KR20220016846A - 만능세포 응집체 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 비-인간-동물로부터 유래된 만능줄기세포를, 특히 다양한 용도에 적합한 응집체 형태로 대량 생산하기 위한 조성물 및 방법, 구체적으로 세포 배양 육류 배양물 및 세포기반 육류 제품의 생산에 사용하기 위한 소-유래된 만능줄기세포 응집체의 대량 생산에 관한 것이다.
Description
본 발명은 비-인간-동물로부터 유래된 만능줄기세포(pluripotent stem cell)를, 특히 다양한 용도에 적합한 응집체(aggregate) 형태로 대량 생산하기 위한 조성물 및 방법, 구체적으로 세포 배양 육류 배양물(cell grown meat culture) 및 세포기반 육류 제품의 생산에 사용하기 위한 소-유래된 만능 줄기세포 응집체의 대량 생산에 관한 것이다.
가축 성장(growth)을 지원하기 위해 많은 소모성 자원, 특히 물, 곡물, 토지 및 에너지를 포함하여 육류 생산용 소가 이용된다. 세계의 급속하게 증가하는 인구는 상기 귀중한 자산의 사용을 더욱 증가시킬 것이다. 따라서 전체 인구를 먹여 살리는 데 필요한 소의 양을 줄이는 방식으로 육류 및 육류 제품을 생산하는 것이 가장 바람직하다. 주요 육류 공급원으로서의 소를 대체하는 것은 또한 소를 대상으로 모여드는 거주자 및 때때로 병에 걸리는 부적합한 상태를 방지할 것이기 때문에 윤리적으로 유익하다. 이러한 이유로 세포 배양 육류 제품(cell grown meat product)은 인도주의적 이유로 육류를 섭취하지 않는 사람들이 잠재적으로 소비할 수도 있다. 세포 기반 육류(배양육(cultured meat), 배양육(cultivated meat), 세포 배양육(cell grown meat), 청정육, 가공육, 시험관 육류 등이라고도 함)는 소비된 식품 함량을 제어하는 방법이기도 하며; 오늘날, 많은 소에게 성장 호르몬이 투여되고 있고, 이는 결국 소비자 접시에 올라간다. 또한, 배양육을 생산하면 단백질 함량, 지방량 및 조성, 철, 비타민 B12, 아연 수치 등의 조절을 통해 육류의 영양가를 개선하고 더 건강하게 만들 수 있다. 또한 엄격한 규제 및 깨끗한 조건하의 생물 반응기(또는 기타 배양 시스템)에서 생산된 육류의 소비는 미생물 오염을 전염시킬 가능성이 적으므로 소비하기에 더 안전하다.
만능줄기세포(PSC)는 신체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 유지하면서 분열하여 자기-재생 능력을 갖는 세포이다. 배아줄기세포(ESC)와 유도만능줄기세포(iPSC)가 모두 만능줄기세포이다. ESC는 전형적으로 착상전 배반포의 내부 세포 덩어리에 있는 세포 집단에서 유래된다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 그의 다능성 특성을 회복하기 위해 재프로그램화된 체세포 분화된 세포에서 생성되는 PSC의 한 유형이다. 문헌[Bogliotti et al., PNAS. 2018 11(9): 2090-2095]은 섬유아세포 성장 인자 2(염기성 섬유아세포 성장 인자, bFGF로도 알려짐) 및 표준 Wnt-신호전달 경로(signaling pathway)의 억제제를 함유하는 배양 시스템(culture system)의 사용에 의해, 안정적인 형태, 전사체, 핵형, 집단-배가 시간, 다능성 마커 유전자 발현 및 후성적 특징을 갖는 만능 소 ESC(bESCs)가 유래됨을 기재하였다.
iPSC로의 재프로그램화 세포는 2006년에 타카하시와 야마나카에 의해 최초로 기재되었다(Takahashi and Yamanaka, Cell 2006, 126: 663-76). 이후, 다수의 간행물이 다수 종의 다양한 세포 유형으로부터 줄기세포를 iPSC로 재프로그램화함을 기재하였다(Yu et al., Science 2007, 318: 1917-20; Takahashiet et al., Cell 2007, 131:861-72; Ogorerc et al. J Anim Sci Biotechnol 2016, 7:10; Ezashi et al., Annu Rev Anim Biosci. 2016, 4:223-53). 소에서, 레트로바이러스/렌티바이러스 형질도입, 다중-프로모터 플라스미드 및 piggyBac 트랜스포손 시스템을 포함한 여러 방법에 의한 재프로그램화 인자의 조합을 사용하여 섬유아세포를 iPSC로 재프로그램화하였다(Ogorevc 2016 ibid; Han et al, Cell Res. 2011, 21: 1509-12; Huang et al., Plos One 2011, 6:e24501; Cao et al., Int J Biol Sci. 2012, 8: 498-511; Talluri et al., Cell Reprogram. 2015, 17: 131-40; Ezashi et al. 2016, ibid). 농장 동물 종에서 세포를 재프로그램화하는데(Ogorevc 2016, ibid) 보다 최신의 방법(예를 들어 비-통합 바이러스- 또는 비-통합 에피솜 벡터 또는 mRNA-기반 방법)이 사용되었다는 보고는 없다. 소 세포에서 mRNA, 소분자 및 단백질을 재프로그램화 인자로 사용하는 것은 입증되지 않았다.
국제특허출원 공보 제 WO 1999/031223 호는 인간 및/또는 동물 소비에 적합한 3차원 동물 근육 조직을 제공하기 위해 동물 세포를 시험관내에서 산업적 규모로 배양한 다음, 선택적으로 뼈 제거, 내장 및/또는 힘줄 및/또는 연골 및/또는 지방 제거를 필요로 하지 않는 육류 포함 식품에 대해 공지된 공정과 유사한 최종 식품으로의 추가의 세포 배양물 가공 단계를 포함하는 육류 제품의 생산 공정을 개시한다. 바람직하게는, 상기 육류 제품은 고형화된 세포 조직을 포함하고, 상기 세포는 근육 세포, 체절 세포 및 줄기 세포 중에서 선택된다. 고형화된 세포 조직을 포함하는 육류 제품이 또한 제공된다.
국제특허출원 공보 제 WO 2006/041429 호 및 미국특허 제 6,835,390 호는 비-인간 조직 가공육 제품 및 상기와 같은 육류 제품의 생산 방법을 개시한다. 상기 육류 제품은 생체외에서 증식(growing)되고 식품 소비에 사용되는 근육 세포를 포함한다.
국제특허출원 공보 제 WO 2010/017562 호는 iPSC, 이를 함유하는 조성물, iPSC의 수득 방법, 및 iPSC의 사용 방법을 제공한다. 또한, 생체내에서 조직(예를 들어 심혈관 조직)을 수복하기 위해 iPSC를 사용하는 방법 및 물질뿐만 아니라 적합한 동물 모델에서 치료학적 가능성을 평가하기 위해 상기와 같은 세포를 사용하는 방법 및 물질을 제공한다.
국제특허출원 공보 제 WO 2013/188679 호는 iPSC의 제조 방법을 개시하며, 여기에서 mRNA 및 miRNA의 조합을 세포내로 도입시킨다.
국제특허출원 공보 제 WO 2015/066377 호는 동물 종의 자기-재생 세포주를 근원성 전사 인자로 변형시켜 근원성-전사-인자-변형 세포주를 생성시킴을 포함하는 배양된 근육 조직의 생성 방법을 개시한다.
국제특허출원공보 제 WO 2018/011805 호는 세포 증식용 생물반응기 챔버를 포함하는 세포 증식 시스템을 개시한다. 상기 출원은 무-혈청 배지에서 섬유아세포를 지방세포로 전환시키기에 적합한 조건하에서 및/또는 섬유아세포를 근세포로 전환시키기 적합한 조건하에서 자발적으로 불멸화된 섬유아세포를 배양하여, 식용 고기를 생성시킴을 포함하는 식용 고기의 시험관내 생성 방법을 추가로 개시한다.
국제특허출원공보 제 WO 2019/016795 호는 3차원 다공성 스캐폴드 및 다수의 세포 유형을 배양하고 근관으로의 근아세포 분화를 유도함을 포함하는 식용 조성물의 생성 방법을 개시한다. 상기 다수의 세포 유형은 근아세포 또는 그의 전구세포, 적어도 한 가지 유형의 세포외(ECM)-분비 세포 및 내피세포 또는 그의 전구세포를 포함한다.
본원의 우선일 이후에 공개된 국제특허출원 공보 제 2019/140260 호는 유제류(ungulate) 가축의 유전자 가공뿐만 아니라 게놈 시험 및 선택, 및 인간 질병 연구를 위한 실험 도구로서 유용한, 이식-전 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 유제류 배아줄기세포(ESC) 또는 배로부터 유래된 만능세포를 수득하는 방법을 개시한다.
미국특허 제 9,944,894 호는 줄기세포 및/또는 분화된 세포를 포함하는 세포 응집체의 확대 및 계대배양을 위한 진동 플랫폼 생물반응기상의 폐쇄된 시스템을 개시한다. 또한, 폐쇄된 시스템이 연관된 다능성 마커 및 분화 가능성과 함께 만능줄기세포 및/또는 그의 자손의 일련의 계대 확대를 허용하는 방법을 개시하였다.
미국특허 제 9,834,749 호는 인간 배아줄기세포(ESC)를 기질 부착이 없는 배양 조건하에서 현탁 배양액 중에서 배양함으로써 상기 ESC를 미분화된 상태로 확대 및 유지시키는 방법을 개시한다. 상기는 ESC로부터 계통-특이적인 세포의 생성에 유용하다. 상기 특허는 또한 상기 현탁 배양액에서 ESC 계통을 유도하는 방법을 개시한다.
비-인간-동물, 특히 소에서 유래된 세포로부터 비-유전자 변형(GM) 세포-배양 육류의 대규모 생산을 가능하게 하는 조성물 및 방법에 대한 충족되지 않은 필요성이 여전히 존재한다.
본 발명은, 특히 균질한 3차원(3D) 비-유전자 변형된(GM) 응집체 형태의, 비-인간-동물 유래된 만능줄기세포(PSC)의 대량 생산을 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명은 지금까지 입수할 수 없었던, 대규모 액체 배양 조건에서 다능성을 유지하는 비-인간-동물 유래된 PSC의 연속 수용조를 제공한다. PSC는 점점 성장하고 있는 세포 배양 육류 제품 산업뿐만 아니라 세포 확대 및 분화 연구를 위한 실험 도구 및 신규의 비-인간-동물 관련 약물의 개발에 사용될 수 있다.
본 발명은 부분적으로, 성장 인자(들) 및 소분자(들)의 특정 조합을 배양 배지에 가하는 경우, 플러싱 과정(flushing procedure)에 의해 수득된, 소-유래된 만능줄기세포, 및/또는 소 태아로부터 유래된 배아줄기세포(ESC)가 성장할 수 있고 다능성을 유지할 수 있으며 대규모 액체 배양 조건하에서 3D 균질한 응집체를 형성할 수 있다는 뜻밖의 발견에 기반한다. 상기 응집체내의 세포는 그의 다능성 및 분열속도를 유지하며, 따라서 상기 응집체의 직경의 증가는 액체 배양액 리터당 109 내지 1012 세포의 최종 농도에 달하는 만능줄기세포의 대량 생산으로 이어지며, 이는 지금까지 비-인간-동물 유래된 세포에 대해 보고되지 않았다.
임의의 특정한 작용 이론 또는 기전에 의해 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 만능줄기세포 대량 생산 및 응집체 형성은 비-인간-동물 세포, 특히 소 세포의 공급원, 성장 인자(들) 및 소분자(들)의 조합을 포함하는 독특한 무-혈청 배지, 및 추가로 세포 응집 및 분리 단계가 일어나는 폐쇄된 시스템 및 비-인간-동물 체온과 양립성인 배양 온도의 사용을 포함한 생육 시스템 셋업(system growth setup)에 기인할 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명의 3D 비-인간-동물 유래된 PSC 응집체는 세포 배양 육류 제품에 대한 공급원이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, PSC는 소-유래된 세포이다.
하나의 측면에 따라, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 PSC를 확대 배지(expansion medium)에 시딩(seeding)하여 현탁 배양액을 형성시키고, 상기 확대 배지는 성장 인자 bFGF, 적어도 하나의 추가적인 성장 인자, 및/또는 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), 및 A 83-01(C25H19N5S)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자의 조합을 포함하는 무-혈청 액체 배지(serum-free liquid medium)이며; (b) 상기 현탁 배양액을 응집체 형성 및 응집체 확대를 가능하게 하는 조건하에서 증식시켜 상기 PSC의 균질한 응집체를 형성시키는 단계를 포함하는, 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 만능줄기세포(PSC) 응집체의 대량 생산 방법을 제공한다.
몇몇 구현예에 따라, 시딩 및 증식은 PSC 및/또는 이를 포함하는 응집체가 부착하지 않는 물질의 벽을 갖는 용기내에서 수행된다. PSC 응집체는 불활성화된 피더(feeder) 세포, 유기 세포외 기질, 피더 세포 순화배지 및/또는 미세담체의 첨가 없이 상기 용기 중에서 형성됨을 분명하게 이해해야 한다. 상응하게, PSC 및/또는 이를 포함하는 응집체는 현탁 배양액내에서 자유로우며 표면에 부착되지 않는다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 용기는 생물반응기이다.
몇몇 구현예에 따라, 균질한 응집체는 적어도 하나의 다능성 마커를 발현하는 세포의 적어도 70%를 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 다능성 마커는 단계-특이적인 배아 항원-4(SSEA4), 8량체-결합 전사인자 4(Oct4), Sall4 전사인자, Nanog 호메오박스(homeobox) 전사인자, 번역인자 Lin28A, DNA-메틸트랜스퍼라제 Dnmt3b, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 다능성 마커는 SSEA4이다.
몇몇 구현예에 따라, 현탁 배양액의 증식 단계 (b)는 형성된 균질한 응집체를 보다 작은 응집체 및/또는 단세포(single cell)로 분리시키고 상기 보다 작은 응집체 및/또는 단세포를 재-응집(re-aggregating)시켜 균질한 응집체를 재-형성시키는 단계를 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 균질한 응집체의 분리는 상기 응집체를 해리 시약 및/또는 해리력(dissociation force)에 노출시킴을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 상기 해리 시약은 적어도 하나의 단백질분해 효소, 및 임의로 적어도 하나의 DNA 분해 효소 및/또는 킬레이트제를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 킬레이트제는 EDTA 및 EGTA 중에서 선택된다. 일부 예시적인 구현예에 따라, 상기 단백질분해 효소는 트립신이다.
일부 구현예에 따라, 해리력은 전단력이다. 몇몇 구현예에 따라, 전단력 속도는 용기내에 내장된 임펠러에 의해 설정된다.
몇몇 구현예에 따라, 분리 단계는 균질한 응집체를 해리 시약 및/또는 해리력에 노출시키기 전에 수성 세척 배지로 세척함을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 재-응집 단계는 보다 작은 응집체 및/또는 단세포를 확대 배지에 시딩함을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 시딩 및 재-응집 단계는 Rho-연관된 단백질 키나제(Rock)의 억제제를 배지에 첨가함을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 응집체의 전체 생산을 폐쇄된 시스템에서 수행한다. 폐쇄된 시스템의 사용은 멸균 환경 및 자동화된 공정을 유지되게 하는, 대규모 PSC 응집체의 대량 생산에 있어서 상당한 장점을 갖는다. 몇몇 구현예에 따라, 분리 및 재-응집 단계를, 상기 폐쇄된 시스템을 유지하는 형태로 생물반응기에 연결된 별도의 용기내에서 수행한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 용기는 세포 보유 장치이다.
몇몇 구현예에 따라, 분리 및 재-응집 단계를 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회 이상 반복한다. 상기 반복 횟수는 무제한일 수 있으며 의도하는 용도에 필요한 PSC의 수에 따라 변할 수 있음을 분명히 이해해야 한다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, PSC 응집체가 세포 배양 육류 생산용인 경우, 응집체 형성 및 분리를 약 106 세포/㎖ 내지 약 109 세포/㎖의 최종 세포 농도에 도달하도록 반복한다. 몇몇 구현예에 따라, 응집체 형성 및 분리를 약 5x106 내지 약 5x108 세포/㎖의 최종 세포 농도에 도달하도록 반복한다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 추가적인 성장인자는 형질전환 성장인자 베타(TGF-β, TGFB) 상과(superfamily)의 단백질이다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 TGF-β는 TGF-β-1, TGF-β-3, 액티빈-A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 TGF-β를 포함하는 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 적어도 하나의 추가적인 성장인자로 이루어지는 조합을 포함한다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 추가적인 성장인자는 TGF-β 상과의 단백질이다. 몇몇 구현예에 따라, TGF-β는 TGF-β-1, TGF-β-3, 액티빈-A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 적어도 하나의 소분자로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인(porcupine) 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1이다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 TGF-β 상과의 단백질, 및 IWR1, CHIR 99021, PD 0325901, A 83-01, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 소분자의 조합을 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1의 조합을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1의 조합을 포함한다.
추가의 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021을 포함하는 조합을 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021로 이루어지는 조합을 포함한다.
추가의 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, 및 IWR1, CHIR 99021, PD 0325901 및 A 83-01로 이루어지는 소분자의 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 동물-유래된 성분이 추가로 없다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말(equine), 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이다. 일부 예시적인 구현예에 따라, 소는 보스 타우루스(Bos Taurus) 종의 것이다.
몇몇 구현예에 따라, PSC는 소-유래된 배아줄기세포(ESC)이다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 소-유래된 배아줄기세포는
(1) 적어도 하나의 소 전-배아(pre-embryo)를 수득하는 단계;
(2) 상기 적어도 하나의 소 전-배아를 배반포 또는 상승된 배반포 단계에 도달하도록 배양하는 단계;
(3) 상기 배반포로부터 적어도 하나의 세포를 수득하는 단계; 및
(4) 상기 적어도 하나의 세포를, 성장인자 bFGF, 및 (i) 적어도 하나의 추가적인 성장인자 (ii) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), 및 A 83-01(C25H19N5S)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자 중 적어도 하나의 조합을 포함하는 배양 배지에서 배양하여, 다수의 소-유래된 배아줄기세포를 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 소 전-배아는 배아 플러싱 과정에 의해 수득된다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 소 전-배아는 냉동 배아이다. 이들 구현예에 따라, 상기 냉동 배아는 배양 전에 해동된다.
당해 분야에 공지되고 본원에서 상술한 바와 같은 임의의 방법에 의해 생성된 확대 배지 중에 시딩된 적어도 하나의 PSC는 신선한 PSC이거나 또는 냉동 모액(frozen stock)으로부터 채취될 수 있음을 분명히 이해해야 한다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 배양 배지는 bFGF 및 IWR1을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, PSC는 비-인간-동물 세포로부터 재프로그램화된 유도 PSC(iPSC)이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간-동물은 포유동물이다. 추가의 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 포유동물은 소이다.
다른 구현예에 따라, PSC는 비-배아줄기세포(ESC)이다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-유전자 변형된 PSC는 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 (a) 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및 (b) 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA의 조합을 도입시키고; 이에 의해 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함하는 방법에 의해 생성된 재프로그램화된 비-인간-동물 유래된 세포이다.
몇몇 구현예에 따라, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포에 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA는 합성에 의해 변형된 mRNA이다.
몇몇 추가의 예시적인 구현예에 따라, PSC는 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 (a) 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및 (b) 상기 비-인간-동물-유래된 세포에 내인성인 적어도 하나의 마이크로RNA의 적어도 하나의 억제제의 조합을 도입시키고; 이에 의해 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함하는 방법에 의해 생성된 재프로그램화된 비-인간-동물 유래된 세포이다.
몇몇 구현예에 따라, 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포에 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA는 합성에 의해 변형된 mRNA이다.
본 발명의 교시에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA를 세포의 게놈내로 통합시키지 않으며, 이에 의해 상기 생성된 iPSC는 유전자 변형되지 않는다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA, 및/또는 적어도 하나의 면역회피 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA 및/또는 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제의 도입을 무-혈청 액체 확대 배지에서 수행한다.
일부 구현예에 따라, 상기 방법은 생성된 적어도 하나의 iPSC를 무-혈청 액체 확대 배지에서 배양하여 다수의 iPSC를 형성시킴을 추가로 포함한다. 무-혈청 액체 확대 배지는 본원에서 상술한 바와 같다. 일부 구현예에 따라, 상기 사용된 무-혈청 액체 확대 배지에 Rock 억제제가 보충된다.
일부 구현예에 따라, 비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들내로 도입된 재프로그램화 mRNA는 OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28, KLF5 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 재프로그램화 인자를 암호화한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
더욱 추가의 구현예에 따라, 이중-가닥 마이크로RNA는 miR-302a, miR-302b, miR-302c, miR-302d, miR-367, miR-218, miR-449b 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제는 RNA 억제성(RNAi) 분자이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제는 miR-145에 표적화된다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들내로 도입된 면역회피 mRNA는 사용시 우두 바이러스(vaccinia virus)로부터의 E3, K3, B18R[EKB] 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 및/또는 형성된 적어도 하나의 iPSC를 37.5 내지 39.5℃의 온도에서 배양한다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 종의 것이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 유제류는 소이다. 이들 구현예에 따라, 적어도 하나의 소-유래된 세포 및/또는 형성된 적어도 하나의 iPSC를, 평균 소 체온인 약 38.6℃에서 배양한다.
일부 구현예에 따라, 소-유래된 세포는 소 탯줄, 소 비인두 점막, 및 소젖 및 혈액으로부터 수득된다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 소 체세포를 비-침습적인 기법에 의해 수집한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 유도 및/또는 재프로그램화된 PSC의 생성에 사용된 소-유래된 세포를 소 탯줄로부터 수득하며, 여기에서 상기 세포는 내피세포, 탯줄 내층세포, 와튼 젤리 세포 또는 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 추가의 구현예에 따라, 소-유래된 세포를 육우 품종 벨기에 블루(Belgium Blue)로부터 수득한다. 상기 품종은 마이오스타틴 유전자의 자연 돌연변이에 기인한 이중 근육 표현형을 특징으로 한다.
몇몇 구현예에 따라, PSC는 입자내에 캡슐화(encapsulating)된다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 입자는 본원에 기재된 바와 같은 세포 증식 및 확대에 필수적인 작용제를 추가로 포함한다. 본 발명의 교시에 따른 성장인자 및/또는 소분자를 포함하는 입자내 PSC의 캡슐화는 전체 배지 부피 중에서 동일한 농도에 도달하는데 요구되는 양에 비해 입자내에서 일정 농도에 도달하는데 요구될 수 있는 이들 작용제의 보다 적은 양으로 인해, 생산 비용의 상당한 절감을 제공할 수 있다.
따라서, 몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 PSC의 시딩 단계 (a)는 상기 PSC 중 적어도 하나를 입자내에 캡슐화하고 다수의 입자를 확대 배지내에 시딩함을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 입자는 적어도 하나의 외부 외피층(outer shell layer)에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 PSC를 포함하는 내부 코어(inner core)를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층은 유체-투과성 식품 등급 물질의 것이다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 유체-투과성 식품 등급 물질은 용해성이다. 이들 구현예에 따라, 캡슐화는 가역적이어서, 상기 외부 외피층 용해시 상기 입자내에 형성된 PSC 응집체의 방출로 이어진다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층은 적어도 하나의 식품 등급 예비-중합체 및/또는 중합체 및/또는 공중합체를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층은 적어도 하나의 하이드로젤로 구성된다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 하이드로젤은 세포 생육 온도에서 외부 외피층을 형성하는 열-가역적인 하이드로젤이다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 식품 등급 중합체는 알기네이트, 젤란-검, 아가, 아가로스, 키토산, 히알루론산, 커들란, 카라기난, 펙틴, 변형 전분 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 내부 코어는 적어도 하나의 PSC의 증식을 지지하는 미세환경을 제공한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 내부 코어 미세환경은 상기 적어도 하나의 PSC의 증식을 지지하는 적어도 하나의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 상기 적어도 하나의 작용제는 당해 분야에 공지된 바와 같은 느린-방출(slow release) 및/또는 지연 방출(sustained release) 제형으로 제형화된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 내부 코어는 성장인자 bFGF, 및 (i) 적어도 하나의 추가적인 성장인자; 및 (ii) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), 및 A 83-01(C25H19N5S)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자 중 적어도 하나의 조합을 포함한다. 성장인자 및/또는 소분자의 조합은 본원에서 상술한 바와 같다.
몇몇 구현예에 따라, 캡슐화된 PSC는 내부 코어내에서 증식하여 입자내에 PSC 응집체를 형성시킬 것이다.
몇몇 구현예에 따라, 현탁 배양액을 동적인 회전, 정적인 조건 또는 이들의 조합하에서 배양한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 현탁 배양액을 동적인 회전 조건하에서 배양한다.
본 발명에 이르러 공정 전체를 통해 확대 배지를 세포가 유래되는 종의 체온인 온도에서 유지시키는 것이 세포를 증식시키고 다수의 세포를 포함하는 응집체를 수득하는데 중요한 것으로 나타났다.
몇몇 구현예에 따라, 배양을 37.5 내지 39.5℃의 온도에서 수행한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이며, 배양 온도는 평균 소 체온인 약 38.6℃이다.
몇몇 구현예에 따라, 생물반응기의 부피는 현탁 배양액을 약 50 ㎖ 내지 약 15,000 리터의 부피로 함유하기에 적합하다.
일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 약 100 ㎖ 내지 약 15,000 리터이다. 일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 약 1 리터 내지 약 15,000 리터이다.
본 발명의 방법의 장점은 모든 단계를 상업적인 규모의 부피로 수행할 수 있다는 것이다. 일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 생물반응기당 약 1,000 리터 내지 약 15,000 리터이다.
몇몇 구현예에 따라, 형성된 PSC 응집체는 약 30 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 몇몇 구현예에 따라, 형성된 PSC 응집체는 약 30 ㎛ 내지 약 550 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 형성된 PSC 응집체는 약 100 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 평균 직경을 갖는다.
몇몇 구현예에 따라, 응집체는 적어도 하나의 다능성 마커를 발현하는 PSC를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 적어도 하나의 다능성 마커는 단계-특이적인 배아 항원-4(SSEA4), 8량체-결합 전사인자 4(Oct4), Sall4 전사인자, Nanog 호메오박스 전사인자, 번역인자 Lin28A, DNA-메틸트랜스퍼라제 Dnmt3b, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 다능성 마커는 SSEA4이다.
추가의 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생성된 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC의 균질한 응집체를 제공한다.
몇몇 구현예에 따라, 균질한 응집체의 평균 직경은 약 30 ㎛ 내지 약 500 ㎛이다. 몇몇 구현예에 따라, 형성된 PSC 응집체는 약 30 ㎛ 내지 약 550 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 형성된 PSC 응집체는 약 100 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 평균 직경을 갖는다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 무-혈청 액체 배지 및 비-인간-동물 유래된 세포 응집체를 포함하는 현탁액을 제공하며, 여기에서 상기 응집체는 적어도 70%의 생육성의 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC를 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC는 약 16 내지 32시간마다 분열할 것이다.
몇몇 구현예에 따라, 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC는 적어도 하나의 다능성 마커를 발현한다.
몇몇 구현예에 따라, 다능성 마커는 단계-특이적인 배아 항원-4(SSEA4), 8량체-결합 전사인자 4(Oct4), Sall4 전사인자, Nanog 호메오박스 전사인자, 번역인자 Lin28A, DNA-메틸트랜스퍼라제 Dnmt3b, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 현탁액내의 응집체는 약 200 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 크기를 갖는다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 현탁액내의 응집체는 약 200 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 평균 크기를 갖는다.
몇몇 구현예에 따라, 현탁액은 약 106 내지 약 109/㎖의 비-유전자 변형된, 비-인간-동물 유래된 PSC를 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 응집체의 PSC는 세포-세포 부착에 기여하는 적어도 하나의 표면 단백질을 발현한다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 및 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이다. 일부 예시적인 구현예에 따라, 소는 보스 타우루스 종의 것이다.
본 발명의 PSC 응집체를 그 자체로서, 예를 들어 추후의 사용을 위한 실험 및 연구 도구 또는 출발 물질로서 사용할 수 있다.
몇몇 구현예에 따라, 본 발명의 PSC 응집체를 세포 배양 육류 산업에서 출발 물질로서 사용할 수 있다. 이들 구현예에 따라, 상기 PSC는 지방세포, 근육세포, 기질세포, 및 내피 계통 중 적어도 하나로 더욱 분화된다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 교시에 따른 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 균질한 응집체 또는 상기 응집체를 포함하는 현탁액을 포함하는 세포 배양 육류 배양물을 제공한다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 균질한 응집체의 자손을 포함하는 세포 배양 육류 제품을 제공한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 자손은 근육세포, 기질세포, 내피세포 및 지방세포 중 적어도 하나를 형성하는, 상기 PSC로부터 분화된 세포를 포함한다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 PSC, 그의 자손, 체세포 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 비-인간-동물 세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 (i) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제; 및 (ii) 적어도 한 가지 유형의 지방산 중 적어도 하나를 포함하는 무-혈청 액체 배지에서 배양하고; 이에 의해 상기 세포를 지방세포로 분화시킴을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 배지는 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제 및 적어도 한 가지 유형의 지방산의 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 배지는 성장인자 bFGF를 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 배지는 Rock 억제제를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 세포 배양은 적어도 4일간이다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제는 IWR-1이다.
몇몇 구현예에 따라, 지방산은 유리 지방산, 저분자량 지방산, 그의 에스테르, 그의 염 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에 따라, PSC는 유도 PSC(iPSC) 및 배아줄기세포로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에 따라 PSC 유도체는 지방 조직으로부터 단리된 기질 줄기세포이다.
몇몇 구현예에 따라, 세포는 배아 근육 조직으로부터 유래된 세포의 집단을 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 배아 근육 조직으로부터 유래된 세포의 집단은 배아 섬유아세포(EF)를 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 분화시키고자 하는 세포는 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 비-인간-동물로부터 유래된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이다.
본원에 개시된 각각의 측면 및 구현예의 임의의 조합은 본 발명의 개시내용 내에 분명히 포함됨을 이해해야 한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기의 설명으로부터 분명해질 것이다.
도 1은 플러싱된 소 배아로부터 유래된 배아줄기세포(bESC)를 도시한다. 도 1A는 조나 펠루시다(Zona Pellucida)로부터 단리되고 시딩 후 1일째에 피더층에 부착된 전-배아의 전형적인 형태를 도시한다. 도 1B는 시딩후 5일째에 ESC-유사 형태를 갖는 세포의 이동이 나타남을 도시한다.
도 2는 피더 층으로서 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포(iMEF)상에서, 2.5 μM IWR1이 보충된 무-혈청 배지 mTeSR1®에서의 bESC의 증식을 도시한다.
도 3은 증식(proliferating)된 bESC의 다능성을 입증한다. 도 3A는 유식 세포측정에 의한, SSEA4 항체에 의한 Alp 0501(17개 실험) 및 Alp 0505(5개 실험)의 양성 염색의 백분율을 도시한다. 도 3B는 실시간 PCR에 의해 측정된 BEF에서의 발현과 비교된 다능성 마커의 발현을 도시한다.
도 4는 유식 세포측정에 의해 측정된 무-피더 배양액에서 증식된 bESC에 의한 다능성 마커 SSEA4의 발현 백분율을 도시한다. 도 4A: PSC 계통 Alp 0501. 도 4B: PSC 계통 Alp 0505.
도 5는 다능성 마커(Oct4)의 발현 대 중배엽 마커(Brachyury)의 발현에 의해 측정된 bESC 계통 Alp 0501 및 Alp 0505의 분화 능력을 입증하였다.
도 6은 6-웰 플레이트에서 bESC 응집체 형성 및 확대를 입증한다. 도 6A; 현탁액 중에서 시딩 후 1일째. 도 6B: 현탁액 중에서 시딩 후 2일째. 도 6C: 현탁액 중에서 시딩 후 7일째. 전형적인 상, 스케일 바 = 200 ㎛.
도 7은 교반식 탱크(STR) 생물반응기에서 bESC의 응집 수율(% 살아있는/살아있는 세포)을 도시한다.
도 8A-8C는 증식 1, 3 및 4일 후(각각 도 8A-C) 교반식 탱크(STR) 생물반응기에서 bESC 응집체 확대를 도시한다. 전형적인 상, 스케일 바 = 650 ㎛.
도 8D-8E는 세포 농도 및 생육력(도 8D) 및 평균 응집체 직경(도 8E)을 도시한다. 시간에 따른 다능성(SSEA4% 발현으로서 제공됨)을 도 8E에 나타낸다.
도 9는 분리 및 재-응집의 과정을 입증한다. 도 9A는 분리에 대한 소스 물질로서 제공되는 3일된 응집체를 도시한다. 도 9B는 해리 시약을 포함하는 배지에 재-시딩된 도 9A의 응집체로부터 수득된 작은 응집체/단세포로부터 형성된 응집체를 도시한다. 전형적인 상, 스케일 바 = 650 ㎛.
도 10은 탯줄 세포의 단리에서 다양한 단계의 전형적인 사진을 도시한다. 도 10A; 탯줄(UC); 도 10B: 와튼 젤리; 도 10C: 조직 절단물; 도 10D: 단리된 UC 세포.
도 11은 BEF의 배양물 내에서 세포로부터 분화된 지방세포의 전형적인 사진을 도시한다. 분화된 세포는 오일 레드 O에 의한 염색으로 인해 보다 어둡게 보인다. 오일 레드 O는 트리글리세라이드 및 지질을 염색한다.
도 12는 12-웰 플레이트 중의 iMEF상에서 biPSC 클론의 증식을 입증한다. 도 12A: 형질감염 후 2주째에 배아줄기세포(ES)-유사 콜로니. 도 12B: 비트로넥틴 코팅된 표면에 적응 후 소 ES-유사 콜로니 형태를 나타내는 명시야 상. 도 12C: 에피솜 CoMiP 플라스미드가 소 숙주 게놈에 통합되지 않았다.
도 13은 mCherry 및 소 OCT4 발현에 의해 입증된, 변형된 mRNA로 효율적으로 형질감염된 BEF 세포를 도시한다. 소 OSKM, mCherry 및 B18R을 암호화하는 변형된 mRNA로 형질감염된 BEF 세포의 형광(도 13A) 및 명시야(도 13B) 상. 형광 상은 1차 mRNA 형질감염 후 24h째에 형질감염 효율을 나타낸다. 도 13C: 처리되지 않은 BEF 세포, iBEF 세포(재프로그램화 유도를 위해 소 OSKM을 암호화하는 변형된 mRNA로 형질감염된 BEF 세포) 및 인간 iPSC 세포에서 소 OCT4 전사물의 qPCR 분석. 값들을 처리되지 않은 BEF 세포에 비교하고(RQ = 1) 소 베타-액틴에 정규화한다.
도 2는 피더 층으로서 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포(iMEF)상에서, 2.5 μM IWR1이 보충된 무-혈청 배지 mTeSR1®에서의 bESC의 증식을 도시한다.
도 3은 증식(proliferating)된 bESC의 다능성을 입증한다. 도 3A는 유식 세포측정에 의한, SSEA4 항체에 의한 Alp 0501(17개 실험) 및 Alp 0505(5개 실험)의 양성 염색의 백분율을 도시한다. 도 3B는 실시간 PCR에 의해 측정된 BEF에서의 발현과 비교된 다능성 마커의 발현을 도시한다.
도 4는 유식 세포측정에 의해 측정된 무-피더 배양액에서 증식된 bESC에 의한 다능성 마커 SSEA4의 발현 백분율을 도시한다. 도 4A: PSC 계통 Alp 0501. 도 4B: PSC 계통 Alp 0505.
도 5는 다능성 마커(Oct4)의 발현 대 중배엽 마커(Brachyury)의 발현에 의해 측정된 bESC 계통 Alp 0501 및 Alp 0505의 분화 능력을 입증하였다.
도 6은 6-웰 플레이트에서 bESC 응집체 형성 및 확대를 입증한다. 도 6A; 현탁액 중에서 시딩 후 1일째. 도 6B: 현탁액 중에서 시딩 후 2일째. 도 6C: 현탁액 중에서 시딩 후 7일째. 전형적인 상, 스케일 바 = 200 ㎛.
도 7은 교반식 탱크(STR) 생물반응기에서 bESC의 응집 수율(% 살아있는/살아있는 세포)을 도시한다.
도 8A-8C는 증식 1, 3 및 4일 후(각각 도 8A-C) 교반식 탱크(STR) 생물반응기에서 bESC 응집체 확대를 도시한다. 전형적인 상, 스케일 바 = 650 ㎛.
도 8D-8E는 세포 농도 및 생육력(도 8D) 및 평균 응집체 직경(도 8E)을 도시한다. 시간에 따른 다능성(SSEA4% 발현으로서 제공됨)을 도 8E에 나타낸다.
도 9는 분리 및 재-응집의 과정을 입증한다. 도 9A는 분리에 대한 소스 물질로서 제공되는 3일된 응집체를 도시한다. 도 9B는 해리 시약을 포함하는 배지에 재-시딩된 도 9A의 응집체로부터 수득된 작은 응집체/단세포로부터 형성된 응집체를 도시한다. 전형적인 상, 스케일 바 = 650 ㎛.
도 10은 탯줄 세포의 단리에서 다양한 단계의 전형적인 사진을 도시한다. 도 10A; 탯줄(UC); 도 10B: 와튼 젤리; 도 10C: 조직 절단물; 도 10D: 단리된 UC 세포.
도 11은 BEF의 배양물 내에서 세포로부터 분화된 지방세포의 전형적인 사진을 도시한다. 분화된 세포는 오일 레드 O에 의한 염색으로 인해 보다 어둡게 보인다. 오일 레드 O는 트리글리세라이드 및 지질을 염색한다.
도 12는 12-웰 플레이트 중의 iMEF상에서 biPSC 클론의 증식을 입증한다. 도 12A: 형질감염 후 2주째에 배아줄기세포(ES)-유사 콜로니. 도 12B: 비트로넥틴 코팅된 표면에 적응 후 소 ES-유사 콜로니 형태를 나타내는 명시야 상. 도 12C: 에피솜 CoMiP 플라스미드가 소 숙주 게놈에 통합되지 않았다.
도 13은 mCherry 및 소 OCT4 발현에 의해 입증된, 변형된 mRNA로 효율적으로 형질감염된 BEF 세포를 도시한다. 소 OSKM, mCherry 및 B18R을 암호화하는 변형된 mRNA로 형질감염된 BEF 세포의 형광(도 13A) 및 명시야(도 13B) 상. 형광 상은 1차 mRNA 형질감염 후 24h째에 형질감염 효율을 나타낸다. 도 13C: 처리되지 않은 BEF 세포, iBEF 세포(재프로그램화 유도를 위해 소 OSKM을 암호화하는 변형된 mRNA로 형질감염된 BEF 세포) 및 인간 iPSC 세포에서 소 OCT4 전사물의 qPCR 분석. 값들을 처리되지 않은 BEF 세포에 비교하고(RQ = 1) 소 베타-액틴에 정규화한다.
본 발명은, 성장인자 및 소분자의 특정 조합이 첨가되고 세포-부착 표면이 없는 액체 무-혈청 배지에 현탁된 비-인간-동물-유래된 PSC로부터 균질한 3D 응집체를 상업적인 규모로 형성시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 대규모 조건하에서 비-인간-동물, 특히 소에서 유래된 PSC로부터 식품 소비용의 비-GM 세포 배양 육류를 생산하고자 하는 오랜 갈망을 충족시킨다.
정의
"포함하다", "포함하는", "포함하다", "포함하는", "갖는"이란 용어 및 이들의 활용 형태는 "포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나" 및 "그"는 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "화합물" 또는 "적어도 하나의 화합물"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본원 전체를 통해, 본 발명의 다양한 구현예는 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의와 간결함을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 따라서 범위에 대한 기재는 가능한 모든 하위 범위와 해당 범위 내의 개별적인 숫자를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 구체적으로 개시된 하위 범위뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별적인 숫자, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이를 범위의 폭에 관계없이 적용한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "약"이란 용어는 숫자 지정의 +10% 또는 -10%의 숫자 지정의 변동을 지칭한다.
"동물" 및 "비-인간 동물"이란 용어는 이로부터 유래된 세포와 관련하여 본원에서 호환가능하게 사용되며 오직 비-인간-동물의 세포만을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "만능줄기세포(PSC)"란 용어는 신체내 모든 다른 세포 유형을 생성시킬 뿐만 아니라, 무제한 번식할 수 있는 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "유도만능줄기세포(iPSC)"란 용어는 체세포로부터 직접 생성될 수 있는 만능줄기세포의 한 유형을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "배아줄기세포(ESC)"란 용어는 비-인간-동물, 특히 소 배반포로부터 유래된 만능줄기세포의 한 유형을 지칭한다.
"3차원(3D)"이란 용어는 액체 현탁액 중에서 증식되고 고체 및/또는 반-고체 표면에 부착하지 않는 세포의 세포 배양물을 지칭한다. 3D 세포 배양은 생물학적 세포가 증식하거나 주변 세포와 상호작용하게 하는 인공적으로 생성된 환경이다. 3D 세포 배양은 세포가 생체내에서 증식하는 방법과 유사하게, 모든 방향으로 세포의 시험관내 성장을 허용한다.
"비-유전자 변형된(비-GM)"이란 용어는 게놈 변경이 없고/외부 핵산에 의한 형질감염으로 인한 게놈내로의 외부 핵산 통합이 없는 온전한 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "응집체"란 용어는 시험관내에서 혼합된 해리된 세포가 "부유 응집체"라 또한 지칭되는 다른 세포와 스스로 그룹을 형성하려고 하는 현상을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 본 발명의 응집체에 관하여 "균질한"이란 용어는 적어도 70%의 비-인간-동물-유래된 PSC를 포함하고 약 30 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 직경을 갖는 다수의 응집체를 지칭한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 응집체의 평균 직경은 약 30 ㎛ 내지 약 450 ㎛, 약 30 ㎛ 내지 약 400 ㎛, 또는 약 30 ㎛ 내지 약 350 ㎛이다. 일부 구현예에서, 상기 응집체의 평균 직경은 300 ㎛ 초과이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 응집체의 평균 직경은 약 30 ㎛ 내지 약 350 ㎛이다. 몇몇 구현예에 따라, 최종 현탁 생성물은 약 250 ㎛ 내지 약 350 ㎛의 평균 직경을 갖는 응집체를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 배지에 관하여 "무-혈청"이란 용어는 동물 혈청이 없는 배지를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 배지에 관하여 "무-동물-유래된 성분"이란 용어는 동물 기원의 어떠한 성분도 함유하지 않는 배지, 특히 포유동물-유래된 성분을 함유하지 않는 배지를 지칭한다.
"세포 배양 육류"란 용어는 본원에서 도살된 동물의 육류와 구별되는 시험관내 동물 세포 배양물로부터 증식된 육류를 기재하는데 사용된다. 시험관내 동물 세포 배양물로부터 증식된 육류를 기재하는데 당해 분야에서 사용될 수 있는 추가적인 용어는 배양육, 배양육, 청정육, 실험실-배양육, 시험관 육류, 시험관내 육류, 관 스테이크, 합성육, 세포-배양육, 세포 배양 육류, 조직가공육, 가공육, 인공 육류, 및 수제육을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 세포 배양 시스템에 관하여 "폐쇄된 시스템"이란 용어는 본 발명의 교시에 따라 PSC 응집체의 생육 주기를 완료하는데 필요한 모든 요소를 포함하는 시스템을 지칭한다.
"재프로그램화"란 용어는 하나의 특정 세포 유형의 또 다른 유형으로의 전환을 지칭한다. 본 발명의 몇몇 구현예에 따라, 재프로그램화는 체세포 유형의, 유도만능줄기세포 또는 iPSC로서 공지된 만능세포 유형으로의 전환이다.
본원에 사용되는 바와 같은 "재프로그램화 mRNA"란 용어는 하기의 전사인자 중 어느 하나를 암호화하는 mRNA를 지칭한다: OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28 및 KLF5.
"용기" 또는 "조직 배양 용기"란 용어는 본원에서 호환가능하게 사용되며 PSC가 용기 물질에 부착하지 않으면서 현탁액 중에서 성장할 수 있는 임의의 용기를 지칭한다. 상기 용기는 밀리리터 범위(예를 들어 비-부착성 플레이트 또는 삼각 플라스크)에서부터 수천 리터 범위(예를 들어 생물반응기)에 이르는 다양한 크기를 가질 수 있다.
하나의 측면에 따라, 본 발명은 (a) 적어도 하나의 PSC를 확대 배지에 시딩하여 현탁 배양액을 형성시키고, 상기 확대 배지는 성장 인자 bFGF, 적어도 하나의 추가적인 성장 인자, 및/또는 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), A 83-01(C25H19N5S), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자를 포함하는 무-혈청 액체 배지이며; (b) 상기 현탁 배양액을 응집체 형성 및 응집체 확대를 가능하게 하는 조건하에서 증식시켜 상기 PSC의 균질한 응집체를 형성시키는 단계를 포함하는, 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC의 응집체의 생성 방법을 제공한다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 시딩 및 증식은 PSC 및/또는 이를 포함하는 응집체가 부착하지 않는 물질의 벽을 갖는 용기내에서 수행된다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 동물-유래된 성분이 추가로 없다.
bFGF(염기성 섬유아세포 성장인자, 또한 FGF2로서 공지됨)는 넓은 유사분열촉진 및 세포생존 활성을 가지며, 배발생, 세포증식, 형태발생, 조직수복, 종양 성장 및 침범을 포함한 다양한 생물학적 과정에 관련된다. bFGF는 JAK/STAT, PI3K, ERK1/2, 및 다른 수용체 티로신 키나제(RTK) 신호전달 경로를 활성화한다. 상기는 미분화된 인간 배아줄기세포의 유지를 지지한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 적어도 하나의 추가적인 성장인자로 이루어지는 조합을 포함한다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 추가적인 성장인자는 형질전환 성장인자 베타(TGF-β, 또한 TGFB로서 기호화됨) 패밀리의 단백질이다.
TGF-β는 3개의 상이한 포유동물 동형(TGF-β1 내지 3, 또는 TGFB1, TGFB2, TGFB3) 및 다수의 다른 신호전달 단백질(액틴-A 포함)을 포함하는 형질전환 성장인자 상과에 속하는 다기능성 사이토카인이다. 활성화된 TGF-β는 다른 인자와 복합체를 이루어, TGF-β 수용체에 결합하는 세린/쓰레오닌 키나제 복합체를 형성한다. TGF-β 수용체는 1형 및 2형 수용체 서브유닛으로 구성된다. TGF-β의 결합 후에, 2형 수용체 키나제는 인산화되며 1형 수용체 키나제를 활성화하여 신호전달 캐스케이드를 활성화한다. 이는 상이한 하류 기질 및 조절 단백질의 활성화를 초래하여, 다수의 면역 세포의 분화, 주화성, 증식, 및 활성화에 기능하는 상이한 표적 유전자의 전사를 유도한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 적어도 하나의 소분자로 이루어지는 조합을 포함한다.
WNT-β-카테닌 신호전달은 세포증식, 분화, 이동, 유전학적 안정성 및 세포자멸사를 조절함으로써 다수의 발생 과정 및 성체 조직 항상성의 유지에 관여하며, 공지된 억제제뿐만 아니라 이 경로의 향후 개발될 억제제가 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다. 공지된 억제제는 예를 들어 문헌[Kahn M. 2014. Nat Rev Drug Discov. 13(7):513-32. doi: 10.1038/nrd4233]에 나열되어 있다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1이다. IWR1은 세포-기반 WNT/β-카테닌 경로를 차단함으로써 WNT 신호전달을 효능있게 억제한다. 상기는 CHIR 99021과 함께 사용될 때 자기-재생을 촉진하고 인간 배아줄기세포 및 마우스 Epi-줄기세포의 다능성을 유지시키는 것으로 나타났다(Kim et al., Nat Commun. 2013, 4: 2403). 또한 IWR1 및 bFGF의 조합을 포함하는 배양 배지는 소 배반포로부터의 만능배아줄기세포의 성장 및 유지를 지지하는 것으로 나타났다(Bogliotii Y S et al., ibid). 몇몇 구현예에 따라, 배지 중 IWR1 농도는 약 1 μM 내지 약 10 μM이다. 일부 구현예에 따라, 배지 중 IWR1 농도는 약 2 μM 내지 약 10 μM이다.
CHIR 99021(6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴)은 글리코겐 신타제 키나제 3(GSK-3)의 선택적이고 효능 있는 억제제인 아미노피리미딘 유도체이다.
PD0325901(N-[(2R)-2,3-디하이드록시프로폭시]-3,4-디플루오로-2-[(2-플루오로-4-요오도페닐)아미노]-벤즈아미드는 효능있고 선택적인 MEK1 및 MEK2 억제제이다.
PD 0325901은 CHIR 99021과 함께 사용되어 체세포를 iPSC로 재프로그램화하고 세포 자기-재생을 촉진할 수 있다.
A83-01 (3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드)은 TGF-β I형 수용체 ALK5 키나제, I형 액티빈/결절 수용체 ALK4 및 I형 결절 수용체 ALK7(IC50 값은 각각 12, 45 및 7.5 nM이다)의 효능있는 억제제이다. A83-01은 Smad2의 인산화를 차단하고 IGF-β-유도된 상피-간엽 이행을 억제한다. A83-01은 iPSC의 분화를 억제하고 시험관내 세포 자기-재생을 유지하는데 사용된다.
다른 구현예에 따라, 확대 배지는 2개의 성장인자 bFGF 및 TGF-β, 및 IWR1, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), 및 A 83-01(C25H19N5S)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 2개의 소분자를 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, 및 IWR1, CHIR 99021, PD 0325901, A 83-01 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자의 조합을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1의 조합을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021을 포함하는 조합을 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 A 83-01로 이루어지는 조합을 포함한다. 추가의 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 CHIR 99021, PD 0325901 및 A 83-01로 이루어지는 소분자의 조합의 조합을 포함한다.
임의의 비-인간-동물-유래된 만능줄기세포는 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 비-인간-동물은 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 종의 것이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 일부 구현예에 따라 상기 유제류는 소이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 소는 암소이다.
예를 들어, 배반포-유래된 PSC를 포함하여 소-유래된 PSC의 상업적인 제제를 또한 입수할 수 있다.
일부 구현예에 따라, PSC는 배아줄기세포(ESC)이다.
일부 구현예에 따라, PSC는 비-배아줄기세포(ESC)이다.
몇몇 구현예에 따라, PSC는 체세포로부터 재프로그램화된 유도 PSC(iPSC)이다.
몇몇 구현예에 따라, PSC는 ESC를 포함하지 않는 체세포로부터 재프로그램화된 유도 PSC(iPSC)이다.
iPSC 생성을 위한 세포의 재프로그램화를 당해 분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 Peleganove 등의 문헌[Poleganov et al., Hum. Gene Ther. 2015; 26:751-766]에 기재된 방법에 의해 수행할 수 있다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 응집체의 생성 방법은
(a) 적어도 하나의 PSC를 확대 배지에 시딩하여 시딩 현탁 배양액을 형성시키는 단계;
(b) 상기 시딩 현탁 배양액을 배양하여 PSC 응집체를 형성시키는 단계;
(c) 상기 응집체를 보다 작은 응집체 및/또는 단세포로 분리시키는 단계;
(d) 단계 (a)-(c)를 적어도 1회 반복하여 목적하는 PSC 농도를 획득하는 단계; 및
(e) 단계 (a)-(b)를 반복함으로써 상기 PSC를 확대시켜 목적하는 응집체 농도를 획득하는 단계
를 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 응집체의 분리는 상기 응집체를 해리 시약 및/또는 해리력에 노출시킴을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 상기 해리 시약은 적어도 하나의 단백질분해 효소 및 임의로 적어도 하나의 DNA 분해 효소 및/또는 킬레이트제를 포함한다. 일부 구현예에 따라, 상기 해리 시약은 적어도 하나의 단백질분해 효소, 적어도 하나의 DNA 분해 효소 및 킬레이트제를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 킬레이트제는 EDTA 및 EGTA 중에서 선택된다. 일부 예시적인 구현예에 따라, 상기 단백질분해 효소는 트립신이다.
일부 구현예에 따라, 해리력은 전단력이다. 몇몇 구현예에 따라, 전단력 속도는 용기내에 내장된 임펠러에 의해 설정된다.
몇몇 구현예에 따라, 분리 단계는 균질한 응집체를 해리 시약 및/또는 해리력에 노출시키기 전에 수성 세척 배지로 세척함을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 단계 (a)-(c)를 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회 이상 반복한다. 상기 반복 횟수는 무제한일 수 있으며 의도하는 용도에 필요한 PSC의 수에 따라 변할 수 있음을 분명히 이해해야 한다. 몇몇 구현예에 따라, 응집 및 분리 단계를 약 106 세포/㎖의 세포 농도에 도달할 때까지 반복한다. 일부 구현예에 따라, 응집 및 분리 단계를 적어도 5x106 세포/㎖, 적어도 107 세포/㎖, 적어도 5x107 세포/㎖, 적어도 108 세포/㎖, 적어도 5x108 세포/㎖, 또는 적어도 109 세포/㎖ 이상의 세포 농도에 도달할 때까지 반복한다.
몇몇 구현예에 따라, 단계 (a)-(c)를 동일한 배지에서 반복한다. 일부 구현예에 따라, 배지는 해리 시약을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 시딩은 비-부착성 조직 배양 용기내에서 수행된다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 PSC의 시딩 단계 (a)는 Rho-연관된 단백질 키나제(Rock)의 억제제를 첨가함을 추가로 포함한다.
현재 당해 분야에 공지되어 있거나 향후 개발될 임의의 ROCK 억제제가 본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 Rock 억제제는 티아조비빈, 파수딜, 리파수딜, 네타르수딜, RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, Y30141로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 Rock 억제제는 Y-27632 디하이드로클로라이드 (1R,4r)-4-((R)-1-아미노에틸)-N-(피리딘-4-일)사이클로헥산카복스아미드)이다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 PSC의 시딩 단계 (a)는 적어도 하나의 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC를 입자내에 캡슐화하고 다수의 상기 입자를 확대 배지내에 시딩함을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 입자는 적어도 하나의 외부 외피층에 의해 둘러싸인 내부 코어를 포함하며, 여기에서 상기 내부 코어는 적어도 하나의 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 증식을 지지하는 적어도 하나의 화합물을 추가로 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층은 유체-투과성 식품 등급 물질의 것이다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층은 가역적인 캡슐화를 위해 설계되어, 상기 입자가 특정 조건에 노출시 상기 캡슐내에 형성된 PSC 응집체가 방출된다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층의 유체-투과성 식품 등급 물질은 용해성이다. 상기 입자의 내부 코어 미세환경은 초기의 세포-세포 상호작용 및 후속적인 세포증식을 가능하게 하지만, 세포 응집 및 유체역학적 응력은 없는 자유 공간을 제공함을 분명히 이해해야 한다. 따라서, 상기 PSC를 캡슐화하는 입자는 배양 효율 및 응집체 형성을 현저하게 개선시킬 수 있다.
몇몇 구현예에 따라, 외부 외피층은 적어도 하나의 식품 등급 중합체 또는 공-중합체를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 외부 외피층은 하이드로젤을 형성하는 하나 이상의 중합체를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 하이드로젤은 열-민감성 및/또는 열-가역적인 하이드로젤이다. 적합한 중합체 및 하이드로젤 물질은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 알기네이트는 캡슐화에 사용되는 것으로 잘 알려진 중합체이다. 겔란-검은 1가 또는 2가 양이온과 블렌딩시 저온에서 하이드로젤을 형성한다(체온에서 젤화한다). 키토산은 포스페이트 이온과 단단한 이온성 하이드로젤을 형성한다. 커들란은 주로 상이한 가열 온도에 기반하여 저-경화성 젤(열-가역적인) 및 고-경화성 젤(열-비가역적인)을 형성할 수 있다. 아가로스, 히알루론산, 카라기난, 변형된 전분 및 펙틴은 모두 본 발명의 교시에 따라 외부 외피층을 형성하기에 적합한 것으로 공지되어 있다.
몇몇 구현예에 따라, 내부 코어 미세환경내에 존재하는 증식을 지지하는 적어도 하나의 화합물을 당해 분야에 공지된 바와 같은 느린-방출 및/또는 지연 방출 제형으로 제형화한다.
몇몇 구현예에 따라, 조직 배양 용기는 PSC가 부착하지 않는 물질로 만들어진다. 따라서, PSC 및/또는 이를 포함하는 응집체는 현탁액내에서 자유로우며 어떠한 표면에도 부착되지 않는다.
몇몇 구현예에 따라, 현탁 배양액을 약 100,000 세포/㎖ 내지 약 50,000,000 세포/㎖의 목적하는 만능세포 농도에 도달하도록 증식시킨다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 현탁 배양액을 PSC가 약 300,000 세포/㎖ 내지 약 10,000,000 세포/㎖ 또는 약 1,000,000 세포/㎖의 농도에 도달하도록 증식시킨다.
몇몇 구현예에 따라, 현탁 배양액을 동적 회전, 정적 조건, 또는 이들의 조합하에서 배양한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 현탁 배양액을 동적 회전 조건하에서 배양한다.
몇몇 구현예에 따라, 배양을, 세포가 유래된 동물의 체온에서 수행한다.
몇몇 구현예에 따라, 배양을 37.5 내지 39.5℃의 온도에서 수행한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간 동물이 소인 경우, 배양 온도는, 평균 소 체온인 약 38.6℃이다.
몇몇 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 용기당 약 100 ㎖ 내지 약 15,000 리터이다.
일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 용기당 약 500 ㎖ 내지 약 15,000 리터이다. 일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 용기당 약 1 리터 내지 약 15,000 리터이다. 일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 용기당 약 1 리터 내지 약 1,500 리터이다. 일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 용기당 약 1 리터 내지 약 150 리터이다.
본 발명의 방법의 장점은 모든 단계를 상업적인 규모의 부피로, 폐쇄된 시스템에서 수행할 수 있다는 것이다. 일부 구현예에 따라, 현탁 배양액의 부피는 용기당 약 1,000 리터 내지 약 15,000 리터이다.
몇몇 구현예에 따라, 형성된 PSC 응집체는 약 30 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에 따라, 상기 응집체는 약 100 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 일부 구현예에 따라, 상기 응집체는 약 150 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 응집체는 약 300 ㎛ 내지 약 550 ㎛의 평균 직경을 갖는다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 응집체 평균 직경은 약 30 ㎛ 내지 약 350 ㎛이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 응집체의 평균 직경은 약 250 ㎛ 내지 약 350 ㎛이다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, PSC는, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 (a) 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및 (b) 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA의 조합을 도입시켜, 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함하는 방법에 의해 생성된 재프로그램화된 비-인간-동물 유래된 세포이다.
몇몇 구현예에 따라, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA는 합성에 의해 변형된 mRNA이다.
몇몇 추가의 예시적인 구현예에 따라, PSC는, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 (a) 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및 (b) 상기 비-인간-동물 유래된 세포에 내인성인 적어도 하나의 마이크로RNA의, 적어도 하나의 억제제의 조합을 도입시켜, 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함하는 방법에 의해 생성된 재프로그램화된 비-인간-동물 유래된 세포이다.
몇몇 구현예에 따라, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA는 인간 또는 비-인간-동물 기원의 것이다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이다. 이들 구현예에 따라, 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA는 인간 또는 소 기원의 것이다.
본 발명의 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 PSC내로 도입시키는 것을 당해 분야에 공지된 바와 같은 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 교시에 따라, 적어도 하나의 mRNA를 세포의 게놈내로 통합시키지 않으며, 이에 의해 생성되는 iPSC는 유전자 변형되지 않는다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA 및/또는 적어도 하나의 면역회피 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA 및/또는 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제의 도입을 무-혈청, 무-동물-유래된 성분 액체 확대 배지에서 수행한다. 일부 구현예에 따라, 배지는 추가의 동물-유래된 성분이 없다.
일부 구현예에 따라, 상기 방법은 생성된 적어도 하나의 iPSC를 무-혈청 액체 확대 배지에서 배양하여 다수의 iPSC를 형성시킴을 추가로 포함한다. 상기 무-혈청 액체 확대 배지는 본원에서 상술한 바와 같다. 일부 구현예에 따라, 상기 사용된 무-혈청 액체 확대 배지에 Rock 억제제를 보충한다.
일부 구현예에 따라, 비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들내로 도입된 재프로그램화 mRNA는 OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28, KLF5 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
추가의 구현예에 따라, 비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들내로 도입된 면역회피 mRNA는 우두 바이러스로부터의 E3, K3, B18R[EKB] 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
더욱 추가의 구현예에 따라, 이중-가닥 마이크로RNA는 miR-302a, miR-302b, miR-302c, miR-302d, miR-367, miR-218, miR-449b 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제는 RNA 억제성(RNAi) 분자이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제는 miR-145에 표적화된다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들내로 도입된 면역회피 mRNA는 사용시, 우두 바이러스로부터의 E3, K3, B18R[EKB] 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 및/또는 형성된 적어도 하나의 iPSC를 37.5 내지 39.5℃의 온도에서 배양한다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 종의 동물이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 유제류는 소이다. 이들 구현예에 따라, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 및/또는 형성된 적어도 하나의 iPSC를, 평균 소 체온인 38.6℃에서 배양한다.
일부 구현예에 따라, 소-유래된 세포는 소 탯줄, 소 비인두 점막, 및 소 혈액으로부터 수득된다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 소 체세포를 비-침습적인 기법에 의해 수집한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 소-유래된 세포를 소 탯줄로부터 수득하며, 여기에서 상기 세포는 내피세포, 탯줄 내층세포, 와튼 젤리 세포 또는 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 추가의 구현예에 따라, 소-유래된 세포를 육우 품종 벨기에 블루로부터 수득한다. 상기 품종은 마이오스타틴 유전자의 자연 돌연변이에 기인한 이중 근육 표현형을 특징으로 한다.
추가의 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 생성된 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 균질한 응집체를 제공한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 응집체는 적어도 하나의 다능성 마커를 발현하는 적어도 70%의 생육성 세포를 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 다능성 마커는 SSEA4, Oct4, Nanog, Lin28A, Sall4, Dnmt3b, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 다능성 마커는 SSEA4이다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 무-혈청 액체 배지, 및 적어도 하나의 다능성 마커를 발현하는 적어도 70%의 생육성 PSC를 포함하는 비-인간-동물 유래된 세포 응집체를 포함하는 현탁액을 제공한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 PSC는 약 16 내지 32시간마다 분열할 것이다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 PSC는 약 16 내지 24시간마다 분열할 것이다.
몇몇 구현예에 따라, 응집체의 PSC는 세포-세포 부착에 기여하는 적어도 하나의 표면 단백질을 발현한다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 본 발명에 따른 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC의 균질한 응집체 또는 이를 포함하는 현탁액을 포함하는 세포 배양 육류 배양물을 제공한다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 본 발명의 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 균질한 응집체의 자손을 포함하는 세포 배양 육류 생성물을 제공한다.
비-인간 동물은 본원에서 상술한 바와 같다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이다.
몇몇 구현예에 따라, 자손은 근육세포, 기질세포, 내피세포 및 지방세포 중 적어도 하나를 형성하도록 PSC로부터 분화된 세포를 포함한다.
이제 본 발명은 뜻밖에도 본 발명의 몇몇 구현예에 따른 확대 배지내 지방산의 존재가 소 유래된 PSC 또는 BEF의 배양물의, 지방세포로의 분화를 유도함을 보인다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 PSC, 그의 자손, 체세포 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 비-인간-동물 세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 (i) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제; 및 (ii) 적어도 한 가지 유형의 지방산 중 적어도 하나를 포함하는 무-혈청 액체 배지에서 배양하고; 이에 의해 상기 세포를 지방세포로 분화시킴을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 배지는 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제 및 적어도 한 가지 유형의 지방산의 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 배지는 성장인자 bFGF를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 배지는 Rock 억제제를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 세포의 배양은 적어도 4일간이다. 다른 구현예에 따라, 세포의 배양은 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 또는 적어도 10일 이상 동안이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제는 IWR-1이다.
몇몇 구현예에 따라, 지방산은 유리 지방산, 저분자량 지방산, 그의 에스테르, 그의 염 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에 따라 PSC는 지방 조직으로부터 단리된 기질 줄기세포이다.
몇몇 구현예에 따라, 세포는 배아 근육 조직으로부터 유래된 세포의 집단을 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 배아 근육 조직으로부터 유래된 세포의 집단은 배아 섬유아세포(EF)를 포함한다.
비-인간-동물은 본원에서 상술한 바와 같다.
본 발명의 세포 배양 육류를 포함하는 식품이 또한 본 발명의 범위내에 포함된다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 성장 인자 bFGF 및 (i) 적어도 하나의 추가적인 성장인자 및 (ii) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021, PD 0325901 및 A 83-01 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자 중 적어도 하나의 조합을 포함하는 비-인간-동물-유래된 PSC를 확대시키기 위한 확대 배지를 제공하며, 여기에서 상기 확대 배지는 무-혈청이고 불활성화된 피더 세포가 없다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 확대 배지는 추가의 유기 기질이 없다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 확대 배지는 추가의 동물-유래된 성분이 없다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 기질 부착성이 없는 현탁 배양액 중에서 배양시 비-인간-포유동물 만능줄기세포를 다능성 상태로 유지시킬 수 있다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 프로테이나제 억제제가 없다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 적어도 하나의 추가적인 성장인자로 이루어지는 조합을 포함한다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 상기 추가적인 성장인자는 TGF-β 상과의 단백질이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, TGF-β는 TGF-β-1, TGF-β-3, 액티빈-A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 bFGF 및 적어도 하나의 소분자로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1이다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 IWR1, CHIR 99021, PD 0325901, A 83-01, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 소분자의 조합을 포함한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1의 조합을 포함한다. 일부 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, 및 TGF-β-1, TGF-β-1 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF, 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021을 포함하는 조합을 포함한다. 몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021로 이루어지는 조합을 포함한다.
추가의 예시적인 구현예에 따라, 확대 배지는 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함한다.
또 다른 측면에 따라, 본 발명은 불활성화된 피더층 세포가 없는 무-혈청 생육 배지; 성장인자 bFGF; 추가적인 성장인자 중 적어도 하나; 및 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021, PD 0325901 및 A 83-01로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자를 포함하는 비-인간-동물-유래된 PSC 응집체를 확대시키기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 구현예에 따라, 상기 키트는 비-인간-동물-유래된 PSC 응집체의 확대를 위한 생육 조건에 대한 설명서를 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 무-혈청 배지는 유기 기질이 추가로 없다. 몇몇 구현예에 따라, 확대 배지는 동물-유래된-성분이 추가로 없다.
몇몇 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제는 IWR1이다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 적어도 하나의 추가적인 성장인자는 TGF-β 상과의 단백질이다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, TGF-β는 TGF-β-1, TGF-β-3, 액티빈-A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
추가의 측면에 따라, 본 발명은 불활성화된 피더층 세포가 없는 무-혈청 생육 배지; 성장인자 bFGF; 성장인자 TGF-β-3; 액티빈 A; 소분자 IWR1; 및 비-인간-동물-유래된 PSC 응집체의 확대를 위한 생육 조건에 대한 설명서를 포함하는 비-인간-동물-유래된 PSC 응집체를 확대시키기 위한 키트를 제공한다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 비-인간-동물-유래된 세포를 iPSC로 재프로그램화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 (a) 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및 (b) 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA의 조합을 도입시키고; 이에 의해 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포에 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA는 합성에 의해 변형된 mRNA이다.
더욱 추가의 측면에 따라, 본 발명은 비-인간-동물-유래된 세포를 iPSC로 재프로그램화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포내로 (a) 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및 (b) 상기 비-인간-동물 유래된 세포에 내인성인 적어도 하나의 마이크로RNA의 적어도 하나의 억제제의 조합을 도입시키고; 이에 의해 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 상기 방법은 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포에 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함한다.
몇몇 구현예에 따라, 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA는 인간 또는 비-인간-동물 기원의 것이다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 소이다. 이들 구현예에 따라, 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA는 인간 또는 소 기원의 것이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
본 발명의 올리고- 또는 폴리뉴클레오티드를 PSC내로 도입시키는 것을 당해 분야에 공지된 바와 같은 임의의 방법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 교시에 따라, 적어도 하나의 mRNA를 세포의 게놈내로 통합시키지 않으며, 이에 의해 생성되는 iPSC는 유전자 변형되지 않는다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA 및/또는 적어도 하나의 면역회피 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA 및/또는 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제의 도입을 무-혈청, 무-동물-유래된 성분 액체 확대 배지에서 수행한다. 일부 구현예에 따라, 배지는 추가의 동물-유래된 성분이 없다.
일부 구현예에 따라, 상기 방법은 생성된 적어도 하나의 iPSC를 무-혈청 액체 확대 배지에서 배양하여 다수의 iPSC를 형성시킴을 추가로 포함한다. 상기 무-혈청 액체 확대 배지는 본원에서 상술한 바와 같다. 일부 구현예에 따라, 상기 사용된 무-혈청 액체 확대 배지에 Rock 억제제를 보충한다.
재프로그램화 mRNA, 면역회피 mRNA, 이중-가닥 마이크로RNA 및 적어도 하나의 마이크로RNA 억제제는 본원에서 상술한 바와 같다.
몇몇 구현예에 따라, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 및/또는 형성된 적어도 하나의 iPSC를 37.5 내지 39.5℃의 온도에서 배양한다.
몇몇 구현예에 따라, 비-인간-동물은 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 종의 것이다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도의 구현예를 나타낸다.
몇몇 구현예에 따라, 유제류는 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 유제류는 소이다. 이들 구현예에 따라, 적어도 하나의 소-유래된 세포 및/또는 형성된 적어도 하나의 iPSC를, 평균 소 체온인 38.6℃에서 배양한다.
일부 구현예에 따라, 소-유래된 세포는 소 탯줄, 소 비인두 점막, 및 소 혈액으로부터 수득된다. 몇몇 예시적인 구현예에 따라, 소 체세포를 비-침습적인 기법에 의해 수집한다.
몇몇 예시적인 구현예에 따라, 소-유래된 세포를 소 탯줄로부터 수득하며, 여기에서 상기 세포는 내피세포, 탯줄 내층세포, 와튼 젤리 세포 또는 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된다. 더욱 추가의 구현예에 따라, 소-유래된 세포를 육우 품종 벨기에 블루로부터 수득한다. 상기 품종은 마이오스타틴 유전자의 자연 돌연변이에 기인한 이중 근육 표현형을 특징으로 한다.
본 발명은 PSC 응집체 형성 분야에서 공지된 원리를 또한 사용하지만; 본 발명은 몇 가지 중요한 영역에서 공지 기술과 다르다. 먼저, 본 발명은 비-인간 동물 유래된 PSC, 특히 소-유래된 PSC의 응집체를 형성하는 방법을 제공한다. 둘째, 본 발명은 응집체의 대규모 생산 방법을 제공한다. 셋째, 본 발명은 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC, 특히 소-유래된 PSC의 응집체의 형성 방법을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 보다 충분하게 예시하기 위해 제공된다. 그러나 이들 실시예는 결코 본 발명의 넓은 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 본 발명의 범위로부터 이탈됨 없이 본원에 개시된 원리의 다수의 변화 및 변형을 용이하게 고안할 수 있다.
실시예
실시예 1: 플러싱된 배아로부터 만능 소 배아줄기세포(bESC)의 유도
세포 유도
수정 후 미리 이식된 배아를 플러싱하는 비-수술적 과정은 기존의 소 사육에서 수행되는 통상적인 과정이다(Castro Neto A.S. et al, Theriogenology 63, 2005, 1249-1255). 이러한 미리 이식된 배아를 배아줄기세포(bESC)를 유도하는데 사용하였다. 배아 플러싱은 이스라엘 인공 수정 및 육종 회사인 Sion에서 조정 및 수행되었다. 플러싱된 배아를 현장에서 광학 현미경으로 검사하고 카운트한 다음 신속하게 출원인 실험실로 이송하였다. bESC를 유도하려면 미리 이식된 배아가 배반포 단계에 있어야 한다. 그러나 플러싱된 배아는 다양한 배 발달 단계(초기 상실배에서부터 확대된 배반포까지)와 다양한 등급(불량에서부터 우수까지)으로 존재한다. 배반포 또는 상승된 배반포 단계에 도달하기 위해 상기 플러싱된 배아를 마이크로피펫을 사용하여 생물학적 후드의 현미경하에서 배 성숙 배지로 옮기고 2-3시간 동안 배양하였다. 배아의 단계와 등급을 평가하고(Stringfellow D.A., Givens M.D., Manual of the International Embryo Transfer Society, 4th edition, Champaign (IL): International Embryo Transfer Society; 2010) 배반포 단계의 배아를 선택하였다. 이어서 배아의 내부 세포 질량(ICM)을 미세수술을 사용하여 단리하였다(도 1A). 이어서 단리된 ICM을 38.6℃, 5% CO2에서 배양하고, bESC 콜로니의 확립을 모니터링하고 문서화하였다(도 1B).
bESC 특성화
본원에서 상술한 바와 같이 유도된 2개의 예시적인 bESC의 계통(본원에서 Alp 0501 및 Alp 0505로서 지정됨)을 다능성 특성에 대해 검사하였다.
이들 bESC 계통을 필수적으로 문헌[Bogliotti Y S et al., 2018. PNAS 115(9): 2090-2095]에 기재된 바와 같이 무-혈청 배지에서 증식시켰다. 간단히, 세포를 2.5 μM IWR1이 보충된 무혈청 배지 mTeSR1®(STEMCELL Technologies Inc. Canada)에서, 피더층으로서 불활성화된 마우스 배아섬유아세포(iMEF)상에서 증식시켰다. 세포를 Rho-연관된 키나제 억제제(Rock 억제제)의 첨가와 함께 3 내지 4일마다 계대배양하였다. bESC 형태는 줄기세포 형태와 합치하며 세포는 한정된 콜로니에서 증식하였다.
bESC 집단 배가 시간(PDT)을, 세포를 12-웰 플레이트에 시딩하고(3회 중복해서) 시딩 후 2, 3 및 4일째에 그 수를 카운팅하여 측정하였다(도 2). 세포 확대는 1회 계대배양(4일)에서 12-14배에 도달하였다. 집단 배가 시간(PDT)은 Alp 0501의 경우 26시간 및 Alp 0505의 경우 24시간인 것으로 계산되었으며, 이는 줄기세포분열 속도와 합치한다.
bESC 계통을 다능성 마커 OCT4, SSEA4, Nanog, Sall4 및 Dnmt3b의 발현에 대해 추가로 조사하였다.
Oct4 면역염색을 하기와 같이 수행하였다:
1. 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 20분간 4% 파라포름알데히드(PFA)와 배양하여 고정시켰다.
2. 세포를 실온에서 10분간 0.3% 트리톤-X와 배양하여 투과화하였다.
3. 세포를 PBS로 세척하였다.
4. 세포를 실온에서 30분간 5% BSA 및 0.1% 트리톤-X와 배양하여 차단하였다.
5. 세포를 4℃에서 밤새 1% BSA 및 0.1% 트리톤-X 중에서 1:100 희석된 항-Oct4 항체(Abcam)로 염색하였다.
6. 세포를 PBS로 3회 세척하고 형광 현미경에 의해 분석하였다.
SSEA4에 대한 유식 세포측정 분석을 하기와 같이 수행하였다:
1. 세포를 PBS로 2회 세척하였다.
2. 세포를 빛을 차단하여 4℃에서 1시간 동안 염색 완충제(R&D Systems) 중에서 1:50 항 SSEA4 항체(R&D Systems)와 배양하였다.
3. 세포를 PBS로 2회 세척하고 유식 세포계를 사용하여 분석하였다.
정량적인 PCR(qPCR) 분석을 하기와 같이 수행하였다:
1. 전체 RNA를 GeneJET RNA 정제 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 세포로부터 추출하였다.
2. 역전사를 RevertAid 첫 번째 가닥 cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)로 수행하였다.
3. 정량적인 PCR(qPCR)을 탐침-기반 검출 방법에 사용하기 위해 설계된 특정 프라이머를 사용하여 수행하여 특정 유전자의 발현을 분석하였다.
4. 모든 발현 데이터를 베타-액틴에 정규화하였다. 변화 배수의 상대적인 정량분석을 비교 Ct(ΔΔCt) 방법을 사용하여 계산하였다.
세포의 Oct4 면역염색은 bES 콜로니내의 세포가 양으로 염색됨(데이터 도시 안 됨)을 보였다. 유식 세포측정을 사용하여 배양물 중의 세포의 80%가 특징적인 다능성 마커 SSEA4에 대해 양성임을 입증하였다(염색되지 않은 세포의 대부분은 대개 합류 배양물 중의 세포의 15%를 구성하는 iMEF이다)(도 3A). 다능성 마커 Nanog, Sall4, Dnmt3b 및 Oct4의 고 발현이 각각에 대한 2회 계대배양에서 2개의 세포주에 대한 정량적인 PCR(qPCR) 분석에 의해 입증되었다.
전반적으로, 세포 형태, 증식 속도, 및 다능성 마커 발현에 기초하여, bESC 계통 Alp 0501 및 Alp 0505는 다능성인 것으로 나타났다.
실시예 2: bESC 증식 및 응집을 위한 무-피더 조건의 개발
무 피더 생육 조건
iMEF 피더층은 배양 배지에 필요한 인자를 분비하고 세포에 생육 기질을 공급함으로써 bESC의 증식 및 다능성을 지지한다. 그러나, 소 세포가 배양 식품에 사용될 때 간편성, 안전 문제 및 소비자 수용을 위해 추가 세포 없이 상기 세포를 증식시키는 것이 상당히 중요하다. 배양 배지에 액티빈 A를 첨가하면서 세포 배양 용기를 코팅 기질 비트로넥틴으로 코팅하는 것으로, iMEF 피더층의 사용을 성공적으로 대체하였다. 플러싱된 배아에서 유래되고 본원에서 상술한 바와 같이 증식되었지만 iMEF 피더층 대신에 비트로넥틴 및 액티빈 A를 사용하여 증식된 bESC는, 면역염색을 사용하여 OCT4(데이터 도시 안 됨) 및 유식 세포분석을 사용하여 SSEA4(도 4)에 양성인 것으로 밝혀졌다.
실시예 3: 중배엽으로의 bESC 분화
본 발명의 교시에 따라 생성된 PSC 응집체의 의도된 용도는 배양된 육류 제품의 산업에 있다. 배양된 육류는 바람직하게는 섬유아세포, 지방세포, 기질 및 내피 세포(모두 중배엽 계통의 유도체이다)를 비롯하여, 근육 조직을 포함하는 다양한 세포를 포함한다. 상응하게, 중배엽으로 분화하는 PSC의 능력을 조사하였다.
bESC의 중배엽으로의 초기 분화:
1. 세포를 하기 실시예 4에서 상세히 기재하는 바와 같이 수확하고 6-웰 플레이트에서 응집체 형성을 위해 시딩하였다.
2. 초기 조건은 하기와 같았다:
a. 생육 배지 mTeSR1(StemCell technologies) 중의 bESC
b. 생육배지 Essential 8(Thermo Fisher Scientific) 중의 bESC
3. 시딩 후 4일째에, 배지를 교체하여 하기 조건을 형성시켰다:
a. mTeSR1 중에 형성된 bESC 응집체의 배지가 남아있었다.
b. Essential 8 배지 중에 형성된 bESC 응집체의 배지가 Essential 6 배지(Thermo Fisher Scientific)로 교체되었거나, 또는
c. Essential 8 배지 중에 형성된 bESC 응집체의 배지가, 8 μM CHIR 99021이 보충된 Essential 6로 교체되었다.
4. 세포 응집체를 3일간 확대시키고, 그 후에 수집하고 재조합 트립신을 사용하여 분리시켰다.
5. 세포 펠릿을 사용하여, Oct4 및 Brachyury 유전자 발현에 대해 실시예 1에 상세히 기재된 바와 같이 RNA를 추출하고 qPCR을 수행하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, PSC의 mTeSR1 생육 배지를 E6 필수 배지로 교체한 결과, 조사된 bESC 계통(Alp 0501 및 Alp 0505) 모두에 대해 다능성 마커 Oct4의 발현이 감소되었다. 8 μM CHIR 99021의 첨가는 Oct 발현의 추가적인 감소 및 초기 중배엽 마커인 Brachyury의 증가로 이어졌으며, 이는 상기 세포가 중배엽으로 분화하는 능력을 가짐을 암시한다.
실시예 4: 비-유전자 변형된 소-유래된 만능줄기세포(PSC)의 응집체의 생성
1. 확대 배지에 소-유래된 PSC를 시딩하여 시딩 현탁 배양액 및 PSC 응집체를 형성시킴
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수득된 bESC를, 성장인자들의 조합을 포함하는 무-혈청 액체 배지인 확대 배지에서 본 발명의 3D bESC 응집체 현탁 배양액을 제조하기 위해 사용하였다.
1.1 세포의 수확 및 시딩:
iPSC 클론을 50 ng/㎖ bFGF 및 2.5 μM IWR1이 보충된 무-혈청 확대 배지 중의 iMEF 피더층상에서 증식시켰다. 3-4일 배양 후에, 콜로니 합류가 70-80%에 도달했을 때, 세포를 하기의 단계에 따라 재조합 트립신을 사용하여 탈착시켜 단세포를 형성시켰다:
a. 생물학적 후드에서 초기 단층 배양물로부터 배지를 흡출한다.
b. 세포를 PBS(-Ca/-Mg)로 세정한다.
c. 예온된 재조합 트립신 용액을 가한다.
d. 배양기 중에서 38.6℃에서 3-5분 배양한다.
e. 용기를 상기 생물학적 후드로 옮기고 대두 항-트립신을 1:50(v/v) 비로 가한다. 상기 용기의 측면을 손바닥으로 탭핑하여 탈착을 돕는다. 기본 배지(보충되지 않은 세척용)를 가하고, 부드럽게 3-4회 피펫팅하여 세포를 단세포로 해리시킨다.
f. 세포를 상기 용기로부터 수집하여 적합한 튜브로 옮긴다. 세포를 원심분리시키고, 상기 세포 펠릿으로부터 상등액을 제거하고, 신선한 배지에 재현탁시킨다.
g. 세포를 카운팅하고 적합한 배양 용기(하기 섹션 1.2 및 1.3 참조)에서 0.2-0.5 x 106 세포/㎖의 농도로 3D 현탁액에 시딩한다. 10 μM의 Rho-연관된 단백질 키나제의 억제제(Rock 억제제, Y27632) 및 1X 폴록사머 188 용액(Pluronic F-68)을 가한다.
h. 2D 조건으로 재시딩을 위해서 iMEF상에서 20-50K 세포/㎠ 밀도로 시딩한다.
1.2 6-웰 플레이트에서 응집체 형성:
bESC를 웰당, 50 ng/㎖ bFGF, 2.5 μM IWR1, 10 μM의 Rho-연관된 단백질 키나제의 억제제가 보충된 3 ㎖ 확대 배지 및 초저 부착 6-웰 플레이트에 0.3x106 세포/㎖로 시딩하였다. 세포를 38.6℃, 5% CO2 및 80% 습도에서 2-7일간 90-95 rpm의 진탕 속도로 배양하였다. 시딩 2일째부터 매일, 사용된 배지의 80%를 조심스럽게 흡출하고 신선한 확대 배지로 교체함으로써 배지를 교환하였으며, 상기 신선한 배지는 10 μM의 Rho-연관된 단백질 키나제의 억제제를 함유하지 않는다. 응집체를 시딩 후 1, 2 및 7일째에 모니터링하였다(도 6). 시딩 다음날 응집체 직경 크기는 38±22 ㎛였다(도 6A). 배양 2일 후에, 응집체 크기는 58±36 ㎛로 증가하였다(도 6B). 7일째에는 기술적 문제로 인해 측정되지 않았으나 응집체는 계속해서 ∼200 ㎛까지 성장하였다(도 6C).
실시예 5: 교반식 탱크 생물반응기 시스템에서 bESC 응집체 형성
bESC의 응집 가능성을 조사한 후에, 교반식 탱크 생물반응기 시스템에서의 증식을 조사하였다. 상기 교반식 탱크 생물반응기 시스템은 장기간 및 자동화 공정에 중요한 추가적인 인자(예를 들어 pH, 용존 산소(DO2) 및 다양한 펌프의 공급/수확 매질에의 연결)의 모니터링 및 조절을 허용한다. bESC를 웰당, 50 ng/㎖ bFGF, 2.5 μM iWR1, 10 μM의 Rho-연관된 단백질 키나제의 억제제가 보충된 70-100 ㎖의 확대 배지에 0.2-0.5x106 세포/㎖의 초기 농도로 접종하였다. pH를 7.0으로 설정하고 DO2는 40-70%로 설정하였다. 임펠러 회전 속도를 90-190 rpm으로 설정하였다. 클론 Alp0505로 실행을 수행하였다. 도 7에서 입증되는 바와 같이, 12회의 별도의 실행에서 평균 104%가 관찰되었다. 응집 수율을 시딩시 살아있는 세포 농도에 대한 접종 24h 후 살아있는 세포 농도의 백분율(살아있는/살아있는 %)로서 계산한다. 수회의 실행에서 >100% 수율을 갖는다는 것은 bESC의 대부분이 응집했을 뿐만 아니라 처음 24h 내에 응집체가 증식 및 확대되기 시작했음을 의미한다.
실시예 6: 교반식 탱크 생물반응기 시스템에서 응집체내에서 bESC의 확대
>70%의 응집 수율이 성공적으로 도달된 후에 응집체에서의 세포 확대를 조사하였다. 세포 증식을 촉진하기 위해서, 전날부터 모든 bFGF가 사용되었거나 열-불활성화되었음을 고려하여 배지에 25 ng/㎖ bFGF(전체 실행 부피에 대해)를 새로 보충하였다. 또한, 세포 대사를 추적하였으며 측정 농도가 <1 gr/L인 경우 글루코스를 가하였다. 이들 단계를 유가 방식으로 수동으로 수행하였으나; 응집체가 45 ㎛의 직경을 통과한 후에는 배지가 관류 필터-시스템을 통해 자동적으로 교환되었다(전형적으로 2-3일 증식 후에). 상기 생물반응기에서, 세포 농도의 증가에 의해 입증되는 바와 같이(도 8D), 시딩으로부터 0.2X106 생육성 세포/㎖에서 4일째에 1.08X106 생육성 세포/㎖(100 ㎖ 중에서)로 5.4배의 확대가 관찰되었다. 나란히, 상기 응집체는 직경이 1일째에 31 ㎛에서 4일째에 56 ㎛로 증가하였다(도 8A-C, 8E). 다능성을 0, 3 및 5일째에 분석하였으며 모든 시점에서 >70%가 남아있었다(도 8D, 5일째 데이터는 도시되지 않음, %SSEA4 = 83%). 응집체 초기 크기, 세포수 및 4일 후 관찰된 확대 배수를 기반으로 하는 이론적 계산은 본원의 하기 표 1에서 입증되는 바와 같이 ∼2.5X107 세포/㎖ 이상의 세포의 100배 확대가 예상된다.
| 그룹 | 세포/응집체 직경(㎛) | 세포/응집체 반경 (㎛) |
부피 (㎛3) |
다공도 인자 | 최종 부피 (㎛3) |
세포수/응집체 | 확대 인자 | 세포 농도 (x106) |
| 단세포 | 18 | 9 | 3052 | 0 | 3052 | 1 | NA | 0.2 |
| 1일후 응집체 | 36 | 18 | 24417 | 0.8 | 19533 | 6 | NA | NA |
| 5 M/㎖ 응집체 | 106 | 53 | 623298 | 0.8 | 498639 | 163 | 26 | 5.1 |
| 25 M/㎖ 응집체 | 180 | 90 | 3052080 | 0.8 | 2441664 | 800 | 125 | 25 |
| 최종 응집체 |
260 | 130 | 9198107 | 0.8 | 7358485 | 2411 | 377 | 75.3 |
실시예 7: 작은 응집체 및 단세포의 재-응집
본 발명의 일부 구현예에 따라, PSC 응집체의 일부는 분리 및 재-응집 과정을 통해 대규모 액체 배양 조건에서 세포 확대-주기를 위한 연속 수용조로서 작용한다. PSC 응집체의 대규모 생산, 특히 세포 배양 육류 제품의 생산에 사용하기 위한 소 유래된 PSC 응집체의 생산을 위해서는 반복적인 분리 및 재-응집 단계를 포함하는, 전체 응집체 형성 과정이 폐쇄된 시스템에서 수행되는 것이 추가로 상당히 중요하다. 폐쇄된 시스템은 응집체 해리 용액을 버리지 않고 동일한 용기에서 분리 및 재-응집 단계를 수행하거나, 또는 예를 들어 상기 용기에 연결된 폐쇄된 시스템 중의 세포 보유/분리 장치를 사용하여 상기 해리 용액을 제거하고 멸균 환경 및 자동화된 공정을 유지하도록 하는 루프를 형성함을 지칭한다. 세포 보유/분리 장치는 일반적이며 3 내지 2000 L 범위의 모든 용기 시스템에 추가될 수 있다.
초기 재-응집 시도에서, 신선한 배지에 재-시딩된, 4 및 7일된 응집체의 분리로부터 수득된 작은 응집체/단세포는 단지 소수의 매우 큰 응집체만을 형성하였다. 또한, 상기와 같은 재-응집 후 세포의 다능성은 유지되지 않았다. 추가의 재-응집 시도에서, 3일된 응집체의 분리로부터 수득된 작은 응집체/단세포(도 9A)를 해리 시약(단백질 분해 효소, DNA 분해 효소 및 킬레이트제)을 함유하는 배지에 재-시딩하였다. 뜻밖에도, 상기 해리 시약의 존재는 재-응집을 가능하게 하며, 상기 형성된 다수의 작은 응집체(도 9B)는 세포의 증식 및 응집체의 확대를 가능하게 한다.
실시예 8: 소 탯줄로부터 기질 간엽 세포의 단리
1. 소 탯줄(bUC) 및 태반을 염수로 적신 천으로 감싼 수집 부위에서 수집하고 4℃의 실험실로 옮겼다. 조직 처리를 수집 후 2-4시간 이내에 시작하였다.
2. 조직을 생물안전 캐비넷에서 얼음상에서 유지된 150-㎜ 페트리 디쉬에 놓고 주사바늘과 주사기를 사용하여 항생제(Pen-strep 용액(Pen-100 u/㎖, Strep-0.1 ㎎/㎖), 젠타마이신 용액(5 ㎎/㎖), 암포테리신 B(0.25 ㎎/㎖)를 포함한다)가 있는 빙냉 PBS로 수회 세정하여 혈병을 제거하였다.
3. bUC(도 10A)를 분리시키고 종방향으로 절단하여, 상피를 건드리지 않으면서 혈관 및 주변 와튼젤리(WJ)를 완전히 노출시켰다.
4. WJ(도 10B)를 혈관 및 내부 상피로부터 긁어내고 페트리 디쉬로 옮겼다. 혈관을 제거하였다.
5. 조직을 기계적 전단 및 효소적 해리에 의해 1- 내지 2-㎜ 조각으로 절단하였다(도 10C)(WJ 및 탯줄 내층(CL)).
6. WJ 조직 조각을 항생제(상기와 같은)가 있는 PBS로 4회 세척하고, 30-40개의 조직 조각을 150-㎝ 조직 배양 디쉬상에 도말하고, 세포 부착 기질과 함께 또는 상기 기질 없이 완전 배지(DMEM(글루타민 및 글루코스 존재), Pen-strep 용액 1%, 젠타마이신 용액 1%, 소 태아 혈청 10%을 포함한다) 또는 무-혈청 배지를 총 20 ㎖ 부피로 가하였다. 이어서 상기 배양물을 2-3일간 38.6℃에서 배양하여 조직 조각이 부착되게 하였다.
7. CL 조직 조각을 항생제(상기와 같은)가 있는 PBS로 4회 세척하였다. 상기 조직 조각을 플레이트 전체에 펼쳐놓았다. 이어서 상기 배양물을 2-3일간 38.6℃에서 배양하여 조직 조각이 부착되게 하였다.
8. 완전 배지를 모든 처리에 대해서 2-3일 배양 후에 교환하였다.
9. 외식편의 세포를 매일 조사하여 증식결과의 출현을 확인하였으며; 세포 증식이 소-유래된 CL의 경우 7-10일의 배양 후에 부착된 외식편으로부터 자명하였다. 이 시점에서부터 3일마다 또는 필요에 따라 배지를 교체하고 세포를 80% 합류율에서 트립신을 사용하여 확대시켰다(도 10D).
10. 1-3회 계대배양 후에 세포를 모으고 10% DMSO가 있는 생육 배지에 재현탁시키고 극저온 튜브(극저온바이알)당 0.2-1.5*106 세포의 농도로 세포은행으로서 동결시켰다.
11. 세포를 38.6℃에서 1-2분간 해동시키고 생육력에 대해 카운팅하였다. 해동시 상기 생육력은 73%를 초과하였다.
사용된 2개의 세포은행 모두에서 생성된 탯줄 내층 세포는 P8/P9까지 낮은 계대에서 섬유아세포와 유사한 형태 및 높은 증식 속도를 갖는 간엽 기질 세포의 전형적인 특징을 가지며 P10에서는 더 큰 세포질로 노화된다. 탯줄 내층 세포의 PCR 분석 결과 상기 세포가 NCAD, THY1/CD90 및 NCAM/CD146 간에 간엽 세포의 전형적인 마커에 대해 양성인 것으로 나타났다.
실시예 9: 소 배아섬유아세포(BEF) 및 근아세포(BEM)의 단리
1. 소 배아의 뒷다리를 태아로부터 수확하고 저온 PBS(-Ca/-Mg) + 1% Pen-Strep이 있는 50 ㎖ 튜브 중에서 실험실로 옮겼다.
2. 생물학적 후드에서, 혈관, 지방조직 및 결합조직을 스테인레스-강 가위 및 족집게를 사용하여 근육조직에서 제거하였다.
3. 선택된 근육조직 조각을 신선한 PBS가 있는 150 ㎜ 디쉬로 옮기고 용액을 2회 교환하였다.
4. 모든 유체를 제거하고 선택된 양의 조직을 페이스트-유사 점조도로 절단하였다.
5. 페이스트를 10 ㎖ DPBS(-Ca/-Mg) 중의 30 ㎎ 콜라게나제(1형, Gibco)를 함유하는 50 ㎖ 튜브(=튜브 #1)로 옮기고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과하였다.
6. 50 ㎖ 튜브를 파라필름으로 밀봉하고 38.6℃에서 1시간 동안 궤도 진탕기(90 RPM) 상에 수평으로 놓았다.
7. 트립신을 단계 5의 종료 전에 15분간 가열하였다.
8. 튜브 #1을 130 RCF에서 1.5분간 원심분리시키고, 이어서 상부 sup(세포+지방 함유)를 새로운 50 ㎖ 튜브(=튜브 #2)로 옮겼다.
9. 20 ㎖의 예온된 트립신을 튜브 #1(잔여 조직 함유)에 가하고 38.6℃에서 20분 동안 궤도 진탕기(90 RPM) 상에 수평으로 놓았다.
10. 나란히, 튜브 #2를 285 RCF에서 5분간 원심분리시키고(세포+조직 잔사 펠릿화), 이어서 sup를 버리고 펠릿을 10 ㎖ 표준 배지로 재-현탁시켰다.
11. 일단 트립신화가 완료되면(단계 #8), 튜브 #1을 285 RCF에서 5분간 원심분리시켰다.
12. 튜브 #1의 sup의 대부분(5 ㎖ 표시까지)을 제거하였다.
13. 표준 배지를 상기 튜브 #1의 10 ㎖ 표시까지 가하였다.
14. 튜브 #1 중의 전체 부피를 13 ㎖ 피펫으로 ∼X15회 피펫팅함으로써 조직 조각을 기계적으로 파괴하였다.
15. 튜브 #1을 130 RCF에서 1.5분간 원심분리시켰다.
16. 튜브 #1(∼5 ㎖)의 중간 상을 수집하고 튜브 #2로 옮겼다.
17. 단계 #14 내지 17을 2회 이상(총 3회) 반복하였다.
18. 최종적으로, 세포 풀 튜브 #2를 5분간 285 RCF에서 원심분리시켜 모든 수집된 세포를 펠릿화하였다.
19. sup를 버리고 세포를 20 ㎖ 표준 배지에 재현탁시켰다.
20. 세포 현탁액을 40 ㎛ 스트레이너를 통해 2X100 ㎜ 디쉬(각각 ∼10 ㎖)로 통과시켰다.
21. 2개의 디쉬를 모두 38.6℃ 5% CO2에서 2시간 동안 배양기에 움직이지 않게 놓았다.
22. 완료 1-시간 전에, 2X100 ㎜ 디쉬를 실온에서 0.1% 젤라틴으로 예비-코팅하였다.
23. 도말 2시간 후에, 세포 디쉬를 다시 후드로 옮기고 상부 sup를 가능한 한 많이 조심해서 버렸다(죽은 부착되지 않은 부유 세포를 함유한다).
24. 디쉬를 약간 기울여 고정된 경사각을 유지시켰다. 이어서 상기 디쉬를 예온된 20% FBS 배지로 서서히 세정하고 15 ㎖ 튜브(근아세포 풀)로 옮겼다. 세정을 적어도 2회 이상(총 3회) 반복하였다.
25. 최종적으로, 모든 세포를 새로 코팅된 100 ㎜ 디쉬에 시딩하였다.
26. 코팅되지 않은 TC 플레이트에 부착된 채로 남은 세포가 목적하는 섬유아세포이다.
실시예 10: 지방세포로의 세포 분화
소 세포가 지방세포로 분화하는 조건은 지방산 및 bFGF 20 ng/㎕, IWR1 2.5 μM 및 Rock 억제제 10 μM의 조합이 보충된 무혈청 배지(지방세포 분화 배지)를 요하였다.
물질 및 용액
1. 최대 계대 6의 BEF 배양물
2. 표준 배지(DMEM HG, 10% FBS, 4 mM L-글루타민, 1% Pen-Strep)
3. PBS, (-)Ca+2, (-)Mg+2, BI 02-023-1A
4. 무혈청 생육 배지:
ES 배지(DMEM/F12 배지, 15% KOSR Gibco, 1% NEAA, 4 mM L-글루타민, 0.1 mM -2-머캅토에탄올, 1% Pen-Strep)
5. 지방세포 분화 배지:
5.1 무혈청 생육 배지
5.2 bFGF 20 ng/㎕
5.3 IWR1 2.5 μM
5.4 Rock 억제제 10 μM
과정
0일째:
1. BEF 배양물을 표준 배지에 15,000 세포/㎠의 농도로 시딩한다.
2. 38.6℃, 5% CO2에서 밤새 배양한다.
1일째:
배지를 버리고 새로 제조된 지방세포 분화 배지를 가한다.
3-9일째:
후일 동안 격일로 지방세포 분화 배지를 교환한다. 배지는 매번 새로 제조해야 한다.
5-10일째:
배양물을 매일 검사하고 오일 소포가 가시화될 것으로 예상된다.
11-30일째:
지방세포 분화 수율의 증가가 예상된다.
지방세포의 고정 및 착색:
1. 오일 레드 O 실행 용액을 제조하기 위해서: 3부의 오일 레드 O 모액을 2부의 dH2O에 가한다.
2. 충분히 혼합하고, 10분간 정치시킨다.
3. 0.2 ㎛ 주사기 필터 또는 1번 와트만 페이퍼 또는 균등물로 여과한다
4. 각 웰에 이소프로판올(60%)을 가하고 5분간 배양한다.
5. 이소프로판올을 제거하고 오일 레드 O 실행 용액을 가하여 세포를 완전하고 균일하게 덮는다(6 웰 플레이트 중의 1 ㎖/웰).
6. 플레이트 또는 디쉬를 회전시키고 10-20분간 배양한다.
7. 오일 레드 O 용액을 제거하고 과잉의 염료가 더 이상 보이지 않을 때까지 필요에 따라 dH2O로 2-5X 세척한다.
상술한 지방세포 분화 배지에 노출될 때, 소 배아섬유아세포(BEF) 배양물은 지방세포로의 분화를 나타내었다. 분화된 세포를 오일 레드 O 염색에 의해 염색하였다. 오일 레드 O는 트리글리세라이드 및 지질을 염색한다(도 11). 세포가 지방세포로 분화하는 조건은 지방산 및 bFGF 20 ng/㎕, IWR1 2.5 μM 및 Rock 억제제 10 μM의 특정 조합이 보충된 무혈청 배지(지방세포 분화 배지)를 요하였다.
지방세포의 출현은 세포를 지방세포 분화 배지와 배양한 지 5일째에 시작되었다. 지방세포 분화는 시간이 지남에 따라 증가하였다.
bFGF는 다른 역할 중에서도 지방생성에 핵심 전사 인자인 PPAR감마2의 발현을 유도한다. IWR-1은 WNT 신호전달 억제제이다. WNT 신호전달은 페록시솜 증식인자-활성화된 수용체 감마(PPAR감마) 및 CEBPA의 유도를 차단함으로써 지방생성을 억제한다. IWR-1의 첨가는 WNT 경로를 억제하며 상응하게 지방생성이 유도된다. ROCK 억제제, Y-26732는 세포의 생존 및 증식을 증대시킨다.
지방 조직으로부터 단리된 소 기질 줄기세포가 또한 상술한 지방세포 분화 배지의 사용으로 지방세포로 효율적으로 분화함을 보였다.
실시예 11: 에피솜 플라스미드를 사용하는 소 세포의 재프로그램화:
BEF는 dTomato 적색 마커와 함께 4개의 표준 재프로그램화 인자(Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)(모두 하나의 프로모터에 의해 조절된다)의 인간 서열을 암호화하는 단일 에피솜 플라스미드(CoMiP Plasmid #63727)를 사용하여 소 유도만능줄기세포(biPSC)로 재프로그램화되었다. 플라스미드 DNA-기반 재프로그램화 방법의 사용은 형질감염된 DNA의 숙주 세포 게놈내로의 무작위 게놈 통합의 잠재적인 위험을 극적으로 감소시키며, 플라스미드 형질감염에 의해 생성된 대부분의 인간 iPSC 세포는 통합이 없는 것으로 밝혀졌다(Diecke S 2015, Sci. Rep., Article number:8081).
BEF 세포를 계대 4(P4)에서 12 ㎍의 CoMiP 플라스미드에 의한 일렉트로포레이션에 의해 형질감염시켰다. 세포 생존을 증가시키기 위해서, CoMiP 플라스미드를 내독소 부재 Qiagen 플라스미드 미니프렙 키트를 사용하여 정제하였다.
형질감염된 세포를 0.1% 젤라틴으로 덮인 10 ㎝ 플레이트 상에서 DMEM 10% FBS 배지에 바로 시딩하고, 형질감염 효율을 하루 후에 CoMiP 플라스미드내 dTomato 컬러 마커의 적색 형광 단백질 발현에 의해 평가하였다. 세포를 4일간 일렉트로포레이션으로부터 회수할 수 있게 하였다. 회수에 이어서, 세포를 트립신처리하고 조사된 마우스 배아 피더층(iMEF)의 상단에 시딩하였다. 다음날 세포 배지를, 2.5 μM 인간 IWR1 및 20 ng/㎖ 인간 bFGF를 포함하는 무혈청 확대 배지(또한 "재프로그램화 배지"라 칭한다)로 교환하였다. 10 μM rock 억제제를 시딩시 가하였다. 세포 배지를 격일로 재공급하였다. 배아줄기세포(ES)-유사 콜로니가 형질감염에 이어서 배양 2주째에 나타났다(도 12A).
단일 콜로니를 손으로 채집하고 세포-은행 및 특성화를 위해 확대시켰다. iPSC는 연장된 계대배양에 이어서 ES-유사 형태를 유지하였다. 클론 확대 후에, iPSC는 무-피더 생육 조건에 맞게 조정되었으며 2.5 μM IWR1 및 50 ng/㎖ 인간 bFGF가 보충된 확대 배지에서 비트로넥틴상에서 증식을 나타내었다(도 12B).
iPSC를 재프로그램화 벡터내의 OCT4와 KLF4 사이의 접합 영역을 표적화하는 프라이머를 사용하여, PCR 분석에 의해 가능한 플라스미드 통합 사건에 대해 선별하였으며, 통합이 없는 것으로 밝혀졌다(도 12C).
실시예 12: 변형된 mRNA를 사용하는 소 세포의 재프로그램화
BEF 세포를, miR203b 및 miR302d를 암호화하는 소 마이크로RNA 클러스터 서열 중 2개와 함께 소 게놈 서열에 따라 4개의 표준 재프로그램화 인자 Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc의 mRNA를 암호화하는 RNA를 사용하여 재프로그램화되도록 유도하였다.
RNA 형질감염에 대한 세포 독성을 감소시키기 위해서, 세포를 B18R 우두 바이러스 서열을 암호화하는 mRNA로 추가로 형질감염시켰다. 형질감염 효율 및 mRNA 발현 평가를 위해서, 세포를 mCherry 적색 마커를 암호화하는 변형된 mRNA로 형질감염시켰다.
우리가 설계한 mRNA 분자의 증대된 번역 및 보다 높은 안정성을 획득하기 위해서 mRNA 변형(모든 염기상의 Ψ5mC, CleanCAP AG, 120-nt Poly-A)을 사용하였다.
RNA 형질감염 프로토콜:
1. BEF를 수확하고, DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep 배지에 시딩하고(10K 세포/㎠) 38.6℃에서 밤새 배양하였다.
2. 배지를 pen-strep 없이 DMEM + 10% FBS로 교환하고 세포를 배양기로 반송하였다.
3. 형질감염 믹스를 제조하였다(100K 세포당): mRNA 및 마이크로RNA를 250 ㎕ Opti-MEM 무혈청 배지에서 희석하였다. 형질감염 시약을 가하고 반응물을 혼합하고 RT에서 5분간 배양하였다.
4. 형질감염 믹스를 세포 배지에 직접 한 방울씩 가하였다.
5. 세포를 38.6℃에서 밤새 배양하였다.
6. 형질감염을 4 연속일 동안 4회 수행하였다(단계 2-5 x 4).
7. 최종 형질감염에 이어서, 배지를 교환하고 세포를 38.6℃에서 2-3일 동안 배양하여 회수할 수 있게 하였다.
8. 세포를 수확하고 생육성에 대해 카운팅하였다.
9. 106 세포를 RNA 단리 및 OCT4 mRNA 발현 수준의 qPCR 분석을 위해 확보하였다.
10. 세포를 DMEM + 10% FBS + 1% Pen-Strep 배지에서 불활성화된 마우스 배아 피더층(iMEF)의 상단에 5K-10K 세포/㎠로 시딩하였다. 세포 펠릿을 또한 채취하였다.
11. 세포를 38.6℃에서 밤새 배양하였다.
12. 세포 배지를 흡출하고, 2.5 μM 인간 IWR, 20 ng/㎖ 인간 bFGF 및 10 μM rock 억제제가 보충된 확대 배지로 교체하였다.
13. 세포 배지를 3주간 격일로 재공급하고, 배양물을 ES-유사 콜로니의 출현에 대해 선별하였다.
형질감염 효율을 평가하기 위해서, 세포를 mCherry 및 OCT4 발현 모두에 대해 분석하였다. mCherry 발현을 형광 현미경을 사용하여, 각각의 형질감염 24시간 후에 평가하였다(도 13A 형광 필터, 13B 명시야). 네 번째 형질감염에 이어서, 세포를 주말에 걸쳐 회수할 수 있게 하고 이어서 세포를 트립신을 사용하여 수확하고 세포 펠릿을 qPCR 분석을 위해 채취하였으며, 이는 재프로그램화 mRNA 및 miRNA에 의해 유도된 BEF(iBEF)에서 OCT4의 높은 전사 수준을 나타내었다(도 13C).
특정 구현예에 대한 전술한 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 충분히 드러낼 것이기 때문에 다른 사람들이 현재의 지식을 적용함으로써 과도한 실험없이 일반적인 개념으로부터 이탈되지 않고 상기와 같은 특정 구현예를 다양한 적용을 위해 쉽게 수정 및/또는 조정할 수 있으며, 따라서, 상기와 같은 적응 및 수정은 개시된 구현예의 등가물의 의미 및 범위 내에서 이해되어야 하고 의도되어야 한다. 본원에 사용된 어구 또는 용어는 제한이 아니라 설명을 위한 것임을 이해해야 한다. 다양한 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 물질 및 단계는 본 발명으로부터 이탈됨 없이 다양한 대안적인 형태를 취할 수 있다.
Claims (76)
- 비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 만능줄기세포(pluripotent stem cell; PSC)의 응집체(aggregate)의 생성 방법으로서,
a. 적어도 하나의 PSC를 확대 배지(expansion medium)에 시딩(seeding)하여 현탁 배양액을 형성시키고, 상기 확대 배지가 성장 인자 bFGF, 및 (i) 적어도 하나의 추가적인 성장인자 및 (ii) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), 및 A 83-01(C25H19N5S)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자 중 적어도 하나의 조합을 포함하는 무-혈청 액체 배지(serum-free liquid medium)인 단계; 및
b. 상기 현탁 배양액을 응집체 형성 및 응집체 확대를 가능하게 하는 조건하에서 증식(growing)시켜 상기 PSC의 균질한 응집체를 형성시키는 단계
를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서,
시딩 및 증식이, 세포 부착 능력이 필수적으로 없는 물질의 벽을 갖는 용기내에서 수행되는 방법. - 제1항에 있어서,
적어도 하나의 PSC가 신선한 세포 또는 냉동 모액(frozen stock)으로부터 수득된 세포인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
현탁 배양액의 증식 단계 (b)가, 형성된 균질한 응집체를 보다 작은 응집체 및/또는 단세포로 분리시키고 상기 보다 작은 응집체 및/또는 단세포(single cell)를 재-응집(re-aggregating)시켜 균질한 응집체를 재-형성시키는 단계를 포함하는 방법. - 제4항에 있어서,
균질한 응집체의 분리가 상기 응집체를 해리 시약 및/또는 해리력(dissociation force)에 노출시킴을 포함하는 방법. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
재-응집이 보다 작은 응집체 및/또는 단세포를 확대 배지에 시딩함을 포함하는 방법. - 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
형성된 균질한 응집체를 보다 작은 응집체 및/또는 단세포로 분리시키고 상기 보다 작은 응집체 및/또는 단세포를 재-응집시키는 단계를 적어도 1회 반복하는 방법. - 제7항에 있어서,
형성된 균질한 응집체를 보다 작은 응집체 및/또는 단세포로 분리시키고 상기 보다 작은 응집체 및/또는 단세포를 재-응집시키는 단계를, 약 106 세포/㎖ 내지 109 세포/㎖의 세포 농도에 도달할 때까지 반복하는 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
시딩 및 재-응집 단계가 Rho-연관된 단백질 키나제(Rock)의 억제제를 확대 배지에 가함을 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
폐쇄된 시스템에서 수행하는 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
Wnt-β-카테닌 신호전달 경로(signaling pathway)의 억제제가 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인(porcupine) 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제11항에 있어서,
Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제가 IWR-1인 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
확대 배지가 bFGF 및 적어도 하나의 소분자를 포함하는 조합을 포함하는 방법. - 제13항에 있어서,
확대 배지가 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함하는 방법. - 제13항에 있어서,
확대 배지가 성장인자 bFGF 및 소분자 IWR1 및 CHIR 99021로 이루어지는 조합을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 추가적인 성장인자가 형질전환 성장인자 베타(TGF-β) 상과(superfamily)의 단백질인 방법. - 제16항에 있어서,
TGF-β가 TGF-β-1, TGF-β-3, 액티빈-A 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제17항에 있어서,
확대 배지가 bFGF, 및 TGF-β-1, TGF-β-3 및 액티빈-A 중 적어도 하나를 포함하는 조합을 포함하는 방법. - 제17항에 있어서,
확대 배지가 성장인자 bFGF, TGF-β-1, TGF-β-3, 및 액티빈-A 중 적어도 하나, 및 소분자 IWR1로 이루어지는 조합을 포함하는 방법. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
PSC의 시딩 단계 (a)가 적어도 하나의 PSC를 입자내에 캡슐화(encapsulating)하고 다수의 상기 입자를 확대 배지내에 시딩함을 추가로 포함하는 방법. - 제20항에 있어서,
입자가 적어도 하나의 외부 외피층(outer shell layer)에 의해 둘러싸인 적어도 하나의 PSC를 포함하는 내부 코어(inner core)를 포함하는 방법. - 제21항에 있어서,
적어도 하나의 외부 외피층이 유체 투과성 식품 등급의 용해성 물질인 방법. - 제22항에 있어서,
식품 등급의 용해성 물질이 중합체, 중합체 전구체(precursor), 공중합체 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
내부 코어가 적어도 하나의 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 증식을 지지하는 적어도 하나의 화합물을 추가로 포함하는 방법. - 제24항에 있어서,
증식을 지지하는 적어도 하나의 화합물을 느린-방출 및/또는 지연 방출 제형으로 제형화하는 방법. - 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
캡슐화된 PSC가 내부 코어내에서 증식하여 입자내에 PSC 응집체를 형성하는 방법. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
현탁 배양액을 동적 회전, 정적 조건 또는 이들의 조합하에서 배양하는 방법. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
현탁 배양액을 세포가 유래되는 비-인간-동물 종의 체온인 온도에서 증식시키는 방법. - 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
현탁 배양액의 부피가 용기당 약 50 ㎖ 내지 약 15,000 리터인 방법. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
형성된 PSC 응집체가 약 50 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 직경을 갖는 방법. - 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
비-인간-동물이 유제류(ungulate), 가금류, 수생동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제31항에 있어서,
유제류가 소, 양, 말(equine), 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마 또는 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제31항 또는 제32항에 있어서,
비-인간-동물 PSC가 유도 PSC(iPSC), 배아줄기세포(ESC) 및 비-배아줄기세포(ESC)로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제33항에 있어서,
비-인간-동물이 소이고, 소 PSC가
i. 적어도 하나의 소 전-배아(pre-embryo)를 수득하는 단계;
ii. 상기 적어도 하나의 소 전-배아를 배반포 또는 상승된 배반포 단계에 도달하도록 배양하는 단계;
iii. 상기 배반포로부터 적어도 하나의 세포를 수득하는 단계; 및
iv. 상기 적어도 하나의 세포를, 성장인자 bFGF, 및 (i) 적어도 하나의 추가적인 성장인자 (ii) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제, CHIR 99021(C22H18Cl2N8), PD 0325901(C16H14F3IN2O4), 및 A 83-01(C25H19N5S)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 소분자 중 적어도 하나의 조합을 포함하는 배양 배지에서 배양하여, 다수의 소-유래된 배아줄기세포를 수득하는 단계
를 포함하는 방법에 의해 생성된 배아줄기세포인 방법. - 제34항에 있어서,
적어도 하나의 소 전-배아를 배아 플러싱 과정(flushing procedure)에 의해 수득하는 방법. - 제33항에 있어서,
iPSC를, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 내로
a. 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및
b. 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA
의 조합을 도입시키고; 이에 의해 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함하는 방법에 의해 생성시키는 방법. - 제36항에 있어서,
적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 내로 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함하는 방법. - 제36항 또는 제37항에 있어서,
이중-가닥 마이크로RNA가 miR-302a, miR-302b, miR-302c, miR-302d, miR-367, miR-218, miR-449b 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제33항에 있어서,
iPSC를, 적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 내로
a. 재프로그램화 인자를 암호화하는 적어도 하나의 재프로그램화 mRNA; 및
b. 상기 비-인간-동물-유래된 세포에 내인성인 적어도 하나의 마이크로RNA의 적어도 하나의 억제제
의 조합을 도입시키고; 이에 의해 적어도 하나의 iPSC를 생성시킴을 포함하는 방법에 의해 생성시키는 방법. - 제39항에 있어서,
적어도 하나의 비-인간-동물-유래된 세포 내로 적어도 하나의 면역회피 mRNA를 도입시킴을 추가로 포함하는 방법. - 제39항 또는 제40항에 있어서,
적어도 하나의 억제제가 miR-145에 대한 것인 방법. - 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 억제제가 RNA 억제성(RNAi) 분자인 방법. - 제36항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 재프로그램화 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키지 않는 방법. - 제36항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 재프로그램화 mRNA, 및/또는 적어도 하나의 면역회피 mRNA 및/또는 적어도 하나의 이중-가닥 마이크로RNA 및/또는 적어도 하나의 miRNA 억제제의 도입을 무-혈청 액체 확대 배지에서 수행하고, 상기 적어도 하나의 mRNA를 세포의 게놈 내로 통합시키지 않는 방법. - 제36항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들 내로 도입된 재프로그램화 mRNA가 OCT4, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28, KLF5 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제37항 또는 제40항에 있어서,
비-인간-동물-유래된 세포 또는 세포들 내로 도입된 면역회피 mRNA가 우두 바이러스(vaccinia virus)로부터의 E3, K3, B18R[EKB] 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제36항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
비-인간-동물이 소이고, 소-유래된 세포가 소 탯줄, 소 비인두 점막, 소 혈액 및 소젖으로부터 수득되는 방법. - 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
균질한 응집체가 적어도 하나의 다능성 마커를 발현하는 세포의 적어도 70%를 포함하는 방법. - 제48항에 있어서,
적어도 하나의 다능성 마커가 단계-특이적인 배아 항원-4(SSEA4), 8량체-결합 전사인자 4(Oct4), Sall4 전사인자, Nanog 호메오박스(homeobox) 전사인자, Lin28A 번역인자, DNA-메틸트랜스퍼라제 Dnmt3b, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC의 다수의 균질한 응집체.
- 무-혈청 액체 배지 및 다수의 균질한 응집체를 포함하는 현탁액으로서, 상기 응집체가 적어도 70%의 생육성, 비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC를 포함하는 현탁액.
- 제51항에 있어서,
비-유전자 변형된 비-인간-동물 유래된 PSC가 약 16 내지 32시간마다 분열하는 현탁액. - 제51항 또는 제52항에 있어서,
비-유전자 변형된 비-인간-동물-유래된 PSC가 적어도 하나의 다능성 마커를 발현하는 현탁액. - 제53항에 있어서,
다능성 마커가 단계-특이적인 배아 항원-4(SSEA4), 8량체-결합 전사인자 4(Oct4), Sall4 전사인자, Nanog 호메오박스 전사인자, Lin28A 번역인자, DNA-메틸트랜스퍼라제 Dnmt3b, 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 현탁액. - 제51항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
PSC가 세포-세포 부착에 기여하는 적어도 하나의 표면 단백질을 발현하는 현탁액. - 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
응집체가 약 200 ㎛ 내지 약 500 ㎛의 평균 크기를 갖는 현탁액. - 제51항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
약 106 내지 약 109의 비-유전자 변형된, 비-인간-동물 유래된 PSC를 포함하는 현탁액. - 제51항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서,
비-인간-동물이 유제류, 가금류, 수생동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 현탁액. - 제58항에 있어서,
유제류가 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마 및 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 현탁액. - 제59항에 있어서,
유제류가 소인 현탁액. - 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른, 비-유전자 변형된 비-인간 동물-유래된 PSC의 다수의 균질한 응집체 또는 이를 포함하는 현탁액을 포함하는 세포 배양 육류.
- 제50항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따른, 비-유전자 변형된 비-인간 동물-유래된 PSC의 다수의 균질한 응집체의 자손을 포함하는 세포 배양 육류 제품(cell grown meat product).
- 제62항에 있어서,
자손이 PSC로부터 분화된 세포를 포함하여 근육세포, 기질세포, 내피세포 및 지방세포 중 적어도 하나를 형성하는 세포 배양 육류 제품. - PSC, 그의 자손, 체세포 및 이들의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 비-인간-동물 세포를 지방세포로 분화시키는 방법으로서, 상기 세포를 (i) Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제; 및 (ii) 적어도 한 가지 유형의 지방산 중 적어도 하나를 포함하는 무-혈청 액체 배지에서 배양하고; 이에 의해 상기 세포를 지방세포로 분화시킴을 포함하는 방법.
- 제64항에 있어서,
배지가 Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 적어도 하나의 억제제 및 적어도 한 가지 유형의 지방산의 조합을 포함하는 방법. - 제64항 또는 제65항에 있어서,
배지가 성장인자 bFGF를 추가로 포함하는 방법. - 제64항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서,
배지가 Rock 억제제를 추가로 포함하는 방법. - 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제가 IWR1, JW67, NSC668036, KY02111, 니클로스아미드, DKK1 또는 si-베타-카테닌, 포큐파인 억제제, 및 IWP-2로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제68항에 있어서,
Wnt-β-카테닌 신호전달 경로의 억제제가 IWR-1인 방법. - 제64항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서,
지방산이 유리 지방산, 저분자량 지방산, 이의 에스테르, 이의 염 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
PSC가 지방 조직으로부터 단리된 기질 줄기세포인 방법. - 제64항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서,
세포가 배아 근육 조직으로부터 유래된 세포의 집단을 포함하는 방법. - 제72항에 있어서,
배아 근육 조직으로부터 유래된 세포가 배아 섬유아세포(EF)를 포함하는 방법. - 제64항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서,
비-인간-동물이 유제류, 가금류, 수생 동물, 무척추동물 및 파충류로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제74항에 있어서,
유제류가 소, 양, 말, 돼지, 기린, 낙타, 사슴, 하마, 및 코뿔소로 이루어지는 그룹 중에서 선택되는 방법. - 제75항에 있어서,
유제류가 소인 방법.
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