CN110804586B - 一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及试剂盒 - Google Patents

一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及试剂盒，属于细胞培养技术领域。诱导培养基以α‑MEM为基础培养基，还包括血小板提取物、SB431542和CHIR99021。临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：将人诱导多能干细胞消化制成单细胞悬浮液，接种至预处理的培养板上；待细胞达到80％汇合度时用诱导培养基进行诱导培养，每天换液；待细胞达100％汇合度时消化制成单细胞悬液，接种至扩增培养基上进行扩增培养3～4代后得到临床级间充质干细胞。本发明提供的方法制备的间充质干细胞为临床应用提供来源统一、供应稳定和特征一致的间充质干细胞来源。

Description

一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及 试剂盒
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及试剂盒。
背景技术
间充质干细胞(MSC,mesenchymal stem cells)是来源于胚胎发育早期的中胚层和外胚层的一种细胞类群，具有多向分化潜能和较低的免疫原性，在再生医学、医学保健、美容等领域被广泛使用。目前间充质干细胞主要来源于脐带、脂肪、骨髓等组织，传代次数有限，且不同供体来源的间充质干细胞存在个体差异性，难以满足临床应用对稳定、性能一致的细胞来源的需求。此外，间充质干细胞移植进入体内，可分化成多种终末细胞类型，在分化过程中，细胞的HLA抗原得以表达。因此，虽然间充质干细胞本身具有免疫耐受性，但在间充质干细胞移植一段时期后，仍有可能产生免疫排斥反应。
目前，间充质干细胞的来源可通过采用人多能干细胞(PSC)诱导得到。人多能干细胞通常指人胚胎干细胞(ESC)和人诱导多能干细胞(iPS)，具有无限自我更新和分化成个体全部细胞类型的能力。目前，从ESC和iPS诱导分化为MSC的方法很多，例如公开号CN106520687 A的专利公开了含血小板衍生因子(PDGFAB)、地塞米松和10％胎牛血清(FBS)的培养基作为分化培养基，用于诱导多能干细胞分化为间充质干细胞，结果表明由iPS细胞分化的MSC在体外培养过程中能很好地进行自我更新和增殖，且具有成骨、成脂和软骨分化能力。但该培养方法需要更换两种不同的分化培养基，且分化得到的间充质干细胞不能用于临床。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的诱导培养基，所述诱导培养基诱导得到的间充质干细胞可用于临床。
本发明的目的还在于提供一种用于人诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的试剂盒，所述试剂盒在生产临床级MSC的过程中使用。
本发明的目的还在于提供一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法。
本发明提供了一种人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化的诱导培养基，以α-MEM培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积浓度5％～10％的人血小板提取物、5～10μmol/L的SB431542和1～5μmol/L的CHIR99021。
优选的，包括以下组分：体积浓度10％的血小板提取物、10μmol/L的SB431542和2μmol/L的CHIR99021。
本发明提供了一种用于人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化的试剂盒，包括所述的诱导培养基。
优选的，所述试剂盒还包括用于间充质干细胞扩增培养的扩增培养基；
所述间充质干细胞扩增培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包含体积浓度5％～10％的人血小板提取物。
本发明提供了所述诱导培养基或所述试剂盒在人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化中的应用。
本发明提供了一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将人诱导多能干细胞消化制成单细胞悬浮液，接种至的预处理的培养板上；
2)待细胞达到80％汇合度时，用所述诱导培养基进行诱导培养，每天换液；
3)待细胞达100％汇合度时，消化制成单细胞悬液，接种至扩增培养基上进行扩增培养，所述扩增培养3～4代后得到的细胞为临床级间充质干细胞。
优选的，步骤1)或步骤3)中消化用试剂为TrypLE select。
优选的，步骤1)中预处理的培养板中预处理的方法是将包被液添加到培养板中，进行孵育包被，得到预处理的培养板；
所述包被液以含有钙和镁离子的DPBS液为基础溶液，还包括Laminin521、Laminin511、Geltrax或Vitronectin；所述Laminin 521、Laminin511、Geltrax或Vitronectin的浓度为5μg/mL；
所述孵育包被包括在2～8℃冰箱孵育过夜或在37℃条件下孵育1～2h。优选的，步骤1)或步骤3)中所述接种时细胞的密度优选为1～5×104/cm2。优选的，步骤2)中诱导培养或步骤3)中扩增培养的温度为37℃，所述步骤2)中诱导培养或步骤3)中扩增培养时CO2的体积浓度为5％。
本发明提供了一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法，利用GMP级试剂作为分化诱导培养基成分，同时采用临床级细胞培养方法，能够高效的将临床级人诱导多能干细胞定向分化为间充质干细胞，阳性特征标志物的表达高达90％以上，阴性标志物则无表达；在体外可分化为骨、软骨、脂肪等细胞类型。本发明提供的方法制备的间充质干细胞为临床应用提供来源统一、供应稳定和特征一致的间充质干细胞来源。
附图说明
图1为不同分化方法在不同时间的细胞形态(40×)，图中各比例尺均为100μm；
图2为不同分化方法，P4代细胞间充质干细胞特异表面标志物表达情况比较结果，其中图2-1为CD105、CD73和CD90的表达情况，图2-2为CD11、CD19和CD34的表达情况；图2-3为CD45和HLA-DR的表达情况；
图3为不同分化方法培养的P5代细胞间充质干细胞的成骨、成软骨和成脂分化能力比较结果；图中各比例尺为100μm；
图4为采用本发明提供的分化方法制备的不同代次细胞在抗炎性细胞因子IL-10、PGE2和IDO和促炎性细胞因子IL-6和TGFβ的mRNA表达水平的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化的诱导培养基，以α-MEM培养基为基础培养基，还包括以下组分：体积浓度5～10％的人血小板提取物、5～10μmol/L的SB431542和1～5μmol/L的CHIR99021。
本发明提供的诱导培养基以α-MEM培养基为基础培养基。所述α-MEM培养基的配方和制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的α-MEM培养基的配方和制备方法即可。在本发明实施例中，所述α-MEM培养基购自Thermo Scientific公司。
本发明提供的诱导培养基包括人血小板提取物。所述人血小板提取物的体积浓度优选为10％。所述人血小板提取物属于GMP级血清替代物，作用如下：含有丰富的细胞生长和增殖所需的生长因子和细胞因子，可替代胎牛血清(FBS)用于培养脂肪源性(AD)、骨髓(BM)或脐带(UC)间充质干细胞(MSCs)。在诱导培养基中，为MSC提供基础生长环境的培养基。本发明对所述人血小板提取物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的人血小板提取物即可。在本发明实施例中，所述人血小板提取物购自UltraGROTM-Advanced，Cat#HPCFDCGL50，HeliosBioScience。
本发明提供的诱导培养基包括SB431542。所述SB431542的浓度优选为10μmol/L。所述SB431542的作用是作为TGF-β、ALK4和ALK7的抑制剂，具有诱导人多能干细胞向中外胚层分化的能力。本发明对所述SB431542的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的SB431542的来源即可。所述SB431542购自Tocris，货号：TB1614-GMP。
本发明提供的诱导培养基包括CHIR99021。所述CHIR99021的浓度优选为2μmol/L。所述CHIR99021作为GSK-3β的抑制剂使用，能够激活Wnt3a信号，从而诱导人多能干细胞向中内胚层分化。所述CHIR99021和SB431542联用，在合适的浓度和作用时间下，可诱导人多能干细胞分化为中胚层细胞，并进一步形成间充质干细胞，较其他组合方案诱导效果具有明显的优势。本发明实施例中，所述CHIR99021购自Tocris，货号为TB4423-GMP。
在本发明中，所述诱导培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的诱导培养方法即可。
本发明提供了一种用于人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化的试剂盒，包括所述的诱导培养基。所述试剂盒还优选包括用于间充质干细胞扩增培养的扩增培养基；所述间充质干细胞扩增培养基以α-MEM培养基为基础培养基，还包含体积浓度5％～10％的人血小板提取物，更优选为10％的人血小板提取物。所述诱导培养基和扩增培养基独立分装。本发明对所述试剂盒中诱导培养基和扩增培养基的体积没有特殊限制要求。
本发明提供了所述诱导培养基或所述试剂盒在人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化中的应用。
本发明提供了一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：
1)将人诱导多能干细胞消化制成单细胞悬浮液，接种至的预处理的培养板上；
2)待细胞达到80％汇合度时，用所述诱导培养基进行诱导培养，每天换液；
3)待细胞达100％汇合度时，消化制成单细胞悬液，接种至所述扩增培养基上进行扩增培养，所述扩增培养3～4代后得到的细胞为临床级间充质干细胞。
本发明将人诱导多能干细胞消化制成单细胞悬浮液，接种至的预处理的培养板上。
在本发明中，人诱导多能干细胞的制备方法为分离提取脐带血单核细胞，并使用仙台病毒或脂质体载体，将Yamanaka转录因子转入脐带血单核细胞，得到诱导多能干细胞。获得的人诱导多能干细胞在体外培养时，可无限自我更新，且通过诱导后，可分化为内胚层、中胚层、外胚层特异的细胞类型。注射到裸鼠体内，可形成具备三胚层结构特征的畸胎瘤。
在本发明中，所述消化用试剂优选为TrypLE select。所述接种时细胞的密度优选为1～5×104/cm2，更优选为2～3×104/cm2。
在本发明中，预处理的培养板中预处理的方法优选是将包被液添加到培养板中，进行孵育包被，得到预处理的培养板；所述包被液以含有钙和镁离子的DPBS液为基础溶液，还包括Laminin 521、Laminin511、Geltrax或Vitronectin；所述Laminin 521、Laminin511、Geltrax或Vitronectin的浓度为5μg/mL。所述Laminin 521、Laminin511、Geltrax或Vitronectin处理培养板后有利于提高人诱导多能干细胞贴壁生长。所述孵育包被优选包括两种孵育方法，其一是在2～8℃冰箱孵育过夜，其二是在37℃条件下孵育1～2h。孵育包被结束后弃去包被液。所述基础溶液购自Gibco公司。
待细胞达到80％汇合度时，用所述诱导培养基进行诱导培养，每天换液。
在本发明中，所述诱导培养的温度优选为37℃。所述诱导培养时CO2的体积浓度优选为5％。所述细胞达到80％汇合度时一般需要3～4d。
待细胞达100％汇合度时，消化制成单细胞悬液，接种至所述扩增培养基上进行扩增培养，所述扩增培养3～4代后得到的细胞为临床级间充质干细胞。
在本发明中，所述消化用试剂优选为TrypLE select。扩增培养接种时细胞浓度优选为1～5×104/cm2。更优选为5×104/cm2。所述扩增培养的温度优选为37℃。所述扩增培养时CO2的体积浓度优优选为5％。在3～4代扩增培养过程中，接种密度优选为1～2×104/cm2。
在本发明中，对制备的临床级间充质干细胞检测8种特异表面标志物(包括3种阳性标志物和5个阴性标志物)表达情况，结果发现MSC的阴性标志物均无表达，MSC阳性标志物CD105、CD73的比例均大于95％。而对于CD90来说，采用本发明提供的诱导培养基进行分化，间充质干细胞表达的CD90表达比例达到89.4％，显著高于其他两个对照组。同时临床级间充质干细胞在成脂、成骨、成软骨分化方面实验结果表明，采用本发明提供的方法得到的间充质干细胞具有较好的成脂、成骨、成软骨等分化能力。
下面结合实施例对本发明提供的一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
MSC诱导培养基的配方(简称M+S+C2)：
1L α-MEM基础培养基中含10％人血小板提取物、10μmol/L SB431542和2μmol/LCHIR99021。经过常规灭菌后得到MSC诱导培养基。
实施例2
MSC诱导培养基的配方：
1Lα-MEM基础培养基中含10％人血小板提取物、5μmol/L SB431542和5μmol/LCHIR99021。经过常规灭菌后得到MSC诱导培养基。
实施例3
MSC诱导培养基的配方：
1L α-MEM基础培养基中含10％人血小板提取物、10μmol/L SB431542和2μmol/LCHIR99021。经过常规灭菌后得到MSC诱导培养基。
实施例4
一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法
1)人iPS细胞用TrypLE select消化成单细胞，按照1×104/cm2接种到Laminin 521(可选Laminin511、Geltrax、Vitronectin等)包被的培养板中；此处laminin 521包被：提前一天用含有钙和镁离子的DPBS稀释Laminin521至终浓度为5μg/mL，加入到培养板中，放2～8℃冰箱孵育过夜后使用。在使用前，将Laminin包被液弃掉。
2)培养4天后，待细胞达到80％汇合度时，更换为实施例1～3制备的MSC诱导培养基，每天换液；
3)诱导培养10天后，待细胞达到100％汇合度时，用TryPLE express消化细胞成单细胞，按照5×104/cm2接种到培养皿，培养在MSC扩增培养基中，记为P0。
4)待细胞达到80％汇合度时，用TryPLE express消化细胞成单细胞，按照2×104/cm2接种到培养皿，培养在MSC扩增培养基中，记为P1。
5)待细胞达到80％汇合度时，用TryPLE express消化细胞成单细胞，按照1×104/cm2接种到培养皿，培养在MSC扩增培养基中，记为P2。
6)此后，每次传代，均按照1×104/cm2进行接种。
7)≥P3代的细胞可用于后续实验或冻存。
对比例1
MSC诱导培养基的配方(简称M)：
1Lα-MEM基础培养基中含10％人血小板提取物。经过过滤除菌后得到MSC诱导培养基。按照实施例3的方法诱导间充质干细胞。
对比例2
MSC诱导培养基的配方(简称M+B+S+C2)：
1L α-MEM基础培养基中含10％人血小板提取物、2％B27、10μmol/L SB431542和2μmol/L CHIR99021。经过过滤除菌后得到MSC诱导培养基。按照实施例3的方法诱导间充质干细胞。
实施例5
将实施例3诱导得到的间充质干细胞、对比例1诱导得到的间充质干细胞以及对比例2诱导得到的间充质干细胞在光学显微镜下观察细胞形态，结果见图1，其中D10是iPS加了诱导培养基培养10天时拍的照片；P0-D9表示P0代的细胞培养9天时拍的照片，P1-D6表示P1代的细胞培养6天时拍的照片，P3-D4表示P3代的细胞培养4天时拍的照片，P4-D3表示P4代的细胞培养3天时拍的照片。
由图1可知，本发明提供的诱导培养基(M+S+C2)，在P0时，细胞形态更为均一(P0-D9)，且以同样密度进行传代时，细胞增殖更快(P1-D6、P3-D4)，对比例2中使用的诱导培养基(M+B+S+C2组)诱导得到的细胞胞体较前两组(M+S+C2组和M组)明显变大，由于胞体越大，增殖越慢，胞体变大不利于细胞增殖。现有技术中有关于B27添加到α-MEM+血小板提取物培养基中用于诱导间质干细胞的分化，但是本实施例结果表明B27的添加不利于间质干细胞的增殖分化。
实施例6
将实施例3诱导得到的间充质干细胞、对比例1诱导得到的间充质干细胞以及对比例2诱导得到的间充质干细胞检测8种特异性表面标志物表达情况，具体的阳性标志物：CD105、CD73、CD90；阴性标志物：CD11、CD19、CD34、CD45、HLA-DR。CD105、CD73、CD90、CD11、CD19、CD34、CD45、HLA-DR等8种标志物的流式直标荧光抗体均购自R&D system。具体的，将P4代的MSC细胞经消化成单细胞后，与以上8种标志物抗体分别混匀，室温避光孵育30分钟后，用磷酸盐缓冲液洗涤2次，上流式细胞仪检测标志物表达比例。
结果见图2。图2为不同分化方法，P4代细胞间充质干细胞特异表面标志物表达情况比较。
结果表明，三种诱导培养基分化的MSC，阴性标志物均无表达，同时MSC阳性标志物CD105、CD73的比例均大于95％。而对于CD90来说，方案M+S+C2诱导的MSC中CD90表达比例达到89.4％，显著高于其余两组(M：50.8％；M+B+S+C2：35.1％)。由此可见，方案M+S+C2的诱导培养基对于诱导多能干细胞向间充质干细胞的分化，更为有效。
实施例7
分别采用M培养基、M+S+C2培养基和M+B+S+C2培养iPS-MSC，将P5代的iPS-MSC，按照StemProTM Chondrogenesis Differentiation Kit(Gibco，A1007101)的说明书进行成软骨分化，并采用阿利新蓝染色对软骨进行染色。按照StemProTM AdipogenesisDifferentiation Kit(A1007001)的说明书进行成脂分化，并采用油红O染色液对脂肪细胞进行染色。按照StemProTM Osteogenesis DifferentiationKit(Gibco，A1007201)的说明书进行成骨分化，并采用茜素红染液对成骨细胞进行染色。
结果见图3。由图3可知，三组细胞，成软骨和成脂分化能力无明显差别，而M+S+C2组的细胞成骨分化能力明显优于其他分组的细胞。
实施例8
收集M+S+C2培养基培养的不同代次(P3、P6、P9)的细胞，分别采用RNA simple总RNA提取试剂盒(天根，DP491)抽提总RNA，采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(天根，KR118)进行反转录，采用
Figure BDA0002291175900000092
qPCR and RT-qPCR Systems(Promega，A6001)进行qRT-PCR分析，反应体系如下：Go Taq qPCR MasterMix(2×)10μL，10μM正向引物0.2μL，10μM反向引物0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 8.6μL，总量20μL；反应程序如下：预变性：95℃，10min；95℃，20s；60℃，30s；72℃，30s，共40次循环。检测抗炎性细胞因子IL-10、PGE2和IDO和促炎性细胞因子IL-6和TGFβ的mRNA表达水平的变化，相关引物序列见表1。
表1引物核苷酸序列信息
Figure BDA0002291175900000091
Figure BDA0002291175900000101
结果如图4所示。抗炎因子IL-10、PGE2和IDO等表达水平随着传代次数的增加，表达基本不变(P＞0.05)。而促炎症细胞因子IL-6和TGFβ的表达水平则随着传代次数的增加，逐渐下降(*P≤0.05)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海市东方医院（同济大学附属东方医院）
<120> 一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法及试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggccagatcc tgtccaagc 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgggtttcc accattagca c 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctgaacctt ccaaagatgg c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcaccaggc aagtctcctc a 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccagcttcg agaaagagtt g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcccagaac tagacgtgca a 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgatgctcat gctcttcgc 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggagactgc atagatgaca gg 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gactttaagg gttacctggg ttg 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcacatgcgc cttgatgtct g 21

Claims (5)

1.一种临床级人诱导多能干细胞源间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将人诱导多能干细胞消化制成单细胞悬浮液，接种至预处理的培养板上；
2)待步骤1)中得到的细胞达到80％汇合度时，用人诱导多能干细胞向临床级间充质干细胞分化的诱导培养基进行诱导培养，每天换液；
所述诱导培养基，以α-MEM培养基为基础培养基，添加以下组分：体积浓度5％～10％的人血小板提取物、5～10μmol/L的SB431542和1～5μmol/L的CHIR99021；
3)待步骤2)中得到的细胞达100％汇合度时，消化制成单细胞悬液，接种至间充质干细胞扩增培养基上进行扩增培养，所述扩增培养3～4代后得到的细胞为临床级间充质干细胞；
所述扩增培养基以α-MEM培养基为基础培养基，添加体积浓度5％～10％的人血小板提取物；
步骤1)或步骤3)中所述接种时细胞的密度为1×104～5×104/cm2。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)或步骤3)中消化用试剂为TrypLEselect。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤1)中预处理的培养板预处理的方法是将包被液添加到培养板中，进行孵育包被，得到预处理的培养板；所述包被液以含有钙和镁离子的DPBS液为基础溶液，还包括Laminin521、Laminin511或Vitronectin；所述Laminin521、Laminin511或Vitronectin的浓度为5μg/mL；
所述孵育包被包括在2～8℃冰箱孵育过夜或在37℃条件下孵育1～2h。
4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤2)中诱导培养或步骤3)中扩增培养的温度为37℃，所述步骤2)中诱导培养或步骤3)中扩增培养时CO2的体积浓度为5％。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述诱导培养基中添加的组分浓度如下：体积浓度10％的血小板提取物、10μmol/L的SB431542和2μmol/L的CHIR99021。
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