CN111566202A - 稳定的多能牛胚胎干细胞的高效衍生 - Google Patents

Abstract

本公开提供了有蹄类动物胚胎干细胞（ESC），其衍生自来自胚胎的植入前胚泡或多能细胞的内细胞团。从农业和生物医学的角度来看，从家养有蹄类动物中衍生出稳定的ESC对基因组测试和选择、基因工程、以及为研究人类疾病提供实验工具非常重要。牛是通常用于食品和生物反应器的最重要的家养有蹄类动物之一。

Description

稳定的多能牛胚胎干细胞的高效衍生

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C. § 119(e)要求2018年1月12日提交的美国临时申请62/616,975号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

尽管进行了多年的研究，但是在牛物种中稳定的多能（pluripotent）胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）的衍生仍具有挑战性。大多数（若非全部）报道的牛ESC细胞系没有通过常用的多能性试验，即体外分化测定、体内畸胎瘤形成和/或嵌合体形成。而且，它们在大量传代后显示出较差的衍生效率、有限的增殖能力和多能性标记的丧失。因此，本领域中需要衍生稳定的牛多能ESC的方法。本公开满足了这种需求并且还提供了相关的优点。

发明概述

本文提供了用于产生稳定的有蹄类动物（ungulate）胚胎干细胞（ESC）的方法，所述方法包括以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：在细胞培养基中培养从胚胎分离的有蹄类动物胚泡（blastocyst）细胞或多能细胞，所述培养基含有：（i）灭活的饲养细胞；（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（Fibroblast Growth Factor 2，FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂。在一方面，从胚胎分离的有蹄类动物ESC、胚泡细胞或多能细胞是牛或绵羊细胞。在另一方面，从胚胎分离的胚泡细胞、多能细胞、或ESC被可检测地标记。

所述方法的步骤不受任何特定顺序的限制。例如，可以合并（i）灭活的饲养细胞；（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂中的一个或多个，然后将胚泡细胞或多能细胞加入培养物中。或者，在一方面，在添加有蹄类动物胚泡或多能细胞后，在细胞培养基中提供（i）、（ii）或（iii）中的一个或多个。或者，将（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂中的一个或两个加入到在灭活的饲养细胞上维持的胚泡细胞或多能细胞中。

在另一方面，细胞培养基进一步包含有效量的Rho相关的卷曲螺旋激酶（Rho-associated coiled-coil kinase，ROCK）抑制剂，或基本上由其组成，或由其组成。ROCK抑制剂的非限制性实例包括AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H1152、Glyclyl-H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB 772077B、SR 3677、TC-S 7001、或Y-27632，或其每一个的等效物中的一种或多种。在一方面，ROCK抑制剂是Y-27632或其等效物。这些是本领域已知的，并且可以从Tocris Bioscience（tocris.com，最后访问于2018年1月11日）购买。

在另一方面，细胞培养基还包含有效量的低脂肪酸牛血清白蛋白（bovine serumalbumin，BSA）或其等效物。低脂肪酸BSA可从Sigma-Aldrich（

，最后访问时间为2018年1月18日）上购买。在另一方面，细胞培养基是经修饰的TeSR1（例如缺乏TGFβ）。在另一方面，细胞培养基是TeSR1、N2B27、或E6（可获自Thermo-Fischer，目录号A15164091）。

在一方面，灭活的饲养细胞是鼠胚胎成纤维细胞，或者，灭活的饲养细胞被有机细胞外基质或饲养细胞条件培养基代替。有机基质的非限制性实例是基质胶或玻连蛋白。在又一方面，灭活的饲养细胞被有机基质代替，并补充有有效量的激活素A。有机基质的非限制性实例是玻连蛋白和基质胶。

在一方面，从其分离多能细胞的有蹄类动物胚胎是通过包括核转移克隆或孤雌生殖激活的方法制备的。在另一方面，胚胎是通过包括天然或人工授精的方法制备的。在另一方面，胚泡细胞是从植入前胚胎（任选地是桑椹（morula）期或卵裂期胚胎）中分离的。在另一方面，胚胎的多能细胞是从孵化后（post-hatch）胚胎的胚胎盘中分离的。

在另一方面，在培养有效的时间后，从细胞培养基中分离出ESC。另外，还可以从培养基或细胞中分离一种或多种微囊泡（microvesicle）或外泌体（exosome）。

进一步提供了用于进行基因组选择的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（i）筛选根据上述制备的方法产生的有蹄类动物ESC的优选基因型；以及（ii）选择包含所述优选基因型的有蹄类动物ESC。优选的基因型可以涉及特定的育种或其他农业特性，例如牛的高牛奶产量，或者涉及肉类生产或品质的某些特性，例如脂肪或蛋白质含量。

进一步提供了遗传修饰有蹄类动物的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（a）由核移植过程建立胚胎，其中将本文公开的有蹄类动物ESC 插入去核的有蹄类动物卵母细胞中，以及（b）将胚胎植入非人类受体宿主中。在另一方面，在受体宿主中妊娠所述胚胎。本文进一步公开了从植入的胚胎得到的非人类动物及其后代。在又一方面，该方法可以进一步包括将有蹄类动物ESC导入经遗传修饰的胚胎或通过核转移克隆产生的胚胎。

还提供了一种产生嵌合的非人类动物的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（a）产生有蹄类动物ESC；（b）将有蹄类动物导入植入前胚胎中；以及（c）将胚胎转移至非人类受体。还进一步提供了通过该方法制备的非人类动物和来自该ESC的后代。

还提供了一种由有蹄类动物ESC产生有蹄类动物生殖细胞（精子和卵母细胞）的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（a）产生有蹄类动物ESC；（b）通过添加/减去生长因子和/或与体细胞共培养，将有蹄类动物ESC体外分化为生殖细胞；或（c）将有蹄类动物ESC或中间分化的细胞移植到非人类动物体内以产生生殖细胞。在一方面，将有蹄类动物ESC移植到种系缺陷（germline-deficient）的非人类胚胎中。在另一方面，将有蹄类动物ESC移植到非牛动物或牛中。还进一步提供了通过这些方法制备的非人类动物以及来自该移植的ESC的后代。

还提供了通过上述方法制备的组合物、细胞、微囊泡、外泌体和非人类动物以及它们的后代。在一方面，本文提供了根据所述方法产生的有蹄类动物ESC以及通过所述方法产生的有蹄类动物ESC的群体。

本公开还提供了从通过这些方法产生的细胞或培养基分离的微囊泡或外泌体，以及由通过本公开内容的方法产生的细胞所产生的微囊泡或外泌体的群体。

在另一方面，所述组合物还包含载体，例如药学上可接受的载体。在另一方面，所述组合物还包含冷冻保存剂或防腐剂。

附图说明

图1A-1D：CTFR-bESC的衍生和表征。（图1A）明场图像和碱性磷酸酶染色显示了CTFR-bESC的典型菌落形态（注意饲养层对碱性磷酸酶是阴性的）。（图1B）牛胚泡（上）和CTFR-bESC（下）中SOX2、OCT4、GATA6和CDX2标记的免疫荧光染色。 P24，第24代。（图1C）CTFR-bESC、整个胚泡和成纤维细胞中内细胞团（inner cell mass，ICM）、滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PE）谱系特异性标记物的表达分析。使用RNA-seq进行转录组分析。样品包括两个独立的CTFR-bESC细胞系（>P30）、两个独立的整个胚泡的库（各10个）和两个牛成纤维细胞系。色阶从红色（高表达）到绿色（低到无表达）。（图1D）代表性图像显示了衍生自由CTFR-bESC产生的畸胎瘤的组织切片的苏木精和曙红染色。CTFR-bESC衍生的畸胎瘤包含来自全部三个胚系的组织：外胚层、内胚层和中胚层。

图2A-2H：衍生的CTFR-bESC稳定且多能。（图2A）在P34的CTFR-bESC中观察到的正常核型（2N＝60个染色体）。（图2B）在第P13、P23、P35和P45代的两个CTFR-bESC细胞系的平均群体倍增时间。柱表示平均值±SEM。（图2C）来自在不同传代收集的两个CTFR-bESC细胞系（在P13、P23、P35、P45的CTFR-bESC A和在P13、P24、P35和P46的CTFR-bESC B）、两个完整的牛胚泡和两个牛成纤维细胞系的RNA-seq数据的主成分分析。蓝色圆圈表示所有CTFR-bESC细胞系都聚集在一起，与传代数无关。红色圆圈表示胚泡，绿色圆圈表示成纤维细胞系。（图2D）热图显示了在P13、P23、P35、P45的CTFR-bESC A和在P13、P24、P35和P46的CTFR-bESC B、两个完整的牛胚泡（BL A和BL B）和两个牛成纤维细胞系（Fib A和Fib B）的整体转录组分析。（图2E）在P13、P23、P35、P45的CTFR-bESC A和在P13、P24、P35和P46的CTFR-bESCB、整个胚泡和成纤维细胞中的特定内细胞团（ICM）、滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PE）谱系特异性标记物的表达分析。使用RNA-seq进行转录组分析，并显示了RPKM值。色阶从红色（高表达）到绿色（低到无表达）。（图2F）在P11、P21、P33、P43的CTFR-bESC 中SOX2（绿色）和POU5F1（红色）的免疫荧光染色。（图2G）在NSG SCID小鼠的腿部肌肉中注射1x10⁶细胞后8周，从两个不同的CTFR-bESC细胞系（A和B）获得的畸胎瘤。（图2H）TUJ1、FOXA2和ASM的免疫荧光染色表明bESC衍生的畸胎瘤表达了三个胚层的标记物。

图 3：抑制经典Wnt信号通路是多能CTFR-bESC自我更新的要求。在补充有或不含IWR1（分别为+IWR1和–IWR1）的培养基中生长的牛胚胎干细胞中对核心多能性标记POU5F1和SOX2进行免疫染色。在免疫荧光分析之前，使细胞在两种条件下生长四代。比例尺100 µm。

图4A-4C。人和小鼠ESC的CTFR-bESC组蛋白甲基化态势的ChIP-seq分析和比较。（图4A）使用bwa-aln将读段（read）映射至UMD3.1牛参考基因组。显示了两个生物学重复的输入、H3K4me3和H3K27me3样品的用于峰调用的映射读段百分比和唯一映射读段总数。（图4B）Venn图显示了在小鼠、人类和CTFR-bESC中发现的H3K4me3-、H3K27me3-和二价基因之间的重叠（图4C），其包括基因总数和每个表观遗传类别物种间重叠百分比。

图5A-5C：CTFR-bESC的组蛋白甲基化态势。（图5A）含有H3K4me3、H3K27me3或二价结构域的基因的转录状态。认为RPKM≥0.4的基因表达，而RPKM <0.4的基因不表达。条形图内显示了表达基因的平均RPKM±SEM值，x轴显示了所有基因（表达和未表达）的平均RPKM±SEM。（图5B）包含H3K4me3（n＝8816）、H3K27me3（n＝2553）或二价结构域（n＝3886）的基因的功能表征。显示了前十个GO术语（term）。条形图显示了来自DAVID的选定的生物过程GO术语的P值的-log₁₀。（图5C）包含H3K4me3（TGFBR1、FGF8、SALL4、TRIM8、SBDS和TAF8）、H3K27me3（OOEP、REC8、SLITRK4、LRRC4B、ARRX和CSNB1）或二价结构域（WNT2、WNT7A、MATN2、CHL1、MSX2和ETV4）的基因的基因组浏览器快照。H3K4me3-、H3K27me3-和二价选择的基因与三个不同的GO术语相关联。基因的开始用黑色箭头表示。

图6A-6D：CTFR-bESC显示了始发（primed）多能性的分子特征。（图6A）在CTFR-bESC中选定的幼稚（naïve）和始发多能性标记的转录组分析。进行RNA-seq，并使用每千碱基每百万的读段（RPKM）值来定义表达的（RPKM≥0.4，红色）和未表达的基因（RPKM<0.4，绿色）。显示了两个生物学重复的平均值。（图6B）CTFR-bESC中核心多能性基因（OCT4、SOX2、NANOG、SALL4）中的H3K4me3-标记和H3K27me3-标记的基因组浏览器快照。（图6C）CTFR-bESC中的始发和幼稚多能性标记的组蛋白甲基化概况的基因组浏览器快照。（图6D）将细胞显微注射到牛桑椹胚胎中之后的CTFR-GFP-bESC整合分析。将被注射的胚胎体外培养3天，并评估胚泡中CTFR-GFP-bESC的存在。

图7A-7C：CTFR-bESC在基因组选择中的潜在应用。（图7A）使用三种不同的铺板（plating）方法（整个胚泡、ICM的机械分离、以及免疫手术衍生的ICM）和胚胎来源（IVM-IVF、OPU-IVF、SCNT，Holstein和Jersey品种（breed））的CTFR-bESC衍生效率。衍生效率被测量为：在P3产生稳定的CTFR-bESC细胞系的胚泡占每种方法接种的胚胎总数的百分比。IVM，体外成熟的屠宰场衍生的卵母细胞；OPU，活体采卵衍生的卵母细胞；IVF，体外受精；SCNT，体细胞核转移。Jersey和Holstein品种。（图7B）示意图示出了通过高效的CTFR-bESC衍生和NT使用CTFR-bESC进行基因组选择以产生具有优良遗传价值的动物的策略。（图7C）由不同来源产生的CTFR-bESC可以用作克隆的核供体。IVM，体外成熟的屠宰场衍生的卵母细胞；OPU，活体采卵衍生的卵母细胞；IVF，体外受精；SCNT，体细胞核转移。Jersey和Holstein品种。

图8A-8C。可以使用不同的铺板方法衍生CTFR-bESC，并将其用于生产NT胚胎。 （图8A）对于三种不同的铺板方法，在铺板（第0天）、生长（第7天）和第一代（CTFR-bESC P1）（第14天）时外植体的代表性图像。（图8B）流式细胞术分析牛成纤维细胞、血清饥饿的牛成纤维细胞和CTFR-bESC中的细胞周期。（图8C）衍生自CTFR-bESC-NT胚胎的CTFR-bESC中SOX2和POU5F1标记的免疫荧光分析。

图 9。CTFR-bESC可以在无饲养层的条件下培养。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层（对照）或不同细胞外基质（基质胶或玻连蛋白）条件（有或没有补充激活素A（10 ng/mL））下培养四代的CTFR-bESC的多能性标记物OCT4和SOX2的明场图像和免疫染色。对照：灭活的MEF。只有在基质胶和玻连蛋白中培养并补充了激活素A的细胞才能保持与CTFR-bESC一致的多能性标记物的表达和形态。

图10A-10D。CTFR条件可用于从绵羊植入前胚胎中衍生稳定的多能ESC。（图10A）在CTFR培养基中培养25至41代的绵羊ESC（oESC）（CTFR-oESC）的形态、碱性磷酸酶染色和核型。（图10B）在CTFR-oESC和绵羊成纤维细胞的两个细胞系中细胞周期的流式细胞仪分析。（图10C）绵羊胚泡（顶部）和在第22代（P22）和P44的CTFR-oESC（底部）中的SOX2、OCT4、GATA6和CDX2标记的免疫荧光染色。（图10D）来自绵羊的组织、胚胎和CTFR-oESC中不同基因的基因表达的实时定量RT-PCR分析。

图11A-11C的示意图显示了胚胎产生方案（图11A）、培养条件（图11B）、以及衍生方法和方案的比较（图11C）。

详细描述

定义

除非另有说明，否则本发明的实践将采用组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组DNA的常规技术，这在本领域的技术范围内。参见例如，Sambrook, Fritschand Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual，第二版；F. M.Ausubel, et al. eds. (1987) Current Protocols In Molecular Biology；the seriesMethods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach(1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds.)；Harlow and Lane,eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual；Harlow and Lane, eds. (1999)Using Antibodies, A Laboratory Manual；以及R.I. Freshney, ed. (1987) AnimalCell Culture。

所有数字值（包括范围），例如pH、温度、时间、浓度、以及分子质量，都是变化（+）或（-）0.1的增值的近似值。应当理解的是，尽管并非总是明确地说明，但所有数字值前面都有术语“约”。还应当理解的是，尽管并非总是明确说明，但本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等效物在本领域中是已知的。

除非上下文另有明确说明，否则如说明书和权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数指代。

术语自体移植、自体转移、自体迁移等是指其中细胞供体也是细胞替代疗法的受体的治疗。术语同种异体移植、同种异体转移、同种异体迁移等是指其中细胞供体与细胞替代疗法的受体属于同一物种、但不是同一个体的治疗。其中供体的细胞已与受体组织相容地匹配的细胞转移有时称为同基因转移。术语异种移植、异种转移、异种迁移等是指其中细胞供体与细胞替代疗法的受体属于不同的物种的治疗。

“克隆增殖”是指通过将单细胞连续分为两个相同的子细胞和/或相同细胞的群体来进行细胞群体的生长。

如本文所用，术语“微小RNA（microRNA）”或“miRNA”是指通常与靶信使RNA转录物（mRNA）的三个主要非翻译区（3'UTR）中的互补序列结合（通常导致基因沉默）的转录后调节子。通常，miRNA是短的非编码核糖核酸（RNA）分子，例如21或22个核苷酸长。术语“微小RNA”和“miRNA”可互换使用。

如本文所用，“冻干”是指低温干燥或冷冻干燥。

细胞衍生的外泌体或微囊泡，也称为细胞外外泌体或微囊泡，是膜包围的结构，其在体外和体内被细胞释放。细胞外外泌体或微囊泡可以包含蛋白质、脂质和核酸，并且可以介导体内不同细胞（包括不同细胞类型）之间的细胞间通讯。两种类型的细胞外外泌体或微囊泡是外泌体或微囊泡和微囊泡。外泌体或微囊泡是小的脂质结合的、细胞分泌的外泌体或微囊泡，通过蛋白质和RNA的细胞间转运来介导细胞间的通讯（El Andaloussi, S. etal. (2013) Nature Reviews: Drug Discovery 12(5):347-357）。外泌体或微囊泡的大小范围为约30 nm至约200 nm。通过将多囊泡内体（MVE）与质膜融合，将外泌体或微囊泡从细胞中释放出来。另一方面，微囊泡在直接从质膜（PM）出芽后从细胞中释放出来，并用不同的因子包装。微囊泡通常比外泌体或微囊泡更大，范围从大约200 nm到1 µm，并且具有不同的功能。

可以使用如本文公开的和可得自biovision.com和novusbio.com的市售试剂盒，或使用本文描述的方法，从真核细胞中分离细胞衍生的外泌体或微囊泡。可以从中分离细胞衍生的外泌体或微囊泡的细胞的非限制性实例包括干细胞。此类干细胞的非限制性实例包括成体干细胞、胚胎干细胞、胚胎样干细胞、非胚胎干细胞、或诱导性多能干细胞。

如本文所用，术语“过表达”、“过度表达”等旨在涵盖将核酸或蛋白质的表达增加至比外泌体或微囊泡天然包含的水平更高的水平。意图是该术语涵盖内源以及异源核酸和蛋白质的过表达。

如本文所用，关于细胞衍生的外泌体或微囊泡的群体的术语“均质的”，是指细胞衍生的外泌体或微囊泡的群体具有相似量的外源核酸、相似量的外源蛋白质、大小相似、或其组合。均质的群体是这样的群体，其中约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约98％、或100％的细胞或细胞衍生的外泌体或微囊泡具有至少一种特征。

如本文所用，关于细胞或细胞衍生的外泌体或微囊泡的群体的术语“异质的”，是指细胞或细胞衍生的外泌体或微囊泡的群体具有不同量的鉴定表型或标记物、或不同量的外源蛋白质、大小不同、或其组合。

术语“基本上”是指特征的完全或接近完全的范围或程度，并且在某些方面，定义了分离的或纯化的细胞、外泌体或微囊泡的群体的纯度。

如本文所用，相对于细胞群体、细胞衍生的外泌体或微囊泡或miRNA，术语“纯化的群体”是指多个群体已经经过了一个或多个选择过程以相对于通常在培养基中发现的细胞、细胞衍生的外泌体或微囊泡的某些其他成分的某些或全部富集或分离所需的细胞类型、外泌体或微泡或miRNA群体。替代地，“纯化的”可以指去除或减少在条件培养基中发现的残留的不希望的组分（例如细胞碎片、可溶性蛋白质等）。如本文所用，“高度纯化的群体”是指细胞或细胞衍生的外泌体或微囊泡的群体，其中条件培养基中的至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的细胞碎片和可溶性蛋白质以及细胞、细胞衍生的外泌体或微囊泡或miRNA被去除。如本文所述的细胞、群体、外泌体或微囊泡和miRNA可以以分离的、纯化的、高度纯化、均质的、基本均质的和异质的形式提供。

如本文所用，术语“培养基”和“培养介质”可互换使用，并且是指用于支持细胞（例如干细胞）的生长的固体或液体物质。优选地，本文所用的培养基是指能够将干细胞维持在未分化状态的液体物质。培养基可以是水基培养基，其包含诸如盐、营养物、矿物质、维生素、氨基酸、核酸、蛋白质（例如细胞因子）、生长因子和激素之类的成分的组合，所有这些都是细胞增殖所必需的并能够将干细胞维持在未分化状态。例如，培养基可以是合成培养基，例如最低限度必需培养基α（MEM-α）（HyClone Thermo Scientific, Waltham, MA, USA）、DMEM/F12、GlutaMAX（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）、神经基础培养基（LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA）、KO-DMEM（Life Technologies, Carlsbad, CA,USA）、DMEM/F12（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA），补充有本文进一步所述的必要的添加剂。在一些实施方案中，细胞培养基可以是培养基的混合物。优选地，本公开的培养基中包括的所有成分是基本上纯的和组织培养级的。“条件培养基”和“条件培养介质”可以互换使用，是指已经在其中培养了一段时间细胞的培养基，并且其中细胞将成分（例如蛋白质、细胞因子、化学物质等）释放/分泌到培养基中。

“组合物”还意在包括细胞、细胞群体、外泌体或微囊泡、miRNA或此类群体、或活性剂与另一种载体的组合，例如惰性的（例如可检测试剂或标记）或活性的化合物或组合物，例如佐剂、稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。载体还包括生物相容性支架、药物赋形剂和添加剂蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物（例如糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物），其可单独或组合存在，其按重量或体积计单独或组合地占1-99.99%。示例性的蛋白质赋形剂包括血清白蛋白（例如人血清白蛋白（HSA） ）、重组人白蛋白（rHA）、明胶、酪蛋白等。代表性的氨基酸/抗体组分（也可以起缓冲作用）包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸，甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。碳水化合物赋形剂也在本发明的范围内，其实例包括但不限于：单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇，例如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。

防腐剂是指增强试剂在组合物中的生存能力的组合物。非限制性实例包括苯甲酸盐（例如苯甲酸钠、苯甲酸）、亚硝酸盐（例如亚硝酸钠）和亚硫酸盐（例如二氧化硫）。

冷冻保护剂是在冷冻和解冻过程中保护试剂的化合物。这样的非限制性实例包括DMSO、甘油和聚乙二醇（PEG）。

“对照”是实验中用于比较目的的替代对象或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。例如，当实验目的是确定基因表达水平改变与特定表型的相关性时，通常最好使用阳性对照（来自对象的样品，携带这种改变并展现出所需的表型）和阴性对照（来自缺乏该改变的表达或表型的对象的对象或样品）。此外，当实验的目的是确定试剂是否影响干细胞的分化或外泌体或微囊泡或miRNA的表达时，最好使用阳性对照（具有已知会影响分化或改变表达的方面的样品）和阴性对照（已知无影响的试剂或未添加试剂的样品）。

术语“培养”是指细胞或生物在各种培养基之上或之中的体外繁殖。应当理解，在培养物中生长的细胞的后代可能与亲本细胞不完全相同（即在形态上、遗传上、或表型上）。“扩展”是指细胞的任何增殖或分裂。

如本文所用，术语“可检测地标记”是指试剂（生物或小分子）连接至另一分子、化合物或聚合物，该另一分子、化合物或聚合物有助于体外或体内检测试剂的存在。

“可检测的标记”是指直接或间接可检测的化合物或组合物，其直接或间接缀合至要检测的组合物，例如N端组氨酸标签（N-His）、磁活性同位素（例如¹¹⁵Sn、¹¹⁷Sn和¹¹⁹Sn）、非放射性同位素（例如¹³C和¹⁵N）、多核苷酸或蛋白质（例如抗体），以生成“经标记的”组合物。该术语还包括与多核苷酸缀合的序列，其将在插入的序列表达时提供信号，例如绿色荧光蛋白（GFP）等。标记本身可以是可检测的（例如放射性同位素标记或荧光标记），或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。标记可以适用于小规模检测，也可以更适用于高通量筛选。这样，合适的标记包括但不限于磁活性同位素、非放射性同位素、放射性同位素、荧光染料、发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。标记可以被简单地检测或可以被量化。被简单地检测到的响应通常包括仅被确认存在的响应，而被量化的响应通常包括具有诸如强度、极化和/或其他性质的可量化（例如可数字报告）值的响应。在发光或荧光测定中，可检测的反应可以使用与实际参与结合的测定组分相连的发光体或荧光团直接产生，或使用与另一（例如报道分子或指示剂）组分相连的发光体或荧光团间接产生。

产生信号的发光标记的例子包括但不限于生物发光和化学发光。可检测的发光响应通常包括发光信号的改变或出现。用于发光标记测定组分的合适方法和发光体是本领域已知的，并且例如在Haugland, Richard P. (1996) Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals（第六版）中描述。发光探针的实例包括但不限于水母发光蛋白和萤光素酶。

合适的荧光标记的例子包括但不限于荧光素、若丹明、四甲基罗丹明、曙红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光素黄、Cascade Blue^TM和得克萨斯红。在Haugland, Richard P.(1996) Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals（第六版）中描述了其他合适的光学染料。

如本文所用，“表达”是指多核苷酸被转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸衍生自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中剪接mRNA。

“差异表达”意指例如与对照相比，基因、外泌体或微囊泡、或标记物的向上或向下表达。在一方面，与多能或干细胞相比，对照是分化的细胞。应用于基因、蛋白质、细胞、群体、外泌体或微囊泡、miRNA、或标记物的“差异表达”，是指与对照（例如在天然环境中发现的表达水平）相比产物的差异产生。差异表达的是从基因转录的mRNA或由基因编码的蛋白质产物。与正常的、未处理的、天然的或对照细胞的表达水平相比，差异表达的基因可以被过度表达或表达不足（亦即被抑制）。在一方面，它是指与对照样品中检测到的表达水平相比，更高（亦即并因此是过表达）或更低1.5倍、或2倍、或至少2.5倍、或至少3.0倍、或至少3.5倍、或至少4.0倍、或者至少5倍、或者10倍更高的过表达。术语“差异表达”还指在对照细胞中沉默但在细胞或组织中表达或在对照细胞中表达但在细胞或组织中不表达的核苷酸序列。

术语“干细胞”是指处于未分化或部分分化状态并且具有自我更新和/或产生分化后代的能力的细胞。自我更新被定义为干细胞在增殖并产生更多此类干细胞并同时维持其发展潜力的能力（即全能、多能、多功能等）。本文使用的术语“体干细胞”是指衍生自非胚胎组织（包括胎儿、少年和成年组织）的任何干细胞。天然的体干细胞已经从各种各样的成人组织中分离出来，包括血液、骨髓、脑、嗅觉上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌。示例性的天然存在的体干细胞包括但不限于间充质干细胞（MSC）和神经干细胞（NSC）。在一些实施方案中，干细胞或祖细胞可以是胚胎干细胞。如本文所用，“胚胎干细胞”是指衍生自受精后但在妊娠结束之前形成的组织的干细胞，包括胚胎前组织（例如胚泡（blastocyst））、胚胎组织、或胎儿组织，其取自妊娠期间的任何时间，通常但不一定在妊娠约10-12周之前。最常见的是，胚胎干细胞是衍生自早期胚胎或胚泡的多能细胞。胚胎干细胞可以直接从合适的组织（包括但不限于人类组织）中获得，或从已建立的胚胎细胞系中获得。“类胚胎干细胞”是指具有胚胎干细胞的一个或多个但并非全部特征的细胞。

“分化”描述了非特异性细胞获得诸如心脏、肝脏或肌肉细胞之类的特异性细胞的特征的过程。“定向分化”是指操纵干细胞培养条件以诱导分化成特定细胞类型。“去分化”定义了可以返回到细胞谱系内的较不特化的位置的细胞。如本文所用，术语“分化的”定义了在细胞谱系内占据更特化的（“分化的”）位置的细胞。如本文所用，“分化为中胚层（或外胚层或内胚层）谱系的细胞”定义了分别特化为特定的中胚层、外胚层或内胚层谱系的细胞。分化为中胚层谱系或产生特定中胚层细胞的细胞的例子包括但不限于脂肪形成细胞、平滑肌形成细胞、软骨形成细胞、心源性细胞、皮肤生成细胞、造血细胞、血管生成细胞、生肌细胞、肾源性细胞、泌尿生殖细胞、成骨细胞、心包生成细胞、或基质细胞。

如本文所用，术语“分化或被分化”定义了在细胞谱系内占据更特化（“分化”）位置的细胞。“去分化”定义了可以返回到细胞谱系内的较不特化的位置的细胞。诱导多能干细胞是去分化细胞的例子。

如本文所用，细胞的“谱系”定义了细胞的遗传，即其前身和后代。细胞谱系将细胞置于发育和分化的遗传方案中。

“多谱系干细胞”或“多能干细胞”是指自身再生并且产生来自不同发育谱系的至少两种进一步分化的子代细胞的干细胞。这些谱系可以来自相同的细菌层（即中胚层、外胚层或内胚层），也可以来自不同的细菌层。从多系干细胞分化而来的具有不同发育谱系的两种子代细胞的例子是成肌细胞和成脂细胞（两者都是中胚层来源的，但会产生不同的组织）。另一个例子是（外胚层来源的）神经源细胞和（中胚层来源的）成脂细胞。

“前体”或“祖细胞”旨在表示具有分化为特定类型细胞的能力的细胞。祖细胞可以是干细胞。祖细胞也可能比干细胞更具特异性。祖细胞可以是单能的或多能的。与成体干细胞相比，祖细胞可能处于细胞分化的后期。祖细胞的例子包括但不限于祖神经细胞。

如本文所用，“多能细胞”定义了可以产生至少两个不同的（基因型和/或表型）进一步分化的子代细胞的分化程度较低的细胞。在另一方面，“多能细胞”包括诱导多能干细胞（iPSC），其是从非多能细胞（通常是成年体细胞）人工衍生的干细胞，其历史上已经通过诱导一种或多种干细胞特异性基因的表达而产生。此类干细胞特异性基因包括但不限于：八聚体转录因子家族，即Oct-3/4；Sox基因家族，即Sox1、Sox2、Sox3、Sox 15和Sox 18；Klf基因家族，即Klf1、Klf2、Klf4和Klf5；Myc基因家族，即c-myc和L-myc；Nanog基因家族，即OCT4、NANOG和REX1；或LIN28。iPSC的例子在以下文献中有所描述：Takahashi et al.(2007) Cell，2007年11月20日在线提前出版；Takahashi & Yamanaka (2006) Cell 126:663–76；Okita et al. (2007) Nature 448:260-262；Yu et al. (2007) Science，2007年11月20日在线提前出版；以及 Nakagawa et al. (2007) Nat. Biotechnol. ，2007年11月30日在线提前出版。

“类胚体（embryoid body）或EB”是培养过程中形成的胚胎干细胞的三维（3D）聚集体，有助于后续分化。当在悬浮培养基中生长时，EB细胞形成被内脏内胚层外层包围的小细胞聚集体。在生长和分化后，EB会发展成囊状胚状体，具有充满液体的空腔和内胚层样细胞的内层。

“诱导多能细胞”是指从成体细胞重编程为未成熟表型的胚胎样细胞。本领域已知有多种方法，例如2014年1月29日发表于Nature的“A simple new way to inducepluripotency: Acid.”，2014年2月5日最后一次访问的sciencedaily.com/releases/2014/01/140129184445，以及美国专利公开第2010/0041054号。人类iPSC也表达干细胞标记物，并且能够产生具有所有三个胚层特征的细胞。

“孤雌生殖（parthenogenetic）干细胞”是指源自卵的孤雌生殖激活的干细胞。产生孤雌生殖干细胞的方法是本领域已知的。参见，例如Cibelli et al. (2002) Science295(5556):819和 Vrana et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(Suppl. 1)11911-6。

如本文所用，术语“多能基因或标记/标记物”意指与不成熟或未分化的表型相关的已表达的基因或蛋白质，例如Oct ¾、Sox2、Nanog、c-Myc和LIN-28。识别此类的方法是本领域已知的，并且识别此类的系统可以从例如EMD Millipore (MILLIPLEX® Map Kit)商购获得。

Rho相关激酶（ROCK）抑制剂Rho相关蛋白激酶（ROCK）是属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC (PKA/ PKG/PKC)家族的激酶。它主要通过作用于细胞骨架而参与调节细胞的形状和运动。此类的非限制性实例包括：噻唑维汀（Thiazovivin）或Y27632，两者均可购自StemcellTechnologies，并且分别可购得；SR3677，可以从tocris.com购买；以及GSK429286，可以从Tocris Bioscience（tocris.com，最后访问于2018年1月11日）购买。

如本文所用，术语“分离的”是指基本上不含其它物质（例如大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%）的分子或生物物质或细胞物质。在一个方面，术语“分离的”是指分别与其他存在于天然来源中的其他DNA、RNA、miRNA、外泌体或微囊泡、蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官分离的核酸（如DNA或RNA）、miRNA、外泌体或微囊泡、蛋白质或多肽、或细胞或细胞器、或组织或器官，其允许对材料进行操作以获得其原始或天然状态下不能实现的结果，例如重组复制或突变操作。术语“分离的”还指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基的核酸或肽，或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。此外，“分离的核酸”意在包括不以天然状态存在的核酸片段，并且不会以天然状态存在。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞蛋白中分离的多肽，并且意欲包括纯化的和重组的多肽，例如纯度大于70%、或80%、或85%、或90%、或95%、或98%。术语“分离的”在本文中也用于指从其他细胞、外泌体或微囊泡、miRNA、或组织中分离的细胞、外泌体或微囊泡、miRNA、或组织，并且意欲涵盖培养的和工程化的细胞或组织以及由此产生或分离的产物。

术语“表型”是指对个体特征或特性的描述，该特征或特性是可测量的，并且仅在群体内的个体子集中表达。在本发明的一方面，个体的表型包括单个细胞、基本上同质的细胞群、分化的细胞群、或由细胞群组成的组织的表型。

术语“药学上可接受的载体”（或介质）可与术语“生物相容的载体或介质”互换使用，是指试剂、细胞、化合物、材料、组合物和/或剂型，其不仅与治疗性给药的细胞和其他药剂相容，而且在合理的医学判断范围内，也适用于与人类和动物的组织接触，而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或具有相称的利益/风险比率的其他并发症。适用于本发明的药学上可接受的载体包括液体、半固体（例如凝胶）和固体材料（例如，细胞支架和基质、管板（tube sheet）以及其他本领域已知的并且在本文更详细描述的这样的材料）。这些半固体和固体材料可以被设计成抵抗体内降解（不可生物降解），或者它们可以被设计成在体内降解（可生物降解的、生物可蚀的）。可生物降解的材料还可以是生物可再吸收的或生物可吸收的，即它可以被溶解并被吸收到体液中（水溶性植入物是一个实例），或者被降解并最终从身体消除，通过转化成其他材料或者通过自然途径分解和消除。

细胞群体是指表型和/或基因型相同（克隆）或不同的一个以上的细胞、外泌体或微囊泡、或miRNA的集合。如本文所述，群体可以是纯化的、高度纯化的、基本上同质的、或异质的。

术语“增殖”是指生长或改变细胞或细胞群的表型。术语“生长”是指在支持培养基、营养素、生长因子、支持细胞或获得所需数量的细胞或细胞类型所需的任何化学或生物学化合物的条件下的细胞增殖。在一个实施方案中，细胞的生长导致组织的再生。

术语“有效量”是指有效产生预期结果（包括体外或体内细胞生长和/或分化、或用于治疗本文所述的病症）的试剂或组合物（例如本文所述的组合物、细胞群体或其他试剂）的浓度或量。应当理解，要施用的细胞数量将根据要治疗的疾病的具体情况而变化，包括但不限于要治疗的大小或总体积/表面积、以及施用部位与待治疗区域位置之间的距离、药物生物学家所熟悉的其他因素。

术语“有效期（或时间）”和“有效条件”是指试剂或组合物达到其预期结果（例如将细胞分化或去分化为预定的细胞类型）所必需或优选的时间段或其他可控制条件（例如体外方法的温度、湿度）。

“对象”、“个体”或“患者”在本文中可以互换使用，并且是指脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为人。哺乳动物包括但不限于小鼠、大鼠、猿、牛、犬、猫、人类、农场动物、运动动物和宠物。

“基本上均质的”描述了其中大于约50％、或者大于约60％、或者大于70％、或者大于75％、或者大于80％、或者大于85％、或者大于90％、或者大于95％的细胞具有相同或相似的表型的细胞群。表型可以通过预先选择的细胞表面标记物或其他标记物来确定。

如本文所用，术语“治疗”等在本文中用于意指获得期望的药理和/或生理作用。就完全或部分预防病症或其迹象或症状而言，该作用可以是预防性的，和/或对于部分或完全治愈该病症和/或归因于该病症的不利作用而言，该作用可以是治疗性的。“治疗”的实例包括但不限于：预防可能在易患疾病但尚未被诊断为患有疾病的对象中发生疾病； 抑制疾病，即阻止其发展；和/或缓解或改善疾病症状。

细胞、外泌体或微囊泡、miRNA、治疗剂或其他试剂和包含它们的组合物的“施用”或“递送”可以在整个治疗过程中连续或间歇地以一个剂量进行。确定最有效的给药方法和剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的、被治疗的靶细胞和被治疗的对象而变化。可以根据主治医师（对于动物，则可以根据治疗兽医）选择的剂量水平和模式而单次或多次给药。合适的剂量制剂和给药方法在本领域是已知的。也可以确定施用途径，确定最有效施用途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的、受治疗的对象的健康状况或疾病阶段及靶细胞或组织而变化。给药途径的非限制性实例包括口服给药、腹膜内、输注、鼻腔给药、吸入、注射和局部应用。

如本文所用，术语“稳定的有蹄类动物胚胎干细胞（ESC）”是指多能的、易于使用通过胰蛋白酶进行的单细胞解离而增殖、并长期维持稳定的形态、核型、多能性标记物表达和多能细胞典型的表观遗传特征的有蹄类动物ESC（例如牛胚胎干细胞）。此外，关于bESC，细胞显示了始发多能性的转录和表观遗传学特征，其表现为：1）DUSP6、ZIC3、DNMT3A/B ZIC2、OTX2、TET1、NCAM1、TET3、MYC、CD47的表达增加；以及2 ）HOXA1、FOXA2、GATA6和TBX3基因中二价结构域的存在；以及3）HOXA9和NKX-2基因中H3K27me3-标记的积累。在一方面，ESC已在培养物中维持超过50周、或超过60周、或超过70周、或超过80周、或超过90周、或超过100周。

有蹄类动物是有蹄动物，例如牛、绵羊、马、猪、长颈鹿、骆驼、鹿、河马、或犀牛。

“灭活/失活的饲养细胞”是有丝分裂失活的哺乳动物细胞，通常是通过用γ射线照射细胞或在丝裂霉素-C存在下孵育细胞而获得的。这样的非限制性实例包括γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞。

如本文所用，“TeSR1”意指如Sun et al. ( 2009) Proc Natl Acad Sci U S A.,Sep 15; 106(37):15720-5所述的培养基。

如本文所用，经修饰的“TeSR1”是指如Chen et al (2011) Nat. Methods, May;8(5): 424–429（在线发布于2011年4月10日）所述的TeSR1培养基制剂修饰。

定制的TeSR1基础培养基是指TeSR1或经修饰的TeSR1培养基的组成变化，其中省略了一些成分（例如TGFβ）。

N2B27是包含25 mL的DMEM/F12（可从ThermoFischer Scientific获得）加上N2培养基（由Cold Spring Harbor Protocol (2017) May 1, Vol. 5:pdb.rec096115. doi:10.1101/pdb.rec096115发布的方案）、25 mL的神经基底和B27培养基（可从ThermoFischerScientific获得，目录号21103049）和50μL的β-巯基乙醇（100 mM）的培养基。不含LIF和抑制剂的培养基储存在4℃且在一个月内使用。

描述性实施方案

用于生产稳定的胚胎干细胞的方法

本文提供了用于产生稳定的有蹄类动物胚胎干细胞（ESC）的方法，所述方法包括以下步骤、或者基本上由以下步骤组成、或者由以下步骤组成：在细胞培养基中培养从有蹄类动物胚胎分离的有蹄类动物胚泡细胞或多能细胞，所述细胞培养基含有：（i）灭活的饲养细胞；（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂。在一方面，所述有蹄类动物胚泡、多能细胞或ESC是牛或绵羊。在另一方面，所述胚泡细胞、多能细胞或ESC被可检测地标记。

本文公开的方法使用公开的组合物和培养条件来建立有蹄类动物ESC（例如牛胚胎干细胞），它们是多能的，易于使用通过胰蛋白酶进行的单细胞解离而增殖，并长期维持稳定的形态、核型、多能性标记物表达和多能细胞典型的表观遗传特征。此外，关于bESC，细胞显示了始发多能性的转录和表观遗传学特征，其表现为：1）DUSP6、ZIC3、DNMT3A/B ZIC2、OTX2、TET1、NCAM1、TET3、MYC、CD47的表达增加；以及2 ）HOXA1、FOXA2、GATA6和TBX3基因中二价结构域的存在；以及3）HOXA9和NKX-2基因中H3K27me3-标记的积累。申请人还确定了始发CTFR-bESC可以整合到牛胚泡的内细胞团中，以及使用长期培养的bESC作为NT核供体的功效。牛ESC的高效衍生可以用于通过基因组选择和/或基因组编辑来生产具有所需遗传价值的牛和其他有蹄类动物，以及通过生殖细胞衍生分化和体外受精进行体外育种。例如，可以使用具有高遗传价值的动物来产生将会用于CTFR-ESC衍生的胚泡，并且这些细胞系可以如基因组选择方法中常规所做地根据其基因型而进行选择，其中选择具有最高的选择基因组评分的CTFR-bESC细胞系并将其用于产生精子和卵母细胞；然后将其用于体外受精和胚胎生产。第二轮胚胎用于生成CTFR-ESC，将会再次根据基因组优点对其进行选择，并用于另一轮生殖细胞生成、胚胎和CTFR-bESC。这种方法通过显著减少世代间隔并确保高水平的选择压力，可以快速进行遗传改良。此外，无限期地体外培养细胞的可能性也将允许通过基因编辑或传统遗传工程技术在每一代引入所需的遗传变异体，从而进一步加速遗传进展。因此，该方法导致世代间隔的显著减少并加速遗传进程。此外，已建立的有蹄类动物ESC代表了强大的平台，可用于获得对支持多能性程序的分子特征的新颖见解，从而能够在多能性细胞中进行“组学”研究，例如全基因组转录和表观遗传学分析，其通常需要大量具有稳定表型的细胞，否则通过早期胚胎中有限数量的动态表皮细胞无法实现。

所述一种或多种Wnt信号传导抑制剂选自：IWR1、XAV-939、ICG-001、Wnt-C59、LGK-974、LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654、沙利霉素（Salinomycin）、SKL2001、KY02111、IWP-2、IWP-L6、Wnt激动剂1、FH535、WIKI4、PRI-724、IQ-1、KYA1797K、2,4-二氨基喹唑啉、Ant1.4Br、Ant 1.4Cl、apicularen、巴氟霉素（bafilomycin）、C59、ETC-159、G007-LK、G244-LM、IWR、氯硝柳胺（Niclosamide）、NSC668036、PKF115-584、吡维铵（pyrvinium）、槲皮素（Quercetin）、Shizokaol D、BC2059、或其组合。这些可从供应商商购获得，例如TorcrisBioscience（tocris.com，上次访问日期为2018年1月11日）或Santa Cruz Biotechnology，或通过技术文献中提供的方法获得。在一个特定方面，Wnt信号传导的抑制剂是IWR1或其等效物。

在该方法的另一方面，在不存在有效量的转化生长因子β（Transforming GrowthFactor Beta，TGFβ）或TGFβ的等效物的情况下培养有蹄类动物胚泡细胞或多能细胞。在另一方面，培养基中完全不存在TGFβ或其等效物。

所述方法的步骤不受任何特定顺序的限制。例如，可以合并（i）灭活的饲养细胞；（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂中的一个或多个，然后将胚泡细胞加入培养物中。或者，在一方面，在添加有蹄类胚泡或多能细胞后，在细胞培养基中提供（i）、（ii）或（iii）中的一个或多个。或者，将（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂中的一个或两个加入到在灭活的饲养细胞上维持的胚泡细胞或多能细胞中。

可以凭经验确定添加至培养条件的FGF2或其等效物的量；然而，非限制性的量为每mL细胞培养基各自约5 ng/mL至约50 ng/mL、或约10 ng/mL至约100 ng/mL、或约10 ng/mL至约50 ng/mL、或约10 ng/mL至约40 ng/mL、或约10 ng/mL至约30 ng/mL。在一个特定方面，FGF2或其等效物的有效量为约20 ng/mL的细胞培养基。

关于所述一种或多种Wnt信号传导抑制剂，有效量可以根据Wnt信号传导抑制剂而变化，并且可以由本领域技术人员凭经验确定。在加入至细胞培养基后，非限制性的量为终浓度约0.1 mM至约100 mM。在另一方面，在加入至细胞培养基后，一种或多种Wnt信号传导抑制剂的有效量为约2.5 mM。

在另一方面，细胞培养基进一步包含有效量的Rho相关的卷曲螺旋激酶抑制剂，或基本上由其组成，或由其组成。ROCK抑制剂的非限制性实例包括AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H1152、Glyclyl-H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB772077B、SR 3677、TC-S 7001、或Y-27632，或其每一个的等效物中的一种或多种。在一方面，ROCK抑制剂是Y-27632或其等效物。这些是可商购的，例如Tocris Bioscience（tocris.com，最后访问于2018年1月11日）。

ROCK抑制剂的有效量将取决于具体的抑制剂，并且可以使用本领域已知的方法凭经验确定。ROCK抑制剂的有效浓度的非限制性实例为在加入至细胞培养基中后各自约1 μM至约1000 μM、或约1 μM至约100 μM、或约1 μM至约50 μM、或约0.1 μM至约100 μM，或约0.1μM至约10 μM。在一方面，在加入至细胞培养基后，ROCK抑制剂的浓度为约10 μM。在另一方面，ROCK抑制剂是Y-27632或其等效物，并且在加入至细胞培养基中后有效量为约10 μM。

在另一方面，细胞培养基还包含有效量的低脂肪酸BSA。在另一方面，细胞培养基是TeSR1。在另一方面，细胞培养基是经修饰的TeSR1。

在一方面，灭活的饲养细胞是鼠胚胎成纤维细胞，或者，灭活的饲养细胞被有机细胞外基质或饲养细胞条件培养基代替。有机基质的非限制性实例是基质胶或玻连蛋白。在又一方面，灭活的饲养细胞被有机基质（例如基质胶或玻连蛋白）代替，并补充有有效量的激活素A（可从例如R＆D Systems商业获得（

，上次访问日期为2018年1月18日））。

在上述方法的一些实施方案中，所述胚泡细胞是分离的内细胞团细胞。在另一方面，内细胞团细胞是通过机械分离或免疫手术而被分离的。

可以将细胞培养有效量的时间或传代，其非限制性实例包括使细胞传代至少3周或至少4周、或如本文所述达10周或更长时间。

在另一方面，可以对通过该方法制备的ESC进行遗传修饰，或者可以对有蹄类动物胚泡细胞或多能细胞进行遗传修饰。因此，该方法可以进一步包括在如上所述的培养之前修饰ESC、或多能细胞或胚泡。

在一方面，从其分离多能细胞的有蹄类动物胚胎是通过包括核转移克隆或孤雌生殖激活的方法制备的。在另一方面，胚胎是通过包括天然或人工授精的方法制备的。在另一方面，胚泡细胞是从植入前胚胎（任选地是桑椹期或卵裂期胚胎）中分离的。在另一方面，胚胎的多能细胞是从孵化后胚胎的胚胎盘中分离的。

可以在培养方法之前或在培养方法期间对有蹄类动物胚胎细胞或多能细胞进行遗传修饰。因此，该方法进一步包括在培养之前对胚泡或多能细胞或ESC进行遗传修饰。

在以上任何方法中，胚泡、或多能细胞或ESC可以在培养方法之前、之中或之后被可检测地标记。

在另一方面，在培养有效的时间后，从细胞培养基中分离出ESC。另外，还可以从培养基中分离一种或多种微囊泡或外泌体。

进一步提供了用于进行基因组选择的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（i）筛选根据上述制备的方法产生的有蹄类动物ESC的优选基因型；以及（ii）选择包含优选基因型的有蹄类动物ESC。优选的基因型可以涉及特定的育种或其他农业特性，例如牛的高牛奶产量，或者涉及肉类生产或品质的某些特性，例如脂肪或蛋白质含量。

人们可以通过任何适当的方法修饰有蹄类动物胚胎，例如，包括从核移植过程建立胚胎，其中将有蹄类动物ESC插入去核的有蹄类动物卵母细胞中。

进一步提供了遗传修饰有蹄类动物的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（a）由核移植过程建立胚胎，其中将本文公开的有蹄类动物ESC 插入去核的有蹄类动物卵母细胞中，以及（b）将胚胎植入非人类受体宿主中。在另一方面，胚胎在受体宿主中被妊娠。本文进一步公开了从植入的胚胎得到的非人类动物及其后代。在又一方面，该方法可以进一步包括将有蹄类动物ESC导入经遗传修饰的胚胎或通过核转移克隆产生的胚胎。

还提供了一种产生嵌合的非人类动物的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（a）产生有蹄类动物ESC；（b）将有蹄类动物ESC导入植入前胚胎中；以及（c）将胚胎转移至非人类受体。还进一步提供了通过该方法制备的非人类动物和来自该ESC的后代。

还提供了一种由有蹄类动物ESC产生有蹄类动物生殖细胞（精子和卵母细胞）的方法，该方法包括以下步骤、基本上由以下步骤组成、或由以下步骤组成：（a）产生有蹄类动物ESC；（b）通过添加/减去生长因子和/或与体细胞共培养，将有蹄类动物ESC体外分化为生殖细胞；或（c）将有蹄类动物ESC或中间分化的细胞移植到非人类动物体内以产生生殖细胞。在一方面，将有蹄类动物ESC移植到种系缺陷的非人类胚胎中。在另一方面，将有蹄类动物ESC移植到非牛动物或牛中。还进一步提供了通过这些方法制备的非人类动物以及来自该移植的ESC的后代。

分离的细胞、外泌体和组合物

还提供了通过上述方法制备的组合物、细胞、微囊泡、外泌体和非人类动物以及它们的后代。在一方面，本文提供了根据所述方法产生的有蹄类动物ESC以及通过所述方法产生的有蹄类动物ESC的群体。就所需表型或基因型而言，所述群体可以是均质的，其中至少70％、或80％、或85％、或90％、或95％、或97％或98％的细胞具有所需表型或基因型。细胞和群体可以被可检测地标记。

本公开内容还提供了从通过这些方法产生的细胞分离的微囊泡或外泌体，以及由通过本公开内容的方法产生的细胞所产生的微囊泡或外泌体的群体。就所需表型或基因型而言，所述群体可以是均质的，其中至少70％、或80％、或85％、或90％、或95％、或97％或98％的细胞具有所需表型或基因型。微囊泡、外泌体或群体可以被可检测地标记。

在另一方面，所述组合物还包含载体，例如药学上可接受的载体。在另一方面，所述组合物还包含冷冻保存剂或防腐剂。

执行本发明的模型

申请人已经发现，在特定的培养条件下，胚胎干细胞（ESC）可以从胚泡期胚胎的内细胞团（ICM）中被捕获并扩增。稳定后，ESC可以在培养物中无限增殖，同时保持多能性——能够产生多种细胞类型和组织的能力。

产生稳定的有蹄类动物ESC（例如牛ESC），不仅将丰富对多能性和家畜物种早期发育的理解，而且还将促进农业和生物技术相关的应用，例如通过基因组选择和/或基因组编辑生产遗传优势的动物和扩大转基因动物生物反应器的用途。

除了衍生自植入前胚胎的多能ESC之外，表皮干细胞（EpiSC）还可以衍生自植入后胚胎的外胚层，其也表现出一些多能性的特征；然而，由于它们在胚泡环境中的存活较差，因此它们在产生胚泡嵌合体方面效率低下。ESC和EpiSC具有独特的分子特征，并体现了分别称为“幼稚”和“始发”的不同多能态。尽管两者都来源于植入前阶段的胚胎，但小鼠ESC是幼稚多能性的金标准，而人类ESC更类似于小鼠EpiSC并且以更晚期的始发多能性状态存在。人类ESC和小鼠EpiSC均因其单细胞克隆性差而臭名昭著，这对于基因编辑是不可取的。另外，它们的衍生效率各不相同。最近，一种新的培养条件被用于获得一种新型的始发EpiSC，它们与原肠胚（gastrula）期上皮细胞共享分子特征，由于其优先移植到原肠胚期小鼠表皮细胞的后部的独特特性而被称为区域选择性多能干细胞（region-selectivepluripotent stem cell，rsPSC）。值得注意的是，rsPSC条件基于具有成纤维细胞生长因子2（FGF2）和经典Wnt-β-catenin信号传导途径抑制剂（IWR1）的简单无血清培养基，允许人类ESC和小鼠EpiSC的体外克隆扩增，并且完善了从植入前和植入后小鼠胚胎衍生EpiSC的效率。

在本研究中，申请人采用rsPSC培养条件来建立牛胚胎干细胞，并以高效率衍生出多能的、易于使用通过胰蛋白酶进行的单细胞解离而增殖、并长期维持稳定的形态、核型、多能性标记物表达和多能细胞典型的表观遗传特征的bESC。此外，bESC显示了始发多能性的转录和表观遗传学特征，其表现为：1）DUSP6、ZIC3、DNMT3A/B ZIC2、OTX2、TET1、NCAM1、TET3、MYC、CD47的表达增加；以及2 ）HOXA1、FOXA2、GATA6和TBX3基因中二价结构域的存在；以及3）HOXA9和NKX-2基因中H3K27me3-标记的积累。然而，令人惊讶的是，始发CTFR-bESC可以整合到牛胚泡的内细胞团中。另外，申请人证明了使用长期培养的bESC作为NT核供体的功效。牛ESC的高效衍生可以用于通过基因组选择和/或基因组编辑来生产具有所需遗传价值的牛，以及通过生殖细胞衍生分化和体外受精进行体外育种。例如，可以使用具有高遗传价值的动物来产生将会用于CTFR-ESC衍生的胚泡，并且这些细胞系可以如基因组选择方法中常规所做地根据其基因型而进行选择，其中选择具有最高的选择基因组评分的CTFR-bESC细胞系并将其用于产生精子和卵母细胞；然后将其用于体外受精和胚胎生产。该第二轮胚胎再次用于生成CTFR-ESC，将会再次根据基因组优点对其进行选择，并用于另一轮生殖细胞生成、胚胎和CTFR-bESC。这种方法通过显著减少世代间隔并确保高水平的选择压力，可以快速进行遗传改良。此外，无限期地体外培养细胞的可能性也将允许通过基因编辑或传统遗传工程技术在每一代引入所需的遗传变异体，从而进一步加速遗传进展。因此，这些方法会导致世代间隔的显著减少并加速遗传进程。此外，已建立的有蹄类动物ESC代表了强大的平台，可用于获得对支持多能性程序的分子特征的新颖见解，从而能够在多能性细胞中进行“组学”研究，例如全基因组转录和表观遗传学分析，其通常需要大量具有稳定表型的细胞，否则通过早期胚胎中有限数量的动态表皮细胞无法实现。

胚胎干细胞（ESC）衍生自植入前胚泡的内细胞团。从农业和生物医学的角度来看，从家养有蹄类动物中衍生出稳定的ESC对基因组测试和选择、基因工程、以及为研究人类疾病提供实验工具非常重要。牛是通常用于食品和生物反应器的最重要的家养有蹄类动物之一。然而，迄今为止，生产稳定的多能牛ESC细胞系仍然是一个挑战。通过使用包含成纤维细胞生长因子2和经典Wnt信号通路抑制剂的培养系统，申请人生产了具有稳定形态、核型、多能性标记物表达和表观遗传学特征的多能牛ESC（bESC）。bESC的衍生效率很高（在最佳条件下为100％）、易于增殖（通过酶处理，如胰蛋白酶和TrypLE）、并且建立快（3-4周）。同样，当用作核移植的供体时，bESC产生正常的胚泡率，这为将其用于基因组选择、基因组编辑和高遗传价值的牛生产提供了可能性。

从家养有蹄类动物中衍生出稳定的ESC对基因组测试和选择、基因工程、以及为研究人类疾病提供实验工具非常重要。ESC已经在啮齿动物和灵长类动物中得到衍生和广泛研究。然而，衍生和增殖稳定的ESC一直是挑战。在此，申请人报告，在基于Wnt途径抑制的新的培养条件中，可以有效地衍生稳定的牛ESC。这些特征明确的ESC细胞系不仅将丰富我们对有蹄类动物多能性程序的理解，而且还将为创建人类疾病的转基因大型动物模型提供有用的资源。

提供以下实施例以举例说明前述概念和公开。

实施例1

CTFR培养基支持多能bESC的衍生和长期培养

在补充有FGF2和IWR1的无血清定制TeSR1基础培养基（无生长因子）（Custom TeSR1base medium supplemented with FGF2 and IWR1）（在本文中称为“CTFR”）条件中对bESC进行衍生、繁殖、培养并经受数轮冷冻和解冻。细胞系可以在ICM/胚胎铺板后第3周结束时建立，并保持50代以上不变（图1）。与人ESC和小鼠EpiSC不同，CTFR-bESC没有显示出具有清晰定义的边缘的圆形菌落形态，而是彼此紧密地附着在一起，形成了相互连接的蜂窝状网状结构，该网状结构明显地与饲养层隔开（图1A）。 CTFR-bESC对碱性磷酸酶（AP）染色呈阳性（图1A）。为了评估长期培养后CTFR-bESC的遗传稳定性，申请人在第34代在两种不同的细胞系中进行了核型分析。结果显示了超过70％的受检中期细胞中的正常染色体含量（n=60）（图2A）。免疫荧光分析（IF）显示长期培养的CTFR-bESC分别表达了多能性标记物SOX2和OCT4，而不表达滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PE）标记物CDX2和GATA6（图1B）。牛胚泡（BL）的IF分析表明SOX2阳性细胞仅在ICM中发现，而CDX2信号仅限于TE细胞（图1B）。从第4代开始，在CTFR-bESC中始终产生SOX2阳性和CDX2阴性IF染色模式，这表明CTFR培养有助于ICM在TE细胞上的增殖。

添加经典的WNT抑制剂对于牛ESC的成功衍生和繁殖至关重要，因为从培养基中撤出IWR1会导致多能性标记物表达丧失（图3）。此外，如果培养基中不存在IWR1，则无法建立bESC细胞系。

申请人还使用两个独立建立的长期培养的CTFR-bESC细胞系、整个牛胚泡和牛成纤维细胞，通过RNA测序（RNA-seq）进行了转录组分析。分析显示，ICFR标记物POU5F1(a.k.a. OCT4)、SOX2、NANOG、LIN28B、DNMT1B、UTF1和SALL4在CTFR-bESC细胞系和牛胚泡中表达（RPKM≥0.4），而在牛成纤维细胞（对照）中不表达（FRKM <0.4）（图1C）。另一方面，在CTFR-bESC细胞系中均未发现TE和PE标记，但在胚泡中表达。值得注意的是，即使在长期培养后，CTFR-bESC的转录组谱也保持稳定（图2C、2D和2E）。这些结果表明，与TE或成纤维细胞相比，CTFR-bESC的表达谱与多能ICM更相似。

申请人还向免疫缺陷的NOD SCID小鼠肌内注射了两个CTFR-bESC细胞系，用于畸胎瘤形成分析，以评估已建立的CTFR-bESC细胞系是否是多能性的。两个细胞系均能够形成畸胎瘤（图2G和2H），其包含来自所有三个主要胚层外胚层、中胚层和内胚层的组织，通过H&E染色（图1D）和IF分析：外胚层（TUJ1）、内胚层 （FOXA2）和中胚层（ASM）（图2H）证明。这些结果表明，CTFR-bESC在延长的体外培养后仍保持了多能性。

CFTR-bESC的组蛋白甲基化态势

缺乏支持多能ESC长期繁殖的培养条件阻碍了我们对大型牲畜物种多能性的分子理解。通过利用稳定的多能CTFR-bESC细胞系，申请人接下来检查了培养的CTFR-bESC中H3K4me3和H3K27me3标记的总体分布，以深入了解牛多能性程序的表观遗传调控。为此，实施了低输入ChIP-seq协议。平均3,100万个唯一映射读段被用于峰调用（图4A），这导致分别仅与H3K4me3、H3K27me3或两者（二价结构域）相关的8,816、2,553和3,886个基因。通过RNA-seq的转录组分析显示，大多数仅H3K4me3基因被表达（94％；RPKM≥0.4），而分别在仅H3K27me3基因和二价基因中表达了47％和64％（图5A）。值得注意的是，仅H3K4me3基因的基因表达水平高于仅H3K27me3基因和二价基因（平均RPKM分别为34、5和8）。

与仅由H3K4me3标记的基因相关的基因本体论（Gene ontology，GO）术语不仅包括看家细胞功能，例如蛋白质转运、细胞分裂、转录和翻译，还包括与多能性相关的特定功能，包括内细胞团增殖、干细胞群体维持和胚泡发育（图5B）。此外，与在CTFR-bESC培养物中使用小分子Wnt抑制剂（IWR1）一致，一个值得注意的富集术语是经典Wnt信号通路的负调控。仅H3K27me3基因的富集GO术语与特定功能相关，这些功能通常在PSC中沉默，例如受精、惊吓反应、免疫球蛋白产生和视觉感知。最后，二价基因的富集GO术语主要与细胞命运决定有关，例如细胞命运定型（commitment）、神经元迁移和分化、中枢神经系统发育和干细胞分化（图5B）。

在图5C中示出了视觉评估与H3K4me3-、H3K27me3-或二价基因的三个选择的GO术语相关的基因。申请人发现，含有H3K4me3-标记的基因在其启动子区域呈现出明确定义的峰，而H3K27me3-基因呈现出较宽的峰（一些在启动子区域，但大多数覆盖了其大部分基因体）。二价基因显示H3K4me3和H3K27me3标记在其启动子区域附近共定位。值得注意的是，对于二价基因，H3K27me3标记比仅H3K27me3的基因更受TSS的限制，并且显示出类似于H3K4me3的峰形（图5C）。

尽管小鼠和人的ESC表现出不同的分子特征，但它们确实具有多能细胞特有的一些共同的转录和表观遗传学特征。申请人比较了已知在人和小鼠ESC中具有H3K4me3、H3K27me3或二价结构域的基因列表与CTFR-bESC的基因列表，发现仅H3K4me3的牛基因中有62％（n=4,898）也含有在人和/或小鼠ESC中的该标记（图4B和4C）。这些基因大多数都被两个物种共享（33％，n=2,563），而与小鼠ESC（6％，n=513）相比，人类ESC（23％，n=1822）具有更多的基因共享。小鼠和/或人类ESC也共有百分之四十四的牛二价基因，其中一半由所有三个物种共享（n=757）。同样，牛二价基因与人ESC的相似性比小鼠ESC更高（分别为13％，n=447和9％，n=317）。有趣的是，仅H3K27me3的牛基因（n=1,697）中只有4％与其他两个物种共享。这种低水平的重叠可能是由于小鼠（n=137）和人类ESC（n=424）中H3K27me3-基因的数量较少。总体而言，这些结果表明，bESC具有与其他哺乳动物物种的PSC相似的表观遗传态势，进一步证实了它们的多能性地位。

CTFR-bESC显示出始发多能性状态的转录和表观遗传特征

为了研究CTFR-bESC的多能性状态，申请人分析了在小鼠和人类ESC研究中鉴定的典型的幼稚和始发多能性标记的表达。大部分检查过的始发多能性标记物在CTFR-bESC（19/22，86％）中表达（RPKM≥0.4），而较少的幼稚标记物（14/22，64％）表达。同样，与幼稚多能性标记基因相比，始发多能性标记基因的所有分析的标记的平均RPKM值均更高（分别为RPKM=17±13和RPKM=25±8.4）（图6A）。

已经显示，在OCT4、SOX2、SALL4和NANOG基因的启动子区域中，H3K4me3峰的唯一存在是幼稚和始发多能性的特征。与小鼠和人一致，CTFR-bESC在这些基因的启动子区域也显示出尖锐的H3K4me3峰，从而揭示了核心多能性基因的保守的表观遗传学特征（图6B）。接下来，申请人评估了在CTFR-bESC基因上H3K4me3-标记和H3K27me3-标记的存在，这些基因在小鼠和人类物种的幼稚和始发多能状态中显示出不同的组蛋白甲基化态势。观察到，对于所有检查的基因，CTFR-bESC中的表观遗传学特征与始发多能态相符，其中HOXA1、FOXA2、GATA6和TBX3基因中存在二价结构域，在HOXA9和NKX-2基因中存在H3K27me3-标记积累（图6C）。

这些结果一起表明，重要的表观遗传学特征（例如关键多能性基因的TSS处H3K4me3标记的存在）在遥远的哺乳动物物种之间共享，并且CTFR-bESC代表了多能性的始发类型。

CFTR-bESC可以体外整合到牛胚泡的ICM中

始发小鼠EpiSC显示出较差的存活，并且在定殖鼠ICM中效率低下。申请人检查了CTFR-bESC整合入植入前牛胚胎的能力。首先将CTFR-bESC用绿色荧光蛋白（GFP）标记物进行标记，然后注入第5天的牛桑椹胚中。培养另外3天后，首先使用CTFR和胚胎培养基的1：1混合物20小时，然后是单独的胚胎培养基，申请人在第8天的胚泡胚胎中检测到许多GFP-bESC，表明CTFR-bESC在牛胚胎内存活并增殖的能力（图6D）。

CTFR-bESC衍生非常高效

CTFR-bESC的衍生效率被测量为在第3代成功建立CTFR-bESC细胞系的胚胎占所接种的胚胎总数的百分比。为了优化CTFR-bESC的衍生效率，申请人评估了三种不同的铺板方法：整个胚泡、通过显微解剖对ICM进行机械隔离、以及通过免疫手术对ICM进行隔离。在所有三种方法中，在衍生效率上均未发现差异，并且该效率与报道的小鼠ESC的衍生效率相当甚至更高（图7A）。三种方法的初始结果略有不同。与其他两种方法相比，免疫手术衍生的产物在细胞形态上更小且更均匀。然而，到第二周末，无论采用何种衍生方法，细胞均显示出相同的形态（图8）。这些结果表明，即使使用简单的整个胚泡铺板，CTFR-bESC也可以在短时间内以均一的细胞形态高效地衍生。

申请人接下来从不同的胚胎来源衍生CTFR-bESC，并检查了胚胎来源是否会影响衍生效率。申请人发现，当使用由OPU-IVF衍生的荷斯坦（Holstein）和泽西（Jersey）品种的胚胎时，衍生效率分别为100％和64％；而使用由屠宰场卵巢吸出的卵母细胞的IVF（IVM-IVF）产生的胚胎时，效率为52％。SCNT衍生的胚胎产生CTFR-bESC的效率为75％。总体而言，这些结果表明可以从不同的胚胎来源有效地产生CTFR-bESC（图7A）。

CTFR-bESC可以用作NT克隆的核供体

CTFR-bESC在牛中的潜在应用是用于基因组选择，然后是产生NT来源的动物（图7B）。为此，测试了使用CTFR-bESC（从不同的胚胎来源获得）产生NT胚的可能性，发现它们都能以10％到20％的效率产生NT胚泡，胚泡的形成与对照成纤维细胞（28％）相比略低（图4C）。从CTFR-bESC克隆的胚胎胚泡发育减少的可能解释是，这些细胞在NT之前的细胞周期的G1/G0阶段不同步。通过FACS分析bESC和成纤维细胞中的血清饥饿后的DNA含量（图8B），申请人注意到，bESC培养物在G1中的细胞仅是与成纤维细胞相比的一半，而在S期（与NT胚胎发育不相容的细胞周期阶段）中的细胞的百分比更高。最后，CTFR-bESC-NT胚胎可用于衍生显示与原始细胞相同的SOX2和OCT4 IF染色模式的次级CTFR-bESC（图8C）。

CTFR-bESC可以在无饲养层的条件下培养

在不存在饲养细胞的情况下培养CTFR-bESC导致在数次传代后细胞分化。另一方面，在有机基质（如基质胶或玻连蛋白）上培养CTFR-bESC并用激活素A补充培养基可以使细胞繁殖多代，同时保持多能性标记物的表达（图9）。

CTFR条件可用于从绵羊胚胎中衍生稳定的多能ESC

使用描述的用于牛ESC的衍生和培养的相同CTFR条件，也成功地从绵羊胚胎衍生ESC。绵羊ESC（oESC）呈圆形菌落形态，经过40次传代后保持稳定，同时保持碱性磷酸酶活性（多能细胞的标记物）和正常倍性（图10A）。CTFR-oESC呈现了多能细胞的细胞周期图特征（图10B），其中与绵羊成纤维细胞相比，G1中的细胞的比例更低。同样，在中间（p22）和晚期（P44）传代，CTFR-oESC对多能性标记物（OCT4和SOX2）染色阳性，而对滋养外胚层（CDX2）和原始内胚层（GATA 4）标记物染色阴性（图10C）。最后，多能性标记物（OCT4、NANOG、SOX2）的阳性基因表达和分化标记物的缺乏表达进一步表明CTFR-oESC在长时间培养后是多能性的和稳定的（图10D）。

讨论

尽管进行了多年的研究，但是没有报道稳定的牛ESC细胞系能够承受培养中延长传代的严格性同时又保持多能性。在当前的研究中，申请人测试了用于牛ESC衍生的无血清培养条件（CTFR）。结果表明，CTFR-bESC适合长期培养，并显示出稳定的遗传、表观遗传和功能多能性特征，可以通过对来自各种来源和遗传背景的胚胎进行简单的全胚泡培养来有效建立。CTFR-bESC表现出具有始发多能性的分子特征，但在桑椹胎显微注射后可以整合入胚泡ICM。另外，申请人证明了使用CTFR-bESC作为核供体来生产NT克隆胚胎的可能性。

在本研究中使用的培养条件允许多能bESC的稳健衍生和长期繁殖。申请人认为，因素的组合以及特别是添加经典的WNT通路抑制剂（IWR1）对于bESC的衍生至关重要。 IWR1通过稳定AXIN 1/2阻止β-连环蛋白向核转运。添加经典的WNT抑制剂已证实可有效地衍生和维持始发小鼠EpiSC和人类ESC/iPSC。在牛物种中，维持失活的经典WNT信号通路对于正常的植入前和植入后早期胚胎发育很重要。在体外植入前发育过程中，通过添加2-氨基-4-(3,4-(亚甲基二氧基)苄氨基)-6-(3-甲氧基苯基)嘧啶（AMBMP）激活经典的WNT-β-连环蛋白信号通路对牛胚泡发育有不利影响，并减少ICM中的细胞总数。此外，使用经典WNT信号通路蛋白抑制剂（（Dickkopf WNT信号通路抑制剂1 (DKK1)，这是女性生殖道自然分泌的并参与母婴沟通）体外处理牛胚胎（受精后第5天至第7天），已证明可显著提高转移至受体后的胚胎存活率。因此，有可能认为IWR1的添加对于牛ESC的成功衍生和繁殖至关重要。实际上，从培养基中撤出IWR1导致多能性标记物表达的损失。此外，如果不添加IWR1，则无法建立bESC细胞系。

小鼠ESC被认为是“幼稚” PSC的金标准，其分子特征类似于ICM内新生的成胚细胞的分子特征。多能性的“始发”状态与植入后的成骨细胞相关，并且可以在培养的小鼠EpiSC中稳定。除啮齿类动物外，灵长类动物（包括人）中还描述了类幼稚的和始发的PSC，它们大多由各自的分子标记定义。所有报道的类幼稚灵长类动物PSC均未通过严格的种系嵌合体测定，而真正的灵长类幼稚PSC仍然难以捉摸。物种差异可能解释了在非啮齿类动物中获得与小鼠ESC等效的细胞的困难。本研究中衍生的CTFR-bESC与小鼠EpiSC和始发人PSC具有许多定义性的转录和表观遗传学特征。例如，与谱系定型有关的基因（例如OrthodenticleHomeobox 2 (OTX2)和Zic Family Member 2 (ZIC2)）的高表达、多能性相关转录因子Homeobox蛋白NANOG和Kruppel样因子4（KLF4）的中等表达水平、以及许多幼稚的多能性标记基因（例如成纤维细胞生长因子4（FGF4）、DNA（胞嘧啶5）-甲基转移酶3样（DNMT3L）、发育多能性相关2和3（DPPA2和DPPA3）、含HORMA域的1（HORMAD1）、转录因子CP2样1 （TFCP2L1）、ZFP42锌指蛋白（ZFP42或REX1）和T-Box 3（TBX3））的可忽略不计的表达。从表观上看，始发CTFR-bESC还与它们的小鼠和人类对应物共享许多功能，例如Homeobox A1（HOXA1）、Forkhead Box A2（FOXA2）、GATA结合蛋白6（GATA6）和T-Box 3（TBX3）基因中存在二价结构域，以及Homeobox A9（HOXA9）和NK2 Homeobox 2（NKX-2）基因中H3K27me3-标记的富集。

产生能与种系相容的嵌合体的能力在功能上将幼稚小鼠ESC与始发EpiSC或rsEpiSC区别开来，后者不能在胚泡环境中存活并且在没有遗传增强细胞存活（例如过表达抗凋亡基因BCL2）的情况下有助于嵌合体。有趣的是，观察到CTFR-bESC在显微注射到桑椹期胚胎后可以存活并在囊胚ICM中定殖。这可能部分归因于CTFR-bESC的优异单细胞存活率。

基因启动子上的H3K4me3-标记和H3K27me3-标记的共同占据是多能细胞最显著的表观遗传特征之一。这些二价结构域通常位于关键的发育基因上，这些基因在ESC中被转录沉默，但准备激活。有趣的是，人和小鼠ESC中也存在44％的CTFR-bESC二价基因，这表明在遥远的哺乳动物物种中，保留了描述多能性和早期谱系定型的许多分子特征。哺乳动物多能性的保守表观遗传学特征在CTFR-bESC-二价基因的GO术语中进一步被指出。根据二价基因数据库（BGDB），前10个富集的GO术语中的四个（经典Wnt信号通路的负调控、神经元迁移、中枢神经系统发育和神经元分化）也在人类ESC中二价基因的前5个富集GO术语中出现。

在本研究中描述的CTFR-bESC是：（1）易于从整个胚泡中获得，（2）快速获得，高效建立，并且易于传代（使用胰蛋白酶的单细胞解离）。这些是生成遗传上优越的牛和工业生成有价值的药物的理想特征，因为它们允许通过bESC衍生、便捷的基因组编辑进行有效的基因组选择，并且适合于NT克隆以产生活体动物。

综上所述，通过使用无血清培养条件，申请人已经衍生了稳定的多能bESC细胞系，其可以在培养物中长期繁殖（在撰写本文时超过70次传代和1年以上），同时保持稳定形态、正常核型、多能转录组和表观基因组特征、以及生成包含来自三个主要生殖谱系的细胞和组织的畸胎瘤的能力。此外，bESC可以在桑椹胚注射后存活并有助于胚泡胚的ICM，并成功地用作克隆的核供体。稳定的bESC的衍生为各种农业和生物技术应用开辟了新途径，例如具有遗传优势的牲畜的产生。PSC具有分化为任何细胞类型（包括配子）的巨大潜力。来自具有高遗传价值的动物的ESC可以分化为卵母细胞和精子，可以从这些体外产生的配子产生胚泡，并且可以通过从这些胚泡中衍生出优良的ESC细胞系来实现生命周期的完成。该模型已经在小鼠中得到证明，并且可以在遗传上优越的动物（特别是对于长世代间隔的物种）的生成中具有很大的用途。从本研究中开发的条件和方案已在牛和羊中起作用，并可潜在地应用于许多其他有蹄类动物，以产生稳定的ESC。

材料和方法

胚胎生产

本研究中使用的体外成熟体外受精（IVM-IVF）胚胎的制备如Chitwood等人先前所述（BMC Genomics. 2013 May 25;14:350. doi: 10.1186/1471-2164-14-350）。活体采卵体外受精（OPU-IVF）和体细胞核移植（SCNT）衍生的胚胎是由TansOva Genetics在爱荷华州苏城中心生产的，使用它们的标准程序生产，并整夜运送到UC Davis进行bESC 衍生。

牛胚泡的显微手术和免疫手术

通过显微手术获得分离的ICM。简而言之，将耗尽ZP的胚泡放在装有PBS的培养皿中，并使用与连接到倒置显微镜（Nikon, TE2000-U）的显微操作设备（Nikon/ Narishige, NT88-V3）相连的微刀片进行显微手术。

通过以下方法进行免疫外科手术：在KSOM中将胚胎与20％抗马血清一起温育（在37℃下1小时；Jackson Immunoresearch, West Grove, PA），随后用SOF-HEPES反复洗涤，并在补充有20％豚鼠补体的KSOM中温育（在37℃下1小时；Innovative Research, Novi,MI）。

CFTR-bESC的衍生和培养

将单个的整个胚泡或分离的ICM置于接种有单层经γ射线辐照的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的12孔培养皿的单独孔中，并在CTFR培养基中培养，该培养基是定制的mTeSR样基础培养基（完全不含生长因子FGF2和TGFβ），含有低脂肪酸BSA（MP Biomedicals NZ），类似于已发布的配方（45）中的基础培养基，补充有20 ng/ml的人FGF2和2.5 μM IWR1（CTFR），并在37℃和5％CO₂下孵育。

48小时后，在立体镜下用22G针将未能粘附到饲养层上的胚泡/ ICM物理地压在培养皿的底部，以促进附着。此后，每天更换培养基。用TrypLE (Gibco, 12563011)解离产物（培养6-7天后）并传代，并在Rho激酶（ROCK）抑制剂（Y-27632，10 μM）的存在下重新播种到新制备的含有MEF和新鲜培养基的孔上（图1）。

一旦建立，就将CTFR-bESC细胞系在含有MEF的孔中在37℃和5％CO₂下生长，并以1:10的分裂比每4-5天传代。为了增加细胞存活，任选地，在传代前1小时将ROCK抑制剂（Y-27632，10 μM）添加到孔中，并且在24小时内还添加到含有MEF和新鲜培养基的新制备的孔中。每天在传代之间进行培养基更换。ROCK抑制剂可用于CTFR-bESC的常规维持和传代。

免疫荧光

如前所述，使用以下一抗对细胞和胚胎进行免疫染色和成像：抗GATA6（sc-7244,Santa Cruz Biotechnology, 1:300），抗SOX2（ANS79-5M, BioGenex, 1:300） ，抗CDX2（MU392A-UC, BioGenex, 1:300）和抗OCT4（sc-8628, Santa Cruz Biotechnology, 1:300）。

RNA-seq

RNAseq的每个复制使用在MEF上生长的CTFR-bESC的6孔板的融合孔。使用QiagenRNeasy Mini Kit分离总RNA，然后使用iScript RT Supermix（Bio-Rad）反转录。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒（Illumina, San Diego, CA）构建文库，并根据制造商的说明在Illumina HiSeq 2500上测序。使用CLC Genomics Workbench 7.0 (CLCbio, Aarhus,Denmark)将测序的读段映射到牛UMD3.1基因组组件和Ensembl 78基因构建注释中。为每个基因计算每千碱基外显子模型（RPKM）值每百万个映射读取的读数。

ChIP-seq

按照制造商的方案，使用饲养层去除微珠（Miltenyi Biotech, 130-095-531）从小鼠胚胎成纤维细胞中分离出CTFR-bESC。在室温下使用0.25％甲醛（Pierce, 28906）使CTFR-bESC（20,000个细胞）交联8分钟，并通过添加125 mM甘氨酸（True Microchip kit,C01010130中提供）终止交联。使用以下抗体，使用True Micro Chip试剂盒（Diagenode,C01010130）进行染色质免疫沉淀：抗H3K27me3（Millipore, ABE 44）和抗H3K4me3（由Diagenode kit提供）。使用ThruPLEX DNA-seq试剂盒（Rubicon, R400406）按照制造商的说明制备测序文库，并在文库扩增步骤中进行16个循环。在Illumina HiSeq4000平台上，在UCBerkeley的Vincent J. Coates基因组测序实验室对文库进行测序，该平台以100 bp的配对末端进行测序。

使用FastQC检查原始读段的测序质量，然后使用bwa-aln将其与带注释的牛基因组（UMD 3.1组件）比对。使用MACS2（49）进行峰调用，其中H3K4me3的设置较窄（-g 2.67e9 -q 0.01 -m 2 100 -B --SPMR）而H3K27me3的设置较宽（-g 2.67e9 -q 0.05 -m 2 100 --broad -B --SPMR --fix-bimodal --extsize 200）。使用golden helix Genome Browser(Bozeman, MT: Golden Helix, Inc. 可从http://www.goldenhelix.com获得)对峰进行可视化。使用Motif EnRichment（HOMER）的超几何优化进一步分析被调用的峰，以发现与基因特征相关的峰，并使用用于注释、可视化和集成发现的数据库（DAVID）进行基因本体分析。

体细胞核移植

为了测试已建立的CTFR-bESC细胞系制造NT胚泡的能力，使用几个CTFR-bESC细胞系作为核供体，使用标准SCNT方法重建去核卵母细胞。原代成纤维细胞用作对照。

等效物

应当理解，尽管已经结合以上实施方案描述了本公开，但是前述描述和实施例旨在说明而不是限制本公开的范围。本公开的范围内的其他方面、优点和修改对于本公开所属领域的技术人员是显而易见的。

可以在缺少在本文没有具体公开的任何元素或限制的情况下，适当地实施本文说明性地描述的本发明。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应该被广泛且没有限制地理解。此外，本文采用的术语和表达已经被用作描述而非限制，在这些术语和表达的使用中，没有意图排除所示和所述特征或其部分的任何等效物，但是应该认识到，在本发明技术要求保护的范围之内各种变化都是可能的。

因此，应该理解的是，尽管已经通过优选实施方案和任选的特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明进行修改、改进和变化，这些修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。在此提供的材料、方法和实施例是优选的实施方案的代表，是示例性的，并且不旨在作为对本技术的范围的限制。

本文广泛地和一般地描述了本发明。落入一般性描述之内的较窄的种类和亚属分组中的每一个也都形成本发明的一部分。这包括了具有从该属中移除任何主题的附带条件或负面限制的本发明的一般性描述，无论被删除的材料是否在本文中被具体描述。

此外，在以马库什组描述本发明的特征或方面的情况中，本领域技术人员将认识到，还借此以该马库什组中的任何单独成员或成员的亚组描述了本发明。

在本文中提及的所有公开文献、专利申请、专利和其他参考文献，其整体都以引用的方式明确地合并入本文中，至如同每个都单独地以引用的方式合并的相同程度。如发生冲突，以本说明书（包括定义）为准。

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Claims (52)

1.一种用于产生稳定的有蹄类动物胚胎干细胞（ESC）的方法，其包括在包含以下条件的细胞培养基中培养从胚胎分离的有蹄类动物胚泡细胞或多能细胞：（i）灭活的饲养细胞；（ii）有效量的成纤维细胞生长因子2（FGF2）或其等效物；以及（iii）有效量的一种或多种Wnt信号传导抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种Wnt信号传导抑制剂选自：IWR1、XAV-939、ICG-001、Wnt-C59、LGK-974、LF3、CP21R7、NCB-0846、PNU-74654、沙利霉素、SKL2001、KY02111、IWP-2、IWP-L6、Wnt激动剂1、FH535、WIKI4、PRI-724、IQ-1、KYA1797K、2,4-二氨基喹唑啉、Ant1.4Br、Ant 1.4Cl、apicularen、巴氟霉素、C59、ETC-159、G007-LK、G244-LM、IWR、氯硝柳胺、NSC668036、PKF115-584、吡维铵、槲皮素、Shizokaol D、BC2059、或其组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Wnt信号传导抑制剂是IWR1或其等效物。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述有蹄类动物胚泡在不存在转化生长因子β（TGFβ）或其等效物的情况下培养。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在加入有蹄类动物胚泡细胞之前，在细胞培养基中提供（i）、（ii）、或（iii）中的任何一个或多个。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中FGF2或其等效物的有效量为每毫升细胞培养基各自约5 ng/mL至约50 ng/mL、或约10 ng/mL至约100 ng/mL、或约10 ng/mL至约50 ng/mL、或约10 ng/mL至约40 ng/mL、或约10 ng/mL至约30 ng/mL。

7.根据权利要求6所述的方法，其中FGF2或其等效物的有效量为每毫升细胞培养基约20 ng/mL。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在加入至细胞培养基之后，所述一种或多种Wnt信号传导抑制剂的有效量为约0.1 mM至约100 mM。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在加入至细胞培养基之后，所述一种或多种Wnt信号传导抑制剂的有效量为约2.5 mM。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含有效量的Rho相关的卷曲螺旋激酶（ROCK）抑制剂。

11.根据权利要求10所述的方法，其中有效量的所述ROCK抑制剂选自：AS1892802、盐酸法舒地尔、GSK 269962、GSK 429286、H1152、Glyclyl-H 1152、HA 1100、OXA 06、RKI 1447、SB 772077B、SR 3677、TC-S 7001、或Y-27632、或其每一个的等效物。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度为约1 μM至约1000μM、约1 μM至约100 μM、约1 μM至约50 μM、约0.1 μM至约100 μM、或约0.1 μM至约10 μM。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述ROCK抑制剂的浓度为约10 μM。

14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632或其等效物。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基进一步包含低脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是TeSR1。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基是经修饰的TeSR1。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述灭活的饲养细胞是鼠胚胎成纤维细胞。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述灭活的饲养细胞被有机基质和/或饲养细胞条件培养基代替。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述有机基质是基质胶或玻连蛋白。

21.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述灭活的饲养细胞被有机细胞外基质代替并补充有激活素A。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胚泡细胞是分离的内细胞团细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述内细胞团细胞已经通过机械分离或免疫手术而分离。

24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括使细胞传代至少3周。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其进一步包括使细胞传代至少4周。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括从所述细胞培养基中分离ESC。

27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其进一步包括从所述培养基中分离一种或多种外泌体。

28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括遗传修饰一种或多种ESC、或多能细胞或有蹄类动物胚泡细胞。

29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中有蹄类动物胚胎是通过包括核转移克隆或孤雌生殖激活的方法制备的。

30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胚胎是通过包括天然或人工授精的方法制备的。

31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胚泡细胞是从植入前胚胎分离的，所述植入前胚胎任选地是桑椹期或卵裂期胚胎。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胚胎的多能细胞是从孵化后胚胎的胚胎盘中分离的。

33.根据权利要求22所述的方法，其中所述有蹄类动物胚泡细胞在培养方法之前或在培养方法期间被进行了遗传修饰。

34.一种有蹄类动物ESC，其根据前述权利要求中任一项所述的方法产生。

35.一种有蹄类动物ESC的分离的群体，其通过权利要求1-33中任一项所述的方法产生。

36.一种微囊泡或外泌体，其分离自权利要求1-33中任一项所述的方法的培养基或ESC。

37.一种组合物，其包含以下中的一个或多个以及载体：权利要求34所述的有蹄类动物ESC、权利要求35所述的群体、或权利要求36所述的微囊泡或外泌体组合物。

38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述载体是药学上可接受的载体。

39.根据权利要求37所述的组合物，其中所述载体进一步包含冷冻保存剂或防腐剂。

40.一种转基因的非人动物，其包含权利要求34所述的有蹄类动物ESC或权利要求35所述的群体。

41.一种转基因的有蹄类哺乳动物，其包含权利要求34所述的有蹄类动物ESC或权利要求35所述的群体。

42.一种进行基因组选择的方法，所述方法包括：

（i）筛选根据权利要求23或25所述的方法产生的有蹄类动物ESC的优选基因型；以及

（ii）选择包含所述优选基因型的有蹄类动物ESC。

43.一种修饰有蹄类动物胚胎的方法，所述方法包括：由核移植过程建立胚胎，其中将权利要求34所述的有蹄类动物ESC插入去核的有蹄类动物卵母细胞中。

44.一种遗传修饰有蹄类动物的方法，所述方法包括：

（a）由核移植过程建立胚胎，其中将权利要求34所述的有蹄类动物ESC插入去核的有蹄类动物卵母细胞中，以及

（b）将所述胚胎植入非人类受体宿主中。

45.根据权利要求44所述的方法，其进一步包括在所述受体宿主中妊娠所述胚胎。

46.一种转基因的非人动物，其通过权利要求44所述的方法产生。

47.根据权利要求46所述的方法，其进一步包括将所述有蹄类动物ESC导入经遗传修饰的胚胎或通过核转移克隆产生的胚胎中。

48.一种产生嵌合非人类动物的方法，所述方法包括：

（a）产生有蹄类动物ESC；

（b）将有蹄类动物导入植入前胚胎中；以及

（c）将胚胎转移至非人类受体。

49.一种用于由有蹄类动物ESC产生有蹄类动物生殖细胞（精子和卵母细胞）的方法，所述方法包括：

（a）产生有蹄类动物ESC；

（b）通过添加/减去生长因子和/或与体细胞共培养，将所述有蹄类动物ESC体外分化为生殖细胞；或

（c）将所述有蹄类动物ESC或中间分化的细胞移植进非人类动物体中以产生生殖细胞。

50.根据权利要求49所述的方法，其中有蹄类动物ESC被移植到种系缺陷的非人类胚胎中。

51.根据权利要求49所述的方法，其中有蹄类动物ESC被移植到非牛动物中。

52.根据前述权利要求中任一项所述的方法、组合物或细胞，其中所述有蹄类动物是牛。

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