KR20110006672A - Ｈｄａｃ 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 - Google Patents

Ｈｄａｃ 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 Download PDF

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케네스 제이. 에일러트센
레이첼 에이. 파워
종 에스. 임
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뉴포텐셜, 인크.
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Abstract

본 발명은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 한 실시예에 있어서, 본 발명은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에 있어서, 본 방법은 HDAC 억제제로 HDAC의 활성을 억제시키는 단계 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 한 타입 이상의 조절 단백질을 억제하는 하나 이상의 작용제에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 다양한 분화 세포 타입으로 재분화 또는 교차분화될 수 있는 ES계 세포의 특징을 가질 수 있는 재프로그래밍 세포 또는 농축 재프로그래밍 세포군에 관한 것이다.

Description

ＨＤＡＣ 조절제의 사용을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 {REPROGRAMMING A CELL BY INDUCING A PLURIPOTENT GENE THROUGH USE OF AN HDAC MODULATOR}
본 출원은 2006년 8월 1일자 미국 특허 출원 제 11/497,064 호의 일부 계속 출원(CIP)으로서, 2005년 8월 1일자 미국 특허 가출원 제 60/704,465 호의 35 U.S.C.§119(e) 규정의 이익을 청구하고, 또한 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/042,890 호; 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/043,066 호; 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/042,995 호; 2008년 11월 12일자 미국 특허 가출원 제 61/113,971 호의 35 U.S.C.§119(e) 규정의 이익을 청구하며, 그 전체 내용은 참고사항으로 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 세포 생물학, 줄기 세포, 세포 분화, 체세포 핵이식 및 세포 치료법(cell-based therapeutics)에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 실시예는 세포를 재프로그래밍(reprogramming)하기 위한 방법, 조성물 및 키트, 그리고 세포 치료법에 관한 것이다.
재생 의학은 많은 인간의 질환에 대한 치료법으로서 높은 가능성을 가지나, 낮은 클로닝 효율성, 잠재적 다능 조직 공급 부족, 및 세포 분화를 어떻게 조절하는지, 어떤 타입의 배아 줄기세포가 선별적 치료에 사용될 수 있는지에 대한 전반적 지식 부족 등을 포함한 몇몇 어려운 기술적 도전이 수반된다. ES 세포는 대단한 가소성을 가지고 있는 반면, 미분화된 ES 세포는 조직 타입의 혼합체를 포함하는 기형종(양성 종양)을 형성한다. 또한, 한 소스에서 다른 소스로의 ES 세포 이식에는 새로운 세포에 대한 거부 반응을 방지하기 위한 약물 투여가 필요할 수도 있다.
태아에서 유래되지 않은 조직으로부터 줄기 세포를 형성하기 위한 새로운 방법을 찾아내려는 시도가 행해지고 있다. 한 방법은 자가 성체 줄기세포의 처리를 포함한다. 재생 의학에 자가 성체 줄기세포를 사용할 때의 이점은 이러한 줄기세포가 동일한 환자로부터 유도되고 다시 되돌아 갈 수 있으며, 따라서 면역-매개 거부반응을 겪지 않는다는 사실에 있다. 이 방법의 결점은 이러한 세포는 ES 세포의 가소성 및 다능성이 부족하기 때문에 그 잠재성이 불확실하다는 것이다. 또 다른 방법은 다능 ES 세포와 같은 세포를 생성하기 위해 성인 조직으로부터 체세포를 재프로그래밍하는 것이다. 그러나, 이 방법은 다세포 생물 내의 각 세포 타입이 일단 고정된 세포로 되거나 세포 주기로부터 벗어난 것으로 간주되는 고유의 후생적 특징(epigenetic signature)을 가지기 때문에 어려운 점이 있다.
세포 DNA는 일반적으로 세포핵과 단백질로 구성된 복합체인 염색질(chromatin)의 형태로 존재한다. 사실상, 대부분의 세포 RNA 분자도 핵단백질 복합체의 형태로 존재한다. 당해 분야에 숙련자에게 알려져 있는 바와 같이, 염색질의 핵단백질 구조는 광범위한 연구 대상이다. 일반적으로, 염색체 DNA는 뉴클레오좀으로 패키징된다. 뉴클레오좀은 코어와 링커를 포함한다. 뉴클레오좀 코어는 코어 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4 중 각각 2개)의 옥타머와, 이를 둘러싼 약 150개의 염기쌍의 염색체 DNA로 구성된다. 또한, 약 50개의 염기쌍의 링커 DNA 단편이 링커 히스톤 H1와 결합되어 있다. 뉴클레오좀은 고차원 염색사로 조직화되고, 염색사는 염색질로 조직화된다. 예를 들어, Wolffe "염색질:구조 및 기능(Chromatin:Structure and Function)" 3rd Ed.,Academic Press, San Diego, 1998 참조.
염색질 구조는 정적이지 않지만, 염색질 리모델링(chromatin remodeling)으로 알려진 공정에 의해 수정될 수 있다. 예를 들어, 염색질 리모델링은 DNA 영역으로부터 뉴클레오좀의 제거, DNA의 한 영역으로부터 다른 영역으로 뉴클레오좀의 이동, 뉴클레오좀 사이의 공간의 변화, 또는 염색체 내의 DNA 영역에 뉴클레오좀의 첨가 등을 포함한다. 또한 염색질 리모델링은 고차원 구조의 변화를 야기함으로써 전사적으로 활성인 염색질(열린구조 염색질 또는 진정 염색질)과 전사적으로 불활성인 염색질(닫힌구조 염색질 또는 이질 염색질)사이의 밸런스에 영향을 줄 수 있다.
염색체 단백질은 다수 타입의 화학적 수정이 가능하다. 코어 히스톤의 번역단계후 수정의 한 메커니즘은 보유되는 고도의 염기성 N-말단 리신 잔기의 엡실런 아미노 기의 가역적 아세틸화이다. 히스톤 아세틸화의 안정 상태는 경쟁하는 히스톤 아세틸트란스퍼라제(들)과 히스톤 데아세틸라제(들)(본 명세서에서, HDAC라고 칭함) 사이의 동적 평형에 의해 달성된다.
HDAC는 서열 독자성 및 도메인 구조에 따라 적어도 4개의 클래스(class)로 분류된다. 클래스 I은 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8이고, 클래스 II는 HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7A, HDAC9, HDAC10이며, 클래스 III은 포유동물 내의 시르투인(sirtuin)(SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, SIRT7)이고, 클래스 IV는 HDAC11이다. 클래스 I HDAC는 효모 전사 조절제 RPD3와 가장 많이 유사하며, 클래스 II HDAC는 효모 HDA1 효소와 가장 많이 유사하다.
히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 전사단계 조절과 관련되어 있다. 히스톤의 가역적 아실화는 염색질 리모델링을 가능하게 하고 유전자 전사의 조절 메커니즘으로서 역할을 할 수 있다. 일반적으로 히스톤의 과아세틸화(hyperacetylation)는 유전자 발현을 촉진시키는 반면, 탈아세틸화는 전사 억제와 관련이 있다. 히스톤 아세틸트랜스퍼라제는 전사 보조활성제(coactivator)로서 역할을 하는 것으로 밝혀진 반면, 데아세틸라제는 전사 억제 경로에 속하는 것으로 알려져 있다.
히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화 사이의 동적 평형은 정상 세포 성장에 있어서 필수적이다. 히스톤 탈아세틸화의 억제는 세포 주기 중지(cell cycle arrest), 세포 분화, 아폽토시스 및 형질전환된 표현형의 역전을 유발한다.
다능 또는 전능 세포의 분화 및 전문화된 표현형으로의 발달은 발달 과정 동안 발현되는 특정 유전자 세트에 의해 측정된다. 유전자 발현은 양의 조절 또는 음의 조절에 영향을 줄 수 있는 유전자 조절 단백질의 서열-특이적 결합에 의해 직접 유발된다. 그러나, 이러한 조절 단백질의 유전자 발현을 직접 유발할 수 있는 능력은, 적어도 부분적으로 세포 DNA 내의 결합 부위의 접근성에 의존한다. 앞서 기술한 바와 같이, 세포 DNA내의 서열의 접근성은 세포 DNA가 패키징되는 세포 염색질의 구조에 의존한다.
따라서, 전사 억제에 관여하는 HDAC의 활성을 억제할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 포함하여, 다능성에 필요한 유전자의 발현을 유도할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 알아내는 것이 유용하다.
본 발명은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 실시예는 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 또한 재프로그래밍된 세포를 생성하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 HDAC 조절제의 사용에 의해 하나 이상의 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 변화시키는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 또한 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 세포, 세포군, 세포 배양액, 세포 배양액으로부터의 세포 서브세트, 균질성 세포 배양액 또는 이질성 세포 배양액을 HDAC 조절제와 접촉시키는 단계, 하나 이상의 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 재분화시키는 단계를 추가로 포함한다.
다른 한 실시예에 있어서, 본 발명은 HDAC의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 억제하는 작용제의 사용에 관한 것이다. 이 작용제는 HDAC의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 억제할 수 있는 어떠한 분자 또는 화합물도 가능하며, 이에는 HDAC 억제제, 소분자, 핵산 서열, DNA 서열, RNA 서열, shRNA 서열, 및 RNA 간섭 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다른 한 실시예에 있어서, 본 발명은 HDAC의 활성을 억제하는 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 유도하는 작용제의 사용에 관한 것이다. 이 작용제는 HDAC를 억제하는 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 유도할 수 있는 어떠한 분자 또는 화합물도 가능하며, 이에는 소분자, 핵산 서열, DNA 서열, RNA 서열, shRNA 서열, 및 RNA 간섭 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
HDAC 억제제는 HDAC의 활성을 억제하는데 사용될 수 있으며, 이에는 TSA, 부틸산 나트륨, 발프로산(valproic acid), 보리노스타트(vorinostat), LBH-589, 아피시딘, TPX-HA db유사체, CI-994, MS-275, MGCD0103, 및 상기 열거한 물질의 유도체 또는 유사체 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
몇몇 실시예에서, 하나 이상의 HDAC 억제제는 하나 이상의 HDAC를 억제시킬 수 있다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 HDAC 억제제는 하나 이상의 HDAC를 동시에 또는 순차적으로 억제시킬 수 있다. HDAC 억제제는 클래스 I, 클래스 II, 클래스 III, 클래스 IV의 HDAC, 또는 알려지지 않았거나 분류되지 않은 HDAC에 지향적일 수 있다. HDAC 억제제는 하나 이상의 클래스의 HDAC 또는 모든 클래스의 HDAC에 지향적일 수 있다. HDAC 억제제의 배합은 하나 이상의 HDAC를 억제할 수 있으며, 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 히스톤 데아세틸라제의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포군을 노출시키는 단계; 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 다능 또는 만능 세포를 시사하는 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 세포를 확장시킴으로써 세포군을 생성하는 단계를 포함하며 분화능(differentiation potential)이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는, 세포를 재프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 제 1 작용제에 세포를 노출시키는 단계; 상기 세포를 제 2 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 제 2 작용제에 노출시키는 단계로서, 이 제 2 조절 단백질은 HDAC와 다른 별개의 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 단계; 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는, 세포를 재프로그래밍하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 제 1 표현형을 갖는 세포를 노출시키는 단계; 상기 세포의 제 1 표현형과 상기 작용제에 세포를 노출한 후에 얻어지는 표현형을 비교하는 단계, 및 재프로그래밍된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 상기 작용제에 세포를 노출시키기 전의 세포의 유전자형과 상기 작용제에 세포를 노출시킨 후에 얻어지는 유전자형을 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포를 노출시키기 전의 세포의 표현형 및 유전자형과, 상기 작용제에 세포를 노출시킨 후의 표현형 및 유전자형을 비교하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 선택된 세포를 세포군으로 배양 및 확장시키는 단계를 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 부호화되는 단백질에 결합하는 항체, 혹은 만능 마커 또는 다능 마커(SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아님)에 결합하는 항체를 사용하여 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 세포는 또한 세포를 분리하는데 효율적인 어떠한 방법에 의해서도 분리될 수 있으며, 이에는 형광 세포 활성화 선별기, 면역조직 화학법, ELISA 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 원 세포 보다 덜 분화된 상태인 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 상기 작용제에 노출시키기 전의 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조와, 상기 작용제에 노출시킨 후에 얻어지는 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 제 1 전사 패턴을 가진 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 세포의 제 1 전사 패턴과 상기 작용제에 노출시킨 후에 얻어지는 전사 패턴을 비교하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 세포 선별은 배아 줄기세포로부터 분석된 전사 패턴과 적어도 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-94%, 95% 또는 95-99% 유사한 전사 패턴을 가진 세포를 확인하는 단계를 포함한다. 배아 줄기세포의 총 전사 패턴을 비교할 수도 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. 그 대신에, 배아 유전자의 서브세트를 비교할 수 있으며, 이에는 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1,000, 1,000-2,000, 2,000-2,500, 2,500-5,000, 5,000-10,000 및 10,000 이상의 유전자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전사 패턴은 이원 방식으로 비교될 수 있다. 즉, 유전자가 전사되는지 아닌지를 결정하기 위해 비교를 시행한다. 또 다른 실시예에서, 각 유전자 또는 유전자의 서브세트에 대한 전사 속도 및/또는 범위가 비교될 수 있다. 전사 패턴은 당해분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는 RT-PCR, 정량적 PCR, 마이크로어레이(microarray), 서던 블로트(southern blot) 및 혼성화 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기술한 방법에 따라 제조된 재프로그래밍된 세포를 사용하여 다양한 질병을 치료하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 또한 재프로그래밍된 세포 및 재분화된 재프로그래밍 세포의 치료 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법에 의해 제조된 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다. 재프로그래밍된 세포는 하나의 계통(lineage) 또는 하나 이상의 계통으로 재분화될 수 있다. 재프로그래밍된 세포는 만능 또는 다능 세포일 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 히스톤 데아세틸라제의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포군을 노출시키는 단계; 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 다능 또는 만능 세포를 시사하는 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 세포를 확장시킴으로써 세포군을 생성하는 단계를 포함하며 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법에 따라 제조되는 농축 재프로그래밍 세포군에 관한 것이다.
다른 한 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 다능 세포를 시사하는 세포표면 마커를 발현한다. 또 다른 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 다능 유전자를 발현하며, 이러한 유전자에는 Oct-4, Sox-2, 및 Nanog가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 다른 한 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 농축 세포군의 적어도 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 96-98%, 또는 적어도 99%를 차지한다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 세포를 재프로그래밍하는데, 그리고 ES계 세포 및 줄기 세포계 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
도 1은 발프로산(VPA)으로 처리된 일차 인간 폐세포내의 Oct-4의 상향 조절을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2는 HDAC 억제제(VPA)로 처리된 일차 인간 폐세포에서, 줄기 세포계 특징을 부여하는 몇몇 유전자의 상향 조절을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 VPA로 처리된 세포내의 Oct-4의 제 1 엑손 내에서 두개의 시토신의 탈메틸화를 보여주는 도면이다.
도 4A는 성인 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화(fold change)에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Nanog에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 도 4B는 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Nanog에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 도 4C는 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Nanog에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 5A는 성인 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Oct-4에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 도 5B는 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Oct-4에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 도 5C는 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Oct-4에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 6은 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Sox-2에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 7은 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 shRNA 간섭 동안 mRNA 발현에 의해 측정되는 바와 같이 다양한 HDAC 및 SIRT 유전자에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 8은 성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa), 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn), 및 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 이중간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Nanog에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 9는 성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa), 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn), 및 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 이중간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Oct-4에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 10은 성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa), 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn), 및 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 이중간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 유전자 Sox-2에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 11은 성인 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 이중간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 다양한 HDAC 유전자 및 SIRT 유전자에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 12는 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 이중간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 다양한 HDAC 유전자 및 SIRT 유전자에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 13은 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 이중간섭 동안 mRNA 발현의 배수 변화에 의해 측정되는 바와 같이 다양한 HDAC 유전자 및 SIRT 유전자에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 14A는 성인 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7a shRNA가 HDAC7a 및 HDAC11의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 퓨로마이신의 부재하에 및 존재하에 증식된 세포에 대한 데이터를 보여준다.
도 14B는 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7a shRNA가 HDAC7a 및 HDAC11의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 퓨로마이신의 부재하에 및 존재하에 증식된 세포에 대한 데이터를 보여준다.
도 14C는 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7a shRNA가 HDAC7a 및 HDAC11의 발현에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 15A는 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 15B는 DNMT1 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 15C는 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 15D는 DNMT1 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 15E는 DNMT1 및 HDAC11 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 15F는 HDAC11 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 15G는 인간 배아 줄기세포의 사진이다.
도 16A는 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 16B는 DNMT1 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 16C는 DNMT1 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 16D는 DNMT1 및 HDAC11 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 16E는 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 16F는 HDAC11 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 16G는 인간 배아 줄기세포의 사진이다.
용어 정의
본 명세서에 수의 범위는 대략적인 것이며, 따라서 별도의 설명이 없는 한 범위 밖의 수치도 포함될 수 있다. 수의 범위는 한 단위씩 증가하고 범위 내의 모든 수치 및 하한치와 상한치를 포함하며, 낮은 수치와 높은 수치 사이에 적어도 두 단위로 분리가 되는 것을 전제로 한다. 한 보기로서, 예를 들어, 분자량, 점성도, 용융지수(melt index) 등과 같은 조성적, 물리적 또는 다른 특성이 100 ~ 1,000이라면, 100, 101, 102 등과 같은 모든 각각의 수치 및 100 ~ 144, 155 ~ 170, 197 ~ 200 등과 같은 하위 범위도 특별히 열거될 수 있다는 것을 의미한다. 1보다 작거나 큰 소수(예를 들어, 1.1, 1.5 등)를 포함하는 범위인 경우, 한 단위는 경우에 따라 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1이 될 수 있다. 10보다 작은 한자리 수를 포함하는 범위인 경우, 한 단위는 통상적으로 0.1로 간주된다. 특별히 의도하는 것이 무엇인지에 대한 예로서 최저치와 최고치 사이의 모든 가능한 조합의 수치를 열거하는 것은 본 명세서에서 특별히 설명하고자 하는 의도가 있는 것이다. 수의 범위는 본 방법에서 인용되는 혼합물의 성분의 상대적 농도와 다양한 온도 및 다른 파라미터 범위에 대해 제공된다.
"세포" 또는 "세포들"은 특별히 그렇지 않다는 언급이 없는 한, 체세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기세포, 기관 특이적 줄기세포, 핵 이식(NT) 유니트 및 줄기계 세포를 포함한다. 세포 및 세포들은 인간 또는 다른 동물세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 생쥐, 기니아 피그, 집쥐, 돼지, 양, 염소 등의 세포일 수 있다. 또한 세포는 비인간 유인원 세포일 수 있다.
"배양 배지" 또는 "성장 배지"는 세포의 성장을 지지할 수 있는 적절한 배지를 의미한다.
"분화"는 배아 발달 동안 세포가 구조적으로 및 기능적으로 전문화되는 과정을 의미한다.
"후생적"은 뉴클레오티드 서열의 변화없이 기능 변화를 물려줄 수 있는 DNA 상태를 의미한다. 후생적 변화는 DNA의 뉴클레오티드 서열 변화없이 예를 들어 메틸화 및 탈메틸화에 의해 DNA를 수정함으로써 유발될 수 있다.
"히스톤"은 DNA가 핵 내에서 고정되기에 충분하도록 DNA를 응축하는 역할을 하며 염색체내에 존재하는 단백질 분자를 의미한다.
"히스톤 데아세틸라제 억제제" 및 "히스톤 데아세틸라제의 억제제"는 히스톤 아세틸라제와 상호작용하여 그 효소 활성을 억제시킬 수 있는 화합물을 의미한다. "히스톤 데아세틸라제 활성 억제"는 히스톤 또는 다른 단백질과 같은 적합한 기질로부터 아세틸기를 제거할 수 있는 히스톤 아세틸라제의 능력을 저하시키는 것을 의미한다. 몇몇 실시예에서 이러한 히스톤 데아세틸라제 활성 감소는 적어도 약 10 ~ 25%, 다른 실시예에서는 적어도 약 50%, 또 다른 실시예에서는 적어도 약 75%, 또 다른 실시예에서는 적어도 약 90%이다. 다른 실시예에서는 히스톤 아세틸라제 활성이 적어도 95%까지 감소되며, 또 다른 실시예에서는 적어도 99%까지 감소된다.
"넉다운"은 유전자 발현이 유전자-특이적 방식으로 억제되는 것을 의미한다. 하나 이상의 유전자 "넉다운"을 가진 세포는 넉다운 생물 또는 간단하게 "넉다운"이라고 칭한다.
"다능"이라는 것은 3 배엽 또는 기본조직 타입의 세포 타입으로 분화될 수 있는 것을 의미한다.
"다능 유전자"는 세포가 다능성이 되는데 기여하는 유전자를 의미한다.
"다능 세포 배양액"은 배아 또는 성인 유래의 분화된 세포와는 명백하게 구별되는 형태를 보이는 "사실상 미분화된" 것이다. 다능 세포는 일반적으로 핵/세포질 비가 높으며, 인이 두드러지고, 식별이 어려운 세포 연접부와 강한 콜로니를 형성하며, 당해 분야에 숙련자에게 널리 인식되고 있는 세포이다. 인지해야 할 점은 미분화 세포 콜로니는 분화된 주변 세포들에 의해 둘러 싸여져 있을 수 있다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 적절한 조건하에 배양시에 사실상 미분화된 콜로니가 유지될 것이며, 배양 세포의 분열시에 증식하는 세포의 대부분은 미분화 세포가 차지한다. 본 명세서에서 기술되는 유용한 세포군은 이러한 기준을 가진 사실상 미분화된 다능 세포를 함유한다. 사실상 미분화된 세포 배양액은 미분화 다능 세포를 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%(세포군 중 총 세포의 퍼센트) 함유할 수 있다.
"조절 단백질"은 생물학적 변화과정을 조절하는 단백질을 의미하며, 이 조절은 양의 방향 및 음의 방향으로의 조절을 포함한다. 조절 단백질은 생물학적 변화과정에 직접 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있으며, 직접적으로 영향력을 행사하거나 복합체에 참여함으로써 영향을 줄 수 있다.
"재프로그래밍"은 핵 속의 후생적 마크를 제거하고, 다른 세트의 후생적 마크를 확립하는 것을 의미한다. 다세포 생물의 발달과정에서, 서로 다른 세포 및 조직은 서로 다는 유전자 발현 프로그램을 획득한다. 이러한 구별되는 유전자 발현 패턴은 DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 다른 염색질 결합 단백질과 같은 후생적 변경에 의해 사실상 조절되는 것으로 보인다. 따라서, 다세포 생물내의 각 세포 타입은 통상적으로 일단 세포가 분화되거나 세포 주기를 벗어나면 "고정"되고 변경되지 않는 것으로 생각되는 고유의 후생적 특징을 가진다. 그러나, 일부 세포는 정상적인 발달과정 또는 특정 질환의 상황에서 중요한 후생적 "재프로그래밍"을 경험한다.
"전능성"은 완전한 배아 또는 기관으로 발육할 수 있는 능력을 의미한다.
본 발명의 실시예는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 세포가 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 본 방법은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 다능성 또는 만능성이며 적어도 하나의 계통으로 유도 분화될 수 있는 재프로그래밍 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 염색질 구조를 변화시키는 단계 및 세포를 다능성 또는 만능성이 되도록 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 염색질 구조의 변화는 HDAC의 활성을 억제하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 HDAC의 활성을 억제하는 단계 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 HDAC의 활성을 억제하는 단계 및 재프로그래밍된 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 다능 또는 만능 유전자는 발현의 배수 증가가 0.25-0.5, 0.5-1, 1.0-2.5, 2.5-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-500, 및 500배 초과(이에 국한되는 것은 아님)까지 유도될 수 있다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 분화된 세포를 플레이팅하는 단계, HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 상기 분화된 세포를 노출시키는 단계, 상기 세포를 배양하는 단계, 및 재프로그래밍된 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 HDAC의 활성을 억제하는 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 유도하는 작용제에 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 조절 단백질의 활성 또는 발현은 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 및 95-99%, 99-200%, 200-300%, 300-400%, 400-500% 및 500% 초과(이에 국한되는 것은 아님)까지 증가될 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 부호화되는 단백질 또는 단백질 단편, 혹은 다능 표면 마커에 대한 항체를 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 항체로는 어떠한 종류도 사용될 수 있으며, 이에는 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 단편, 펩티드 모방 항체, 활성 영역에 대한 항체, 단백질 보존 영역에 대한 항체 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자 혹은 다능 또는 만능 표면 마커에 의해 작동되는 리포터를 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 리포터로는 어떠한 종류도 사용될 수 있으며, 이에는 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 시안 형광 단백질(CFP), 노란색 형광 단백질(YFP), 박테리아 루시퍼라제(bacterial luciferase), 해파리 에쿼린(jellyfish aequorin), 강화 녹색 형광 단백질, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), dsRED, β-갈락토시다제, 및 알칼리성 포스파타제 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 선별가능한 마커로서의 저항물질을 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 저항물질에는 항생제 저항물질, 살균제, 퓨로마이신, 하이그로마이신(hygromycin), 디하이드로폴레이트 환원제, 티미딘 키나제, 네오마이신 저항물질(neo), G418 저항물질, 마이코페놀산 저항물질(gpt), 제오신 저항 단백질 및 스트렙토마이신 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포를 노출시키기 전의 세포의 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조와 상기 작용제로 처리한 후에 얻어지는 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 염색질 구조의 어떠한 특징도 비교할 수 있으며, 이에는 진정 염색질, 이질 염색질, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 또는 히스톤 구성성분의 존재 및 부재, 히스톤의 위치, 히스톤의 배열, 및 염색질과 관련이 있는 조절 단백질의 존재 또는 부재 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 모든 유전자 영역의 염색질 구조가 비교될 수 있으며, 이에는 강화물질 고유영역, 활성자 고유영역, 프로모터, TATA 박스, 전사 개시 부위의 업스트림 영역, 전사 개시 부위의 다운스트림 영역, 엑손, 및 인트론 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다른 한 실시예에 있어서, 본 방법은 하나 이상의 HDAC의 활성을 억제하는 단계, CpG 디뉴클레오티드 내의 하나 이상의 시토신을 탈메틸화하는 단계, 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 세포를 HDAC 억제제와 접촉시키는 단계; HDAC의 활성을 억제시키는 단계; 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 재프로그래밍된 세포는 다능성 또는 만능성일 수 있다.
본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 사용되는 HDAC 억제제는 어떠한 HDAC와도 상호작용을 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 HDAC 억제제는 알려진 HDAC의 클래스들 중 어느 한 클래스의 HDAC와 상호작용을 할 수 있다. 본 발명의 HDAC 억제제는 클래스 I, 클래스 II, 클래스 III, 또는 클래스 IV의 HDAC와 상호작용을 할 수 있다. 본 발명의 HDAC 억제제는 한 특정 클래스의 HDAC, 모든 클래스의 HDAC, 또는 클래스 I과 클래스 II; 클래스 I과 클래스 III; 클래스 I과 클래스 IV; 클래스 II와 클래스 III; 클래스 II와 클래스 IV; 클래스 III와 클래스 IV; 클래스I, II 및 III; 클래스II, III 및 IV; 클래스I, II 및 IV(이에 국한되는 것은 아님)를 포함한 다수의 클래스의 HDAC와 상호작용을 할 수 있다. 또한 본 발명의 HDAC 억제제는 알려진 클래스들 중 어느 한 클래스에 속하지 않는 HDAC와 상호작용을 할 수 있다.
HDAC 억제제는 가역적 작용 메커니즘을 가질 수도 있고 비가역적 작용 메커니즘을 가질 수도 있다. HDAC 억제제는 어떠한 결합 친화성도 가질 수 있으며, 예를 들어 밀리몰(mM), 마이크로몰(μM), 나노몰(nM), 피코몰(pM) 및 펜타몰(fM)이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
이러한 억제는 특이적인 것이 바람직하다. 예를 들어, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 관련없는 다른 생물학적 효과를 제공하기 위해 필요한 억제제의 농도보다 낮은 농도에서 히스톤으로부터 아세틸기를 제거할 수 있는 히스톤 데아세틸라제의 능력을 저하시킨다. 히스톤 데아세틸라제 억제 활성에 필요한 억제제의 농도는 관련없는 생물학적 효과를 제공하기 위해 필요한 농도보다 바람직하게는 적어도 2배 낮으며, 보다 바람직하게는 적어도 5배 낮고, 더욱 바람직하게는 적어도 10배 낮으며, 가장 바람직하게는 20배 낮다.
다른 한 실시예에서, HDAC 억제제는 HDAC의 촉매적 도메인을 함유하는 아연에 결합함으로써 작용할 수 있다. 이러한 작용 메커니즘을 갖는 HDAC 억제제는 여러 그룹으로 분류된다. 즉, (i) 트리코스타틴 A와 같은 하이드록삼산(hydroxamic acid); (ii) 환형 테트라펩티드; (iii) 벤즈아미드 ; (iv) 친전자성 케톤; 및 (v)페닐부티레이트 및 발프로산과 같은 지방족산 그룹의 화합물로 분류된다.
다른 한 실시예에 있어서, HDAC 억제제는 NAD+ 의존적이며 니코틴아미드, NAD 유도체, 디하이드로코마린, 나프토피라논 및 2-하이드록시나프알데히드(이에 국한되는 것은 아님)를 포함하는 시르투인 클래스 III HDAC에 지향적일 수 있다.
다른 한 실시예에서, HDAC 억제제는 비히스톤계 이펙터 분자의 아세틸화 정도를 변화시킴으로써 유전자의 전사를 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법, 조성물 및 키트에 사용되는 HDAC 억제제는 HDAC의 효소 억제제로서만 작용하는 것으로 생각하지 않아야 한다. 다향한 비히스톤계 전사 인자 및 전사 공동조절제는 아세틸화에 의해 변형될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이에는 ACTR, cMyb, p300, CBP, E2F1, EKLF, FEN 1, GATA, HNF-4, HSP90, Ku70, NFκB, PCNA, p53, RB, Runx, SF1, Sp3, STAT, TFIIE, TCF 및 YY1 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아세틸화되는, 전사 활성화에 관여하는 어떠한 전사 인자 또는 단백질의 활성은 본 발명의 방법으로 증가될 수 있다.
하기 표 1은 HDAC 억제제로서 기능을 할 수 있는 대표적인 화합물의 목록을 제공한다. 표 1의 "이소타입(isotype)"이라는 용어는 단지 화합물이 특정 클래스의 HDAC에 선호도를 가지는지에 대한 이해를 제공하기 위한 의미이다. 특정 이소타입 또는 클래스의 HDAC의 목록은 그 화합물이 단지 그 이소타입 또는 클래스에 대한 친화성을 가지는 것으로만 해석하지 않아야 한다. 본 발명의 HDAC 억제제는 본 명세서에 열거한 어떠한 HDAC 억제제의 유도체 및 유사체도 포함한다.
부틸산 또는 부티레이트는 제 1 HDAC 억제제로 확인되었다. 그러나, 밀리몰 농도에서, 부티레이트는 HDAC에 특이적이 아닐 수 있으며, 또한 핵단백질의 포스포릴화 및 메틸화 뿐만 아니라 DNA 메틸화를 억제할 수 있다. 유사체인 페닐부티레이트는 유사한 방식으로 작용한다. 트리코스타틴 A(TSA) 및 트라폭신(TPX)이 보다 특이적이다. TPX 및 TSA는 히스톤 데아세틸라제의 억제제로서 부각되고 있다. TSA는 HDAC를 가역적으로 억제시키는 반면, TPX는 HDAC 효소와 결합하여 이를 불활성화시킨다. 부티레이트와는 달리, TSA 또는 TPX의 경우, 아직 다른 효소계의 비특이적 억제에 대해 보고되지 않았다.
발프로산도 또한 히스톤 데아세틸라제 활성을 억제한다. VPA는 서로 다른 몰의 작용 메커니즘에 의존하는 다수의 생물학적 활성을 가진 공지된 약제이다. VPA는 항경련제(antiepileptic drug)이다. VPA는 기형발생성을 가진다. 임신 중 항경련제로서 VPA를 사용하면, VPA는 태어난 아기의 수 퍼센트에서 선천적 결손증(신경관 폐쇄 결손 및 다른 기형)을 유발시킬 수 있다. 생쥐의 경우, VPA는 적당히 투여했을 때 대부분의 생쥐 태아에서 기형발생성을 가진다. VPA는 핵 호르몬 수용체(PPAR-델타)를 활성화시킨다. 표 1은 HDAC 억제제로서 기능을 할 수 있는 대표적인 화합물의 목록이다.
HDAC 억제제 이소타입 친화도 범위 화학적 분류
부티레이트/부틸산나트륨 클래스 I/IIa mM 카르복실레이트
페닐 부티레이트 카르복실레이트
발프로산(VPA) 클래스 I/IIa mM 카르복실레이트
AN-9, 피발로일옥시메틸 부티레이트 n/a uM 카르복실레이트
m-카르복시시아남산 비스하이드록삼산(CBHA) n/a uM 하이드록사메이트
ABHA(아젤레익
비스하이드록삼산)		 n/a uM 하이드록사메이트
옥삼플라틴 n/a uM 하이드록사메이트
HDAC-42 하이드록사메이트
SK-7041 HDAC1/2 nM 하이드록사메이트
DAC60 하이드록사메이트
UHBAs
투바신 HDAC6 하이드록사메이트
트라폭신B 환형 펩티드/에폭시다제
A-161906 n/a 하이드록사메이트
R306465/JNJ16241199 HDAC1/8 하이드록사메이트
SBHA(수베릭
비스하이드록사메이트)		 n/a uM 하이드록사메이트
3-CI-UCHA
ITF2357 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
PDX-101 클래스 I/II uM 하이드록사메이트
파이록사미드 클래스 I,
알려지지않은
클래스 II		 uM 하이드록사메이트
스크립타이드 n/a uM 하이드록사메이트
수베로일아닐리드 하이드록삼산/보리노스타트/졸린자 클래스 I/II/IV uM 하이드록사메이트
트리코스타틴A 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
LBH-589(파노비노스타트) 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
NVP-LAQ824 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
아피시딘 HDAC nM 환형 펩티드
뎁시펩티드/FK-228/
로디뎁신/FR901228		 클래스 I/II 펩티드
TPX-HA 동족체(CHAP); CHAP1, CHAP31, CHAP50 nM 하이드록사메이트
CI-994(N-아세틸 디날린) HDAC1/2 nM 벤즈아미드
MS-275(MS-27-275와 동일) HDAC1 nM 벤즈아미드
PCK-101
MGCD0103 HDAC1/2 nM 벤즈아미드
디알릴 디설파이드(DADS) n/a uM 디설파이드
술포라판(SFN) n/a uM 이소티오시아네이트
술포라판
(이중결합을 가진 SFN)		 n/a uM 이소티오시아네이트
에루신 n/a n/a 이소티오시아네이트
페닐부틸 이소티오시아네이트 n/a uM 이소티오시아네이트
레티노이드
SFN-N-아세틸시스테인 (SFN-NAC) n/a uM 이소티오시아네이트
SFN-시스테인(SFN-Cys) n/a uM 이소티오시아네이트
비오틴 n/a n/a 메틸-수용체
알파-리포산 n/a n/a 카르복실레이트
Vit E 대사산물 n/a n/a
트리플로오로메틸 케톤 유용 nM 트리플루오로메틸 케톤
알파-케토아미드
스플리토미신 클래스 III
LAQ824 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
SK-7068 HDAC1/2 nM 하이드록사메이트
파노비노스타트 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
벨리노스타트 클래스 I/II nM 하이드록사메이트
또한 다양한 HDAC 억제제는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)로부터 입수할 수 있으며, 이에는 APHA 화합물; 아피디신; 데푸데신; 스크립타이드; 시르티놀; 및 트리코스타틴 A 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 추가적인 HDAC 억제제는 Vinci-Biochem(Italy)으로부터 입수할 수 있으며, 이에는 5-아자-2'-데옥시시티딘; CAY10398; CAY10433; 6-클로로-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-카르바졸-1-카르복사미드; HC 톡신; ITSA1; M344; MC 1293; MS-275; 옥삼플라틴; PXD 101; SAHA; 스크립타이드; 시르티놀; 스플리토미신 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한 덱사메타손도 어떠한 HDAC 억제제와도 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 덱사메타손 및 5-아자-2'-데옥시시티딘을 함유하는 조성물이 사용될 수 있다.
HDAC 억제제는 어떠한 수, 어떠한 배합 및 어떠한 농도로도 사용될 수 있으며, 이에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-15, 16-20 및 21-25 HDAC 억제제가 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 하나 또는 그 이상의 억제 단백질을 저해시킬 수 있다. 하나 또는 그 이상의 억제 메커니즘이 사용될 수 있으며, 이에는 소분자 억제제, HDAC 억제제, shRNA, RNA 간섭, 및 작은 간섭 RNA 등이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 보상 기전으로 기능을 하는 둘 또는 그 이상의 억제 단백질을 저해하는 단계를 포함하는 세포의 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 중복 기전으로 기능을 하는 둘 또는 그 이상의 단백질을 저해하는 단계를 포함하는 세포의 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 HDAC 단백질을 억제하는 단계 및 억제된 HDAC에 보상을 위한 기능을 하는 하나 이상의 단백질을 억제하는 단계를 포함하는 세포의 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 하나의 억제 단백질, 예를 들어 HDAC을 저해함으로써, 하나 이상의 다른 억제 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 중복, 보상 또는 중복 및 보상 단백질의 발현 억제는 shRNA, RNA 간섭, HDAC 억제제, 및 소분자 억제제(이에 국한되는 것은 아님)를 포함한 어떠한 적절한 방법을 사용함으로써 달성될 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 억제 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 저해하는 단계로서 상기 억제 단백질의 저해가 다른 억제 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 증가시키지 않는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 억제 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 저해하는 단계로서 상기 억제 단백질의 저해가 보상 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 증가시키지 않는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 억제 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 저해하는 단계로서 상기 억제 단백질의 저해가 중복 단백질의 발현, 활성, 또는 발현과 활성을 증가시키지 않는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 조절 단백질의 활성, 발현 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포를 노출시키는 단계를 포함하는 세포의 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 조절 단백질은 같은 패밀리일 수도 있고 별개의 단백질 패밀리 멤버일 수도 있다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 제 1 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포를 노출시키는 단계; 상기 세포를 제 2 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 제 2 작용제에 노출시키는 단계로서, 이 제 2 조절 단백질은 제 1 조절 단백질과 다른 별개의 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 제 1 및 제 2 조절 단백질은 단백질의 발현을 조절 또는 변화시키는데 관여하는 어떠한 단백질이어도 가능하며, 이에는 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 리신 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 트리코스타틴 A, 히스톤 데메틸라제, 리신 데메틸라제, 시르투인, 시르투인 활성제, 핵 수용체, 고아 핵수용체, Esrrβ 및 EssRγ 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 재프로그래밍 세포는 다능 또는 만능성일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 재프로그래밍 세포는 배아 줄기세포와 유사한 특성을 포함한 여러가지 다른 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍된 세포는 미분화 상태로 적어도 10, 15, 20, 30 또는 그 이상의 계대(passages) 동안 증식할 수 있다. 다른 형태로서, 재프로그래밍된 세포는 분화되지 않고 1년을 초과하는 기간 동안 증식될 수 있다. 또한 재프로그래밍된 세포는 증식 및/또는 분화 과정 동안 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 또한 몇몇 재프로그래밍된 세포는 미분화 상태로 생체내에서 무제한 증식할 수 있는 세포일 수 있다. 또한 몇몇 재프로그래밍된 세포는 장기간 배양을 통해 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 장기간 배양 후에도 3가지 종류의 배아 생식층(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 유도체로 분화되기 위한 잠재성을 유지할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 생물체 내에서 어떠한 세포 타입도 형성할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 미분화 증식을 유지하지 못하는 배지 상에서의 증식과 같은 특정 조건하에서 배양체(embryoid body)를 형성할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 예를 들어, 배반포와의 융합을 통해 키메라를 형성할 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 다양한 마커에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 재프로그래밍된 세포는 알칼리성 포스파타제를 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및/또는 Tra-1-81을 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 Oct4, Sox2 및 Nanog를 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 mRNA 레벨에서 발현할 것이고, 또한 다른 재프로그래밍된 세포는 예를 들어 세포 표면상에서 또는 세포내에서 단백질 레벨에서 발현할 것이라는 것을 알아야 한다.
재프로그래밍된 세포는 어떠한 재프로그래밍된 세포 특성 또는 범주(들) 및 본 명세서에서 기술한 특성의 어떠한 조합도 가질 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍된 세포는 SSEA-1을 발현하지 않고 알칼리성 포스파타제를 발현할 수 있으며, 적어도 20 계대 동안 증식할 수 있고, 어떠한 세포 타입으로도 분화될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 재프로그래밍된 세포는 세포 표면상에서 SSEA-1을 발현할 수 있으며, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직을 형성할 수 있고, 분화없이 1년을 초과하는 기간 동안 배양될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 알칼리성 포스파타제(AP)에 양성, SSEA-1에 양성, SSEA-4에 음성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 Nanog에 양성, Sox2에 양성, Oct-4에 양성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 Tcl1에 양성, Tbx3에 양성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 크립토(Cripto)에 양성, 스텔라(Stellar)에 양성 및 Daz1에 양성을 나타낼 수 있다. 재프로그래밍된 세포는 모노클론 항체인 TRA-1-60(ATCC HB-4783) 및 TRA-1-81(ATCC HB-4784)의 결합 특이성을 가지는 항체와 결합하는 세포 표면 항원을 발현할 수 있다. 또한 앞서 기술한 바와 같이, 재프로그래밍된 세포는 영양 세포층(feeder layer)없이 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20의 계대 동안 또는 1년을 초과하는 기간 동안 유지될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 지방세포, 골격근, 내피, 엽록체, 평활근, 심근, 신경세포, 조혈세포, 췌장소도, 또는 사실상 신체의 세포를 포함하는 광범위한 세포 타입의 다른 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다. 재프로그래밍된 세포는 모든 세포 게통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다. 재프로그래밍된 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6-10, 11-20, 21-30, 및 30 초과의 계통을 포함하는 다양한 수의 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다.
세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 어떠한 유전자도 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 이러한 유전자로는 N-메틸트랜스퍼라제(Gnmt), Octamer-4(Oct4), Nanog, SRY(성별 결정 영역 Y)-박스 2(Sox2라고도 알려져 있음), Myc, REX-1(Zfp-42라고도 알려져 있음), 인테그린 α-6, Rox-1, LIF-R, TDGF1(CRIPTO), 프라길리스, SALL4(sal계 4), GABRB3, LEFTB, NR6A1, PODXL, PTEN, 백혈구 세포로부터 유도되는 케모탁신 1(LECT1), BUB1, 및 Klf4와 Klf5 같은 Kruppel계 인자(Klf) 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 다양한 수의 유전자는 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 이에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 및 50 초과의 유전자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, Ramalho-Santos et al.(Science 298, 597 (2002)), Ivanova et al.(Science 298, 601 (2002)) 및 Fortunel et al.(Science 302, 393b(2003))의 3가지 타입의 줄기 세포가 각각 비교되고, 줄기 세포의 기능적 특성을 부여하는데 중요한 것으로 간주되는 통상적으로 "줄기세포성" 유전자라고 표현되는 유전자의 목록이 확인되었다. 상기 언급된 연구에서 확인된 어떠한 유전자도 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있다. 하기의 표 2는 줄기 세포의 기능적 특성을 부여하는데 관여하는 것으로 간주되는 유전자의 목록을 제공한다. 표 2에 기재된 유전자 이외에도, 알려진 유전자와 상동관계가 거의 또는 전혀 없는 93개의 발현 서열 태그(EST) 클러스터도 Ramalho-Santos et al. 및 Ivanova et al.에 의해 확인되었으며, 이들 또한 본 발명의 방법에 포함된다. 표 2는 줄기 세포 특징을 부여하는데 관여하는 유전자의 목록이다.
기호 유전자 기능
F2r 트롬빈 수용체 G단백질 결합수용체, 응고과정,
맥관 발생에 필요
Ghr 성장호르몬 수용체 성장호르몬 수용체/결합 단백질, Jak2활성화
Itga6 인테그린 알파 6 세포부착, 세포표면 매개신호전달,
인테그린 b1과 결합가능
Itgb1 인테그린 베타 1
(파이브로넥틴 수용체)		 세포부착, 세포표면 매개신호전달,
인테그린 a6과 결합가능
Adam 9 디스인테그린 및
메탈로프로테이나제 도메인 9(멜트린 감마)		 세포부착, 세포밖 단백질분해,
점재적 융합 단백질
Bys 비스틴계(비스틴) 세포부착, 배아착상(태반)에 중요
Ryk 수용체계 티로신키나제 비전통적 수용체 티로신 키나제
Pkd2 다낭성 신종 2 칼슘채널
Kcnab3 전압차 개방 칼륨 통로,
세이커 관련 서브 패밀리, 베타 멤버3		 칼륨 채널의 조절 서브유니트
Gnb1 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 베타1 G-단백질 결합 수용체 신호전달
Gab1 성장인자 수용체 결합 단백질2(Grb2)-관련 단백질 1 다수의 신호전달 경로의 통합
Kras2 키르스텐 쥐 육종 암유전자 2 GTP와 결합하여 성장인자 수용체로부터 신호전달
Ras p21단백질 활성제(Gap)와 매우 유사한 EST RAS기능 억제제
Cttn 코르악틴 액틴 세포골격 조절, 종양 내에서 과발현
Cops4 COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 4		 Cop9신호전달 복합체, 다수의 신호전달 경로의 통합, 단백질 분해조절
Cops7a COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 7a		 Cop9신호전달 복합체, 다수의 신호전달 경로의 통합, 단백질 분해조절
Madh1 Mad 동족체 1(Smad1) TGFb 경로신호 변환기
Madh2 Mad 동족체 2(Smad2) TGFb 경로신호 변환기
Tbrg1 TGFb 조절 1 TGFb에 의해 유도
Stam 신호변환 아덥터 분자(SH3 도메인 및 ITAM 모티브) 1 Jak티로신 키나제와 관련
Statip1 STAT 상호작용 단백질 1 Jak/Stat3결합을 위한 스캐폴드
Cish2 시토킨 유도성 SH2 함유 단백질(Ssi2) STAT 유도 STAT억제제-2,
Igf1R과 상호작용
Jak3와 적당히(moderately) 유사한 ESTs 잠재적 키로신 키나제
PPP2R1B와 매우 유사한 ESTs 단백질 포스파타제 2의 조절서브 유니트, 추정 종양 억제제
Rock2 Rho-관련 감긴 코일 형성 키나제 2 세린/트레오닌 키나제, Rho의 표적
Yes 야마구찌 육종 바이러스 암유전자 동족체 세포내 티로신 키나제, 전암유전자,
Src 패밀리
Yap Yes-관련 단백질1 Yes와 결합, 전사 공활성제
Ptpn2 단백질 티로신 비-수용체 포스파타제 2 데포스포릴레이트 단백질
Ppplr2 단백질 포스파타제 1,
조절(억제제) 2		 단백질 포스파타제 1의 조절 서브유니트
Ywhab 티로신/트립토판 모노옥시게나제 활성화 단백질 베타(14-3-3베타) 포스포세린-단백질과 결합, PKC 경로
Ywhah 티로신/트립토판 모노옥시게나제 활성화 단백질 에타(14-3-3에타) 포스포세린-단백질과 결합, PKC 경로
Axo 액스트로핀 PHD도메인 함유, 아데닐레이 시클라제 도메인 및 G-단백질 상호작용에 대한 일치 영역을 포함,
뉴런 유지에 필요
Trip6 갑상선 호르몬 수용체 상호작용제 6 TH 존재하에 THR과 상호작용,
Rel 전사인자에 대한 추정 공활성화제
Gfer 성장인자, erv1(맥주효모)계 (간재생 증진제) 설피드릴 옥시다제, 간재생 촉진,
EGFR 및 MAPK 경로 자극
Upp 우리딘 포스포릴라제 우리딘과 우라실 상호전환,
형질전환 세포 내에서 고도로 발현,
2-데옥시-D-리보즈 생성, 강력한 혈관 형성인자
Mdfi MyoD 패밀리 억제제 bHLH 및 베타-카테닌/TCF 전사인자의 억제제
Tead2 TEA 도메인 2 전사인자
Yap Yes-관련 65kD Yes와 결합, 전사 공활성제
Fhl1 4와 1/2 LIM RBP-J/Su(H)와 상호작용
Zfx 아연핑거X-결합 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp54 아연핑거 54 아연핑거, 추정 전사인자
아연핑거 단백질 아연핑거, 추정 전사인자
D17Ertd197e D17Ertd197e 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우 유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Rnf4 RING 핑거 4 스테로이드-매개 전사
Chd1 크로모도메인 헬리카제 DNA결합 단백질 1 염색질 구조의 변경,
SNF2/SW 12 패밀리
Etl1 증감제 트랩 유전자 부위 염색질 구조의 변경,
SNF2/SW 12 패밀리
Rmp Rpb5-매개 단백질 RNA와 결합, Pol II, 전사 억제
Ercc5 절제 수선 5 엔도뉴클레아제 UV-유도 손상의 억제
Xrcc5 X선 수선 5 (Ku80) 헬리카제, V(D)J 재조합에 관여
Msh2 MutS 동족체 2 미스매치 수선, 대장암에서 돌연변이
Rad23b Rad23b 동족체 절제수선
Ccnd1 시클린 D1 G1/S전이, CDk2 및 4 조절, 유방암에서 과다발현, 다른 암에 관련됨
Cdkn1a Cdk 억제제 1a P21 G1/S전이 억제, Cdk2 억제제,
HSC 유지에 필요
Cdkap1 Cdk2관련 단백질 DNA프리마제,
DNA복제의 잠재적 조절제(S상)
Cpr2 세포주기 이행 2 맥주 효모 내에서 G1중지 극복
Gas2 성장중지 특이적 2 성장중지 세포에서 고도발현,
액틴 세포 골격의 일부
CenpC 동원체 단백질 C 활성 동원체 내에 존재
Wig1 야생형 p53 유도1 P53표적, 종양세포 성장억제
Tmk 티미딜레이트 키나제 dTTP합성경로, S상 진행에 필수적
Umps 우리딘 모노포스페이트
합성효소		 피리미딘 생합성
Sfrs3 스프라이싱 인자 RS 리치 3 조직-특이적 차별 스프라이싱에 연관,
세포주기 조절
엑스포틴 1과 매우 유사한 ESTs 세포주기 조절 핵방출 단백질
CAD와 매우 유사한 ESTs 피리미딘 생합성의 3기능성 단백질, MAPK에 의한 활성화(포스포릴화)
Mapkkkk3와 유사한 ESTs Map키나제 캐스케이드
Gas2 성장중지 특이적 2 성장중지 세포 내에서 고도발현,
액틴 세포골격의 일부,
카스파제-3의 표적, p53을 안정화
Wig1 야생형 p53 유도 1 p53표적, 종양세포 성장 억제
Pdcd2 프로그래밍된 세포사멸 2 알려지지 않음
Sfr3 스플라이싱 인자 RS 리치3 조직-특이적 차별 스플라이싱 세포주기 조절
Sfrs6과 매우 유사한 EST 추정 스플라이싱 인자
전-mRNA 스플라이싱 인자 Prp6과 매우 유사한 EST 추정 스플라이싱 인자
Snrp1c 소핵 리보뉴클레오프로테인 폴리펩티드 C U1 snRNPs, 스플라이세오솜의 구성성분
Phax RNA방출에 사용되는 포스포릴화 아댑터 U snRNA 핵방출 매개
NOL5 핵인 단백질 5(SIK와 유사) 전-rRNA 프로세싱
Nop56과 매우 유사한 EST 전-rRNA 프로세싱
Rnac RNA 시클라제 알려지지 않음
Ddx1과 매우 유사한 EST DEAD-박스 단백질, 추정 RNA 헬리카제
Eif4ebp1 단백질 1과 결합하는 진핵생물 번역개시 인자 4E 전사억제제, 수개의 신호 전달경로에 의해 조절(포스포릴화)
Eif4g2 진핵생물 번역개시 인자 4, 감마2 전사 억제제, 장배형성 및 ESC분화에 필요
Eif3s1과 매우 유사한 EST 번역억제인자
Mrps31 미토콘드리아 리보솜 단백질 S31 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Mrpl17 미토콘드리아 리보솜 단백질 L17 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Mrpl34 미토콘드리아 리보솜 단백질 L34 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Hspa11 열충격 70kD 단백질계 1 (Hsc70t) 샤페론, 고환-특이적
Hspa4 열충격 70kD 단백질 4
(Hsp110)		 샤페론
Dnajb6 DnaJ(Hsp40) 동족체, 서브패밀리 B, 멤버6(Dnaj의 포유동물족) 공-샤페론
Hrsp12 열반응성 잠재적 샤페론
Tcp1-rs1 서열 1에 관련한 T-복합 단백질 1 잠재적 샤페론
Ppic 펩티딜프롤릴 이소머라제 C(시클로필린 C) 펩티딜-프롤릴 결합의 이성체화
Fkbp9 FK506-결합단백질 9(63kD) 잠재적 펩티딜-프롤릴 이소머라제
Fkbp13과 적당히 유사한 ESTs 잠재적 펩티딜-프롤릴 이소머라제
Ube2d2 유비퀴틴-공액화 효소 E2D2 E2, 단백질의 유비퀴틴화
Arih1 아리아드네 동족체 E3 가능성, 유비퀴틴 리가제
Fbxo8 F-박스 온리 8 추정SCF 유비퀴틴 리가제 서브유니트
Ubc13과 적당히 유사한 ESTs(bendless) 잠재적 E2, 단백질의 유비퀴틴화
Usp9x 유비퀴틴 프로테아제 9,
X 염색체		 단백질로부터 유비퀴틴 제거
Uchrp 유비퀴틴 c-말단 하이드로라제 관련 폴리펩티드 단백질로부터 유비퀴틴 제거가능성
Axo 악소트로핀 E3와 유사한 RING-CH도메인 함유,
유비퀴틴 리가제
Tpp2 트리펩티딜 펩티다제 II 세린 엑스포펩티다제,
프로테아솜과 관련
Cops4 COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 4		 Cop9시그널로솜, 다수의 신호전달경로의 통합, 단백질 분해 조절
Cops7a COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 7a		 Cop9시그널로솜, 다수의 신호전달경로의 통합, 단백질 분해 조절
프로테아솜 26S 서브유니트와 매우 유사한 ESTs, 비-ATP아제, 12(p55) 프로테아솜의 조절 서브유니트
Nyren18 NY-PEN 18항원(NUB1) 인터페론-9 유도, Nedd8의 하향조절, 유비퀴논계 단백질
Rab18 Rab18, 멤버 RAS 암유전자 패밀리 small GTPase, 소낭수송 조절
Rabggtb RAB 게란일게라닐 트랜스퍼라제 b 서브유니트 Rob 단백질의 막결합 조절
Stxbp3 신탁신 결합 단백질 3 소낭/막 융합
Sec23a Sec23a(S. cerevisiae) ER에서 골지로 수송
코아토머 델타와 적당히 유사한 ESTs ER에서 골지로 수송
Abcb1 다제-내성 물질 1(Mdr1) 독성 화학물질 축출
Gsta4 글루타티온 S-트랜스퍼라제 4 산화적 스트레스에 반응
Gslm 글루타메이트-시스테인 리가제 조절제 서브유니트 글루타티ㄹ온 생합성
Txnrd1 티오레독신 리덕타제 티오레독신에 대한 환원성 등가물 전달
Txn1 티오레독신계 32kD 산화환원 밸런스,
단백질의 디설파이드 브릿지 감소
Laptm4a 리소좀-관련 단백질
트랜스막 4A(MTP)		 소분자를 리소좀으로 임포트
Rcn 레티큘로칼빈 ER단백질 Ca+2결합,
종양세포계에서 과발현
Supl15h Lec15 동족체의 억제제 돌리콜 포스페이트-만노즈의 ER합성,
GPI 앵커의 전구물질, N-글리코실화
Pla2g6 포스포리파제 A2,
그룹 VI		 인지질의 가수분해
Acadm 아세틸-조효소 A
데히드로게나제, 중쇄(medium chain)		 지방산 베타-산화
Suclg2 숙시네이트-조효소 A 리가제, GDP-형성, 베타 서브유니트 조절 서브유니트, Krebs 회로
Pex7 페록시솜 생물발생 인자 7 페록시솜 단백질 임포트 수용체
Gcat 글리신 C-
아세틸트랜스퍼라제(KBL)		 트레오닌을 글리신으로 전환
Tjp1 폐쇄이음부 단백질 1 폐쇄이음부의 구성성분, 폐쇄이음부 결핍 세포 내에서 카드헤린과 상호작용
본 발명의 실시예는 또한 유전자의 염색질 구조를 변화시키는 단계 및 상기 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조를 변화시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 히스톤을 변형시킴으로써 염색질 구조를 변화시키는 단계를 추가로 포함한다. 히스톤 변형에는 아세틸화, 메틸화, 탈메틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화(ubiquitination), 수모화(sumoylation), ADP-리보실화, 탈이민화 및 프롤린 이성체화 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기술한 방법에 따라 제조된 재프로그래밍된 세포를 이용하여 다양한 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련자는 본 명세서에서 제공하는 기술을 기초로 하여, 광범위한 다혈증 질병을 치료하는데 있어서 재생 의학의 가치 및 가능성을 인정할 것이다. 이러한 질병에는 심장병, 당뇨병, 피부병 및 피부이식, 척추 손상, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명은 손상되지 않은 새로운 세포의 도입이 치료적 해소의 형태를 제공하는 병을 치료하기 위하여, 인간을 포함한 동물에 재프로그래밍된 세포를 투여하는 방법을 포함한다.
이 분야의 통상의 기술자는 재프로그래밍된 세포가 재분화된 세포, 예를 들어 뉴런으로서 동물에 투여될 수 있으며, 동물에 있어서 병들거나 손상된 뉴런을 대체하는데 유용할 것이라는 점을 쉽게 이해할 것이다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 동물에 투여되어, 주위 환경으로부터 신호 및 큐를 받으면 주변 세포 환경에 의해 지시되는 원하는 세포 타입으로 재분화될 수 있다. 이와 다르게, 세포를 시험관 내에서 재분화시킨 다음, 이 재분화된 세포를 필요로 하는 포유동물에 투여할 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 생체내 환경에서 오랜 기간 생존할 수 있도록 하기 위해 외과이식용으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포가 성장 및 보존되고 증식하여 포화상태(confluence)가 되도록 하기 위해서, 전구 배지(progenitor medium)와 같은 적합한 배양 배지 내에서 세포를 번식시킬 수 있다. 이 세포를 예를 들어, 트립신을 불활성화시키기 위한 5% 혈청 플러스 1 mg/ml의 포도당, 0.1mg/ml의 MgCl2, 0.1mg/ml의 CaCl2로 보강시킨(완전 PBS) 0.05% 트립신을 함유하는 포스페이트 완충염(PBS)과 같은 완충 용액을 사용하여 배양 기질로부터 느슨해지게 한다. 이 세포를 원심분리를 이용하여 PBS로 세척한 다음, 트립신을 함유하지 않는 완전 PBS 내에서 주입을 위해 선택된 밀도로 재현탁시킬 수 있다.
복막 투여에 적합한 약제 조성물은 활성 성분과 함께 멸균수 또는 멸균 등장수를 함유한다. 이러한 조성물은 일괄 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사투여용 조성물은 보존제를 함유하는 수회 사용량의 용기 또는 앰플과 같은 단위 사용 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 복막 투여용 조성물은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 부형제 중의 유화액, 페이스트, 및 매몰식 지속-방출 또는 생분해성 조성물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 조성물은 또한 1종 이상의 추가 성분을 추가로 함유하며, 이러한 성분에는 현탁제, 안정화제, 또는 분산제가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 CNS, PNS, 피부, 간, 신장, 심장, 췌장 등을 포함한 신체의 질병 또는 외상을 치료하기 위해서 다른 치료적 절차와 함께 재프로그래밍된 세포를 외과이식하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 다른 세포와 함께 동시-외과이식될 수 있으며, 이 두 세포는 모두 환자에 유익한 영향을 주는 유전적으로 변형된 또는 비유전적으로 변형된 세포로서, 예를 들어 부신의 크롬친화성 세포, 태아 뇌조직 세포 및 태반 세포 등이 있다. 따라서 본 발명의 방법은 본 명세서에 제공되는 기술 내용을 인지한 당해 분야 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 다른 치료적 절차와 함께 병행될 수 있다.
본 발명의 재프로그래밍된 세포는 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 5,082,670 호 및 제 5,618,531 호에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 "나체 상태"에서 환자에게 또는 신체의 다른 적합한 부위에 이식될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 단일 세포들로 구성되는 혼합물/용액 또는 세포 응집체의 현탁액을 함유하는 용액으로서 이식될 수 있다. 이러한 응집체는 약 10 ~ 500마이크로미터, 보다 바람직하게는 약 40 ~ 50 마이크로미터의 직경을 가질 수 있다. 재프로그래밍된 세포 응집체는 구체 당 약 5 ~ 100, 보다 바람직하게는 약 5 ~ 20의 세포를 포함할 수 있다. 이식 세포의 밀도는 마이크로리터 당 약 10,000 ~ 1,000,000의 세포, 보다 바람직하게는 약 25,000 ~ 500,000의 세포의 범위를 가질수 있다.
본 발명의 재프로그래밍된 세포의 이식은 당해 분야에 잘 알려져 있는 기술, 더욱이 미래에 발전될 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명은 재프로그래밍된 세포를 동물, 바람직하게는 인간에 이식, 외과이식, 주입 또는 도입하는 방법을 포함한다.
또한 재프로그래밍된 세포는 미세캡슐화(예를 들어, 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 4,352,883 호; 및 제 5,084,350 호 참조) 또는 거대캡슐화(예를 들어, 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 5,284,761 호; 제 5,158,881 호; 제 4,976,859 호 및 제 4,968,733 호; 및 국제 공보 WO 92/19195; WO 95/05452 참조)를 포함하여 공지된 캡슐화 기술에 따라 캡슐화되어 생물학적 활성 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 거대캡슐화의 경우, 기구 내의 세포 수는 다를 수 있는데, 각 기구는 바람직하게는 103 ~ 109 세포를 포함하며, 보다 바람직하게는 약 105 ~ 107 세포를 포함한다. 몇몇 거대캡슐화 기구는 환자에 이식될 수 있다. 세포의 거대캡슐화 및 이식 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 6,498,018 호에 기술되어 있다.
또한 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 치료 목적을 위해 또는 환자의 조직속에서 통합 및 분화를 추적하기 위해 외부 단백질 또는 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 예를 들어 Sambrook et al.(1989, Molecular Coloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 Ausubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons, New York)에 기술한 바와 같이, 재프로그래밍된 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법 및 발현 벡터와 함께 재프로그래밍된 세포 내에서 외인성 DNA의 발현을 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 HDAC의 활성을 억제함으로써 재프로그래밍되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도함으로써 재프로그래밍되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 실시예는 하나 이상의 HDAC 억제제를 세포와 접촉시킴으로써 제조되는 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 재프로그래밍된 세포를 제조하고 ES계 세포 및 줄기세포계 세포를 생성하는데, 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는데, 및 하나 이상의 HDAC의 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 키트는 하나 이상의 HDAC 억제제를 함유할 수 있다. 키트는 다수의 HDAC 억제제를 함유할 수 있다. HDAC 억제제는 단일 용기 또는 다수 용기 내에 제공될 수 있다.
키트는 또한 세포가 재프로그래밍 되었는지를 결정하는데 필요한 시약을 함유할 수 있으며, 이러한 시약에는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자가 유도되었는지를 테스트하기 위한 시약, HDAC를 저해하는지를 테스트하기 위한 시약, 및 염색질 구조의 리모델링을 테스트하기 위한 시약이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
키트는 또한 재프로그래밍된 세포를 특정 계통 또는 다중 계통으로 분화시키기 위해 사용될 수 있는 작용제를 함유할 수 있으며, 이러한 계통으로는 뉴런, 골아세포, 근육세포, 상피세포 및 간세포 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
키트는 또한 그 속에 제공되는 구성성분의 용도를 설명해 놓은 이해지도 자료를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "이해지도 자료"는 키트 속에 포함되는 본 발명의 방법의 유용성을 전달함으로써 분화된 세포의 재프로그래밍에 영향을 줄 수 있는데 활용될 수 있는 공보, 기록, 도표 또는 다른 표현 매체를 포함하는 의미로 사용된다. 이해지도 자료는 임의로 또는 번갈아서, 본 발명의 세포를 재분화 및/또는 교차분화(transdifferentiating)시키는 방법을 하나 이상 기술할 수 있다. 본 발명의 키트의 이해지도 자료는 예를 들어, 본 발명의 HDAC 억제제를 포함하는 용기에 첨부될 수 있다. 아니면, 이 이해지도 자료는 수령인이 이해지도 자료와 HDAC 억제제 또는 그 구성성분을 조합해서 사용하도록 하는 의도에서 용기와는 별도로 배달될 수 있다.
이제 본 발명은 다음의 실시예를 통해 설명될 것이다. 본 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 실시예로 인해 제한을 받지 않으며, 본 명세서에 제공되는 기술내용의 결과로서 이루어지는 것이 명백한 모든 변경을 포함한다. 미국 특허, 출원이 인정된 미국 특허 출원서 또는 공개된 미국특허 출원서를 포함한 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 참고사항으로서 본 명세서에 기재된다.
실시예
본 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 하기의 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
히스톤 데아세틸라제 억제제는 히스톤 단백질을 아세틸화하고 DNA를 탈메틸화함으로써, 적어도 두가지 방식으로 염색질 구조를 변화시키는 것으로 밝혀졌다. 세포가 다능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현은 히스톤 아세틸라제 억제제의 존재하에 및 부재하에 테스트되었다. 이 실시예에서는, 발프로산(VPA)이 사용되었으나, 어떠한 히스톤 데아세틸라제 억제제도 사용될 수 있다.
방법
세포 배양: Cell Applications(San Diego, CA)로부터 일차 인간 폐세포를 구매하고, 이를 10% 소태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 0.5% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Hyclone) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다. 1mM VPA 또는 5mM VPA의 존재하에, 혹은 VPA 부재하에 3일 동안 세포를 성장시켰다.
정량적인 RT - PCR : 각 배양조건 하에서(0mM VPA, 1mM VPA 및 5mM VPA), 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-4 및 Nanog의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해로 Trizol Reagent(Life Technology) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)은 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템((Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응의 템플릿(template)으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-4 및 Nanog의 발현 정도는 GAPD에 대해 표준화되었다.
배아 택맨 저밀도 어레이 분석( Embryonic Taqman Low Density Array analysis): 세포가 다능성이 되는데 기여하는 몇몇 유전자("줄기성 유전자")의 발현 정도는 인간 배아 택맨 저밀도 어레이 분석(TLDA)를 이용하여 측정되었다. 또한, DNA 메틸 트랜스퍼라제 DNMT3B의 발현 정도도 측정하였다. 상대적인 발현 정도를 정량화하기 위해, 정량적인 실시간 RT-PCR에, 90개의 배아 줄기세포와 발생 유전자(developmental gene) 및 6개의 내생적인 대조용 유전자를 포함하는 Applied Biosystem 인간 배아 택맨 저밀도 어레이 분석(TLDA)를 이용하였다. 간단하게 기술하면, ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(ABI; Foster City, CA)을 사용하여 RNA를 역전사한 후에, TLDA 미세유동 카드의 포트 각각에 50㎕의 뉴클레아제가 없는 물 + 50㎕의 ABI Universal Taqman 2× PCR Master Mix 중 50ng 샘플 cDNA를 피페팅하고, ABI 7900HT Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA)상에서 분석하였다. 비처리된 대조용 세포와 비교해서, 처리된 세포의 유전자 발현 정도의 상대적인 양(배수 변화)를 계산하기 위해서 ΔΔCT법을 이용하였다. 또한 처리된 세포를 연방정부 승인된 인간 배아 줄기세포와 비교할 수 있다.
비설파이트 시퀀싱( bisulfite sequencing ): 비설파이트 시퀀싱은 메틸렌의 패턴을 결정하기 위해 DNA에 비설파이트 처리를 하는 것이다. 비설파이트 시퀀싱은 DNA를 비설파이트로 처리하면 시토신 잔기가 우라실로 전화되지만, 5-메틸시토신 잔기는 영향을 받지 않고 그대로 남아있는 사실을 기초로 한다. 따라서, 비설파이트 처리에 의해, 개별적인 시토신 잔기의 메틸화 상태에 따라 DNA 서열의 특이적 변화를 유도할 수 있고, 이로써 DNA 단편의 메틸화 상태에 대한 고해상도의 정보를 얻을 수 있다.
다능 유전자 프로모터의 메틸화는 비설파이트 시퀀싱에 의해 분석하였다. 간단하게 기술하면, 페놀클로로포름-이소아밀알콜 추출에 의해 DNA를 정제하였다. 제조사의 프로토콜(Zymo Research; Orange, CA)에 따라 EZ DNA 메틸화 키트를 사용하여 비설파이트 전환을 수행하였다. 비-CpG 디뉴클레오티드 내의 모든 시토신의 우라실로의 전환율은 100%이었다. 전환된 DNA를 인간 Oct4, Nanog 및 SOX2에 대한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 산물을 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen; Carlsbad, CA)에 의해 E.Coli로 클로닝시켰다. SP6 및 T7 프라이머로 시퀀싱함으로써 각 샘플의 10개 클론을 확인하였다. 관심 대상인 각 프로모터에 대한 전체 메틸화 퍼센트 및 제시된 CpG에 대한 메틸화 시토신의 수를 세포군 간에 비교하였다.
결과
도 1에 도시한 바와 같이, Oct-4의 발현은 대조용 세포(MC)와 비교해서, 5mM VPA로 처리된 일차 인간 폐세포 내에서 샹향 조절되었다(약 2.7배; p<0.01). 이러한 결과는 HDAC 억제제가 세포가 다능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현을 유도 또는 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다.
또한 5mM VPA에서 3일 동안 성장시킨 세포를 이용하여 몇몇 "줄기성" 유전자의 발현 정도도 분석하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 배아 택맨 저밀도 어레이 분석결과, 다음과 같은 줄기성 유전자의 상향 조절이 확인되었다. 즉, GABRB3(p<0.05); LEFTB(p<0.05); NR6A1(p<0.03); PODXL(p<0.05); PTEN(p<0.01)(n=그룹당 3 레플리케이트). 또한, DNA 메틸트랜스퍼라제인 DNMT3B는 하향 조절되었다. 대조용 세포에서는 검출되지 않는 몇몇 다른 줄기성-관련 유전자가 FOXD3, NR5A2, TERT, LIFR, SERP2, TFCP2L1, LIN28, SOX2 및 XIST를 포함한 VPA-처리 세포에서 유도되었다.
바이설파이트 시퀀싱에 의해 Oct-4 유전자의 제 1 엑손을 분석하였다. 바이설파이트 시퀀싱 결과, 비처리된(-) 및 처리된(+) 세포에서 Oct4로부터 업스트림(3F-3R)으로 메틸화 시토신이 확인되었다(도 3 참조), 또한 처리된 세포내의 Oct4의 프로모터/엑손 영역에서 CpG 디뉴클레오티드 내의 2개 시토신이 탈메틸화되었다(도 3 참조). 이러한 패턴은 몇몇 클론에서 일치하였다(도시되지 않음).
이러한 결과로부터, HDAC 억제제는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현을 유도할 수 있으며, DNA 메틸트랜스퍼라제의 발현을 억제하고 DNA에서 시트신을 탈메틸화할 수 있다는 것이 입증되었다.
실시예 2
HDAC7 shRNA 렌티바이러스 감염이 Oct4, Nanog 및 Sox2에 대한 mRNA 양에 미치는 영향을 테스트하였다. 또한 별도의 실험에서, HDAC11 shRNA 렌티바이러스 감염이 Oct4, Nanog 및 Sox2에 대한 mRNA 발현 정도에 미치는 영향도 테스트하였다. 3가지 타입의 인간 진피 섬유아세포를 사용하였다. 즉, 성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa), 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn), 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf).
방법 :
HDAC7을 저해하기 위해서, 인간 진피 섬유아세포(HDFa, HDFn, 및 HDFf)를 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. 별도의 실험에서, HDAC7을 저해하기 위해서, 인간 진피 섬유아세포(HDFa, HDFn, 및 HDFf)를 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. RNA를 HDF로부터 분리하고(퓨로마이신 선별 포함), RT-PCR에 의해 표적 유전자, 예를 들어 Oct4, Nanog, Sox2, 다양한 HDAC 및 다양한 SIRT 유전자의 발현을 분석하였다. shRNA 구조물은 shRNA로 성공적으로 트랜스펙션된 세포를 선별하는 방식으로서 퓨로마이신(항생제) 저항물질을 포함하였다. 트랜스펙션 후에, 배양액에 퓨로마이신을 가하였다. 저항성이 없는(따라서 트랜스펙션되지 않음) 세포는 사망하였으며, 이로써 배양액 속에는 트랜스펙션된 세포들만 잔류하였다.
세포 배양: 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 인간 진피 섬유아세포를 shRNA 구조물로 감염시켰다. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였다. HDAC7a에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GCTTTCAGGATAGTCGTGA
다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.2: AGCGAGACTTCATGGACGA
또한, 다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.3: TGGTGGTATACAATGCAGG
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리젤(matrigel; BD Biosceinces, San Jose, CA)이첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에서 배양되었다. 이 실험에서 세포는 HDAC7 또는 HDAC11에 지향적인 shRNA로 감염되었다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-3/4 및 Nanog의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-3/4 및 Nanog의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과
HDAC7 및 HDAC11 shRNA 렌티바이러스 감염이 유전자 Nanog의 mRNA 양에 미치는 영향은 도 4A(HDFa), 도 4B(HDFn), 및 도 4C(HDFf)에 도시되어 있다. 3가지 세포 타입 모두에서, 퓨로마이신 존재하에 및 부재하에(성인 및 신생아 인간 진피 섬유아세포의 경우) HDAC7a 및 HDAC11 넉다운 둘 다는 유전자 Nanog에 대한 mRNA의 양을 증가시켰다. HDFa 및 HDFn 세포의 경우, Nanog 발현이 적어도 6배 증가하였다. 퓨로마이신 선별없는 상태 및 선별 상태에서 Nanog mRNA의 양이 증가된 것이 관찰되었다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, HDAC7 저해는 HDAC11 저해와 비교했을 때, Nanog의 mRNA 발현의 급격한 증가를 유발하였다. 그러나, 시간이 감에 따라, 유전자 Nanog에 대한 mRNA 양의 증가는 HDAC7이 저해되든 또는 HDAC11이 저해되든 상관없이 동등한 수준을 나타내었다. 유전자 Nanog에 대한 mRNA 양의 증가는 HDFf에서는 관찰되었으나, HDFa 및 HDFn에서는 뚜렷하게 관찰되지 않았다.
HDAC7 및 HDAC11 shRNA 렌티바이러스 감염이 유전자 Oct-4의 mRNA 양에 미치는 영향은 도 5A(HDFa), 도 5B(HDFn), 및 도 5C(HDFf)에 도시되어 있다. HDFa 및 HDFn 세포에서, HDAC7a 및 HDAC11 넉다운 둘 다는 유전자 Oct-4에 대한 mRNA의 양을 증가시켰다. 퓨로마이신 존재하에 및 부재하에 Oct-4의 발현 증가가 관찰되었다(도 5A 및 도5B). 유전자 Oct-4에 대한 mRNA 양의 증가는 유전자 Nanog와 비교했을 때, 크지 않은 수준이었다.
도 6은 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA 렌티바이러스 감염이 Sox-2의 mRNA 양에 미치는 영향을 보여준다. 유전자 Sox-2에 대한 mRNA 양의 증가가 전혀 관찰되지 않았다.
도 7은 HDAC7 shRNA 렌티바이러스 감염이 다양한 HDAC 유전자 및 SIRT 유전자의 mRNA 발현 정도에 미치는 영향을 보여준다. 도 7에서 도시된 바와 같이, HDAC7 shRNA 감염 후 3일에 HDAC9, HDAC5, 및 HDAC11 mRNA의 발현이 증가되었다. HDAC7 mRNA의 양은 렌티바이러스 감염 후 3일경에 기저 수준의 약 50% 감소되었다.
하나의 HDAC(이 경우 HDAC7)를 억제함으로써, 몇몇 다른 HDAC 유전자의 발현 증가를 유발시킬 수 있다. HDAC들은 서로 밀접한 관계가 있으며, 중복적인 또는 적어도 유사한 기능을 갖도록 진화한다. 한 패밀리 멤버가 억제되면, 이 억제된 멤버를 보충하기 위해 다른 패밀리 멤버의 발현이 증가될 수 있다. HDAC들은 매우 중요한 기능을 가지므로, 중복 및/또는 보상 경로가 발전될 수 있다. 세포를 재프로그래밍하는 메커니즘 중의 하나는 중복 및/또는 보상 경로에 관련되어 있는 다수의 패밀리 멤버를 동시에 또는 순차적으로 표적화하는 것이다. 세포를 재프로그래밍하는 또 다른 메커니즘은 같은 패밀리의 억제 단백질을 표적으로 삼거나 여러 다른 패밀리의 조절 단백질 중 억제 단백질을 표적으로 삼는 것이다.
실시예 4
HDAC7 및 HDAC11 shRNA 렌티바이러스 감염이 Oct4, Nanog 및 Sox2에 대한 mRNA 발현 정도에 미치는 영향을 테스트하였다. 같은 실험에서, HDAC7 및 HDAC11을 저해하고 다양한 유전자의 발현에 미치는 영향도 테스트하였다. 3가지 타입의 인간 진피 섬유아세포를 사용하였다. 즉, 성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa), 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn), 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf).
방법 :
HDAC7 및 HDAC11을 저해하기 위해서, 인간 진피 섬유아세포(HDFa, HDFn, 및 HDFf)를 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. 별도의 실험에서, HDAC7을 저해하기 위해서, 인간 진피 섬유아세포(HDFa, HDFn, 및 HDFf)를 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. RNA를 HDF로부터 분리하고(퓨로마이신 선별 포함), RT-PCR에 의해 표적 유전자, 예를 들어 Oct4, Nanog, Sox2, 다양한 HDAC 및 다양한 SIRT 유전자의 발현을 분석하였다. shRNA 구조물은 shRNA로 성공적으로 트랜스펙션된 세포를 선별하는 방식으로서 퓨로마이신(항생제) 저항물질을 포함하였다. 트랜스펙션 후에, 배양액에 퓨로마이신을 가하였다. 저항성이 없는(따라서 트랜스펙션되지 않음) 세포는 사망하였으며, 이로써 배양액 속에는 트랜스펙션된 세포들만 잔류하였다.
세포 배양: 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 인간 진피 섬유아세포를 shRNA 구조물로 감염시켰다. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였다. HDAC7a에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GCTTTCAGGATAGTCGTGA
다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.2: AGCGAGACTTCATGGACGA
또한, 다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.3: TGGTGGTATACAATGCAGG
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리겔(BD Biosceinces, San Jose, CA)이 첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에서 배양되었다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-3/4 및 Nanog의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-3/4, Nanog 및 Sox-2의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과 :
도 8에 나타낸 바와 같이, Nanog 발현은 퓨로마이신 존재하에 및 부재하에 두 가지 세포 타입 HDFf 및 HDFn에서 HDAC7 및 HDAC11의 이중 넉다운에 의해 증가하였다. HDFf 세포에서는 Nanog 발현이 급속히 증가하였으며, 5일 동안 일관된 반응이 관찰되었다. HDFa 세포에서는 영향이 크지 않다는 점이 관찰되었다.
도 9는 HDAC7 및 HDAC11 shRNA의 이중 또는 동시 간섭 동안 Oct-4의 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여준다. 퓨로마이신의 존재하에 및 부재하에서 모두 Oct-4 발현 증가가 관찰되었다. HDFn 세포에서는 급격한 증가가 관찰되었으며, HDAC7 또는 HDAC11의 단일 넉다운과 비교했을 때 Oct-4에 대한 mRNA 발현이 증가하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, 태아 인간 진피 섬유아세포에서 Sox-2 발현이 일관성있게 나타났다. Sox-2 발현은 HDAC7 및 HDAC11의 이중 넉다운에 의해 유지되었다.
도 11은 성인 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA의 이중 간섭동안 다양한 HDAC 유전자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여준다. HDAC9의 발현의 급격한 증가가 관찰되었다. HDAC5의 발현도 증가하였다. 다른 유전자의 경우는 영향이 크지 않다는 점이 관찰되었다(도 11 참조).
도 12는 태아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA의 이중 간섭동안 다양한 HDAC 유전자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여준다. 퓨로마이신 선별 후 7일에 HDAC9의 발현의 급격한 증가가 관찰되었다. 다양한 다른 HDAC의 발현은 퓨로마이신 선별 후 7일에 감소하였다. 다른 유전자의 경우는 영향이 크지 않다는 점이 관찰되었다(도 12 참조).
도 13은 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 HDAC7 및 HDAC11 shRNA의 이중 간섭 동안 다양한 HDAC 유전자의 mRNA 발현에 미치는 영향을 보여준다. 퓨로마이신 선별없이 및 퓨로마이신 선별 후 5일에 HDAC9의 발현의 급격한 증가가 관찰되었다. HDAC5의 발현도 증가하였다. 다른 유전자의 경우는 영향이 크지 않다는 점이 관찰되었다(도 13 참조).
이러한 결과는 shRNA 구조물이 HDAC를 부호화하는 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있으며, 세포를 재프로그래밍하는데 관여하는 두 유전자인 Oct-4 및Nanog와 같은 다능 유전자의 발현을 유도할 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 이러한 결과는 HDAC의 억제가 분화능을 세포에 복원시키는데 필수적인 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 본 발명의 방법은 어떠한 HDAC 또는 HDAC 관련 단백질도 구조적으로 또는 기능적으로 억제하는데 사용될 수 있다.
보상 경로, 중복 경로, 또는 보상 경로와 중복 경로를 설명하기 위해, 다능 유전자를 침묵시키는데 관여하는 하나 이상의 HDAC 또는 기타 다른 단백질을 억제할 수 있다. 같은 패밀리의 억제 단백질 중의 하나 이상의 단백질, 또는 두개의 다른 패밀리의 억제 단백질 중의 둘 이상의 단백질을 억제할 수 있다. 세포를 재프로그래밍하기 위한 효율적인 메커니즘 중의 하나는 보상, 중복, 또는 보상과 중복 경로 내에서 다수 단백질을 억제하는 것이다. 이러한 억제 경로 내에서 기능을 하는 단백질은 shRNA, HDAC 억제제, 소분자 억제제 또는 이 물질의 배합에 의해 억제될 수 있다.
실시예 5
HDAC7 shRNA 렌티바이러스 감염이 HDAC11에 미치는 영향을 테스트하였다. 3가지 타입의 인간 진피 섬유아세포를 사용하였다. 즉, 성인 인간 진피 섬유아세포(HDFa), 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn), 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf).
방법
세포 배양: 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 인간 진피 섬유아세포를 shRNA 구조물로 감염시켰다. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였다. HDAC7a에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GCTTTCAGGATAGTCGTGA
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리겔(BD Biosceinces, San Jose, CA)이 첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에서 배양되었다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 HDAC7a 및 HDAC11의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen; Valencia, CA)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. HDAC7a 및 HDAC11의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과
HDAC7a shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포에서, HDAC11의 발현은 증가한 반면, HDAC7a의 발현은 감소하였다(도 14A). 신생아 인간 진피 섬유아세포(도 14B) 및 태아 인간 진피 섬유아세포(도 14C)에서도 유사한 결과가 나타났다. 류로마이신 존재 및 부재 둘 다에서 발현 증가가 관찰되었다. 테스트된 세가지 타입 세포 모두에서, HDAC11 발현이 보상 방식으로 샹향 조절되었다. 다능 유전자의 발현을 감소시키는데 관여하는 조절 단백질을 부호화하는 유전자 발현을 억제함으로써, 조절 단백질을 부호화하는 다른 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 단일 패밀리의 조절 단백질 또는 다수 패밀리의 조절 단백질을 표적화하는 다수 작용제는 세포를 재프로그래밍하기 위한 효율적인 수단이 될 수 있다. 이러한 작용제로는 소분자 억제제 및 shRNA 구조물 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
실시예 6
다능 유전자의 발현을 위해, HDAC7, HDAC11 또는 DNMT1에 지향적인 렌티바이러스 shRNA로 감염된 세포를 염색하고 가시화하였다. 이 실시예에서는 Oct-4 및Sox-2의 단백질 발현을 분석하였으나, 당해 숙련자는 본 발명의 방법이 세포를 프로그래밍하는데 및 분화능을 세포에 복원시키는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
방법
세포 배양: 태아 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications, Inc.(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이를 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 태아 인간 진피 섬유아세포를 다음과 같은 조성을 가진 조성물 중의 하나로 감염시켰다. 즉, (1) DNMT1에 지향적인 shRNA 렌티바이러스; (2) HDAC7에 지향적인 shRNA 렌티바이러스; (3) DNMT1 및 HDAC7에 지향적인 shRNA 렌티바이러스; 및 (4) HDAC7a 및 HDAC11에 지향적인 shRNA 렌티바이러스. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였다. HDAC7a에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GCTTTCAGGATAGTCGTGA
다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.2: AGCGAGACTTCATGGACGA
또한, 다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.3: TGGTGGTATACAATGCAGG
DNMT1에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.4: GTCTACCAGATCTTCGATA
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리겔(BD Biosceinces, San Jose, CA)이 첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에서 배양되었다.
면역조직 화학: 면역조직 검사를 위해서, 표적 shRNA-감염 세포 및 대조용 세포를 챔버 슬라이드(LabTek, Napersville, IL) 에서 성장시켰다. 그 다음, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 다능 마커인 Oct-3/4(Abcam, Cambridge, MA)에 대항적인 특이적 항체로 배양시켰다. Oct3/4의 염색은 적색으로서 가시화되었다. 핵은 DAPI 염색(Vectorshield)으로 가시화되었으며, 청색으로 보인다.
결과
Oct-4 단백질 발현은 shRNA 간섭에 의해 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 증가하였다. 도 15A는 감염되지 않은 HDFf(음성 대조용)의 사진이며, 도 15G는 감염된 인간 배아 줄기세포(양성 대조용)의 사진이다. 음성 대조용 세포에서는, Oct-4 단백질 발현이 거의 검출되지 않았다. 도 15B는 DNMT1에 지향적인 shRNA로 감염된 HDFf 세포의 사진이다. 세포가 DNMT1 shRNA에 노출되면, Oct-4 단백질 발현이 명백히 증가한다. HDAC7 shRNA로 감염된 HDFf 세포에서는 Oct-4 단백질이 최소수준으로 검출되는 것을 보여준다(도 15C). 이는 이러한 특정 샘플의 프로세싱 때문으로 보인다.
DNMT1 및 HDAC7 shRNA로 감염된 세포는 Oct-4 단백질 발현의 급격한 증가를 보여주었다(도 15D). DNMT1 및 HDAC7 shRNA 둘 다로 처리된 세포는 인간 배아 줄기세포(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 매우 유사한 발현 패턴을 나타내었다(도 15E). 이러한 데이터는 Oct-4 유전자 발현의 증가가 Oct-4 단백질 발현의 증가를 유발한다는 것을 보여주는 본 실시예의 데이터와 일치한다. DNMT1 및 HDAC11은 전사 조절 및 염색질 리모델링에 있어서 별개의 기능을 가진다. 두 개의 별도의 조절 그룹의 멤버의 저해로 인해 Oct-4 발현의 급격한 증가가 이루어졌다. DNMT1 및 HDAC11로 감염된 세포에서도 Oct-4 단백질 발현이 증가하였다(도 15E). DNMT1 및 다수 HDAC의 저해로 인해 Oct-4 단백질 발현이 증가하였다.
HDAC7 및 HDAC11 shRNA로 감염된 세포에서는 Oct-4의 발현 증가가 전혀 검출되지 않았다(도 15F). 이러한 결과는 실험 시스템의 제한으로 인해 나타날 수 있다. 다른 면에서, 이러한 결과는 다능 유전자 발현의 적절한 증가를 암시하는데, 이때 다중 경로가 억제되어야 한다. 별개의 조절 복합체 내에서 기능을 가지는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해함으로써, 다능 유전자의 발현 정도를 증가시킬 수 있다. 이러한 조절 복합체의 멤버는 억제될 수 있다.
Sox-2 단백질 발현은 shRNA 간섭에 의해 태아 인간 진피 섬유아세포에서 증가하였다. 도 16A는 감염되지 않은 HDFf(음성 대조용)의 사진이며, 도 8G는 감염된 인간 배아 줄기세포의 사진이다(도 16G). 음성 대조용 세포에서는, Sox-2 단백질 발현이 거의 검출되지 않았다. 도 16B는 DNMT1에 지향적인 shRNA로 감염된 HDFf 세포의 사진이다. 핵 염색은 뚜렷하게 눈에 보이지만, Sox-2 단백질은 단지 적은 양이 검출되었다. HDAC7 및 DNMT1 shRNA로 감염된 HDFf 세포에서는 Sox-2 단백질이 최소수준으로 검출되는 것을 보여준다(도 16C). 이는 이러한 특정 샘플의 프로세싱 때문으로 보인다.
DNMT1 및 HDAC11 shRNA로 감염된 세포는 Sox-2 단백질 발현의 급격한 증가를 보여주었다(도 16D). 두 개의 별도의 조절 그룹의 멤버의 저해로 인해 Sox-2 발현의 급격한 증가가 이루어졌다. HDAC7 shRNA로 감염된 세포는 Sox-2 단백질 발현을 최소수준으로 보여주었다(도 16E). HDAC7 및 HDAC11로 감염된 세포에서도 Sox-2 단백질 발현이 증가하였다(도 16F). DNMT1 및 다중 HDAC의 저해로 인해 Sox-2 단백질 발현이 증가하였다.
이러한 결과는 히스톤 데아세틸라제 및 DNA 메틸 트랜스퍼라제가 세포를 재프로그래밍하는데 관여하는 다능 유전자의 발현을 증가시켰다는 것을 입증한다. 두개의 별개의 shRNA 구조체는 두개의 별개의 조절 단백질에 표적으로 되며, 이로 인해 Oct-4 및 Sox-2 단백질 발현의 급격한 증가를 유발하였다. 다는 유전자의 전사 저해 또는 억제에 관여하는 또는 하나 이상의 조절 단백질의 저해는 세포를 재프로그래밍하고 분화능을 세포에 복원시키는데 효율적인 메커니즘이 될 수 있다.
히스톤 데아세틸라제 및 그 관련 패밀리 멤버의 억제를 통해 다능 유전자의 발현을 증가시킬 수 있고, 분화된 세포를 재프로그래밍할 수 있다. 이 재프로그래밍 방법은 난세포, 배아 또는 배아 줄기세포와 무관하다. 그러므로, 이 방법은 유해한 영향을 줄 수 있는 바이러스 벡터에 의존하지 않는다. 이 방법은 또한 c-mys 및 Klf4와 같은 암유전자와 무관하다.
또한, 본 발명의 방법은 체세포 핵이식(SCNT)없이 분화된 세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있다. SCNT는 매우 비효율적이며, 재프로그래밍 분야에서 큰 한계점을 가진다. 본 발명은 SCNT의 필요성을 해소한다.
본 발명의 방법은 강한 리포터 요소를 함유하는 인공 벡터와는 반대로, 내생 Oct-4 유전자의 발현 증가를 보여준다. 인공 벡터는 내생 유전자와 같은 염색질 구조를 가지지도 않고 게놈 환경을 형성하는 프로모터 요소 및 다른 유전자도 함유하지 않는다. 인공 벡터는 천연 게놈의 환경을 재현하는데 필요한 많은 천연 요소를 함유하지 않는다. 이 실시예에서 제시된 결과는 인간 세포를 치료함으로써 얻어지는 효과 및 내생 유전자에 미치는 영향을 보여준다.
마지막으로, 이 실시예에서 제시된 데이터는 소분자 조절제가 히스톤 아세틸라제와 같은 단백질 복합체의 기능을 변화시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 염색질 구조 변화는 분화된 세포를 재프로그래밍하고 분화능을 복원시키는데 있어서 한 단계이다.
본 명세서에서 특정 실시예를 설명 및 기술하고 있지만, 당해 분야 숙련자는 같은 목적을 달성하는 것으로 생각되는 어떠한 배합도 기술된 특정 실시예를 대체할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원서는 본 발명의 원리에 따라 이루어질 수 있는 어떠한 수정 또는 변경도 포함한다. 그러므로, 본 발명은 본 출원서의 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다. 본 출원서에서 인용한 특허, 참고문헌 및 공개자료에 대한 기술은 참고문헌으로 포함된다.

Claims (20)

  1. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 히스톤 데아세틸라제의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포를 노출시키는 단계; 다능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 다능 세포를 시사하는 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 세포를 확장시킴으로써 세포군을 생성하는 단계를 포함하며 분화능(differentiation potential)이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 상기 작용제에 노출시키기 전과 후의 세포의 표현형을 비교하는 단계 및 다능 세포와 일치하는 표현형을 가진 세포를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자에 의해 부호화되는 단백질 또는 세포 표면 마커에 지향적인 항체를 사용하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 세포 표면 마커는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 확장시키는 단계 전에, 상기 작용제에 노출시키기 전에 존재하는 상기 세포의 다능 유전자의 염색질 구조와 상기 작용제에 노출시킨 후에 얻어지는 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 염색질 구조를 비교하는 단계는 히스톤의 아세틸화 상태를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Sox-2 및 Nanog로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 작용제는 소분자 억제제, 핵산 서열, 및 shRNA 구성물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 히스톤 아세틸라제는 HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8, HDAC4, HDAC5, HDAC6, HDAC7A, HDAC9, HDAC10, HDAC11, SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6, 및 SIRT7으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, HDAC의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 제 1 작용제에 세포를 노출시키는 단계; 상기 세포를 제 2 조절 단백질의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 제 2 작용제에 노출시키는 단계로서, 이 제 2 조절 단백질은 HDAC와 다른 별개의 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 단계; 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포가 상기 제 1 작용제 및 제 2 작용제에 동시에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자에 의해 부호화되는 단백질 또는 세포 표면 마커에 지향적인 항체를 사용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 세포 표면 마커는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 상기 제 1 및 제 2 작용제에 노출하기 전과 후 세포의 표현형을 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 1 및 제 2 작용제는 소분자 억제제, 핵산 서열, 및 shRNA 구조물로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 2 조절 단백질은 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 리신 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 리신 데메틸라제, 시르투인, 및 시르투인 활성제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 히스톤 데아세틸라제의 활성, 발현, 또는 활성과 발현을 억제하는 작용제에 세포군을 노출시키는 단계; 다능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 다능 세포를 시사하는 세포 표면 마커를 발현하는 세포를 선별하는 단계; 및 상기 선별된 세포를 확장시킴으로써 세포군을 생성하는 단계를 포함하며 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법에 따라 제조되는 농축 재프로그래밍 세포군.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 재프로그래밍 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.
  19. 제 17 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.
  20. 제 17 항에 있어서,
    상기 재프로그래밍 세포는 세포군의 적어도 60%를 차지하는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.


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