예시된 것들을 비롯하여 본 발명에 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., 1995]에 상세히 기재되어 있다.
일 구체예에 따른 세포 치료제 또는 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 분말, 과립, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다. 또한, 세포 치료제는 주사용 제형으로 제형화될 수 있다. 이 경우 제형화하기 위한 공지된 통상적 성분이 이용될 수 있고, 통상적인 방법으로 제형화될 수 있다.
일 양상에 따른 배지 조성물 및 방법에 의하면, 짧은 기간 내에 높은 수득률로 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 배상체 형상의 단계가 없어 제조 공정이 단순하고, 균질성을 갖는 세포를 수득할 수 있어 기존 방법보다 단축된 기간으로 세포 치료제의 제공이 가능한 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포를 중간엽 줄기세포로 직접 분화하는 방법을 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 3은 비교예에 따른 배상체 형성 시스템을 통한 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 4는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 수득률(직접분화 + SB431542 + RS1 + Y27632)을 배상체 형성 시스템을 이용한 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 수득률(배상체 경유 분화 + SB431542)과 비교한 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(직접분화 + (SB431542 + RS1 + Y27632))를 세포 치료제로서 활용하기 위해 소요되는 분화 기간을 배상체 형성 시스템을 이용한 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(배상체 + SB431542))와 비교한 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 배양 30일째(Passage 4)의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 발현 마커를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 배양 4일째의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 발현 마커를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 배양 30일째(Passage 4)의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포와 배양 4일째의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 발현 마커를 비교한 그래프이다.
도 9는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 분화능을 확인한 그래프이다.
도 10은 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태 특성을 DNA 교정제와 ROCK 억제제 단독 처리에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태 특성과 비교한 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인간배아줄기세포의 중간엽 줄기세포로의 직접 분화
1.1. 인간배아줄기세포의 배양
인간배아줄기세포를 지지세포 없이 배양하기 위해 하기와 같이 수행하였다.
구체적으로, 인간 유래 성분만으로 구성된 세포 부착 기능 강화제인 CTS CellstartTM 를 표면적 2.0 cm2인 4 웰 조직세포배양 용기 (Tissue culture dish)에 160 ㎕/well 의 농도로 4℃ 에서 24시간 처리하였다. 이후에, 남아있는 CTS CellstartTM 를 상온에서 조직세포배양 용기 (Tissue culture dish) 로부터 모두 제거한 다음, 배아줄기세포 배양액인 mTeSRTM (StemCells, USA) 배양액을 500 ㎕/well의 농도로 상기 조직세포배양 용기에 넣은 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에 위치시켰다.
다음으로, 지지세포 위에서 증식된 인간 배아줄기세포(CHA-hES NT 18, CHA university)를 마이크로팁(Micro-tip, Axygen, USA)을 이용하여 기계적 계대 방법(Mechanical sub-passage)으로 작은 군집체들(small clumps)로 조각내었고, 이를 인큐베이터에 위치시켰던 상기 조직세포배양 용기에 15 내지 20 clumps/well 이 되도록 분주 하였다. 이후에 5일간 매일 새로운 배아 줄기세포배양액 (mTeSRTM) 500 ㎕/well 로 교체하면서 인간배아줄기세포를 지지세포 없이 증식 시켰다.
1.2. 인간배아줄기세포의 중배엽성 세포로의 분화 유도
상기 실시예 1.1.에서 지지세포 없이 증식시킨 인간배아줄기세포를 중배엽성 세포로 분화시키기 위해 TGF-β 억제제를 처리하였다.
구체적으로, TGF-β 저해제(SB431542)를 DMSO (Dimethylsulfoxide, Sigma, USA) 에 1mM 스탁 농도로 녹인 후, 최종 농도 1 μM 이 되도록 배아줄기세포 분화액 (DMEM/F12, 20 % (v/v) SR, 1 % (v/v) NEAA, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1 % (v/v) penicillin-streptomycin)에 희석하였다. 이후에, 상기 실시예 1.1.에서 5일간 증식 배양된 인간 배아줄기세포를 SB431542를 포함하는 상기 배아줄기세포 분화액에서 4일 동안(Day 0, 1, 2) 처리하여 중배엽성 세포로 분화시켰다.
1.3. 중배엽성 세포의 전처리
상기 실시예 1.2.에서 배아줄기세포 분화액 처리 3일째(Day 3)에 배치를 교체하여 추가적으로 1일 동안 배양하였다. 구체적으로 배지는 Rad 51 촉진제 (RS1) 10 μM, ROCK 저해제 (Y27632) 10 μM, TGF-β 저해제 (SB431542) 1 μM 이 함유된 분화 배지로 교체하여 중배엽성 세포를 전처리 하였다.
1.4. 중간엽 줄기세포로의 분화 유도
상기 실시예 1.3.에서 전처리한 중배엽성 세포를 중간엽 줄기세포로 성분 분화 시키고, 계대 배양하여, 중배엽성 줄기세포를 수득하였다.
구체적으로, 분화 4일째(Day)에 배양 배지를 모두 제거한 후, 1 % (v/v) 페니실린-스트렙토마이신을 혼합한 PBS로 세포를 세척하였다. 이후에, 0.125 % 트립신을 상온에서 처리하여 단일 세포화 한 후, 중간엽 줄기세포 성숙 배지(DMEM/F12, 10 % (v/v) FBS, 4ng/ml bFGF, 1 % (v/v) NEAA, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 1 % (v/v) penicillin-streptomycin)로 중성화 시킨 다음, 1,000 rpm에서 5 분간 원심분리하였다. 다음으로 원심분리하여 얻어진 세포를 CTS CellstartTM 가 미리 코팅된 1 웰/ 12 웰 디쉬에 모두 분주하고, 이후, 80-90% 의 세포 밀집도(confluency)에 이를 때마다, 12 웰 디쉬 (Passage 0) -> 6 웰 디쉬 (Passage 1) -> T-25 플라스크 (Passage 2) -> T-75 플라스크 (Passage 3) 순으로, 0.05% 트립신을 상온에서 처리하여 단일 세포화 하는 방식으로 지속 계대 배양하였다. 이 과정에서 비중배엽성 줄기세포는 탈락되고, 중배엽성 줄기세포를 수득하였다.
일 구체예에 따른 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법을 도 1에 도식화하여 나타내었다.
비교예 1. 배상체 형성 시스템을 통한 중간엽 줄기세포의 제조
대조군으로서, 배상체 형성 시스템을 통한 인간배아줄기세포로부터 중간엽 줄기세포를 제조하였다. 배상체 형성 시스템을통한 중간엽 줄기세포는 아래와 같이 제조하였다.
구체적으로, 인간배아줄기세포주를 7.5x104 cells/well (0.1% gelatin coated dish, 4well)의 농도로 미리 준비된 MEF 배양보조세포 위에서 콜로니 형태로 공배양하였다. EB 형성을 위하여, 상기 hESC 를 해부현미경 하에서 멸균된 팁을 사용하여 기계적으로 여러 군(2~4의 clump form) 으로 분리하였으며, 20% KSR(knockout-serum replacement, Invitrogen)이 첨가된 DMEM/F12 (Dulbecco;s Modified Eagle Medium; Nutrient Mixture F-12) 배지의 60mm 페트리 접시 위에서 5일단 배양하였다. EB 가 형성된 후, 20% KSR + DMEM/F12배지(EB 배양액:hESC 배양액에서 bFGF만 제외한 배양액)에서 하루 배양한 후, 상기 EB 배양액에서 1uM TGF-beta inhibitor (SB431542)를 첨가하여 2주간(13일간) 배양하였으며, 배지는 이틀에 한번 교체 해 주었다. 이후 1웰(well)에 EB 가 5내지 7개의 밀도가 되도록 0.1% 젤라틴(30min, air dry)으로 코팅된 6웰 플레이트로 옮겼으며, 10% FBS 및 1% P/S(penicillin-streptomycin, Invitrogen)가 첨가된 DMEM(low glucose;5.5mM D-glucose (1g/L)에서 16일간 배양하였다. 배양 48시간 후, EB의 부착 및 EB로부터 뻗어 나오는 세포들을 확인하였으며, 배지는 일주일에 두 번 교체해주었다. 16일 후, EB 에서 뻗어 나와 자란 세포들은 TrypLE solution(Invitrogen; 500ul TrypLE per 1well, 2min incubation)으로 분리하며 0.1% 젤라틴이 코팅된 75T 플라스크로 옮겨 10 % FBS 및 1% P/S 가 첨가된 DMEM(low glucose; 5.5mM D-glucose (1g/L))에서 배양하였다. 다음 날, 10% FBS 및 1% P/S 가 첨가된 DMEM(low glucose; 5.5mM D-glucose (1g/L)에서 MSC 증식배지인 10% FBS, 1% P/S, 1% NEAA(nonessential amino acids, Invitrogen) 및 0.1% β-mercaptoethanol (Invitrogen)에 도달할 때 마다 0.05% Trypsin-EDTA (1.5ml per 75T flask, 2min incubation)을 이용하여 계대 배양하는 방식으로 중간엽 줄기세포를 제조하였다.
비교예 2. DNA 교정제(DNA repair agent) 단독 처리를 통한 중간엽 줄기세포의 제조
상기 실시예 1.3.에서 ROCK 억제제를 사용하지 않고, Rad 51 촉진제 (RS1) 10 μM 및 TGF-β 저해제 (SB431542) 1 μM을 처리한 것만을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 중간엽 줄기세포를 제조하였다.
비교예 3. ROCK 억제제 단독 처리를 통한 중간엽 줄기세포의 제조
상기 실시예 1.3.에서 DNA 교정제를 사용하지 않고, ROCK 저해제 (Y27632) 10 μM 및 TGF-β 저해제 (SB431542) 1 μM을 처리한 것만을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 중간엽 줄기세포를 제조하였다.
실험예. 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 특성 분석
1. 세포 형태학적 특성 분석
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 수득한 중간엽 줄기세포의 세포 형태학적 특성을 분석하기 위해, 위상차 현미경 (phase-contrast microscope)(Nikon TE-2000) 하에서 중간엽 줄기세포 특이적인 세포 증식형태(소용돌이 모양)를 형성시키며 증식되는지 확인하였고, 그 결과는 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 3은 비교예에 따른 배상체 형성 시스템을 통한 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태학적 특성을 나타낸 사진이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 제조방법에 의해 제조된 인간배아줄기세포유래 중간엽 줄기세포는 분화 약 10일째부터 성체 조직 유래 중간엽 줄기세포와 유사한 소용돌이 모양(spindle-like shape)의 세포를 형성하며 점차 증식되어 분화 약 24일째에 이르러서는 대부분의 세포가 중간엽 줄기세포 유형을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, 도 3에 나타낸 바와 같이 기존에 보고된 배상체 형성 시스템을 이용한 인간배아줄기세포유래 중간엽 줄기세포는 40일째에 소용돌이 모양을 형성하며 증식되는 것을 확인할 수 있었다.
이는 일 구체예에 따른 방법이 기존에 보고된 방법보다 더 빠른 기간 내에 순도 높은 중간엽 줄기세포 특이적인 형태를 나타내는 세포를 확보할 수 있음을 의미한다.
2. 세포 수득률 분석
상기 실시예 1의 방법에 의한 세포의 수득률을 분석하기 위해 증식 세포 수를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1 및 비교예 1의 중간엽 줄기세포를 제조하는 과정 중, 트립신에 의해 단일 세포화 하는 단계에서 0.4 % (v/v) 트립판 블루 용액으로 세포를 염색하였다. 이후에, 헤마싸이토미터를 이용하여 수득 된 세포의 생존세포수를 분석하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
또한, 상기 실시예 2.1.의 세포 형태학적 관점에서, 일 구체예에 따른 방법으로 제조된 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 치료제로서 사용 가능한 적용 시점은 중간엽 줄기세포 특이적인 세포 증식 형태인 소용돌이 형태의 증식 특징을 나타내는 3계대수 이상 부터이다. 이에, 세포 치료에 적용하기 위한 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포주의 분화 소요 시간도 상기와 동일한 방법으로 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 4는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 수득률(직접분화 + (SB431542 + RS1 + Y27632))을 배상체 형성 시스템을 이용한 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 수득률(배상체 + SB431542))과 비교한 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(직접분화 + (SB431542 + RS1 + Y27632))를 세포 치료제로서 활용하기 위해 소요되는 분화 기간을 배상체 형성 시스템을 이용한 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포(배상체 + SB431542))와 비교한 그래프이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법은 기존에 보고된 방법에 비해 짧은 기간 내에 많은 수의 세포를 수득할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 방법은 기존에 보고된 배상체 형성 시스템에 비해 세포 치료제로서 적용 가능한 분화 기간을 약 1.5배에서 2배 정도 단축시켰음을 알 수 있었다.
3. 표면 발현 마커 분석
상기 실시예 1.에서 제조된 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 표면 마커 발현 분석을 위해 유세포 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 인간배아줄기세포유래 중간엽 줄기세포배양(배양 30일째(Passage 4))를 1% (v/v) 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 PBS 로 수세한 다음, 트립신 (0.05%, Trypsin/EDTA, Gibco, USA)을 사용하여 단일 세포화 하였다. 이후에, 차가운 4% 포름알데히드 용액으로 상온에서 30분간 고정한 다음, 0.2 % (v/v) FBS를 포함한 PBS 로 4회 수세하였다. 이후 APC 또는 PE가 표지된 항체를 0.2% FBS를 포함하는 PBS 에 최종적으로 5-15 ug 의 농도가 되도록 희석한 후, 어두운 곳에서 30 분간 상온에서 처리하였다. 다음에, 0.2 % (v/v) FBS 가 함유된 PBS 로 4회 수세 후, 유세포 분석기를 통해 발현 정도를 확인하였다. 항체는, 미분화세포 표지자인 TRA-1-60 (phycoerythrin (PE)-conjugated mouse anti-human TRA-1-60;Cat.560193, BD PharmingenTM), 조혈모세포 표지자인 CD34 (allophycocyanine (APC)-conjugated mouse anti-human CD34;Cat. 555824, BD PharmingenTM), 혈액-혈관형성 전구세포 표지자인 VEGFR2 (APC-conjugated mouse anti-human VEGFR2;Cat. BD PharmingenTM), 중간엽 줄기세포 표지자인 CD29 (APC-conjugated mouse anti-human CD29;Cat.559883, BD PharmingenTM), CD44 (APC-conjugated mouse anti-human CD44;Cat.559942, BD PharmingenTM)), CD90 (APC-conjugated mouse anti-human CD90;Cat.561971, BD PharmingenTM) 및 CD105 (APC-conjugated mouse anti-human CD105;Cat.562408, BD PharmingenTM) 에 대한 항체를 사용하였다.
상기의 유세포 분석 결과는 도 6에 나타내었다.
또한, 일 구체예에 따른 방법이 혈액-혈관형성 전구세포를 경유하지 않고 분화되는지 여부를 확인하기 위해, 배양 4일째(실시예 1.3)의 세포의 표면 마커 발현을 유세포 분석으로 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
아울러, 상기 배양 30일째(Passage 4)와 배양 4일째의 세포의 표면 마커 발현 분석 결과를 비교하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 6은 일 구체예에 따른 배양 30일째(Passage 4)의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 발현 마커를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 배양 4일째의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 발현 마커를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 배양 30일째(Passage 4)의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포와 배양 4일째의 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 표면 발현 마커를 비교한 그래프이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 미분화 세포 마커 (Pluripotent marker)인 TRA-1-60, 조혈모세포 마커 (Hematopoietic stem cell marker)인 CD34, 그리고 중간엽 줄기세포 마커(Mesenchymal stem cell maekers)인 CD29, CD44, CD90, CD105의 발현 여부를 확인 한 결과, 미분화 세포 표지 인자인 TRA-1-60은 발현하고 있지 않은 반면 (TRA-1-60, 0.00%), 중간엽 줄기세포 마커들은 높은 비율로 발현하고 있는 것을 알 수 있었다(CD29, 99.70%; CD44, 99.45%; CD90. 87.15%; CD105, 96.60%). 따라서, 일 구체예에 따른 방법으로 유도된 인간배아줄기세포유래 중간엽 줄기세포는 높은 중배엽성 성질을 갖는 세포임을 확인하였다.
또한 도 7에 나타낸 바와 같이, 분화 4일째에 세포의 표면 마커를 분석한 결과, 조혈모 세포 표지자인 CD34의 발현 비율이 매우 높게 나타나면서(CD34; 69.65%), 혈액-혈관형성 전구세포(Hemangioblast)의 마커인 VEGFR2 는 거의 발현하지 않는 것을 알 수 있었다(VEGFR2; 0.70%).
또한, 상기 도 6 및 도 7의 결과를 종합하여 도 8에 나타낸 바와 같이, 분화 30일째(Passage 4)에서는 중간엽 줄기세포 마커들이 높은 비율로 발현하고, 분화 4일째에는 조혈모 세포 표지자인 CD34이 높은 비율로 발현하고 혈액-혈관형성 전구세포(Hemangioblast)의 마커인 VEGFR2가 낮은 비율로 발현하는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 제조 방법이 혈액-혈관형성 전구세포를 경유하지 않고, 조혈모세포 성질을 갖는 미성숙 중간엽 줄기세포를 경유하는 형태로 제조된다는 것을 의미한다.
4. 세포 분화능 분석
상기 실시예 1에서 제조된 인간배아줄기세포유래 중간엽 줄기세포의 지방세포, 골세포, 및 연골 세포 분화능을 확인하였다.
구체적으로, 지방세포 분화 유도제 (StemPro®Adipocyte differentiation kit, Gibco), 골세포 분화 유도제 (StemPro®Osteocyte differentiation kit, Gibco) 및 연골세포 분화 유도제 (StemPro®Chondrocyte differentiation kit, Gibco)를 이용하여 각각 지방, 골, 및 연골세포로 제조사의 지시에 따라 분화 유도하였다. 이후에, 지방세포(Adipocyte), 골 세포(Osteocyte), 및 연골 세포(Chondrocyte) 특이적인 염색액(각각 순서대로 Oil red O, Alizarin red 그리고 Alcian blue)을 사용하여 세포 분화를 최종적으로 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 분화능을 확인한 그래프이다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 지방세포로 분화 유도한 경우에는 지질 특이적 염색액인 Oil red O 에 의해 세포 내 지질 성분이 적색으로 염색되는 지질 방울 (Lipid droplet)의 형태를 확인하였고, 골 세포로 분화 유도한 경우에는, Alizarin red 용액에 의해 세포 내 축적된 칼슘이 짙은 오렌지 색을 띄는 형태를 확인하였고, 연골 세포로 분화 유도한 경우에는 연골 세포 특이적 염색액인 Alcian blue 에 의해서 연골 세포의 세포외 기질(Matrix) 물질인 뮤신이 청색으로 염색되는 것을 확인하였다. 상기의 결과로 일 구체예에 따라 제조된 중간엽 줄기세포는 지방세포, 골세포, 연골세포로 분화할 수 있어 다분화능이 있음을 알 수 있다.
5. 단독 물질 처리에 따른 기간별 세포 형태 차이 분석
DNA 교정제와 ROCK 억제제 단독 처리에 따른 기간별 세포 형태 차이를 분석하기 위해 상기 실시예 1, 비교예 2 및 비교예 3의 세포의 세포 형태를 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 분석하였다. 대조군(Control)로서는 DNA 교정제와 ROCK 억제제를 모두 사용하지 않고 TGF-β 억제제인 SB431542를 단독처리한 것을 사용하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10은 일 구체예에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태 특성을 DNA 교정제와 ROCK 억제제 단독 처리에 따른 인간배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포의 세포 형태 특성과 비교한 사진이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 모든 그룹에서 소용돌이 형태의 중간엽 줄기세포 증식 형태가 나타났지만, 가장 먼저 중간엽 줄기세포 형태를 나타내면서 높은 수율을 나타낸 것은 일 구체예에 따른 중간엽 줄기세포(SB431542+RS1+Y27632)인 것을 알 수 있었다. 또한, SB431542+Y27632 또는 SB431542+RS1 처리시에는 약 30일 이상에서 중간엽 줄기세포로의 균일한 증식이 이루어지고, SB431542 단독처리한 대조군 그룹에서는 23일경에 크기가 큰 세포의 증식이 관찰되나, 30일경에 이르러서는 거의 소멸되고 다른 그룹과 마찬가지의 중간엽 줄기세포 형태의 세포가 나타나지만 균일성은 떨어지는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 중간엽 줄기세포의 제조 방법은 짧은 기간 내에 높은 수득률로 중간엽 줄기세포를 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 배상체 형상의 단계가 없어 제조 공정이 단순하고, 균질성을 갖는 세포를 수득할 수 있어 기존 방법보다 단축된 기간으로 세포 치료제의 제공이 가능하다는 것을 알 수 있었다.

Claims (30)

  1. DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 다능성 줄기세포의 중간엽 줄기세포 분화 유도용 배지 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 DNA 교정제는 3-[(벤질아미노)설포닐]-4-브로모-N-(4-브로모페닐)벤즈아미드(3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide), 또는 4-브로모-N-(4-브로모페닐)-3-[[(페닐메틸)아미노]설포닐]-벤즈아미드(4-Bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide)인 것인 배지 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), 4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥세인카복사마이드(4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide), 4-(1-아미노에틸)-N-(1H-피롤로(2,3-b)피리딘-4-일)시클로헥세인카복사마이드 디히드로클로라이드(4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo(2,3-b)pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride), N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-1,4,5,6-테트라히드로-2-메틸-6-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3-피리딘카복사마이드(N-(6-Fluoro-1H-indazol-5-yl)-1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-6-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3-pyridinecarboxamide), 및 1-(3-히드록시벤질)-3-[4-(피리딘-4-일)티아졸-2-일]요소(1-(3-Hydroxybenzyl)-3-[4-(pyridin-4-yl)thiazol-2-yl]urea), 2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로 -1H-1,4-디아즈핀 디히드로클로라이드(2-Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]-hexahydro-1H-1,4-diazepine dihydrochloride), N-[2-[2-(디메틸아미노)에톡시]-4-(1H-피라졸-4-일)페닐 -2,3-디히드로 -1,4-벤조디옥신 -2-카복사마이드 디히드로클로라이드(N-[2-[2-(Dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide dihydrochloride], 2-플루오로-N-[[4-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)페닐]메틸]벤젠메탄아민 디히드로클로라이드(2-Fluoro-N-[[4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)phenyl]methyl]benzenemethanamine dihydrochloride), N-[3-[[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸 -3-일)-1-에틸 -1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시]페닐]-4-[2-(4-모르포리닐)에톡시]벤즈아마이드(N-[3-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxy]phenyl]-4-[2-(4-morpholinyl)ethoxy]benzamide), (3S)-1-[[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조 [4,5-c]피리딘-7-일]카보닐]-3-피롤리딘아민 디히드로클로라이드((3S)-1-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-7-yl]carbonyl]-3-pyrrolidinamine dihydrochloride), N-[(1S)-2-히드록시-1-페닐에틸]-N'-[4-(4-피리디닐)페닐]-요소(N-[(1S)-2-Hydroxy-1-phenylethyl]-N'-[4-(4-pyridinyl)phenyl]-urea), 아자인돌-1(Azaindole-1), 및 나르시클라신(Narciclasine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, TGF-β 억제제를 더 포함하는 것인 배지 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 TGF-β 억제제는 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘(2-[3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물(4-(5-Benzol[1,3]dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)-benzamide hydrate), 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 및 4-[4-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(3,4-Methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide), 2-(3-(6-메틸피리딘 -2-일)-1H-피라졸 -4-일)-1,5-나프티리딘(2-(3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸 -4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-(1,1-디메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-6-메틸-피리딘(2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1- dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine), 2-(5-클로로 -2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프터리딘(2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)-4-[(4-pyridyl)amino]pteridine), 6-[2-터트-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일]-퀴녹살린(6-[2-tert-Butyl-5-(6-methyl-pyridin-2-yl)-1H-imidazol-4-yl]-quinoxaline), 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸 -1-에탄올(4-[2-Fluoro-5-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]phenyl]-1H-pyrazole-1-ethanol), 3-[[5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-(6-퀴녹살리닐)-1H-이미다졸-2-일]메틸]벤즈아마이드(3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]benzamide)로 이루어진 군으로 부터 선택된 어느 하나인 것인 배지 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 DNA 교정제는 5 μM 내지 20 μM 의 농도로 포함되는 것인 배지 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 5 μM 내지 20 μM 의 농도로 포함되는 것인 배지 조성물.
  8. 청구항 4에 있어서, 상기 TGF-β 억제제는 0.2 μM 내지 2.0 μM 의 저농도로 포함되는 것인 배지 조성물.
  9. 분리된 다능성 줄기세포를 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 다능성 줄기세포를 DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포를 제조하는 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 배양된 배아줄기세포를 TGF-β 억제제의 존재하에서 중배엽성 세포로 분화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 9에 있어서, 상기 분화 유도된 중간엽 줄기세포를 중간엽 줄기세포 성숙 배지에서 배양하는 단계; 또는 상기 성숙 배지에서 배양된 중간엽 줄기세포를 계대 배양하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 9에 있어서, 상기 분리된 다능성 줄기세포를 배양하는 단계는 지지세포의 부재 하에서 세포 부착 기능 강화제가 코팅된 배양 용기에서 배양하는 것인 방법.
  13. 청구항 9에 있어서, 배상체 형성 단계를 포함하지 않는 것인 방법.
  14. 청구항 9에 있어서, 상기 DNA 교정제는 3-[(벤질아미노)설포닐]-4-브로모-N-(4-브로모페닐)벤즈아미드(3-[(benzylamino)sulfonyl]-4-bromo-N-(4-bromophenyl)benzamide), 또는 4-브로모-N-(4-브로모페닐)-3-[[(페닐메틸)아미노]설포닐]-벤즈아미드(4-Bromo-N-(4-bromophenyl)-3-[[(phenylmethyl)amino]sulfonyl]-benzamide)인 것인 방법.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 파수딜(Fasudil), 리파수딜(Ripasudil), 4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)시클로헥세인카복사마이드(4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide), 4-(1-아미노에틸)-N-(1H-피롤로(2,3-b)피리딘-4-일)시클로헥세인카복사마이드 디히드로클로라이드(4-(1-aminoethyl)-N-(1H-pyrrolo(2,3-b)pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride), N-(6-플루오로-1H-인다졸-5-일)-1,4,5,6-테트라히드로-2-메틸-6-옥소-4-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-3-피리딘카복사마이드(N-(6-Fluoro-1H-indazol-5-yl)-1,4,5,6-tetrahydro-2-methyl-6-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3-pyridinecarboxamide), 및 1-(3-히드록시벤질)-3-[4-(피리딘-4-일)티아졸-2-일]요소(1-(3-Hydroxybenzyl)-3-[4-(pyridin-4-yl)thiazol-2-yl]urea), 2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]-헥사히드로 -1H-1,4-디아즈핀 디히드로클로라이드(2-Methyl-1-[(4-methyl-5-isoquinolinyl)sulfonyl]-hexahydro-1H-1,4-diazepine dihydrochloride), N-[2-[2-(디메틸아미노)에톡시]-4-(1H-피라졸-4-일)페닐 -2,3-디히드로 -1,4-벤조디옥신 -2-카복사마이드 디히드로클로라이드(N-[2-[2-(Dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide dihydrochloride], 2-플루오로-N-[[4-(1H-피롤로[2,3-b]피리딘-4-일)페닐]메틸]벤젠메탄아민 디히드로클로라이드(2-Fluoro-N-[[4-(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridin-4-yl)phenyl]methyl]benzenemethanamine dihydrochloride), N-[3-[[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸 -3-일)-1-에틸 -1H-이미다조[4,5-c]피리딘-6-일]옥시]페닐]-4-[2-(4-모르포리닐)에톡시]벤즈아마이드(N-[3-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-6-yl]oxy]phenyl]-4-[2-(4-morpholinyl)ethoxy]benzamide), (3S)-1-[[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-1H-이미다조 [4,5-c]피리딘-7-일]카보닐]-3-피롤리딘아민 디히드로클로라이드((3S)-1-[[2-(4-Amino-1,2,5-oxadiazol-3-yl)-1-ethyl-1H-imidazo[4,5-c]pyridin-7-yl]carbonyl]-3-pyrrolidinamine dihydrochloride), N-[(1S)-2-히드록시-1-페닐에틸]-N'-[4-(4-피리디닐)페닐]-요소(N-[(1S)-2-Hydroxy-1-phenylethyl]-N'-[4-(4-pyridinyl)phenyl]-urea), 아자인돌-1(Azaindole-1), 및 나르시클라신(Narciclasine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  16. 청구항 9에 있어서, 상기 TGF-β 억제제는 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-1,5-나프티리딘(2-[3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-1,5-naphthyridine), 4-(5-벤졸[1,3]디옥솔-5-일-4-피리딘-2-일-1H-이미다졸-2-일)-벤즈아미드 수화물(4-(5-Benzol[1,3]dioxol-5-yl-4-pyridin-2-yl-1H-imidazol-2-yl)-benzamide hydrate), 4-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-5-(2-피리디닐)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 및 4-[4-(3,4-메틸렌디옥시페닐)-5-(2-피리딜)-1H-이미다졸-2-일]-벤즈아마이드 수화물(4-[4-(3,4-Methylenedioxyphenyl)-5-(2-pyridyl)-1H-imidazol-2-yl]-benzamide hydrate), 3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아마이드(3-(6-Methyl-2-pyridinyl)-N-phenyl-4-(4-quinolinyl)-1H-pyrazole-1-carbothioamide), 2-(3-(6-메틸피리딘 -2-일)-1H-피라졸 -4-일)-1,5-나프티리딘(2-(3-(6-Methylpyridine-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)-1,5-naphthyridine), 4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸 -4-일]-퀴놀린(4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]-quinoline), 2-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-(1,1-디메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-6-메틸-피리딘(2-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-2-(1,1- dimethylethyl)-1H-imidazol-5-yl]-6-methyl-pyridine), 2-(5-클로로 -2-플루오로페닐)-4-[(4-피리딜)아미노]프터리딘(2-(5-Chloro-2-fluorophenyl)-4-[(4-pyridyl)amino]pteridine), 6-[2-터트-부틸-5-(6-메틸-피리딘-2-일)-1H-이미다졸-4-일]-퀴녹살린(6-[2-tert-Butyl-5-(6-methyl-pyridin-2-yl)-1H-imidazol-4-yl]-quinoxaline), 4-{4-[3-(피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일]-피리딘-2-일}-N-(테트라히드로-2H-피란-4-일)벤즈아마이드 수화물(4-{4-[3-(Pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl]-pyridin-2-yl}-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide hydrate), 4-[2-플루오로-5-[3-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]페닐]-1H-피라졸 -1-에탄올(4-[2-Fluoro-5-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]phenyl]-1H-pyrazole-1-ethanol), 3-[[5-(6-메틸-2-피리디닐)-4-(6-퀴녹살리닐)-1H-이미다졸-2-일]메틸]벤즈아마이드(3-[[5-(6-Methyl-2-pyridinyl)-4-(6-quinoxalinyl)-1H-imidazol-2-yl]methyl]benzamide)로 이루어진 군으로 부터 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  17. 청구항 10에 있어서, 상기 TGF-β 억제제의 존재하에서 중배엽성 세포로 분화시키는 단계는 TGF-β 억제제를 함유하는 배지에서 2일 내지 7일 동안 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  18. 청구항 9에 있어서, 상기 배지에서 분화 유도하는 단계는 DNA 교정제, ROCK 억제제, 및 TGF-β 억제제를 함유하는 배지에서 1일 내지 2일 동안 분화 유도하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 상기 성숙 배지에서 배양하는 단계는 트립신을 처리하는 단계; DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 성숙 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 성숙 배지에서 배양된 세포를 원심분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  20. 청구항 11에 있어서, 상기 계대 배양하는 단계는 세포 부착 기능 강화제가 코팅된 배양 용기에서 트립신의 존재하에서 계대 배양하는 것인 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 계대 배양은 1 내지 10 계대까지 수행되는 것인 방법.
  22. 청구항 11에 있어서, 상기 계대 배양은 탈락된 비중배엽성 줄기세포를 제거하고, 중배엽성 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  23. 청구항 9에 있어서, 상기 다능성 줄기세포는 핵 이식 다능성 줄기세포(NT-hPSC), 반수성체-유래 다능성 줄기세포(pn-hPSC), 역분화 만능 줄기세포(iPSC), 또는 배아줄기세포(ESC)인 것인 방법.
  24. 청구항 9에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포로 분화 유도하는 단계에서 상기 중간엽 줄기세포는 미성숙 중간엽 줄기세포이고, 상기 미성숙 중간엽 줄기세포를 경유하여 중간엽 줄기세포가 제조되는 것인 방법.
  25. 청구항 24에 있어서, 상기 미성숙 중간엽 줄기세포는 혈액-혈관 형성 전구세포(Hemangioblast)의 마커인 VEGFR2에 대하여 세포 집단의 10% 이하로 발현하여, 혈액-혈관 형성 전구세포를 경유하지 않는 것인 방법.
  26. 청구항 9에 있어서, 상기 제조된 중간엽 줄기세포는 세포 집단의 70% 이상이 마커 CD29, CD44, CD90, 또는 CD105에 대하여 양성이며, 세포 집단의 10% 이하가 마커 TRA-160, CD34, 또는 VEFGR2에 대하여 음성인 것인 방법.
  27. 청구항 9에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 조혈모세포, 근육세포, 심근세포, 간 세포, 연골세포, 상피 세포, 비뇨기관 세포, 신장세포, 혈관세포, 망막세포 및 뉴런 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분화능을 갖는 것인 방법.
  28. DNA 교정제(DNA repair agent) 및 ROCK(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase) 억제제의 존재하에서 분화 유도된 다능성 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 세포 집단의 70% 이상이 마커 CD29, CD44, CD90, 또는 CD105에 대하여 양성이며, 세포 집단의 10% 이하가 마커 TRA-160, CD34, 또는 VEFGR2에 대하여 음성인 것인 세포.
  30. 청구항 9의 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 적어도 3계대 이상 계대 배양하는 단계로서, 세포 치료제 적용을 위한 분화 유도 및 배양 기간이 다능성 줄기세포로부터 20일 내지 40일인 것인 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제조하는 방법.
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