JP2020506707A - 細胞の運命を操作するための方法 - Google Patents

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Abstract

人工多能性幹細胞を生成する方法が、本明細書に開示される。本方法は、体細胞又は非胚細胞集団を提供すること、体細胞又は非胚細胞集団を、ある量の少なくとも１つのリプログラミング因子、ＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤、及び／又はＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤と接触させること、及び少なくとも１つの人工多能性幹細胞を生成するのに十分な期間にわたって体細胞又は非胚細胞を培養することを含む。ＳＩＲＴ２を上方制御し、及び／又はＳＩＲＴ１を下方制御することによって、細胞を分化させるための方法も、本明細書において提供される。この方法の使用によって生成される細胞株及び医薬組成物も開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２０１７年２月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４５４，２５４号の利益を主張するものであり、この仮特許出願の内容は、全体が参照により本明細書に援用される。
本発明の分野は、再生医療の分野に関する。
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって授与された助成金番号ＮＳ０８４８６９、ＮＳ０７０５７７、及びＧＭ１０１４２０の下で政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
２０世紀初頭、Ｏｔｔｏ Ｗａｒｂｕｒｇは、正常細胞と比較して形質転換細胞において、高いレベルの酸素の存在下でも、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）から解糖への代謝の切り替えを観察した１。興味深いことに、最近の研究は、様々なタイプの幹細胞、特に、プライミングされた多能性幹細胞（例えば、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣ）の代謝が、やはりＯＸＰＨＯＳより解糖に偏っており、Ｗａｒｂｕｒｇ様効果を示すことを示した７。実際に、より最近の研究は、プライミングされたｈＰＳＣにおいて、ＯＸＰＨＯＳから解糖へのこの代謝の切り替えが、ｈＰＳＣにおける生体エネルギー学、生合成能、及び／又はエピジェネティック制御にとって重要であることを示しており８〜１２、これは、メタボロミクス解析によってさらに裏付けられた１１、１３。プライミングされた状態を表すｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣと異なり、マウスＥＳＣは、ナイーブ状態で（ｎａｉｖｅ ｓｔａｔｅ）且つエネルギー的に二価であることが知られており、要求に応じて解糖からＯＸＰＨＯＳへと動的に切り替えることができる９。したがって、これらの研究は、代謝リプログラミングが、多能性の誘導の際、幹細胞同一性に密接に関連していることを示唆している。しかしながら、それが原因であるか、又は同一性を反映しているに過ぎないかは、不明である。
細胞の運命を操作する（例えば、多能性を誘導し、又は培地中で高度に分化した細胞を生成する）ためのリプログラミング技術を最適化するための多くの取り組みにもかかわらず、そうした技術は、低い効率（多くの場合、０．１％よりはるかに低い）、再現不可能性（ｉｒｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）、及び異なる標的宿主細胞型にわたる限られた拡張性という問題に悩まされている。さらに、疾患発症機序研究に使用されるｉＰＳＣの大半（約９６％）は、未だにレトロウイルス／レンチウイルスリプログラミング方法によって生成される。Ｂｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３：７１３−７２６（２０１２）。いくつかの非組み込み型（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）リプログラミング方法（例えば、アデノウイルス、センダイウイルス、エピソーム、ｍＲＮＡ、成熟マイクロＲＮＡ、及び直接タンパク質方法）が存在しているが、これらの方法は、レトロ／レンチウイルス方法よりはるかに効率が低いため、それらの幅広い利用は、著しく阻まれている。
患者個体別の、免疫適合性のある（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）生体材料を生成するという最終的な治療上の目標を考えると、有意な量で有効なリプログラミングを提供しながら、ウイルス成分の使用を避ける、細胞をリプログラミングするための安定した再現性のある手段を確立することが、当該技術分野において大いに必要とされている。このような改良された方法は、理想的に、リプログラミングの高い効率、一貫した再現性を有し、様々な細胞型に容易に拡張可能であり得る。
本明細書に記載される本発明の一態様において、人工ヒト多能性幹細胞を生成するための方法であって、体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の１つ以上のリプログラミング因子及びさらにＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの人工ヒト多能性幹細胞を生成するのに十分な期間にわたって体細胞又は非胚細胞集団を培養することを含む方法を提供する。いずれかの態様の一実施形態において、本方法は、体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の、ＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤を送達することをさらに含む。ＳＩＲＴ１を上方制御する例示的な薬剤としては、限定はされないが、小分子、ペプチド、又はＳＩＲＴ１をコードする発現ベクターが挙げられる。
いずれかの態様の一実施形態において、ＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤は、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴ、又は阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である。例示的なＲＮＡｉとしては、限定はされないが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡが挙げられる。いずれかの態様の一実施形態において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐである。
いずれかの態様の一実施形態において、本方法は、ｍｉＲ−３０２／３６７クラスターから選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを細胞に送達することをさらに含む。
いずれかの態様の一実施形態において、少なくとも１つのリプログラミング因子は、細胞内のｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、又はＫｌｆ４の発現を増加させる薬剤である。いずれかの態様の別の実施形態において、リプログラミング因子は、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（「ＳＶ４０ＬＴ」）、又はｐ５３を標的にする低分子ヘアピン（「ｓｈＲＮＡ−ｐ５３」）の発現を増加させる薬剤である。
いずれかの態様の一実施形態において、送達は、細胞集団を、薬剤、又は薬剤をコードするベクターと接触させることを含む。送達は、形質導入、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、直接注入、及び／又はトランスフェクションを含み得る。
一実施形態又はいずれかの態様において、ベクターは、非組み込み型（ｎｏｔ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）又は組み込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）である。例示的な非組み込み型ベクターとしては、限定はされないが、エピソームベクター、ＥＢＮＡ１、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型ＲＮＡ、又はセンダイウイルスが挙げられる。例示的な組み込み型ベクターとしては、限定はされないが、レトロウイルス、レンチウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが挙げられる。一実施形態又はいずれかの態様において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
一実施形態又はいずれかの態様において、培養は、７〜２１日間の期間にわたる。
一実施形態又はいずれかの態様において、ＳＩＲＴ２は、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％下方制御される。一実施形態又はいずれかの態様において、ＳＩＲＴ１は、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍上方制御される。いずれかの態様の一実施形態において、適切な対照は、本明細書に記載される薬剤が送達された細胞集団であり得る。
いずれかの態様の一実施形態において、本明細書に記載される方法は、適切な対照と比較して、人工多能性幹細胞の数の少なくとも２倍の増強をもたらす。
本明細書に記載される本発明の一態様は、本明細書に記載される任意の方法によって生成される人工多能性幹細胞を含む細胞株を提供する。
本明細書に記載される本発明の一態様は、本明細書に記載される任意の方法によって生成される人工多能性幹細胞又はその集団と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
本明細書に記載される本発明の別の態様は、分化体細胞へのヒト多能性幹細胞又は癌細胞の分化を誘導するための方法であって、ＳＩＲＴ２の発現又はレベルを上方制御する第１の薬剤への前記ヒト多能性幹細胞又は癌細胞の曝露を、ＳＩＲＴ１の発現又はレベルを下方制御する第２の薬剤への曝露と組み合わせて含む方法を提供する。
本明細書に記載される本発明のさらに別の態様は、分化細胞を生成するための方法であって、多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの分化細胞を生成するのに十分な期間にわたって分化条件下で細胞集団を培養することを含む方法を提供する。一実施形態において、本方法は、多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤を送達することをさらに含む。
いずれかの態様の一実施形態において、多能性細胞集団は、胚性幹細胞集団、成体幹細胞集団、人工多能性幹細胞集団、又は癌幹細胞集団である。
いずれかの態様の一実施形態において、ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤は、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡｉである。
いずれかの態様の一実施形態において、ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤は、小分子、ペプチド、及びＳＩＲＴ２をコードする発現ベクターからなる群から選択される。
いずれかの態様の一実施形態において、培養は、７〜３００日間の期間にわたる。
いずれかの態様の一実施形態において、ＳＩＲＴ１は、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％下方制御される。いずれかの態様の一実施形態において、ＳＩＲＴ２は、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍上方制御される。
いずれかの態様の一実施形態において、本明細書に記載される方法は、適切な対照と比較して、分化細胞の数の少なくとも２倍の増強をもたらす。
いずれかの態様の一実施形態において、分化細胞は、適切な対照と比較して、有意に短い期間で生成される。
いずれかの態様の一実施形態において、分化条件は、神経細胞を生成するための神経分化に特異的である。
本明細書に記載される本発明の一態様は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生成される分化細胞を含む細胞株を提供する。
本明細書に記載される本発明の一態様は、細胞又は細胞集団の状態又は運命を区別するための方法であって、前記細胞又は細胞集団内のＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は調節を測定することを含む方法を提供する。一実施形態において、上方制御されたＳＩＲＴ１及び下方制御されたＳＩＲＴ２の測定は、多能性幹細胞状態を区別又は定義する。一実施形態において、下方制御されたＳＩＲＴ１及び上方制御されたＳＩＲＴ２の測定は、体細胞分化細胞状態を区別又は定義する。
本明細書に記載される本発明の別の態様は、誘導される集団から多能性幹細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ１の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ２の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法を提供する。一実施形態において、候補細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生成される。
本明細書に記載される本発明のさらに別の態様は、誘導される集団から分化細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ２の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ１の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法を提供する。一実施形態において、候補細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかによって分化される。
いずれかの態様の一実施形態において、測定は、免疫蛍光によって行われる。
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語及び語句の意味が、以下に示される。特に記載されない限り、又は文脈から黙示されない限り、以下の用語及び語句は、以下に示される意味を含む。技術の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるため、定義は、特定の実施形態を説明するのを助けるために提供され、権利請求される技術を限定することは意図されていない。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、この技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用と、本明細書において与えられるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に与えられる定義が優先されるものとする。
免疫学及び分子生物学における一般的な用語の定義が、Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．によって発行されたＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８−０−９１１９１０−１９−３）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．によって発行された、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）；及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．によって発行されたａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）；Ｅｌｓｅｖｉｅｒによって発行されたＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）；Ｊｏｎｅｓ ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓによって発行されたＬｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出され、これらの内容は全て、全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書において使用される際の「幹細胞」という用語は、増殖が可能であり、且つ分化した、又は分化可能な娘細胞を生じ得る多数の母細胞を生成する能力を有するさらなる前駆細胞を生じる未分化細胞を指す。娘細胞自体は、親発生能（ｐａｒｅｎｔａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有する１つ以上の細胞も保持しながら、その後１つ以上の成熟細胞型へと分化可能な後代細胞を増殖及び産生するように誘導され得る。「幹細胞」という用語はまた、特定の環境下で、より特殊化した又は分化した表現型へと分化する能力又は可能性を有し、且つ、特定の環境下で、実質的に分化せずに増殖する能力を保持する、前駆細胞のサブセットを指す。一実施形態において、幹細胞という用語は、一般に、天然の母細胞を指し、その子孫（後代細胞）は、分化によって、例えば、胚細胞及び組織の進行的な多様化において生じるような完全に個々の特徴を獲得することによって、多くの場合、異なる方向に特殊化する。細胞分化は、典型的に、多くの細胞分裂によって起こる複雑な過程である。分化細胞は、多分化能／多能性細胞から誘導され得、多分化能／多能性細胞自体は、多分化能／多能性細胞から誘導される、などである。これらの細胞のそれぞれは、幹細胞であると考えられ得るが、それぞれが生じ得る細胞型の範囲は、かなり異なり得る。
本明細書において使用される際の「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、適切な分化条件下で、体内で任意の細胞型へと分化する能力を有する細胞を指す。胚性幹細胞は、「多能性」であると考えられる。
「多分化能細胞」に関して使用される際の「多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、３つ全ての胚葉に由来する細胞の全てではないがいくつかへと分化することが可能な細胞を指す。したがって、多分化能細胞は、部分的に分化した細胞である。多分化能細胞は、当該技術分野において周知であり、多分化能細胞の例としては、例えば、造血幹細胞及び神経幹細胞などの成体幹細胞が挙げられる。多分化能は、幹細胞が、所与の系列の多くの細胞型を形成し得るが、他の系列の細胞を形成しないことを意味する。例えば、多分化能血液幹細胞は、多くの異なる血液細胞型（赤血球、白血球、血小板など）を形成することができるが、それは、天然に神経を形成することができない。「多分化能」という用語は、全能性及び多能性より低い発生能の程度を有する細胞を指す。
「成体幹細胞」という用語は、胎児、幼若、及び成体組織を含む非胚性組織に由来する任意の多分化能幹細胞を指すのに使用される。幹細胞は、血液、骨髄、脳、嗅上皮、皮膚、膵臓、骨格筋、及び心筋を含む様々な成体組織から単離されたものである。これらの幹細胞のそれぞれは、遺伝子発現、因子応答性、及び培養中のモルフォロジーに基づいて特性評価され得る。例示的な成体幹細胞としては、神経幹細胞、神経堤幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、及び膵幹細胞が挙げられる。上に示されるように、幹細胞は、実質的に全ての組織にあることが分かっている。
「分化細胞」という用語は、細胞分化過程においてあまり特殊化されていない細胞型の細胞（例えば、人工多能性幹細胞などの幹細胞）から誘導されるより特殊化された細胞型の細胞を指す。細胞発生に関して、「分化した」、又は「分化している」という形容詞は、「分化細胞」が、それと比較される細胞より発生経路をさらに下って進行した細胞であることを意味する相対的な用語である。したがって、幹細胞は、系統の限定された前駆細胞（中胚葉幹細胞など）へと分化することができ、これは、次に、経路をさらに下って他の型の前駆細胞（心筋細胞前駆細胞など）、その後、最終段階の分化細胞へと分化することができ、これは特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していることがあり、又は保持していないことがある。
実験的操作により、幹細胞として開始する細胞が、分化した表現型へと進行し得るが、その後、（例えば、本明細書に記載される方法などによる操作により）幹細胞表現型へと「元に戻る（ｒｅｖｅｒｓｅ）」及び再発現することが可能である。この逆転は、「脱分化」又は「リプログラミング」又は「逆分化」と呼ばれることが多い。同様に、多分化能又は多能性になるように脱分化した細胞は、その後、様々な分化した表現型へと分化され得る。
本明細書において使用される際、「成体細胞」という用語は、胚発生後に全身で見られる細胞を指す。
本明細書において使用される際、「体細胞」は、生殖系列細胞でない細胞を指す。体細胞は、様々な器官又は組織、例えば、真皮、心臓組織、肺組織、又は歯根膜に由来する線維芽細胞であり得る。
本明細書に記載される方法及び組成物において使用される細胞は、任意の対象に由来し得る。本明細書において使用される際の「対象」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を指す。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、（特に、高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えばマウス又はラット、モルモット）、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、ウシなどの哺乳動物、及びニワトリ、両生類、は虫類などの非哺乳動物を含む。一実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験動物又は疾患モデルとしての代替動物である。
本明細書において使用される際、「培養」は、成長に好適な条件（例えば、培養培地のタイプ、培養培地の栄養組成物、温度、ｐＨ、Ｏ２及び／又はＣＯ２パーセンテージ、湿度水準）に細胞集団を維持することを指す。
本明細書において使用される際、「適切な対照」は、非処理の、それ以外は同一の細胞又は集団（例えば、本明細書に記載される薬剤によって接触されていないか、又は非対照細胞と比較して、本明細書に記載される薬剤のサブセットのみによって接触された幹細胞集団若しくは分化細胞集団）を指す。
本明細書において使用される際、「リプログラミング因子」は、細胞集団を脱分化するのに使用される因子を指す。いくつかのこのような因子が、当該技術分野において公知であり、例えば脱分化を促進することが確認された、例えば一連の転写因子である。例示的なリプログラミング因子としては、限定はされないが、Ｏｃｔ３、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ５、ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、ＳＶ４０ＬＴ、Ｇｌｉｓ１、及びｐ５３ ｓｈＲＮＡが挙げられる。一実施形態において、リプログラミング因子は、血清飢餓などの環境条件である。
「下方制御する（ｄｏｗｎｍｏｄｕｌａｔｅ）」、「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、又は「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」という用語は全て、本明細書において、再現性のある統計的に有意な量の減少を意味するのに使用される。ある実施形態において、「下方制御する」、「減少させる」、「低下させる」又は「阻害する」は、典型的に、基準レベル（例えば、所与の処理がない場合）と比較して、少なくとも１０％の減少を意味し、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の減少、並びに１００％の減少を含み得る。
「上方制御する（ｕｐｍｏｄｕｌａｔｅ）」、「増加させる（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、又は「活性化する（ａｃｔｉｖａｔｅ）」という用語は全て、本明細書において、再現性のある統計的に有意な量の増加を意味するのに使用される。ある実施形態において、「上方制御する」、「増加させる」、「増強する」、又は「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベルと比較して、少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％の増加、又は最大で１００％及びそれを含む増加又は１０〜１００％の間の任意の増加、あるいは、基準レベルと比較して、少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の増加、２０倍の増加、３０倍の増加、４０倍の増加、５０倍の増加、６倍の増加、７５倍の増加、１００倍の増加など又は２倍〜１０倍の間の任意の増加又はそれ以上の増加を意味し得る。マーカーに関して、「増加」は、このようなレベルの再現性のある統計的に有意な増加である。
本明細書において使用される際、「サーチュイン１（ＳＩＲＴ１）」は、例えば、脱アセチル化によって、細胞制御に不可欠なタンパク質を制御するＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）依存性デアセチラーゼ酵素を指す。いくつかの種についてのＳＩＲＴ１配列、例えば、ＳＩＲｒＬ１及びＳＩＲ２αとしても知られているヒトＳＩＲＴ１（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２３４１１）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＰ＿００１１３５９７０．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＭ＿００１１４２４９８．１）が知られている。ＳＩＲＴ１は、ヒトＳＩＲＴ１（その天然変異体、分子、及び対立遺伝子を含む）を指し得る。ＳＩＲＴ１は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物ＳＩＲＴ１を指す。
本明細書において使用される際、「サーチュイン２（ＳＩＲＴ２）」は、モノ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する細胞内調節タンパク質として機能するＮＡＤ依存性デアセチラーゼ酵素を指す。いくつかある役割の中でも特に、細胞質ＳＩＲＴ２は、微小管アセチル化及び髄鞘形成などの過程を調節することが示されており、核ＳＩＲＴ２は、Ｈ４Ｋ１６の脱アセチル化によって、メチル化を促進する。いくつかの種についてのＳＩＲＴ２配列、例えば、ＳＩＲ２、ＳＩＲ２Ｌ、及びＳＩＲ２Ｌ２としても知られているヒトＳＩＲＴ２（ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２２９３３）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＰ＿００１１８０２１５．１）並びにｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ ＮＭ＿００１１９３２８６．１）が知られている。ＳＩＲＴ２は、ヒトＳＩＲＴ２（その天然変異体、分子、及び対立遺伝子を含む）を指し得る。ＳＩＲＴ２は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの哺乳動物ＳＩＲＴ２を指す。
本明細書において使用される際、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、ヌクレオシドのポリマーを示すために、「核酸」と同義的に使用される。典型的に、ポリヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合によって結合された、ＤＮＡ又はＲＮＡにおいて天然に見られるヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）から構成される。しかしながら、この用語は、天然の核酸において見られるか否かにかかわらず、化学的に又は生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを含有するヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む分子を包含し、このような分子は、特定の用途に好ましいことがある。本出願がポリヌクレオチドに言及する場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方、並びにそれぞれ一本鎖及び二本鎖形態の両方（及び各一本鎖分子の補体）が想定されることが理解される。核酸は、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性二本鎖ＤＮＡの１つの核酸鎖であり得る。あるいは、それは、いずれの二本鎖ＤＮＡにも由来しない一本鎖核酸であり得る。
本明細書において使用される際、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、アミノ酸のポリマーを指すために同義的に使用される。ペプチドは、比較的短いポリペプチド、典型的に、約２〜６０アミノ酸長である。本明細書において使用されるポリペプチドは、典型的に、タンパク質において最も一般的に見られる２０Ｌ−アミノ酸などのアミノ酸を含有する。しかしながら、当該技術分野において公知の他のアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体が使用され得る。ポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上が、例えば、炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、共役、官能化のためのリンカーなどの化学物質の付加によって修飾され得る。共有結合又は非共有結合された非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、なお「ポリペプチド」であると考えられる。例示的な修飾としては、グリコシル化及びパルミトイル化が挙げられる。ポリペプチドは、天然源から精製されるか、組み換えＤＮＡ技術を用いて産生されるか、又は従来の固相ペプチド合成などの化学的手段によって合成され得る。
本明細書において使用される際の「ＲＮＡｉ」という用語は、干渉ＲＮＡ又はＲＮＡ干渉を指す。ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡのプロセシングを阻害する、例えば、ｍＲＮＡ翻訳を阻害し、又はｍＲＮＡ分解をもたらす分子による、特定のｍＲＮＡの破壊による選択的転写後遺伝子サイレンシングの手段を指す。本明細書において使用される際、「ＲＮＡｉ」という用語は、任意のタイプの干渉ＲＮＡ（限定はされないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内在性マイクロＲＮＡ及び人工マイクロＲＮＡを含む）を指す。例えば、それは、ＲＮＡの下流のプロセシングの機構にかかわらず、ｓｉＲＮＡとして既に同定された配列を含む（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらすインビボプロセシングの特定の方法を有するものと考えられるが、このような配列は、本明細書に記載される隣接配列の文脈においてベクターに組み込まれ得る）。
「低分子干渉（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」とも呼ばれる「低分子干渉（ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）という用語は、例えば、ＲＮＡｉによって、標的遺伝子、例えばＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２の発現を阻害するように機能する薬剤として定義される。本明細書において使用される際、「ｓｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡを形成する核酸を指し、この二本鎖ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡが、標的遺伝子と同じ細胞内に存在するか又は同じ細胞内で発現される場合、遺伝子又は標的遺伝子の発現を低下させるか又は阻害する能力を有する。二本鎖ＲＮＡｓｉＲＮＡは、相補的鎖によって形成され得る。一実施形態において、ｓｉＲＮＡは、二本鎖ｓｉＲＮＡを形成し得る核酸を指す。ｓｉＲＮＡの配列は、完全長標的遺伝子、又はその部分配列に対応し得る。典型的に、ｓｉＲＮＡは、少なくとも約１５〜５０ヌクレオチド長である（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補的配列は、約１５〜５０ヌクレオチド長であり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、約１５〜５０塩基対の長さ、好ましくは、約１９〜〜３０塩基ヌクレオチド、好ましくは、約２０〜２５ヌクレオチド長、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０ヌクレオチド長である）。ｓｉＲＮＡは、約１、２、３、４、又は５ヌクレオチドの長さを有する各鎖上に３’及び／又は５’突出部を含有し得る。突出部の長さは、２つの鎖間で独立しており、すなわち、１つの鎖上の突出部の長さは、第２の鎖上の突出部の長さに依存しない。好ましくは、ｓｉＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解又は特異的転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）によってＲＮＡ干渉を促進することが可能である。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成され得、それは、インビトロ転写によって産生され得、又はそれは、宿主細胞内で産生され得る。
本明細書において使用される際、「ｓｈＲＮＡ」又は「低分子ヘアピンＲＮＡ」（ステムループとも呼ばれる）は、あるタイプのｓｉＲＮＡである。一実施形態において、これらのｓｈＲＮＡは、短い、例えば約１９〜約２５ヌクレオチド、アンチセンス鎖、続いて、約５〜約９ヌクレオチドのヌクレオチドループ、及び類似のセンス鎖から構成される。あるいは、センス鎖が、ヌクレオチドループ構造の前にあり得、アンチセンス鎖が後にあり得る。ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡｉ及び／又はｓｉＲＮＡ種として機能するが、ｓｈＲＮＡ種が安定性の向上のために二本鎖ヘアピン様構造である点が異なる。これらのｓｈＲＮＡは、プラスミド、レトロウイルス、又はレンチウイルスなどの非レトロウイルスに含まれてもよく、例えば、ｐｏｌ ＩＩＩ Ｕ６プロモーター、又は別のプロモーターから発現され得る（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｓｔｅｗａｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００３）ＲＮＡ Ａｐｒ；９（４）：４９３−５０１を参照）。
「マイクロＲＮＡ」又は「ｍｉＲＮＡ」という用語は、同義的に使用され、これらは、内在性ＲＮＡであり、そのうちの一部は、転写後レベルでタンパク質コード遺伝子の発現を調節することが知られている。内在性マイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することが可能な、ゲノム中に天然に存在する低分子ＲＮＡである。人工マイクロＲＮＡという用語は、ｍＲＮＡの生産的利用を調節することが可能な、内在性マイクロＲＮＡ以外の任意のタイプのＲＮＡ配列を含む。マイクロＲＮＡ配列は、Ｌｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，ｐ．９９１−１００８（２００３）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１５４０（２００３）、Ｌｅｅ ａｎｄ Ａｍｂｒｏｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２（２００１）、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５８−８６１（２００１）、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９（２００２）、Ｌａｇｏｓ Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８５３−８５７（２００１）、及びＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ ｅｔ ａｌ，ＲＮＡ，９，１７５−１７９（２００３）（これらは、参照により援用される）などの刊行物において記載されている。複数のマイクロＲＮＡがまた、前駆体分子に組み込まれ得る。さらに、ｍｉＲＮＡ様ステムループが、ｍｉＲＮＡ及び又はＲＮＡｉ経路を介して内在性遺伝子の発現を調節するために、人工ｍｉＲＮＡ及び低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を送達するためのビヒクルとして、細胞内で発現され得る。
本明細書において使用される際の「ベクター」という用語は、宿主細胞への送達のため、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物を指す。本明細書において使用される際、ベクターは、ウイルス又は非ウイルスであり得る。「ベクター」という用語は、適切な制御要素と結合したときに複製が可能であり、遺伝子配列を細胞に移動し得る任意の遺伝要素を包含する。ベクターとしては、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書において使用される際、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子中にパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、必須でないウイルス遺伝子の代わりに、本明細書に記載されるポリペプチドをコードする核酸を含有し得る。ベクター及び／又は粒子は、インビトロ又はインビボのいずれかで核酸を細胞内に移動するために用いられ得る。多くの形態のウイルスベクターが、当該技術分野において公知である。
本明細書において使用される際、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結されて、その中に含まれる核酸配列からＲＮＡ又はポリペプチド（例えば、ポリペプチドをコードするＳＩＲＴ１）の発現を指令するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもではないが、細胞に対して異種であることが多い。発現ベクターは、さらなる要素を含んでもよく、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有してもよく、したがって、２つの生物内、例えば、発現のためにヒト細胞内及びクローニング及び増幅のために原核生物宿主内で維持されることが可能である。「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質を産生し、必要に応じて、タンパク質を分泌するのに関与する細胞過程を指し、これには、該当する場合、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳並びにタンパク質の折り畳み、修飾及びプロセシングが含まれるが、これらに限定されない。
ベクターは、組み込み型又は非組み込み型であり得る。「組み込み型ベクター」には、それらの送達されたＲＮＡ／ＤＮＡが、宿主細胞染色体に永久的に組み込まれている。「非組み込み型ベクター」は、エピソームのままであり、これは、その中に含まれる核酸が、宿主細胞染色体に組み込まれないことを意味する。組み込み型ベクターの例としては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ハイブリッドアデノウイルスベクター、及び単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられる。
非組み込み型ベクターの一例は、非組み込み型ウイルスベクターである。非組み込み型ウイルスベクターは、宿主ＤＮＡにそれらのゲノムを組み込まないため、組み込み型レトロウイルスがもたらすリスクをなくす。一例は、エプスタイン・バールｏｒｉＰ／核抗原−１（「ＥＢＮＡ１」）ベクターであり、これは、限られた自己複製が可能であり、哺乳類細胞内で機能することが知られている。エプスタイン・バールウイルスに由来する２つの要素、ｏｒｉＰ及びＥＢＮＡ１を含有するため、ウイルス複製領域ｏｒｉＰへのＥＢＮＡ１タンパク質の結合は、哺乳類細胞内のプラスミドの比較的長期のエピソームの存在を維持する。ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターは、この特定の特徴により、組み込みのないｉＰＳＣの生成のために理想的である。別の非組み込み型ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。
別の非組み込み型ウイルスベクターは、ＲＮＡセンダイウイルスベクターであり、これは、感染細胞の核に入らずにタンパク質を産生することができる。Ｆ欠損センダイウイルスベクターは、数回の継代のために感染細胞の細胞質内に留まるが、迅速に希釈され、数回の継代（例えば、１０回の継代）の後、完全に失われる。
非組み込み型ベクターの別の例は、ミニサークルベクターである。ミニサークルベクターは、プラスミド骨格が、発現されるべき真核生物プロモーター及びｃＤＮＡのみを残して放出された環状ベクターである。
本明細書において使用される際、「小分子」という用語は、ペプチド、ペプチド模倣体、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、アプタマー、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、モル当たり約１０，０００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物（例えば、複素環式有機及び有機金属化合物を含む）、モル当たり約５，０００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、モル当たり約１，０００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、モル当たり約５００グラム未満の分子量を有する有機又は無機化合物、並びにこのような化合物の塩、エステル、及び他の薬学的に許容できる形態を含み得るが、これらに限定されない化学物質を指す。
本明細書における方法によって生成される細胞は、薬学的に許容できる担体を含む組成物中にあり得る。本明細書において使用される際の「薬学的に許容できる担体」という用語は、対象の体内の目標とする場所に活性成分（例えば、細胞）を運ぶ又は輸送するのに関与する薬学的に許容できる材料、組成物又はビヒクル、例えば、液体若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒又は封入材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、対象、例えばヒトへの投与と適合するという意味で「許容」できなければならない。一実施形態において、担体は、水又は細胞培養培地以外の何かである。
「統計的に有意な」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、２標準偏差（２ＳＤ）又はそれ以上の差を意味する。
本明細書において使用される際、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法又は組成物に必須の組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素に関して使用されるが、必須であるか否かにかかわらず、指定されていない要素の包含を許容する。
単数形の用語（「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」）は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、「又は」という用語は、文脈上明らかに他の意味を示さない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料が、本開示の実施又は試験において使用され得るが、好適な方法及び材料が、後述される。「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、ラテン語の例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａ）に由来し、本明細書において、非限定的な例を示すのに使用される。したがって、「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」という用語の同義語である。
ＳＩＲＴ２下方制御及びＳＩＲＴ１上方制御がヒト多能性の分子署名であることを示す、実験からの結果を示す。（図１Ａ）アセチル−Ｌｙｓに対する抗体を用いたｈＤＦ及びｈＥＳＣタンパク質の免疫沈降、続いて、アセチル化タンパク質を同定するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。（図１Ｂ）データベース検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｘｔｂｉｏ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上で見られる）からの結果を用いた、ｈＥＳＣ系列（ｎ＝２５）及び正常体細胞株（ｎ＝１５）におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２の相対的発現レベルの平均値散布図。全ての細胞株情報が、表６に示される。（平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）、両側不対スチューデントｔ検定）。 ＳＩＲＴ２下方制御及びＳＩＲＴ１上方制御がヒト多能性の分子署名であることを示す、実験からの結果を示す。（図１Ｃ）ｈＤＦ、ｉＰＳＣ及びｈＥＳＣからのＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ニューマン−コイルス事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図１Ｄ）ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のタンパク質レベル。 ＳＩＲＴ２下方制御及びＳＩＲＴ１上方制御がヒト多能性の分子署名であることを示す、実験からの結果を示す。（図１Ｅ）ｈＥＳＣのインビトロ分化中のＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、Ｏｃｔ４及びＳＯＸ２の相対的ｍＲＮＡレベル。（ｎ＝２つの生物学的に独立した実験）。（図１Ｆ）インビトロＤＡ分化の前及び後のそれぞれの、多能性マーカー（Ｏｃｔ４及びＴｒａ−１−６０）及び神経マーカー（ＴＨ及びＴｕｊ１）の免疫蛍光アッセイ。核を示すのにＨｏｅｃｈｓｔを使用した。スケールバー、１００μｍ。 ＳＩＲＴ２下方制御及びＳＩＲＴ１上方制御がヒト多能性の分子署名であることを示す、実験からの結果を示す。（図１Ｇ及び１Ｈ）ＤＡ神経マーカー（ＴＨ、Ｌｍｘ１ｂ、及びＴｕｊ１）の遺伝子発現レベル（図１Ｇ）及び多能性マーカー（図１Ｈ）が、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のものとともに示される。（平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００５、両側不対スチューデントｔ検定）。 ＳＩＲＴ２下方制御及びＳＩＲＴ１上方制御がヒト多能性の分子署名であることを示す、実験からの結果を示す。（図１Ｉ）インビトロＤＡ分化中のＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２タンパク質レベル。 ＳＩＲＴ２が、解糖酵素のアセチル化及び酵素活性を調節することを示す、実験からの結果を示す。（図２Ａ）左側：ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）あり又はなしの誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ Ｈ９ ｈＥＳＣの代表的な写真。スケールバー、１００μｍ。右側：ＳＩＲＴ２過剰発現の効率を、ＳＩＲＴ２特異的抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認した。 ＳＩＲＴ２が、解糖酵素のアセチル化及び酵素活性を調節することを示す、実験からの結果を示す。（図２Ｂ〜２Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ ｈＥＳＣ（ＳＩＲＴ２ＯＥ）からの総タンパク質抽出物を、抗アルドラーゼＡ、抗ＰＧＫ１、抗エノラーゼ若しくは抗ＧＡＰＤＨ抗体（図２Ｂ）又は抗アセチル−Ｌｙｓ（図２Ｃ）で免疫沈降させた。各酵素のアセチル化レベルを、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体（図２Ｂ）又は各特異的抗体（図２Ｃ）を用いたウエスタンブロット法によって評価した。各抽出物における酵素活性が、図２Ｄに示される。等量の抽出物を用いたアルドラーゼＡ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、ＧＡＰＤＨ、及びβ−アクチンのウエスタンブロット法が、対照（インプット）として示される。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ−＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、解糖酵素のアセチル化及び酵素活性を調節することを示す、実験からの結果を示す。（図２Ｂ〜２Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ ｈＥＳＣ（ＳＩＲＴ２ＯＥ）からの総タンパク質抽出物を、抗アルドラーゼＡ、抗ＰＧＫ１、抗エノラーゼ若しくは抗ＧＡＰＤＨ抗体（図２Ｂ）又は抗アセチル−Ｌｙｓ（図２Ｃ）で免疫沈降させた。各酵素のアセチル化レベルを、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体（図２Ｂ）又は各特異的抗体（図２Ｃ）を用いたウエスタンブロット法によって評価した。各抽出物における酵素活性が、図２Ｄに示される。等量の抽出物を用いたアルドラーゼＡ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、ＧＡＰＤＨ、及びβ−アクチンのウエスタンブロット法が、対照（インプット）として示される。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ−＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、解糖酵素のアセチル化及び酵素活性を調節することを示す、実験からの結果を示す。（図２Ｂ〜２Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ ｈＥＳＣ（ＳＩＲＴ２ＯＥ）からの総タンパク質抽出物を、抗アルドラーゼＡ、抗ＰＧＫ１、抗エノラーゼ若しくは抗ＧＡＰＤＨ抗体（図２Ｂ）又は抗アセチル−Ｌｙｓ（図２Ｃ）で免疫沈降させた。各酵素のアセチル化レベルを、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体（図２Ｂ）又は各特異的抗体（図２Ｃ）を用いたウエスタンブロット法によって評価した。各抽出物における酵素活性が、図２Ｄに示される。等量の抽出物を用いたアルドラーゼＡ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、ＧＡＰＤＨ、及びβ−アクチンのウエスタンブロット法が、対照（インプット）として示される。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ−＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、解糖酵素のアセチル化及び酵素活性を調節することを示す、実験からの結果を示す。（図２Ｅ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２０Ｅからの総タンパク質を、抗アルドラーゼＡ又は抗エノラーゼ抗体を用いて免疫沈降させ、ウエスタンブロット法を、抗アセチル−Ｌｙｓ又は抗ＳＩＲＴ２抗体を用いて行った。野生型及びＳＩＲＴ２−ＧＦＰ ｈＥＳＣからの全細胞溶解物（インプット）のアルドラーゼＡ、エノラーゼ、及びβ−アクチンウエスタンブロット法を、ＩＰのための等タンパク質濃度の対照として使用した。（図２Ｆ及び２Ｇ）モック及びＳＩＲＴ２ノックダウン（ＫＤ）ｈＤＦからの総タンパク質抽出物を、抗アルドラーゼＡ、抗ＰＧＫ１、抗エノラーゼ又は抗ＧＡＰＤＨ抗体によって免疫沈降させた。アルドラーゼＡ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、又はＧＡＰＤＨのアセチル化レベル及び酵素活性を、それぞれ抗アセチル−Ｌｙｓ抗体（図２Ｆ）及び酵素アッセイ（図２Ｇ）を用いたウエスタンブロット法によって決定した。ＷＴ及びＳＩＲＴ２ＫＤ ｈＤＦからの全細胞溶解物（インプット）のアルドラーゼＡ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、ＧＡＰＤＨ、及びｂ−アクチンウエスタンブロット法を、ＩＰ及び酵素活性アッセイのための等濃度の対照として使用した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）が示される。ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 Ｋ３２２のアセチル化状態が、ＡｌｄｏＡ活性を調節することを示す、実験からの結果。（図３Ａ）ウエスタンブロット法は、ＡｌｄｏＡ−Ｍｙｃが、ＳＩＲＴ２ＫＤ ２９３Ｔ細胞において高アセチル化されるが、総タンパク質は変化されないことを示す。（図３Ｂ）異なる種に由来する推定アセチル化部位（Ｋ１１１及びＫ３２２）の配列アラインメント。 Ｋ３２２のアセチル化状態が、ＡｌｄｏＡ活性を調節することを示す、実験からの結果。（図３Ｃ）Ｍｙｃタグ化ＡｌｄｏＡ、ＡｌｄｏＡＫ１１１Ｑ、及びＡｌｄｏＡＫ３２２Ｑをそれぞれ、ｈＤＦにおいて発現させた。ＡｌｄｏＡタンパク質を、Ｍｙｃ抗体を用いてＩＰによって精製し、ＡｌｄｏＡに対する特異的活性を決定した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図３Ｄ）Ｍｙｃタグ化ＡｌｄｏＡ、ＡｌｄｏＡＫ１１１Ｒ、及びＡｌｄｏＡＫ３２２Ｒをそれぞれ、ＳＩＲＴ２ ｓｈＲＮＡ（ＳＩＲＴ２ＫＤ）を同時発現するｈＤＦにおいて発現させた。ＡｌｄｏＡタンパク質を、Ｍｙｃ抗体を用いてＩＰによって精製し、ＡｌｄｏＡに対する特異的活性を決定した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 Ｋ３２２のアセチル化状態が、ＡｌｄｏＡ活性を調節することを示す、実験からの結果。（図３Ｅ）ヒトＡｌｄｏＡの結晶構造モデル（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋコード：１ＡＬＤ）。 Ｋ３２２のアセチル化状態が、ＡｌｄｏＡ活性を調節することを示す、実験からの結果。（図３Ｆ）示される試料中で同定されたアセチル化Ｌｙｓ。 ＳＩＲＴ２が、ｈＰＳＣの代謝及び細胞生存に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図４Ａ）Ｄｏｘあり又はなしの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ Ｈ９ ｈＥＳＣ（ＳＩＲＴ２ＯＥ）の解糖生体エネルギー学を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ分析装置を用いて評価した。平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）が示される。ｎ＝３つの生物学的に独立した実験。（図４Ｂ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥからの基礎解糖速度、解糖能及び解糖予備能が、図４Ａに示される。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＰＳＣの代謝及び細胞生存に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図４Ｃ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣの細胞増殖を、ＥＳＣ培養条件下で２日置きに細胞数を決定することによって分析した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。（図４Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしのＧＦＰ陽性（ＧＦＰ＋）ＷＴ及びＳＩＲＴ２ Ｈ９ ｈＥＳＣを、それぞれＧＦＰ陰性（ＧＦＰ−）ｈＥＳＣと１：１の比率で混合した。ＧＦＰ＋／ＧＦＰ−比を、各継代で測定した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＰＳＣの代謝及び細胞生存に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図４Ｅ）アネキシンＶ／７−ＡＡＤ染色によって測定される、ＥＳＣ培養条件下で３日間にわたるＤｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣのアポトーシス数。 ＳＩＲＴ２が、ｈＰＳＣの代謝及び細胞生存に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図４Ｆ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ ｈＥＳＣ系列（Ｈ９及びＨ７）並びに２つのｉＰＳＣ系列（ｉＰＳＣ−１及びｉＰＳＣ−２）におけるアネキシンＶ陽性細胞の定量化。１：Ｄｏｘなしのモック、２：Ｄｏｘありのモック、３：ＤｏｘなしのＳＩＲＴ２ＯＥ、４：ＤｏｘありのＳＩＲＴ２ＯＥ。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＰＳＣの代謝及び細胞生存に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図４Ｇ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ ｈＰＳＣ（Ｈ９及びｈｉＰＳＣ−１）の細胞内ＲＯＳレベル。１：Ｄｏｘなしのモック、２：Ｄｏｘありのモック、３：ＤｏｘなしのＳＩＲＴ２ＯＥ、４：ＤｏｘありのＳＩＲＴ２ＯＥ。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝５つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図４Ｈ）Ｄｏｘあり又はなしのＳＩＲＴ２ＯＥによるｈＰＳＣ（Ｈ９及びｈｉＰＳＣ−１）の細胞死に対する酸化防止剤の影響。１：Ｖｅｈのみ、２：ＮＡＣ、３：Ｄｏｘ＋Ｖｅｈ、４：Ｄｏｘ＋ＮＡＣ。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＥＳＣの初期インビトロ分化中の代謝に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図５Ａ及び５Ｂ）誘導性ＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣを、最大で４日間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ培地中で培養することによって自然発生的に分化するように誘導し、多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＲｅｘ１）（図５Ａ）並びに初期分化マーカー（Ｐａｘ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂ−Ｔ）、及びＳｏｘ１７）（図５Ｂ）の遺伝子発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＥＳＣの初期インビトロ分化中の代謝に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図５Ａ及び５Ｂ）誘導性ＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣを、最大で４日間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ培地中で培養することによって自然発生的に分化するように誘導し、多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＲｅｘ１）（図５Ａ）並びに初期分化マーカー（Ｐａｘ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂ−Ｔ）、及びＳｏｘ１７）（図５Ｂ）の遺伝子発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＥＳＣの初期インビトロ分化中の代謝に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図５Ｃ）初期分化中のＤｏｘあり又はなしのＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣにおけるＳＩＲＴ２の発現レベル。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図５Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣの解糖生体エネルギー学を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ分析装置を用いて評価した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図５Ｅ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣの細胞外ラクテート産生。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、ｈＥＳＣの初期インビトロ分化中の代謝に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図５Ｆ）ＳＩＲＴ２ＯＥ Ｈ９ ｈＥＳＣを、７日間にわたって自然発生的に分化するように誘導し、分化している細胞を、外胚葉（Ｏｔｘ２）、内胚葉（Ｓｏｘ１７）、及び中胚葉（Ｂ−Ｔ）について、系列特異的マーカーの存在下で免疫染色した。スケールバー、１００ｕｍ。 ＳＩＲＴ２が、ｈＥＳＣの初期インビトロ分化中の代謝に影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図５Ｇ）分化条件下で、最大で１２日間にわたって分化した、Ｄｏｘあり又はなしの野生型（モック）並びに誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ（ＳＩＲＴ２ＯＥ）Ｈ９及びＨ７ ｈＥＳＣ系列における外胚葉（Ｐａｘ６、Ｍａｐ２、ＧＦＡＰ及びＡＡＤＣ）、内胚葉（Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ、ＣＫ８及びＣＫ１８）、及び中胚葉（Ｍｓｘ１及びＢ−Ｔ）を表すマーカーの遺伝子発現レベルを示すヒートマップ。１：Ｄｏｘなしのモック、２：Ｄｏｘありのモック、３：ＤｏｘなしのＳＩＲＴ２ＯＥ、４：ＤｏｘありのＳＩＲＴ２ＯＥ。（ｎ＝２つの生物学的に独立した実験）。 ＳＩＲＴ２ＫＤが、多能性の誘導中に線維芽細胞における代謝リプログラミングを促進することを示す、実験からの結果を示す。（図６Ａ及び６Ｂ）トランスフェクション後３日の時点での、対照（ｓｉＮＳ）又はＳＩＲＴ２ ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＩＲＴ２）に感染したヒト線維芽細胞（ｈＤＦ）の酸素消費速度（ＯＣＲ）（図６Ａ）及びＥＣＡＲ（図６Ｂ）を、ＸＦ分析装置によって評価した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５、両側不対スチューデントｔ検定）。（図６Ｃ）トランスフェクション後３日の時点での、ｓｉＮＳ又はｓｉＳＩＲＴ２に感染したｈＤＦのＯＸＰＨＯＳ能力。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験）。 ＳＩＲＴ２ＫＤが、多能性の誘導中に線維芽細胞における代謝リプログラミングを促進することを示す、実験からの結果を示す。（図６Ｄ及び６Ｅ）ｓｉＮＳ及びｓｉＳＩＲＴ２からの基礎呼吸、ＡＴＰターンオーバー、最大呼吸、酸化予備能（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｒｅｓｅｒｖｅ）（図６Ｄ）又はＦＣＣＰ注入後の相対的ＯＣＲ変化（図６Ｅ）が、ｃに示される。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、両側不対スチューデントｔ検定）。 ＳＩＲＴ２ＫＤが、多能性の誘導中に線維芽細胞における代謝リプログラミングを促進することを示す、実験からの結果を示す。（図６Ｆ及び６Ｇ）ＯＣＲが、トランスフェクション後３日（図６Ｆ）又は８日（図６Ｇ）の時点で、４つのリプログラミング因子（Ｙ４）及び／又はＳＩＲＴ２ノックダウン（ＳＩＲＴ２ＫＤ）を発現するレンチウイルスに感染したｈＤＦについて示された。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験）。 ＳＩＲＴ２ＫＤが、多能性の誘導中に線維芽細胞における代謝リプログラミングを促進することを示す、実験からの結果を示す。（図６Ｈ及び６Ｉ）トランスフェクション後３日（図６Ｈ）又は８日（図６Ｉ）の時点での、Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤからの基礎呼吸、ＡＴＰターンオーバー、最大呼吸、及び酸化予備能が、図６Ｆ及び６Ｇに示される（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２ＫＤが、多能性の誘導中に線維芽細胞における代謝リプログラミングを促進することを示す、実験からの結果を示す。（図６Ｈ及び６Ｉ）トランスフェクション後３日（図６Ｈ）又は８日（図６Ｉ）の時点での、Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤからの基礎呼吸、ＡＴＰターンオーバー、最大呼吸、及び酸化予備能が、図６Ｆ及び６Ｇに示される（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２ＫＤが、多能性の誘導中に線維芽細胞における代謝リプログラミングを促進することを示す、実験からの結果を示す。（図６Ｊ及び６Ｋ）Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤからのＯＣＲ／ＥＣＡＲ比（図６Ｊ）又はＦＣＣＰ注入後の相対的ＯＣＲ変化（図６Ｋ）が、ｆ、ｇに示される。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、代謝変化によって体細胞核リプログラミングに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図７Ａ）Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤに感染したｈＤＦにおけるＳＩＲＴ２ ｍＲＮＡの発現レベルの時間的経過。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝４つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。（図７Ｂ及び７Ｃ）Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤに感染したｈＤＦにおけるＯＣＲ（図７Ｂ）及びＥＣＡＲ（図７Ｃ）を、ＸＦ分析装置によって評価した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝４つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、代謝変化によって体細胞核リプログラミングに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図７Ｂ及び７Ｃ）Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤに感染したｈＤＦにおけるＯＣＲ（図７Ｂ）及びＥＣＡＲ（図７Ｃ）を、ＸＦ分析装置によって評価した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝４つの生物学的に独立した実験、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。（図７Ｄ）Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤに感染したｈＤＦからのラクテート産生の測定。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、代謝変化によって体細胞核リプログラミングに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図７Ｅ及び７Ｆ）ｉＰＳＣ生成に対するＳＩＲＴ２ＯＥ又はＫＤの影響。上側：過剰発現（図７Ｅ）又はノックダウン（図７Ｆ）の効率を、抗ＳＩＲＴ２抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認した。下側：感染の１４日後（ｄｐｉ）の時点でのＡＰ陽性コロニーの代表的な写真。（平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、代謝変化によって体細胞核リプログラミングに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図７Ｅ及び７Ｆ）ｉＰＳＣ生成に対するＳＩＲＴ２ＯＥ又はＫＤの影響。上側：過剰発現（図７Ｅ）又はノックダウン（図７Ｆ）の効率を、抗ＳＩＲＴ２抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認した。下側：感染の１４日後（ｄｐｉ）の時点でのＡＰ陽性コロニーの代表的な写真。（平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、代謝変化によって体細胞核リプログラミングに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図７Ｇ及び７Ｈ）形質導入の８日後の時点での、Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤによるｉＰＳＣ生成に対する解糖阻害剤、２−オキシグルコース（２ＤＧ）の影響を、ＯＣＲ（図７Ｇ）及びＥＣＡＲ（図７Ｈ）によって評価した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝４つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ＳＩＲＴ２が、代謝変化によって体細胞核リプログラミングに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図７Ｉ）Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ２ＫＤによるｉＰＳＣ生成に対する２ＤＧの影響。形質導入の１４日後の時点でのＡＰ陽性コロニーの代表的な写真。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ）。 ｍｉＲ−２００ｃが、ＳＩＲＴ２を直接標的にすることを示す、実験からの結果を示す。（図８Ａ及び８Ｂ）ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡによるＳＩＲＴ２の改変された発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図８Ａ）又はＳＩＲＴ２特異的抗体を用いたウエスタンブロット法（図８Ｂ）によって分析した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ｍｉＲ−２００ｃが、ＳＩＲＴ２を直接標的にすることを示す、実験からの結果を示す。（図８Ｃ）ｍｉＲ−２００ｃ（上側）並びに成熟形態のｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ及び−３ｐ（下側）のステムループの配列。 ｍｉＲ−２００ｃが、ＳＩＲＴ２を直接標的にすることを示す、実験からの結果を示す。（図８Ｄ及び８Ｅ）対照（Ｓｃｒ）、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐ（５ｐ）及び−３ｐ（３ｐ）についてのｍｉＲＮＡ模倣体によるＳＩＲＴ２の改変された発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図８Ｄ）又はＳＩＲＴ２特異的抗体を用いたウエスタンブロット法（図８Ｅ）によって分析した。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。（図８Ｆ）２９３Ｔ細胞内の対照（Ｓｃｒ）と比べたＳＩＲＴ２のＣＤＳ断片に対するｍｉＲ−２００ｃ−５ｐの影響を実証するルシフェラーゼ検証アッセイ。（平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊Ｐ＜０．０１、ボンフェローニ事後検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡ）。 ｍｉＲ−２００ｃが、ＳＩＲＴ２を直接標的にすることを示す、実験からの結果を示す。（図８Ｇ）代謝の切り替え及び体細胞リプログラミングを調節する際のｍｉＲ−２００ｃ−ＳＩＲＴ２−解糖酵素（アルドラーゼ、ＧＡＰＤＨ、エノラーゼ、及びＰＧＫ１）軸についての提案モデル。 ヒトｉＰＳＣ生成に対するＳＩＲＴ１過剰発現（ＯＥ）及びＳＩＲＴ２ノックダウン（ＫＤ）の複合効果を示す、実験からの結果を示す。線維芽細胞を、ＳＩＲＴ１ＯＥ又はＳＩＲＴ２ＫＤあり又はなしで、４つのリプログラミング因子を発現するレンチウイルスで処理した。レンチウイルス形質導入の１４日後の時点でのＡＰ陽性コロニーの代表的な写真。平均±標準偏差（ｓ．ｄ．）、ｎ＝３つの生物学的に独立した実験、＊＊＊Ｐ＜０．００５、ボンフェローニ事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ。 ＳＩＲＴ１発現が、癌において可変であることを示す、実験からの結果を示す。一部の癌細胞がより高いレベルのＳＩＲＴ１を発現するようであるが、それは、ＥＳＣ及びｉＰＳＣのように一貫していない。しかしながら、ＳＩＲＴ１が、癌幹細胞において一貫して高度に発現されることが予測される。 ＳＩＲＴ２発現が、癌において可変であることを示す、実験からの結果を示す。一部の癌細胞が、より低いレベルのＳＩＲＴ２を発現するようであるが、それは、ＥＳＣ及びｉＰＳＣのように一貫していない。ＳＩＲＴ２が、癌幹細胞において一貫して下方制御されることが予測される。 ｈＤＦと比較して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおけるＷａｒｂｕｒｇ様効果を示す、実験からの結果を示す。（図１２Ａ）フィーダーフリー条件下で培養されるヒトＥＳＣ（Ｈ９）及びｈｉＰＳＣを、核染色のためのＨｏｅｃｈｓｔ染色とともに多能性マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ４、及びＴＲＡ１−６０）に対する特異的抗体で染色した。スケールバー＝１００ｐｍ。 ｈＤＦと比較して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおけるＷａｒｂｕｒｇ様効果を示す、実験からの結果を示す。（図１２Ｂ）ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣの代表的な写真。（図１２Ｃ）７日間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ培地中で培養することによる、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣのインビトロ自然発生的分化。免疫染色画像（第１及び第２の列のパネル）は、外胚葉（０ｔｘ２）、中胚葉（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ；Ｂ−Ｔ）、及び内胚葉（Ｓｏｘ１７）についての系列特異的マーカーを示す。スケールバー＝１００ｐｍ。 ｈＤＦと比較して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおけるＷａｒｂｕｒｇ様効果を示す、実験からの結果を示す。（図１２Ｄ）細胞内ＡＴＰレベルは、元の線維芽細胞内よりｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣにおいて有意に低かった。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊＊＊ｐ＜０．００５。（図１２Ｅ）Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ分析装置によって評価される、親ｈＤＦ及びｈｉＰＳＣ並びにｈＥＳＣのミトコンドリア生体エネルギー学。 ｈＤＦと比較して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおけるＷａｒｂｕｒｇ様効果を示す、実験からの結果を示す。（図１２Ｆ）ｈＤＦ及びｈｉＰＳＣ並びにｈＥＳＣにおけるＧＬＵＴ１〜ＧＬＵＴ７を含むグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）の発現レベル。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１。（図１２Ｇ）アセチル−Ｌｙｓに対する抗体を用いたｈＤＦ及びｈＥＳＣタンパク質の免疫沈降、続いて、アセチル化タンパク質を同定するためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析。 図１２及び表２に示されるアセチル化タンパク質についてのＣＩＤスペクトルを示す、実験からの結果を示す。チューブリン、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼアイソザイムＭ１／Ｍ２及びＡＴＰシンターゼについてのペプチドを、ＩＰ及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析の組合せによって検出した。ＩＰを、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体を用いて行った。 図１２及び表２に示されるアセチル化タンパク質についてのＣＩＤスペクトルを示す、実験からの結果を示す（図１３−１の続き）。 ｈＥＳＣにおけるサーチュインファミリー発現のメタ分析を示す、実験からの結果を示す。（図１４Ａ）表５に示されるｈＥＳＣにおけるサーチュインファミリー遺伝子発現についてこの試験に使用される、集められたデータ。上方制御された、下方制御された、及び有意な変化なしにそれぞれ相当する、アップ、ダウン、及びＮ／Ａとして示される各サーチュインの発現レベル。括弧内の数値は、５つの異なる試験からの発現変化を表す。 ｈＥＳＣにおけるサーチュインファミリー発現のメタ分析を示す、実験からの結果を示す。（図１４Ｂ）異なる細胞間のＳＩＲＴ２発現変化を示す代表的なデータ。ＳＩＲＴ２下方制御が、分化細胞及び元の線維芽細胞と比較してｈＰＳＣにおいて観察された。 ｈＥＳＣにおけるサーチュインファミリー発現のメタ分析を示す、実験からの結果を示す。（図１４Ｃ〜１４Ｇ）データベース分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｘｔｂｉｏ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上で見られる）に基づいた、いくつかのｈＥＳＣ系列及び正常な非癌細胞株にわたる、ＳＩＲＴ３（図１４Ｃ）、ＳＩＲＴ４（図１４Ｄ）、ＳＩＲＴ５、（図１４Ｅ）ＳＩＲＴ６（図１４Ｆ）、及びＳＩＲＴ７（図１４Ｇ）の発現レベル比較。相対的発現レベルが、散布図の平均値として示される。 ｈＥＳＣにおけるサーチュインファミリー発現のメタ分析を示す、実験からの結果を示す。（図１４Ｃ〜１４Ｇ）データベース分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｘｔｂｉｏ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上で見られる）に基づいた、いくつかのｈＥＳＣ系列及び正常な非癌細胞株にわたる、ＳＩＲＴ３（図１４Ｃ）、ＳＩＲＴ４（図１４Ｄ）、ＳＩＲＴ５、（図１４Ｅ）ＳＩＲＴ６（図１４Ｆ）、及びＳＩＲＴ７（図１４Ｇ）の発現レベル比較。相対的発現レベルが、散布図の平均値として示される。 誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ Ｈ９ ｈＥＳＣの特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１５Ａ）発現ベクターにわたって誘導できるＥＧＦＰ ＳＩＲＴ２ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）のプラスミドマップ。 誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ Ｈ９ ｈＥＳＣの特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１５Ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析される、Ｄｏｘあり又はなしのＳＩＲＴ２−ＧＦＰｈＥＳＣにおける解糖酵素の発現レベル。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．００５。 誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ Ｈ９ ｈＥＳＣの特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１５Ｃ及び１５Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしのｈＥＳＣ、ｈＤＦ、及びＳＩＲＴ２−ＧＦＰｈＥＳＣにおける多能性マーカーの発現レベル。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．００５。 誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ Ｈ９ ｈＥＳＣの特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１５Ｃ及び１５Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしのｈＥＳＣ、ｈＤＦ、及びＳＩＲＴ２−ＧＦＰｈＥＳＣにおける多能性マーカーの発現レベル。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．００５。 ＡｌｄｏＡのアセチル化に対する改変されたＳＩＲＴ２発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１６Ａ〜１６Ｄ）質量分析法分析によるＡｌｄｏＡ Ｋ１１１（図１６Ａ及び１６Ｂ）及びＫ３２２（図１６Ｃ及び１６Ｄ）アセチル化の検出。記号「＠」は、アセチル化部位を示す。 ＡｌｄｏＡのアセチル化に対する改変されたＳＩＲＴ２発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１６Ａ〜１６Ｄ）質量分析法分析によるＡｌｄｏＡ Ｋ１１１（図１６Ａ及び１６Ｂ）及びＫ３２２（図１６Ｃ及び１６Ｄ）アセチル化の検出。記号「＠」は、アセチル化部位を示す。 ＡｌｄｏＡのアセチル化に対する改変されたＳＩＲＴ２発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１６Ａ〜１６Ｄ）質量分析法分析によるＡｌｄｏＡ Ｋ１１１（図１６Ａ及び１６Ｂ）及びＫ３２２（図１６Ｃ及び１６Ｄ）アセチル化の検出。記号「＠」は、アセチル化部位を示す。 ＡｌｄｏＡのアセチル化に対する改変されたＳＩＲＴ２発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１６Ａ〜１６Ｄ）質量分析法分析によるＡｌｄｏＡ Ｋ１１１（図１６Ａ及び１６Ｂ）及びＫ３２２（図１６Ｃ及び１６Ｄ）アセチル化の検出。記号「＠」は、アセチル化部位を示す。 ＡｌｄｏＡのアセチル化に対する改変されたＳＩＲＴ２発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１６Ｅ）Ｍｙｃタグ化ＡＩｄｏＡ、ＡｌｄｏＡＫ１１１Ｑ、及びＡｌｄｏＡＫ３２２４をそれぞれ、２９３Ｔ細胞において発現させた。ＡｌｄｏＡタンパク質を、Ｍｙｃ抗体を用いてＩＰによって精製し、ＡＩｄｏＡに対する特異的活性を決定した。ＭｅａｎｔＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊０＊ｐ＜０．００５。（図１６Ｆ）Ｍｙｃタグ化ＡｌｄｏＡ、ＡｌｄｏＡＫ１１１Ｒ、及びＡｌｄｏＡＫ３２２Ｒをそれぞれ、ＳＩＲＴ２ ｓｈＲＮＡ（ＳＩＲＴ２ＫＤ）を同時発現する２９３Ｔ細胞において発現させた。ＡｌｄｏＡタンパク質を、Ｍｙｃ抗体を用いてＩＰによって精製し、ＡｌｄｏＡに対する特異的活性を決定した。ＭｅａｎｔＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊＊＊ｐ＜０．００５。 ＳＩＲＴ２過剰発現の後の、ｈＰＳＣ系列の代謝及び機能的特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１７Ａ、１７Ｃ、及び１７Ｅ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７ ｈＥＳＣ（図１７Ａ）並びに２つのｉＰＳＣ系列（図１７Ｃ及び１７Ｅ）からの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ細胞株の解糖生体エネルギー学を、ＸＦ分析装置によって評価した。（図１７Ｂ、１７Ｄ、及び１７Ｆ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７ ｈＥＳＣ（図１７Ｂ）並びに２つのｉＰＳＣ系列（図１７Ｄ及び１７Ｆ）からのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥの基礎解糖速度、解糖能及び解糖予備能がそれぞれ、図１７Ａ、１７Ｃ、及び１７Ｅに示される。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；”ｐ＜０．０１。 ＳＩＲＴ２過剰発現の後の、ｈＰＳＣ系列の代謝及び機能的特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１７Ａ、１７Ｃ、及び１７Ｅ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７ ｈＥＳＣ（図１７Ａ）並びに２つのｉＰＳＣ系列（図１７Ｃ及び１７Ｅ）からの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ細胞株の解糖生体エネルギー学を、ＸＦ分析装置によって評価した。（図１７Ｂ、１７Ｄ、及び１７Ｆ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７ ｈＥＳＣ（図１７Ｂ）並びに２つのｉＰＳＣ系列（図１７Ｄ及び１７Ｆ）からのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥの基礎解糖速度、解糖能及び解糖予備能がそれぞれ、図１７Ａ、１７Ｃ、及び１７Ｅに示される。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；”ｐ＜０．０１。 ＳＩＲＴ２過剰発現の後の、ｈＰＳＣ系列の代謝及び機能的特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１７Ａ、１７Ｃ、及び１７Ｅ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７ ｈＥＳＣ（図１７Ａ）並びに２つのｉＰＳＣ系列（図１７Ｃ及び１７Ｅ）からの野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２−ＧＦＰ細胞株の解糖生体エネルギー学を、ＸＦ分析装置によって評価した。（図１７Ｂ、１７Ｄ、及び１７Ｆ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７ ｈＥＳＣ（図１７Ｂ）並びに２つのｉＰＳＣ系列（図１７Ｄ及び１７Ｆ）からのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥの基礎解糖速度、解糖能及び解糖予備能がそれぞれ、図１７Ａ、１７Ｃ、及び１７Ｅに示される。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；”ｐ＜０．０１。 ＳＩＲＴ２過剰発現の後の、ｈＰＳＣ系列の代謝及び機能的特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１７Ｇ）ＯＣＲが、Ｄｏｘあり又はなしで、２つのｈＥＳＣ系列（Ｈ９及びＨ７）並びにｈｉＰＳＣ−１系列について示された。１：Ｄｏｘなしのモック、２：Ｄｏｘありのモック、３：ＤｏｘなしのＳＩＲＴ２ＯＥ、４：ＤｏｘありのＳＩＲＴ２ＯＥ。平均ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００５。 ＳＩＲＴ２過剰発現の後の、ｈＰＳＣ系列の代謝及び機能的特性評価を示す、実験からの結果を示す。（図１７Ｈ）Ｄｏｘあり又はなしのＨ７つのｈＥＳＣ及び２つの独立したｉＰＳＣ系列（ｈｉＰＳＣ−１及びｈｉＰＳＣ−２）からのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥの細胞増殖を、ＥＳＣ培養条件下で２日置きに細胞数を決定することによって分析した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。”ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。 ＳＩＲＴ２が、ｈｉＰＳＣの初期分化能の代謝シグネチャに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図１８Ａ及び１８Ｂ）誘導性ＳＩＲＴ２ＯＥ ｈｉＰＳＣ−１細胞を、最大で４日間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ培地を培養することによって自然発生的に分化するように誘導し、多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＲｅｘ１）（図１８Ａ）及び初期分化マーカー（Ｐａｘ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂ−Ｔ）、及びＳｏｘ１７）（図１８Ｂ）の遺伝子発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 ＳＩＲＴ２が、ｈｉＰＳＣの初期分化能の代謝シグネチャに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図１８Ａ及び１８Ｂ）誘導性ＳＩＲＴ２ＯＥ ｈｉＰＳＣ−１細胞を、最大で４日間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ培地を培養することによって自然発生的に分化するように誘導し、多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＲｅｘ１）（図１８Ａ）及び初期分化マーカー（Ｐａｘ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂ−Ｔ）、及びＳｏｘ１７）（図１８Ｂ）の遺伝子発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 ＳＩＲＴ２が、ｈｉＰＳＣの初期分化能の代謝シグネチャに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図１８Ｃ）初期分化中のＤｏｘあり又はなしのＳＩＲＴ２ＯＥ ｈｉＰＳＣ−１細胞におけるＳＩＲＴ２の発現レベル。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５。（図１８Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ ｈｉＰＳＣ−１細胞の解糖生体エネルギー学を、Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦ分析装置を用いて評価した。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５。（図１８Ｅ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ２ＯＥ ｈｉＰＳＣ−１細胞の細胞外ラクテート産生。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。 ＳＩＲＴ２が、ｈｉＰＳＣの初期分化能の代謝シグネチャに影響を与えることを示す、実験からの結果を示す。（図１８Ｆ）分化条件下で最大で１２日間にわたる、Ｄｏｘあり又はなしのｈｉＰＳＣ−１及びｈｉＰＳＣ−２を含む野生型（モック）及び誘導性ＳＩＲＴ２ＯＥ ｈｉＰＳＣ系列における外胚葉（Ｐａｘ６、Ｍａｐ２、ＧＦＡＰ及びＡＡＤＣ）、内胚葉（Ｆｏｘａ２、Ｓｏｘ１７、ＡＦＰ、ＣＫ８及びＣＫ１８）、及び中胚葉（Ｍｓｘ１及びＢ−Ｔ）を表すマーカーの遺伝子発現レベルを示すヒートマップ。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。１：Ｄｏｘなしのモック、２：Ｄｏｘありのモック、３：ＤｏｘなしのＳＩＲＴ２ＯＥ、４：ＤｏｘありのＳＩＲＴ２ＯＥ。 代謝リプログラミング及びｉＰＳＣ生成に対する改変されたＳＩＲＴ１発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１９Ａ）発現ベクターにわたって誘導できるＥＧＦＰ ＳＩＲＴ１ドキシサイクリンのプラスミドマップ。 代謝リプログラミング及びｉＰＳＣ生成に対する改変されたＳＩＲＴ１発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１９Ｂ）ＯＣＲが、トランスフェクション後３日の時点での、Ｄｏｘあり又はなしの野生型（モック）又は誘導性ＳＩＲＴ１−ＧＦＰ（ＳＩＲＴＩＯＥ）に感染したｈＤＦについて示された。 代謝リプログラミング及びｉＰＳＣ生成に対する改変されたＳＩＲＴ１発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１９Ｃ及び１９Ｄ）Ｄｏｘあり又はなしのモック及びＳＩＲＴ１ＯＥからのＯＣＲ／ＥＣＡＲ比（図１９Ｃ）、及びＦＣＣＰ注入後の相対的ＯＣＲ変化（図１９Ｄ）が、図１９Ｂに示される。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。 代謝リプログラミング及びｉＰＳＣ生成に対する改変されたＳＩＲＴ１発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１９Ｅ及び１９Ｆ）ｉＰＳＣ生成に対するＳＩＲＴ１ＫＤ又はＯＥの影響。上側：ＳＩＲＴ１ＫＤ又はＯＥの効率を、抗ＳＩＲＴＩ抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認した。下側：レンチウイルス形質導入の１４日後の時点でのＡＰ陽性コロニーの代表的な写真。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．００５。 代謝リプログラミング及びｉＰＳＣ生成に対する改変されたＳＩＲＴ１発現の影響を示す、実験からの結果を示す。（図１９Ｅ及び１９Ｆ）ｉＰＳＣ生成に対するＳＩＲＴ１ＫＤ又はＯＥの影響。上側：ＳＩＲＴ１ＫＤ又はＯＥの効率を、抗ＳＩＲＴＩ抗体を用いたウエスタンブロット法によって確認した。下側：レンチウイルス形質導入の１４日後の時点でのＡＰ陽性コロニーの代表的な写真。平均±ＳＥＭ（ｎ＝３）が示される。＊ｐ＜０．００５。 代謝リプログラミング及びｉＰＳＣ生成に対する改変されたＳＩＲＴ１発現の影響を示す、実験からの結果を示す。Ｇ、Ｈ：トランスフェクション後３日（図１９Ｇ）又は６日（図１９Ｈ）の時点での、Ｙ４及び／又はＳＩＲＴ１ＯＥに感染したｈＤＦにおけるＯＣＲ。
本発明の態様は、細胞によって使用される代謝経路が、分化のその状態に直接影響を与えるという発見に基づいている。細胞代謝と分化状態との間の相関が既に観察されているが、細胞状態に対する代謝の原因となる影響は、理解されていなかった。本明細書に示される結果は、用いられる代謝経路が、細胞を多能性又は分化のいずれかに向かわせることを示す。したがって、代謝リプログラミング（例えば、実験的操作による）は、細胞の分化状態に直接影響を与え得る。解糖代謝の利用を増加させ、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）代謝を低減するための細胞のリプログラミングは、細胞を低分化状態にする（それによって、細胞の「幹細胞らしさ（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」を高めるために）。一方、解糖の利用を低減し、ＯＸＰＨＯＳ代謝を増加させるための細胞のリプログラミングは、細胞をより分化した状態にする。
本発明の態様は、どの代謝経路が用いられるかを細胞が調節する１つの方法が、タンパク質アセチル化によるものであるという発見にさらに基づいており、ここで、アセチル化解糖酵素は、それらの脱アセチル化同等物と比較して、高度に活性である。これは、細胞の運命における様々な代謝経路の役割の認識とともに、細胞の運命が、解糖酵素のアセチル化状態の適切な操作によって操作され得ることを示す。
したがって、本発明の一態様は、解糖酵素のアセチル化状態の操作による、細胞の運命の変化に関する。細胞内の解糖を低減するための、本来分化される細胞（例えば、体細胞）における解糖酵素の脱アセチル化は、細胞を多能性に向かわせる。あるいは、（例えば、多能性又は多分化能）細胞内の解糖を増加させるための、低分化細胞における解糖酵素のアセチル化は、細胞を分化に向かわせる。
解糖を低減する１つのこのような方法は、デアセチラーゼＳＩＲＴ２の操作によって行われる。ＳＩＲＴ２は、解糖酵素を脱アセチル化し、それによって、それらの活性を低下させ、解糖を抑制する。ＳＩＲＴ２は、分化細胞において高度に活性である。ＳＩＲＴ２活性の低下は、解糖を増加させ、それによって、細胞を脱分化に向かわせる。あるいは、低分化細胞（例えば、幹細胞）におけるＳＩＲＴ２活性は、解糖酵素活性と同様に、比較的低く、ここで、ＯＸＰＨＯＳは、主に代謝に使用される。低分化細胞におけるＳＩＲＴ２活性の増加は、解糖酵素を脱アセチル化し、解糖を抑制し、細胞をより分化した状態にする。
別のアセチル化調節因子である、ＳＩＲＴ１は、細胞の運命に関して、ＳＩＲＴ２の活性と相互関係にある活性を有する。ＳＩＲＴ１は、低分化細胞において活性であり、ここで、活性は、より分化した細胞において低下する。ＳＩＲＴ２と同様に、ＳＩＲＴ１は、解糖の利用を増加させ、ＯＸＰＨＯＳの利用を低減し、それによって、非分化状態に寄与するように、代謝酵素のアセチル化を改変する。したがって、ＳＩＲＴ１操作は、細胞の運命に影響を与えるために本明細書に記載される方法において使用され得、ここで、ＳＩＲＴ１の増加が、細胞を脱分化に向かわせ、ＳＩＲＴ１の減少が、細胞をさらなる分化に向かわせる。
用いられる代謝経路を操作することによって細胞の運命を変化させる能力は、（例えば、分化細胞から多能性細胞を生成するため、及び多能性細胞から分化細胞を生成するための）細胞の運命操作の公知の方法を向上させるのに有用である。リプログラミング因子を用いて細胞を脱分化させるための方法が、当該技術分野において周知である。例としては、山中（リプログラミング）因子：Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ（又は１−Ｍｙｃ）及びＫｌｆ−４の導入、並びにさらにＴｈｏｍｓｏｎ（リプログラミング）因子：Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ−２８の導入が挙げられる。残念ながら、（例えば、多能性）細胞の脱分化を誘導する現行の方法は、かなり非効率的であり、少ないパーセンテージの所望の生成物を生成する。細胞を低分化状態にするための、本明細書に記載されるような、ＳＩＲＴ１（上方制御）及びＳＩＲＴ２（下方制御）などによる細胞代謝の調節を用いて、細胞を脱分化させる（例えば、人工多能性細胞を生成する）ための公知の方法を向上させることができる。したがって、この方法は、リプログラミング因子の総メンバーと組み合わせて、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２調節を含む。しかしながら、本明細書に記載されるような、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２調節が、生成される脱分化細胞の数を増加させ、及び／又は脱分化過程においてリプログラミング因子の１つ以上の省略を可能にすることが予測される。１つ以上のリプログラミング因子を省略する能力は、それが細胞の総操作の減少を容易にする場合、公知の手順の向上と考えられる（例えば、細胞へのより少ない異物の送達）。
様々な分化因子及び／又は培養手順を用いることによって、（例えば、多能性又は多分化能幹細胞）細胞を分化させるための様々な方法が公知である。これらの方法の多くは、誘導の低い有効性及び／又は誘導の遅い速度の問題がある。細胞をより分化した状態にするための、本明細書に記載されるような、ＳＩＲＴ１（下方制御）及びＳＩＲＴ２（上方制御）などによる細胞代謝の調節を用いて、細胞を分化させる（例えば、神経細胞を生成する）ための公知の方法を向上させることができる。したがって、この方法は、分化の公知の方法と組み合わせて、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２調節を含む。しかしながら、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２調節が、分化細胞を生成し、及び／又は生成される分化細胞の数を増加させるのに必要とされる時間を減少させることが予測される。ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２調節が、分化過程に必要とされる１つ以上の工程又は因子の省略も可能にすることも予測される。
さらに、本明細書に記載される本発明は、ＳＩＲＴ１及び／又はＳＩＲＴ２の発現レベル及び／又は活性に基づいて、多能性幹細胞及び分化細胞を選択するための方法を提供する。
本明細書に記載される方法及び組成物は、細胞の運命をより簡単且つ容易に改変するために、ＳＩＲＴ１及び／又はＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性が調節されることを必要とする。ＳＩＲＴ１は、例えば、脱アセチル化によって、細胞制御に不可欠なタンパク質を制御するＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）依存性デアセチラーゼ酵素である。ＳＩＲＴ２は、モノ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を有する細胞内調節タンパク質として機能するＮＡＤ依存性デアセチラーゼ酵素である。
下方制御する又は下方制御は、タンパク質（例えば、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２）の機能を低下させることを指す。これは、細胞内の機能性ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２自体の産生を直接阻害することによって（例えば、遺伝子発現又はタンパク質合成を低減することによって）、あるいはＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２機能／活性を低下させることによって行われ得る。ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２機能／活性は、例えばＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２タンパク質自体を直接阻害するか、又は他の場合、当該タンパク質を分解のためにターゲティングすることによって、低下され得る。したがって、下方制御のために本発明において有用な薬剤は、ＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２遺伝子発現又はタンパク質合成を阻害するか、又はＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２機能又は活性を阻害するものである。ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２の下方制御はまた、ＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２遺伝子発現又はＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２機能／活性を誘導するか又は正に調節する上流因子の阻害によって達成され得る。したがって、下方制御のための別の有用な薬剤は、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２について記載されるものに対応する方法によって、このような上流因子を阻害又は下方制御する薬剤である。
上方制御する又は上方制御は、機能性タンパク質のレベルを増加させることを指し、下方制御について記載される方法によって、ただし、代わりに遺伝子発現又はタンパク質活性を増加又は活性化させることによって、達成される。
人工多能性幹細胞
幹細胞は、子孫細胞を産生するように自己複製及び分化する単一細胞レベルでの能力によって定義される未分化細胞であり、自己複製する前駆細胞、複製しない前駆細胞、及び最終的に分化細胞を含む。幹細胞はまた、それらの分化のレベルに応じて、複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系列の機能細胞へとインビトロで分化し、並びに移植後に複数の胚葉の組織を生じ、胚盤胞への注入後に、全てではないが実質的にほとんどの組織に寄与するそれらの能力によって特性評価される。「人工多能性幹細胞」は、成体細胞、例えば、体細胞又は非胚細胞から直接生成される多能性幹細胞である。
本明細書に記載される本発明の一態様は、人工ヒト多能性幹細胞を生成するための方法であって、体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の１つ以上のリプログラミング因子（例えば、山中因子又はＴｈｏｍｓｏｎ因子）及びさらにＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの人工ヒト多能性幹細胞を生成するのに十分な期間にわたって体細胞又は非胚細胞集団を培養することを含む方法を提供する。一実施形態において、本方法は、体細胞又は非胚細胞集団に、有効量のＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤を送達することをさらに含む。
一実施形態において、体細胞又は非胚細胞集団は、少なくとも１つの人工ヒト多能性幹細胞を生成するのに十分な期間にわたって培養される。培養は、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも２１日間、又はそれ以上の期間にわたって行われ得る。
ある場合に、化学及び／又は大気条件は、リプログラミングのために変更される。例えば、体細胞及び非胚細胞が、血管新生されていない場合、大気中２１％のＯ２の代わりに、５％のＯ２の低酸素状態下での低酸素のリプログラミングが、リプログラミング効率を高める機会をさらに提供し得る。同様に、化学的誘導技術は、様々なリプログラミング試験において広く使用されている、リプログラミング、特に、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤分子、バルプロ酸（ＶＰＡ）と組み合わせて使用されている。
同時に、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）−ＥＲＫ（「ＭＥＫ」）阻害剤ＰＤ０３２５９０１、形質転換成長因子β（「ＴＧＦ−β」）Ｉ型受容体ＡＬＫ４、ＡＬＫ５及びＡＬＫ７阻害剤ＳＢ４３１５４２及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（「ＧＳＫ３」）阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１などの他の小分子が、自己複製を持続するために、他の経路の調節（例えば、ＭＡＰＫキナーゼ（ＭＥＫ）−ＥＲＫ経路の阻害）と組み合わせて、分化誘導経路の活性化（例えばＢＭＰシグナル伝達）のために適用されている。Ｙ−２７６３２及びチアゾビビン（「Ｔｚｖ」）などのＲｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（「ＲＯＣＫ」）阻害剤などの他の小分子が、特に、単一細胞解離の際に、生存を促進し、細胞死の脆弱性を低減するために適用されている。したがって、本明細書に記載される方法における因子の１つ以上の包含が想定される。
リプログラミングの効率
リプログラミング（例えば、細胞の運命を変化させること）の効率は、当業者によって容易に理解される多くの技術のうちの１つによって容易に確認される。例えば、効率は、薬剤及びリプログラミング因子を受けるドナー細胞の数と、生成されるリプログラミングされたコロニー（脱分化コロニー）の数との比率によって表され得る。薬剤及びリプログラミング因子を受けるドナー細胞の数は、薬剤又はリプログラミング因子をコードするベクターに含まれるＧＦＰなどのレポーター遺伝子の使用などによって、直接測定され得る。あるいは、送達効率の間接的な測定は、一対の試料送達剤及びリプログラミング因子ベクターの送達効率を測定するために、代用物としてレポーター遺伝子をコードするベクターをトランスフェクトすることによって達成され得る。さらに、生成されるリプログラミングされたコロニーの数は、例えば、Ｔｒａ−１−６０などの表面マーカーの転写因子Ｏｃｔ−４又はＮａｎｏｇ、又は抗体染色の内在性発現を用いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性クローン、コロニーなどの１つ以上の多分化能又は多能性特性の出現を観察することによって測定され得る。あるいは、効率は、人工多能性幹細胞生成に必要とされる時間によって表され得る。誘導された細胞のパーセンテージと誘導の時間との組合せも使用され得る。
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、適切な対照と比較して、少なくとも２倍の人工多能性幹細胞の数の増強をもたらす。別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、適切な対照と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上の人工多能性幹細胞の数の増強をもたらす。本明細書において使用される際、「適切な対照」は、（例えば、ＳＩＲＴ２を下方制御する及び／又はＳＩＲＴ１を上方制御する）薬剤の非存在下で同等に処理された細胞集団を指す。リプログラミングの効率は、上述されるように評価され得る。
本明細書に記載される本発明の一態様は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生成される人工幹細胞様細胞（例えば、多能性幹細胞）を含む細胞株を提供する。
本明細書に記載される本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生成される人工幹細胞様細胞（例えば、多能性幹細胞）又はその集団と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物を提供する。
ＳＩＲＴ２の下方制御及び／又はＳＩＲＴ１の上方制御によるリプログラミング因子
体細胞又は非胚細胞集団は、１つ以上のリプログラミング因子とさらに接触される。一実施形態において、１つ以上のリプログラミング因子は、山中（リプログラミング）因子、例えば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、ｃ−Ｍｙｃ（又は１−Ｍｙｃ）及びＫｌｆ−４から選択されるか、又はＴｈｏｍｓｏｎ（リプログラミング）因子、例えば、Ｏｃｔ−４、Ｓｏｘ−２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ−２８から選択される１〜４つのリプログラミング因子である。リプログラミング因子は、従来、発生の初期に通常発現されることが理解され、着床前の胚及び着床後の胚の内部細胞塊を構成する細胞のサブセットの多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を適切に維持するのに関与する。それらの異所性発現は、宿主細胞内の本来休止状態の内在性コア多能性プログラムを開始し、伝播する胚様転写カスケードの確立を可能にするものと考えられる。
一実施形態において、リプログラミング因子は、例えば、所与のリプログラミング因子をコードする核酸を含む、本明細書に記載されるものなどのベクターを介して、細胞において発現される。別の実施形態において、リプログラミング因子は、例えば、裸のＤＮＡとして所与のリプログラミング因子をコードする核酸の発現によって、細胞において発現される。
さらなるリプログラミング因子としては、限定はされないが、Ｔｅｒｔ、Ｋｌｆ−４、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（「ＳＶ４０ＬＴ」）及びｐ５３を標的にする短ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ−ｐ５３」）が挙げられる。これらの因子の１つ以上が、本明細書に記載される送達方法を用いて、細胞にさらに送達されて、リプログラミング過程を促進し得る。
本明細書に記載される薬剤及びリプログラミング因子は、必然的にベクターに含まれ、したがってベクターをさらに含み得る。外因性遺伝子を標的哺乳類細胞に移動するのに有用な多くのこのようなベクターが利用可能である。ベクターは、エピソーム、例えばプラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来ベクター（例えば、ウイルスベクター）であってもよく、又は相同的組み換え若しくはランダムな組み込み、例えばレトロウイルス由来ベクター（ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなど）を介して、標的細胞ゲノムに組み込まれ得る。幹細胞の修飾については、レンチウイルスベクターが好ましい。ＨＩＶ又はＦＩＶ ｇａｇ配列に基づくものなどのレンチウイルスベクターが、ヒト幹細胞の休止期など、非分裂細胞をトランスフェクトするのに使用され得る（Ｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９５（２０）：１１９３９−４４を参照）。ある実施形態において、レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株との組合せにも、カプシドタンパク質が標的細胞を感染させるのに機能する場合、用途があり得る。通常、細胞及びウイルスは、培養培地中で少なくとも約２４時間にわたってインキュベートされる。次に、細胞は、用途によっては短い期間、例えば２４〜７３時間、又は少なくとも２週間にわたって培養培地中で成長され、分析前に５週間以上にわたって成長され得る。一般的に使用されているレトロウイルスベクターは、「欠陥があり（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）」、すなわち、増殖感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。ベクターの複製は、パッケージング細胞株中での増殖を必要とする。
本方法におけるベクターの様々な組合せの使用が想定される。当該技術分野における様々なベクター及びリプログラミング因子が、細胞内でリプログラミングを確立することが可能な複数の成分を示すようであるが、成功したリプログラミングが定着するのに必要な化学量論的発現レベルを考慮したとき、高度の複雑性が存在する。例えば、Ｏｃｔ−４及びＳｏｘ−２が、別個のベクター上で２つの因子を送達することと対照的に、１：１の比率で単一のベクター上の単一の転写産物においてコードされる場合、体細胞リプログラミング効率は、４倍高いと報告されている。後者の事例は、２つの因子のあまり制御されない組み込み率をもたらし、リプログラミング効率に悪影響を与える。これらの障害に対処する一手法は、導入遺伝子の上流が転写プロモーターから遠位にあることを条件として、内部リボソーム侵入部位（「ＩＲＥＳ」）の包含などの、多シストロン性ベクターの使用である。この機構は、１つ以上の導入遺伝子が、単一のリプログラミングベクターにおいて提供されるのを可能にし、様々な誘導性又は構成的プロモーターが、発現カセットとして一緒に組み合わされて、複数の導入遺伝子のためのより細かいレベルの転写制御を与えることができる。これらのより特異的なレベルの制御は、リプログラミング過程にかなりの利点を与えることができ、したがって、ベクター上の別個の発現カセットが、別個のプロモーターの制御下のように設計され得る。
単一の、又は少数のベクターを介してこのような因子を提供する利点があるが、ベクターサイズの上限が存在し、これは、宿主標的細胞内でのそれらの送達を促進する試みを妨害し得る。例えば、多シストロン性ベクターの使用に関する初期の報告は、場合により１％未満の細胞、より典型的に０．１％未満で起こる、リプログラミングの非常に低い効率が注目された。これらの障害は、部分的に、大きい構築物に対する低い耐性を有するいくつかの標的宿主細胞（例えば、線維芽細胞）、又は宿主細胞によるＩＲＥＳ部位の非効率なプロセシングに起因する。さらに、ベクター発現カセットにおける因子の配置は、その化学量論的及び時間的発現の両方に影響を与え、リプログラミング効率に影響を与えるさらなる変数となる。したがって、いくつかの改良された技術が、様々な発現カセットにおける１つ以上のリプログラミング因子をそれぞれコードする複数のベクターに依存し得る。これらの設計の下で、送達のための特定のベクターの量の変更は、標的細胞における発現レベルを調整するための、粗いが比較的単純な経路を提供する。
別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、体細胞又は非胚細胞が、リプログラミング因子によって接触される必要がない。
人工多能性幹細胞の分化
本明細書に記載される本発明の一態様は、分化細胞を生成するための方法であって、多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの分化細胞を生成するのに十分な期間にわたって、分化条件下でこの集団を培養することを含む方法を提供する。一実施形態において、本方法は、ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤を送達することを含む。
多能性幹細胞は、生物の任意の細胞型へと分化する能力を含む。幹細胞を分化させるための方法及びプロトコルが、細胞型に基づいて変化することが理解されるべきであり、例えば、ニューロンへの分化は、肝細胞への分化と比較して異なるプロトコルを必要とし得る。幹細胞を所与の細胞型へと分化させるためのプロトコルは、当該技術分野において公知である。当業者は、特異的系統由来マーカー（例えば、クラスＩＩＩ β−チューブリン、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、又はカルレチニン）について分化細胞を評価することによって、細胞が特定の細胞型（例えば、ニューロン）へと分化しているかどうかを決定することができる。様々な細胞型のためのマーカーが公知であり、当業者によって決定され得る。
特異的分化条件は、典型的に、特異的分化培地中での培養を必要とする。本明細書において使用される際、「分化培地」は、幹細胞を特定の細胞型へと分化させるのに必要とされる因子を含有する培地を指す。特定の分化細胞（例えば、ニューロン、又は他の神経細胞型）を生成するのに有用な分化培地は、例えば、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から、様々な細胞型について市販されている。当業者は、所望の細胞型のための適切な分化培地及び条件を決定することができる。
一実施形態において、分化条件は、神経分化（例えば、神経前駆細胞への分化）に対して特異的である。神経細胞への幹細胞様細胞の分化のための方法が、レチノイン酸、ＢＭＰ阻害剤（例えば、ノギン（ｎｏｇｇｉｎ））、Ｎ２、Ｂ２７、及びＩＴＳなどの、神経分化を促進する因子を含有する培地中で幹細胞様細胞の接着性集団を培養することを含む。接着性幹細胞様細胞は、基質、例えば、ラミニン、フィブロネクチン、又はコラーゲンに接着性であるか、又はフィーダー細胞の集団、例えば、線維芽細胞の単層に接着性であり得る。例えば、神経ロゼットの存在によって観察されるように、培養物中の細胞が神経運命に寄与し始めるとき、それらは、許容培地中で培養され、神経ロゼットが、高レベルの塩基性ＦＧＦ２を含有する許容培地中で継代培養される。神経分化のための方法が、例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ｄｈａｒａ，ＳＫ．，ａｎｄ Ｓｔｉｃｅ，ＳＬ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００８ Ｏｃｔ １５；１０５（３）：６３３−６４０においてさらに概説されている。
別の例として、幹細胞様細胞は、肝細胞分化を促進する因子、例えば、ＦＧＦ−４、及びＨＧＦを含有する培地中で幹細胞様細胞を培養することによって、肝細胞へと分化され得る。６日後、細胞は、分化を可能するために、ＦＧＦ−４、ＨＧＦ、及びオンコスタチンＭを含有する培地中で培養される。完全肝細胞分化は、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ４ａ、及びアルブミンなどの肝細胞マーカーについて細胞を評価することによって決定され得る。肝細胞分化のための方法は、例えば、全体が参照により本明細書に援用される、Ａｇａｒｗａｋ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２００８ Ｆｅｂ ２１；２６（５）：１１１７−１１２７においてさらに概説されている。
本明細書に記載される方法及び組成物とともに使用するための幹細胞は、天然幹細胞又は「人工」幹細胞、例えば、本明細書に記載される方法を用いて生成される人工多能性幹細胞であり得る。人工多能性幹細胞は、当該技術分野において公知の任意の方法（例えば、本明細書に記載されるような）を用いて生成され得る。幹細胞は、任意の哺乳動物対象、例えば、ヒト、霊長類、ウマ科動物、ウシ、ブタ、イヌ科動物、ネコ科動物、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターなどから得られるか又は生成され得る。一実施形態において、幹細胞は、ヒト幹細胞である。一実施形態において、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。
一実施形態において、多能性幹細胞集団は、胚性幹細胞集団、成体幹細胞集団、人工多能性幹細胞集団、又は癌幹細胞集団である。一実施形態において、幹細胞は、非胚性幹細胞である。
一実施形態において、多能性細胞集団は、少なくとも１つの分化細胞を生成するのに十分な期間にわたって、例えば、分化培地中で培養される。培養は、１〜５日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、少なくとも４０日間、少なくとも５０日間、少なくとも６０日間、少なくとも７０日間、少なくとも８０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１００日間、少なくとも１１０日間、少なくとも１２０日間、少なくとも１３０日間、少なくとも１４０日間、少なくとも１５０日間、少なくとも１６０日間、少なくとも１７０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも１９０日間、少なくとも２００日間、少なくとも２１０日間、少なくとも２２０日間、少なくとも２３０日間、少なくとも２４０日間、少なくとも２５０日間、少なくとも２６０日間、少なくとも１２７０日間、少なくとも２８０日間、少なくとも２９０日間、少なくとも３００日間、又はそれ以上の期間にわたって行われ得る。一実施形態において、培養は、７〜１００日間、７〜２００日間、７〜３００日間、１００〜２００日間、２００〜３００日間、５０〜１５０日間、１５０〜２５０日間、又は１５０〜３００日間の期間にわたって行われる。
一実施形態において、本明細書に記載される方法は、適切な対照と比較して、少なくとも２倍の分化細胞の数の増強をもたらす。別の実施形態において、本明細書に記載される方法は、適切な対照と比較して、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、又はそれ以上の分化細胞の数の増強をもたらす。一実施形態において、増強は、適切な対照と比較して、少なくとも１００倍、２５０倍、５００倍、７５０倍、１００倍又はそれ以上である。１つのこのような「適切な対照」は、ＳＩＲＴ１を下方制御しない及び／又はＳＩＲＴ２を上方制御しない以外は同一の方法に供される同様又は同一の細胞である。脱分化の効率は、リプログラミングの効率について上述されるように評価され得る。
一実施形態において、分化細胞は、適切な対照より有意に短い期間にわたって産生される。一実施形態において、期間は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％短い。一実施形態において、期間は、適切な対照と比較して、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、又はそれ以上短い。
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生成される分化細胞を含む細胞株に関する。
薬剤
様々な実施形態において、薬剤が、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２を調節する（例えば、上方制御するか、又は下方制御する）ために細胞に送達される。本明細書において使用される際の「薬剤」という用語は、限定はされないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどの任意の化合物又は物質を意味する。「薬剤」は、限定はされないが、合成及び天然のタンパク質性及び非タンパク質性実体を含む、任意の化学物質、実体又は部分であり得る。ある実施形態において、薬剤は、核酸、核酸類似体、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸、又は限定はされないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマーを含む炭水化物、並びにその修飾及び組合せなどである。特定の実施形態において、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、マクロライド、レプトマイシン及びそれらの関連天然産物又は類似体を含む、非置換若しくは置換アルキル、芳香族、又はヘテロシクリル部分を含んでいた。化合物は、所望の活性及び／又は特性を有することが公知であり得、又は多様な化合物のライブラリーから選択され得る。
このような薬剤は、通常存在しないか又は細胞内で投与されるレベルで存在しない任意の実体の形態を取り得る。化学物質；小分子；核酸配列；核酸類似体；タンパク質；ペプチド；アプタマー；抗体；又はその断片などの薬剤は、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御又は上方制御するのに使用するために、同定又は生成され得る。
遺伝子発現を特異的に阻害するように設計された核酸配列の形態の薬剤が特に有用である。このような核酸配列は、ＲＮＡ又はＤＮＡであり得、一本鎖又は二本鎖であり得、該当するタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸類似体、例えばペプチド−核酸（ＰＮＡ）、偽相補性（ｐｓｅｕｄｏ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＰＮＡ（ｐｃ−ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）などを含む群から選択され得る。このような核酸配列としては、例えば、限定はされないが、例えば転写抑制因子として作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列、例えば限定はされないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍＲＮＡｉ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
薬剤は、１つ以上の化学的種類からの分子、例えば、有機分子（有機金属分子を含み得る）、無機分子、遺伝子配列などであり得る。薬剤はまた、１つ以上のタンパク質からの融合タンパク質、キメラタンパク質（例えば、関連又は異なる分子の機能的に有意な領域のドメインスイッチング又は相同的組み換え）、合成タンパク質又は置換、欠失、挿入及び他の変異を含む他のタンパク質変異であり得る。
一実施形態において、薬剤は、リボザイムなどの触媒アンチセンス核酸構築物であり、これは、ＲＮＡ転写産物を切断することが可能であり、それによって、コードされたタンパク質の産生を防止する。リボザイムは、リボザイム触媒部位に隣接する標的に相補的な配列の２つの領域によって、特定の配列に標的化され、これとアニールする。結合の後、リボザイムは、部位特異的に標的を切断する。特異的遺伝子産物の配列を特異的に認識し切断するリボザイムの設計及び試験は、当業者に一般的に知られている。
一実施形態において、薬剤は、遺伝子発現を阻害する（すなわち、遺伝子の発現を抑制及び／又は抑止する）。このような薬剤は、当該技術分野において「遺伝子サイレンサー」と呼ばれ、当該技術分野において一般的に知られている。例としては、限定はされないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は核酸類似体の核酸配列が挙げられ、これは、一本鎖又は二本鎖であり得、該当するタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、核酸、核酸類似体、例えば限定はされないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、偽相補性ＰＮＡ（ｐｃ−ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）及びその誘導体などを含む群から選択され得る。核酸剤としてはまた、例えば、限定はされないが、転写抑制因子として作用するタンパク質をコードする核酸配列、アンチセンス分子、リボザイム、低分子阻害性核酸配列、例えば限定はされないが、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡｉ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが挙げられる。
薬剤は、直接、それが投与される形態で機能し得る。あるいは、薬剤は、細胞内の核酸及び／又はタンパク質阻害剤又はＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２の活性化剤の産生をもたらす、細胞中への核酸配列の導入及びその転写などの、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を調節する何かを生じるように細胞内で修飾又は利用され得る。ある実施形態において、薬剤は、任意の化学物質、実体又は部分（限定はされないが、合成及び天然の非タンパク質性実体を含む）である。特定の実施形態において、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、マクロライド、レプトマイシン及びそれらの関連天然産物又は類似体を含む、非置換若しくは置換アルキル、芳香族、又はヘテロシクリル部分を含んでいた。薬剤は、所望の活性及び／又は特性を有することが公知であり得、又は多様な化合物のライブラリーから選択され得る。
タンパク質及び／又はペプチド又はその断片の形態の薬剤はまた、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御又は上方制御するように設計され得る。このような薬剤は、通常存在しないタンパク質又は通常、宿主細胞において内因的に発現されるタンパク質を包含する。有用なタンパク質の例は、突然変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組み換えタンパク質、キメラタンパク質（これらのいずれかは、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２についてのドミナントネガティブタンパク質の形態を取り得る）、抗体、ミディボディ（ｍｉｄｉｂｏｄｉｅｓ）、ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、修飾タンパク質及びその断片である。薬剤は、本明細書において同定される遺伝子産物、及びまだ同定されていないものの核酸及び／又はタンパク質を不活性化するように機能する、抗体（ポリクローナル若しくはモノクローナル）、中和抗体、抗体断片、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣体、アプタマー、オリゴヌクレオチド、ホルモン、小分子、核酸、核酸類似体、炭水化物又はその変異体も含む。
一実施形態において、ＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤は、少なくとも１つの人工多能性幹細胞を生成するために分化細胞に送達される。このような実施形態において、薬剤は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％又はそれ以上、ＳＩＲＴ２を下方制御する。別の実施形態において、ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤が、少なくとも１つの分化細胞を生成するために幹細胞に送達される。このような実施形態において、薬剤は、適切な対照と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍若しくはそれ以上だけ、又は適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％だけ、ＳＩＲＴ２を上方制御する。「適切な対照」は、薬剤が送達されていない、同様又は同一に処理された同じタイプの細胞又はその集団であり得る。
別の実施形態において、ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤が、少なくとも１つの分化細胞を生成するために幹細胞に送達される。このような実施形態において、薬剤は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％だけ、ＳＩＲＴ１を下方制御する。別の実施形態において、ＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤は、細胞を脱分化する（例えば、少なくとも１つの人工多能性幹細胞を生成する）ために分化細胞に送達される。このような実施形態において、薬剤は、適切な対照と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍若しくはそれ以上だけ、又は適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％若しくはそれ以上だけ、ＳＩＲＴ１を上方制御する。「適切な対照」は、薬剤が送達されていない、同様又は同一に処理された細胞又はその集団であり得る。
一実施形態において、ＳＩＲＴ１は、例えば、ＳＩＲＴ１をコードする核酸を含むベクターを介して、細胞において発現されるＳＩＲＴ１をコードする核酸によって上方制御される。別の実施形態において、ＳＩＲＴ１をコードする核酸は、例えば、裸のＤＮＡとしてＳＩＲＴ１をコードする核酸の発現によって、細胞において発現される。一実施形態において、ＳＩＲＴ１をコードする核酸は、配列番号２の配列に対応する配列を有するか；又は配列番号２の配列を含むか；又は配列番号２の配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性を有し、且つ配列番号２の配列と同じ活性（例えば、その基質のアセチル化）を有する配列を含む。
一実施形態において、ＳＩＲＴ２は、ＳＩＲＴ１をコードする核酸の発現によって上方制御される。ＳＩＲＴ２をコードする核酸は、例えば、ＳＩＲＴ２をコードする核酸を含むベクターを介して、細胞において発現され得る。別の実施形態において、ＳＩＲＴ２をコードする核酸は、例えば、裸のＤＮＡとしてＳＩＲＴ２をコードする核酸の発現によって、細胞において発現される。一実施形態において、ＳＩＲＴ２をコードする核酸は、配列番号３の配列に対応する配列を有するか；又は配列番号３の配列を含むか；又は配列番号３の配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性を有し、且つ配列番号３の配列と同じ活性（例えば、その基質のアセチル化）を有する配列を含む。
一実施形態において、薬剤は、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御する小分子である。このような小分子としては、限定はされないが、表１に列挙される小分子が挙げられる。小分子をスクリーニングするための方法が、当該技術分野において公知であり、所望の標的（例えば、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２）を所与として、例えば、多能性幹細胞又は分化細胞を誘導するのに効率的な小分子を同定するのに使用され得る。
一実施形態において、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤は、抗体若しくはその抗原結合断片、又は抗体試薬である。本明細書において使用される際、「抗体試薬」という用語は、所与の抗原に特異的に結合する、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体又は抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。態様のいずれかのある実施形態において、抗体試薬は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略記される）、及び軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略記される）を含み得る。別の例において、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。「抗体試薬」という用語は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂ及びｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲ、及びドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、全体が参照により本明細書に援用される、ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；２６（３）：６２９−３９を参照））並びに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭ（並びにそのサブタイプ及び組合せ）の構造的特徴を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット、及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）及び霊長類化抗体を含む任意の源に由来し得る。抗体は、ミディボディ、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ）、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含む。
ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存的な、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と呼ばれる領域を散在させた、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得る。フレームワーク領域及びＣＤＲの程度は、正確に定義されている（全体が参照により本明細書に援用される、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１−３２４２、及びＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照）。各ＶＨ及びＶＬは、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲ：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４から構成される。
ある実施形態において、本明細書に記載される薬剤（例えばＳＩＲＴ１、又はＳＩＲＴ２）として使用するための核酸が、核酸の送達及び／又は発現のためのベクターに含まれる。
一実施形態において、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本明細書において使用される際、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、マイクロＲＮＡのものなどの、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列に対して相補的な合成された核酸配列を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的に、標的に結合し、転写、翻訳、又はスプライシングのレベルにおける発現を停止することによって、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的の発現をブロックするように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞条件下で、遺伝子、例えば、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２にハイブリダイズするように設計された相補的な核酸配列である。したがって、標的に対して十分に相補的である、すなわち、所望の効果を得るために、細胞環境に関して十分な特異性で、十分によくハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択される。
一実施形態において、薬剤は、ＲＮＡ阻害によって、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御する。所与の遺伝子の発現の阻害剤は、阻害性核酸であり得る。一実施形態において、阻害性核酸は、阻害性ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）である。ＲＮＡｉは、一本鎖又は二本鎖であり得る。
ｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又は人工ｍｉＲＮＡであり得る。一実施形態において、本明細書に記載されるｉＲＮＡは、標的、例えばＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２の発現及び／又は活性の阻害をもたらす。一実施形態において、薬剤は、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御するｓｉＲＮＡである。一実施形態において、薬剤は、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御するｓｈＲＮＡである。
当業者は、例えば、公的に入手可能な設計ツールを用いて、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を標的にするようにｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを設計することができる。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｙｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）又はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの企業によって一般的に商業的に作製される。当業者は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを、細胞中にトランスフェクトし、コードされたタンパク質についてのウエスタンブロット法によって細胞内の遺伝子の発現レベルを検出することによって、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡが、その下方制御のために、例えば、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を有効に標的にするかどうかを容易に評価することができる。
一実施形態において、ｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡであり得る。ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡが使用されることになる条件下で二本鎖構造を形成するようにハイブリダイズするのに十分に相補的な２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して、実質的に相補的な、及びほぼ完全に相補的な、相補性領域を含む。標的配列は、標的の発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来し得る。他方の鎖（センス鎖）は、２つの鎖がハイブリダイズして、好適な条件下で組み合わされたときに二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖に対して相補的な領域を含む。
ｉＲＮＡのＲＮＡは、安定性又は他の有益な特徴を促進するように化学修飾され得る。本発明で取り上げられる核酸は、参照により本明細書に援用される、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているものなどの、当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。
マイクロＲＮＡ
一実施形態において、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤は、ｍｉＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、２２ヌクレオチドの平均長さを有する小さいノンコーディングＲＮＡである。これらの分子は、通常、３’非翻訳（３’ＵＴＲ）領域において、ｍＲＮＡ分子内の相補的な配列に結合し、それによって、標的ｍＲＮＡ分解又は阻害されたｍＲＮＡ翻訳を促進することによって作用する。マイクロＲＮＡとｍＲＮＡとの間の相互作用は、「シード配列」として知られているもの、不完全なワトソン・クリック型塩基対合によって、ｍＲＮＡへの配列特異的結合を指令するマイクロＲＮＡの６−８−ヌクレオチド領域によって媒介される。９００を超えるマイクロＲＮＡが、哺乳動物において発現されることが知られている。これらの多くは、それらのシード配列に基づいてファミリーに分類され、それによって、類似のマイクロＲＮＡの「クラスター」を同定し得る。ｍｉＲＮＡは、例えば、裸のＤＮＡとして、細胞において発現され得る。ｍｉＲＮＡは、例えば、裸のＤＮＡとして、細胞において発現される核酸によってコードされ得るか、又はベクター内に含まれる核酸によってコードされ得る。
一実施形態において、ＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤は、ｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐである。ｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐは、ｍｉＲＮＡ−２００ｃの成熟産物である。ｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐ配列は、いくつかの種、例えば、ヒトｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐ、例えば、ｍｉＲＢａｓｅ受託番号ＭＩＭＡＴ０００４６５７について知られている。ヒトｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐは、ＣＧＵＣＵＵＡＣＣＣＡＧＣＡＧＵＧＵＵＵＧＧ（配列番号１）の配列を含む。ｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐは、ヒトｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐ（その天然変異体、分子、及び対立遺伝子を含む）を指し得る。
一実施形態において、薬剤、例えば、ｍｉＲＮＡは、配列番号１の配列に対応する配列を有するか；又は配列番号１の配列を含むか；又は配列番号１の配列に対する少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは少なくとも１００％の配列同一性を有し、且つ配列番号１の配列と同じ活性を有する（例えば、ＳＩＲＴ２を下方制御し、多能性状態を誘導する）配列を含む。
様々な他のマイクロＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ−３０２、及び−３６７として）は、リプログラミング因子との相乗作用を有することが示されている。これらの１つ以上はまた、本明細書に記載される方法において、脱分化を誘導するために細胞に送達され得る。ｍｉＲ−３０２／３６７クラスターは、８つのマイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−３６７、３０２ｄ、３０２ｃ−５ｐ、３０２ｃ−３ｐ、３０２ａ−５ｐ、３０２ａ−３ｐ、３０２ｂ−５ｐ及び３０２ｂ−３ｐを含有する。ｍｉＲ３０２ａ−ｄは、同じシード配列、ＡＡＧＵＧＣＵ（配列番号２００）を含有する。ｍｉＲ−３０２／３６７クラスターメンバーは、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の多能性、自己複製及びリプログラミングなどの、多様な生物学的過程において重要な役割を果たすことが実証されている。ｍｉＲ−２００クラスターは、ｍｉＲ−２００ａ、ｍｉＲ−２００ｂ、ｍｉＲ−２００ｃ、ｍｉＲ−１４１及びｍｉＲ−４２９を含むマイクロＲＮＡのファミリーである。一実施形態において、本明細書に記載される方法は、ｍｉＲＮＡ−２００ｃ−５ｐ以外のｍｉＲＮＡ−２００クラスターのメンバーを包含／送達しない。
本明細書に記載される様々な実施形態において、記載される特定のポリペプチドのいずれかの変異体（天然又はその他）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に修飾された変異体、及び／又は保存的置換変異体が包含されることがさらに考えられる。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列における単一のアミノ酸又は小さいパーセンテージのアミノ酸を改変する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質配列に対する個々の置換、欠失又は付加が、「保存的に修飾された変異体」であることを認識し、ここで、改変は、化学的に類似したアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらし、ポリペプチドの所望の活性を保持する。このような保存的に修飾された変異体は、本開示と適合する多型変異体、種間ホモログ、及び対立遺伝子に追加され、それらを除外しない。
所与のアミノ酸が、類似の生理化学的特性を有する残基によって置換され得、例えば、１つの脂肪族残基を別のものと置換する（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａなどが互いに対して）、又は１つの極性残基を別のものと置換する（Ｌｙｓ及びＡｒｇ；Ｇｌｕ及びＡｓｐ；又はＧｌｎ及びＡｓｎの間など）。他のこのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有する全領域の置換が周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドが、天然又は基準ポリペプチドの所望の活性、例えば、リガンドに媒介される受容体活性及び特異性が保持されることを確認するために、本明細書に記載されるアッセイのいずれか１つにおいて試験され得る。
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似性にしたがって分類され得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５）において）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。あるいは、天然の残基が、共通の側鎖特性に基づいてグループ分けされ得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。具体的な保存的置換としては、例えば；ＡｌａをＧｌｙ若しくはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎ若しくはＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａ若しくはＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎ若しくはＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕ若しくはＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅ若しくはＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ若しくはＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ若しくはＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ若しくはＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；及び／又はＰｈｅをＶａｌ、Ｉｌｅ若しくはＬｅｕへの保存的置換が挙げられる。
ある実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチド（又はこのようなポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載されるアミノ酸配列の１つの機能的断片であり得る。本明細書において使用される際、「機能的断片」は、当該技術分野において公知の又は本明細書において後述されるアッセイにしたがって、野生型の基準ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持するペプチドの断片又はセグメントである。機能的断片は、本明細書に開示される配列の保存的置換を含み得る。
ある実施形態において、本明細書に記載されるポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチド又は分子の変異体であり得る。ある実施形態において、変異体は、保存的に修飾された変異体である。保存的置換変異体は、例えば、天然ヌクレオチド配列の突然変異によって得られる。本明細書において言及される「変異体」は、天然又は基準ポリペプチドに対して実質的に相同であるが、１つ以上の欠失、挿入又は置換のため、天然又は基準ポリペプチドのものと異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は基準ＤＮＡ配列と比較したときに、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失、又は置換を含むが、非変異体ポリペプチドの活性を保持する変異体タンパク質又はその断片をコードする配列を包含する。様々なＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発手法が、当該技術分野において公知であり、当業者によって適用され得る。
変異体アミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は基準配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であり得る。天然配列と突然変異配列との間の相同性の程度（同一性パーセント）は、例えば、ワールドワイドウェブ上でこのために一般的に用いられる自由に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、デフォルト設定を有するＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎ）を用いて２つの配列を比較することによって決定され得る。
天然アミノ酸配列の改変は、当該技術分野において公知のいくつかの技術のいずれかによって達成され得る。突然変異は、例えば、特定の遺伝子座において、天然配列の断片へのライゲーションを許容する制限部位によって隣接される、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって導入され得る。ライゲーションの後、得られる再構成された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠失を有する類似体をコードする。あるいは、オリゴヌクレオチド指向型部位特異的突然変異誘発手順は、必要とされる置換、欠失、又は挿入にしたがって改変された特定のコドンを有する改変されたヌクレオチド配列を提供するために用いられ得る。このような改変を作製するための技術は、十分に確立されており、例えば、Ｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ４２：１３３、１９８６）；Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号明細書及び同第４，７３７，４６２号明細書（これらは、全体が参照により本明細書に援用される）によって開示されるものを含む。ポリペプチドの適切な配座を維持するのに関与していないいずれのシステイン残基も、一般にセリンで置換されて、分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合が、ポリペプチドに加えられて、その安定性を向上させ、又はオリゴマー化を促進することができる。
薬剤の送達
本明細書に記載される方法及び組成物において、薬剤は、それが細胞に対して意図される効果を発揮し得るように細胞と接触される。一実施形態において、薬剤は、単に、細胞の外部と相互作用することによって（例えば、受容体に結合することによって）細胞に対してその効果を発揮する。細胞に内部で作用する薬剤（例えば、ＲＮＡｉ又はコードされたタンパク質）は、（例えば、適切な細胞内の位置への細胞取り込み及び送達を促進する製剤中で）細胞と接触されるとき、細胞によって容易に取り込まれる形態で送達され得る。一実施形態において、薬剤は、それがその効果を発揮し得るように細胞によってそれが容易に取り込まれる製剤中にある。一実施形態において、薬剤は、培地に適用され、ここで、薬剤は、細胞（前駆細胞及び／又はフィーダー細胞など）と接触し、その調節効果をもたらす。
薬剤は、ＲＮＡｉ分子（例えばｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ）などにより、標的遺伝子（例えば、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２）の遺伝子サイレンシングをもたらし得る。これは、薬剤の存在なしの細胞に見られるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％だけ、標的についての細胞内のｍＲＮＡレベルの減少を伴う。好ましい一実施形態において、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％だけ減少される。
本明細書において使用される際、「送達」は、有効量の、例えば、細胞又はその集団に入り、適切に機能する薬剤、例えば、薬剤を適切に発現する機能性タンパク質又はベクターの送達を指す。送達は、当該技術分野において公知の任意の技術を用いて行われ得る。例示的な技術としては、限定はされないが、形質導入、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、直接注入、又はトランスフェクションが挙げられる。薬剤（例えば、ＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２をコードするベクター、又はＳＩＲＴ１若しくはＳＩＲＴ２の小分子阻害剤）の有効な送達は、例えば、それぞれウエスタンブロット法又はｑＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質又はｍＲＮＡレベルを測定することによって評価され得る。薬剤の有効な送達は、薬剤の目的とする標的の生物学的機能を評価することによってさらに測定され得る。
一実施形態において、薬剤は、薬剤を含む培地中で細胞を培養することによって、細胞に送達される。１つ以上の薬剤とともに細胞の集団を培養することは、様々な方法で達成され得る。例えば、細胞、例えば、体細胞又は非胚細胞の集団が、１つ以上の薬剤と接触され得る。体細胞又は非胚細胞は、所定の期間、例えば７日間以上にわたってこれらの薬剤の存在下で培養され得る。２つ以上の薬剤（例えば、ＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤、及びＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤）が、細胞の集団と接触される場合、細胞が薬剤に同時に曝されるように、薬剤は、細胞培養培地中で一緒に存在し得る。あるいは、薬剤は、細胞培養培地に連続的に加えられ得る。例えば、異なる薬剤が、培養期間中の異なる時点で培養培地に加えられるように、例えば、１つ以上の薬剤は、特定の投与計画にしたがって、培養物中で細胞の集団に加えられ得る。
最適な送達方法は、薬剤のタイプに基づいて変化し得、当業者によって決定され得ることが理解される。
特定の細胞運命の細胞集団の同定
本発明の一態様は、誘導される集団から多能性幹細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ１の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ２の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法に関する。一実施形態において、候補細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて誘導された。別の実施形態において、候補細胞は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて誘導された。
一実施形態において、ＳＩＲＴ１のレベル及び／又は活性は、適切な対照と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍若しくはそれ以上だけ、又は適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％若しくはそれ以上だけ増加され、ＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％だけ減少される。本明細書において使用される際、「適切な対照」は、人工多能性細胞でない、同様又は同一に処理された細胞又はその集団を指す。適切な対照は、多能性状態に誘導されていない同一の細胞集団、例えば、薬剤又はリプログラミング因子によって接触されていない細胞集団であり得る。
本明細書に記載される本発明の別の態様は、誘導される集団から分化細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ２の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ１の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法を提供する。一実施形態において、候補細胞は、本明細書に記載される方法のいずれかを用いて誘導される。別の実施形態において、候補細胞は、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて誘導される。
一実施形態において、ＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性は、適切な対照と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍若しくはそれ以上だけ、又は適切な対照と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％若しくはそれ以上だけ増加され、ＳＩＲＴ１のレベル及び／又は活性は、適切な対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％だけ減少される。本明細書において使用される際、「適切な対照」は、天然又は人工のいずれかの幹細胞又はその集団であり得る。適切な対照は、分化されるように誘導されていない同一の幹細胞集団、例えば、薬剤又は分化因子によって接触されていないが、それ以外は同一に処理された細胞集団であり得る。
一実施形態において、ＳＩＲＴ１及び／又はＳＩＲＴ２のレベルは、細胞内のＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２タンパク質を検出する試薬（例えば、抗体試薬）を用いた免疫蛍光によって測定される。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）は、所与のＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２発現レベルを有する細胞を選択するのに使用され得る。あるいは、ＳＩＲＴ１及び／又はＳＩＲＴ２のレベルは、例えば、それぞれウエスタンブロット法又はＰＣＲベースのスクリーニング（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって、例えば、細胞内のタンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルを評価することによって測定され得る。ＳＩＲＴ１及び／又はＳＩＲＴ２の活性は、例えば、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２基質がアセチル化されているかどうかを決定することによって、例えば、機能アッセイによって評価され得る。
一態様において、本発明は、本発明に必須であるものとして本明細書に記載される組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素に関するが、必須であるか否かにかかわらず、指定されていない要素の包含を許容する（「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ））。ある実施形態において、組成物、方法又はそのそれぞれの構成要素の説明に含まれるべき他の要素が、本発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を与えないものに限定される（「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」）。これは、記載される方法内の工程並びに組成物及びその構成要素に同等に適用される。他の実施形態において、本明細書に記載される、本発明、組成物、方法、及びそのそれぞれの構成要素は、構成要素、組成物又は方法に必須の要素であると見なされないいずれの要素も除外することが意図される（「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」）。
特定される全ての特許、特許出願、及び刊行物は、例えば、本発明とともに使用され得る、このような刊行物中に記載される方法を説明及び開示するために、参照により本明細書に明示的に援用される。これらの刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示内容についてのみ提供される。これに関して、本発明者らが、先行発明によって又は任意の他の理由のために、このような開示に先行する権利がないことを認めるものと何も解釈されるべきではない。これらの文献の日付に関する全ての記載又は内容に関する表現は、本出願人に入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付又は内容の正確性に関するいかなる承認をなすものでもない。
本明細書に記載される技術のある実施形態は、以下の番号付けられた段落のいずれかにしたがって定義され得る。
１．人工ヒト多能性幹細胞を生成するための方法であって、体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の１つ以上のリプログラミング因子及びさらにＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの人工ヒト多能性幹細胞を生成するのに十分な期間にわたって体細胞又は非胚細胞集団を培養することを含む方法。
２．体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の、ＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤を送達することをさらに含む、段落１に記載の方法。
３．リプログラミング因子が、細胞内のｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、又はＫｌｆ４の発現を増加させる薬剤である、段落１又は２に記載の方法。
４．リプログラミング因子が、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（「ＳＶ４０ＬＴ」）、又はｐ５３を標的にする短ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ−ｐ５３」）の発現を増加させる薬剤である、段落１〜３に記載の方法。
５．ＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡｉからなる群から選択される、段落１〜３のいずれかに記載の方法。
６．ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである、段落５に記載の方法。
７．マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐである、段落６に記載の方法。
８．ＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤が、小分子、ペプチド、及びＳＩＲＴ１をコードする発現ベクターからなる群から選択される、段落２〜７のいずれか１つに記載の方法。
９．ｍｉＲ−３０２／３６７クラスターから選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを細胞に送達することをさらに含む、段落１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．送達が、細胞集団を、薬剤又は薬剤をコードするベクターと接触させることを含む、段落１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．送達が、形質導入、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、直接注入、及び／又はトランスフェクションを含む、段落１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．ベクターが、非組み込み型又は組み込み型である、段落１０に記載の方法。
１３．非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、ＥＢＮＡ１ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型ＲＮＡ、及びセンダイウイルスからなる群から選択される、段落１２に記載の方法。
１４．ベクターが、エピソームベクターである、段落１０〜１２に記載の方法。
１５．ベクターが、レンチウイルスベクターである、段落１０に記載の方法。
１６．培養が、７〜２１日間の期間にわたる、段落１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．ＳＩＲＴ２が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％下方制御される、段落１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．ＳＩＲＴ１が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍上方制御される、段落１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．適切な対照と比較して、人工多能性幹細胞の数の少なくとも２倍の増強がもたらされる、段落１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．段落１〜１９のいずれか１つに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞を含む細胞株。
２１．段落１〜１９のいずれか１つに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞又はその集団と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
２２．分化細胞を生成するための方法であって、多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの分化細胞を生成するのに十分な期間にわたって、分化条件下でこの集団を培養することを含む方法。
２３．多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤を送達することをさらに含む、段落２２に記載の方法。
２４．多能性細胞集団が、胚性幹細胞集団、成体幹細胞集団、人工多能性幹細胞集団、及び癌幹細胞集団からなる群から選択される、段落２２又は２３に記載の方法。
２５．ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡｉからなる群から選択される、段落２３又は２４に記載の方法。
２６．ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである、段落２５に記載の方法。
２７．ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤が、小分子、ペプチド、及びＳＩＲＴ２をコードする発現ベクターからなる群から選択される、段落２２〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．送達が、細胞集団を、薬剤をコードするベクターと接触させることを含む、段落２２〜２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．送達が、形質導入、ヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロポレーション、直接注入、及び／又はトランスフェクションを含む、段落２８に記載の方法。
３０．ベクターが、非組み込み型又は組み込み型である、段落２８に記載の方法。
３１．非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、ＥＢＮＡ１ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型ＲＮＡ、及びセンダイウイルスからなる群から選択される、段落３０に記載の方法。
３２．ベクターが、エピソームベクターである、段落２８〜３０のいずれかに記載の方法。
３３．ベクターが、レンチウイルスベクターである、段落２８に記載の方法。
３４．培養が、７〜３００日間の期間にわたる、段落２２〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．ＳＩＲＴ１が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％下方制御される、段落２２〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３６．ＳＩＲＴ２が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍上方制御される、段落２３〜３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．適切な対照と比較して分化細胞の数の少なくとも２倍の増強がもたらされる、段落２３〜３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．分化細胞が、適切な対照と比較して、有意に短い期間で生成される、段落２３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．分化条件が、神経細胞を生成するための神経分化に特異的である、段落２２〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．段落２２〜３９のいずれか１つに記載の方法によって生成される分化細胞を含む細胞株。
４１．誘導される集団から多能性幹細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ１の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ２の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法。
４２．ＳＩＲＴ１のレベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍増加される、段落４１に記載の方法。
４３．ＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％減少される、段落４１に記載の方法。
４４．候補細胞が、段落１〜２１のいずれかに記載の方法によって誘導される、段落４１に記載の方法。
４５．誘導される集団から分化細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ２の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ１の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法。
４６．ＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍増加される、段落４５に記載の方法。
４７．ＳＩＲＴ１のレベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％減少される、段落４５に記載の方法。
４８．候補細胞が、段落５０〜５３のいずれかに記載の方法によって分化される、段落４５に記載の方法。
４９．測定が、免疫蛍光によって行われる、段落４１又は４５に記載の方法。
癌細胞の特徴は、「Ｗａｒｂｕｒｇ効果」と呼ばれる現象である、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）から解糖への代謝の切り替えであり、これはまた、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）などのプライミングされたヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）においても観察される。ＳＩＲＴ２の下方制御及びＳＩＲＴ１の上方制御が、プライミングされたｈＰＳＣの分子署名であり、多能性の誘導を大いに調節することが、本明細書において報告される。ＳＩＲＴ２下方制御は、解糖経路の酵素（例えば、アルドラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、及びエノラーゼ）の高アセチル化及びそれらの向上した活性をもたらし、これは、ＳＩＲＴ２が、多能性の誘導中に代謝リプログラミングを大いに調節することを示す。このモデルの裏付けとして、ヒト線維芽細胞におけるＳＩＲＴ２のノックダウンが、リプログラミング因子の非存在下及び存在下の両方で、有意に減少したＯＸＰＨＯＳ及び増加した解糖をもたらした。アルドラーゼリシン残基３２２を、ＳＩＲＴ２の脱アセチル化がアルドラーゼ活性を確実に下方制御する重要なアセチル化部位として本明細書において同定した。さらに、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐがＳＩＲＴ２を特異的に標的にし、コード配列内に存在すると同定された２つのｍｉＲＮＡ応答要素によってその発現を下方制御することが分かった。さらに、ｈＥＳＣにおけるドキシサイクリン誘導性ＳＩＲＴ２過剰発現は、エネルギー代謝に有意に影響を与えて、多能性分化特性などの幹細胞機能を改変した。総合すると、本明細書に記載される実験データは、少なくとも、部分的に、ヒトの多能性の誘導中の解糖酵素アセチル化及び活性、並びに多能性幹細胞機能の調節によって、代謝リプログラミング（Ｗａｒｂｕｒｇ様効果）の主要調節因子としてｍｉＲ−２００ｃ−ＳＩＲＴ２軸を同定する。
導入部
最近のプロテオミクス研究は、細胞代謝の多様な局面に関与する核、細胞質、及びミトコンドリアの多くのタンパク質が、ヒト、マウス、及び原核細胞において高アセチル化されることを明らかにした１４〜１６。特に、解糖及びトリカルボン酸（ＴＣＡ）回路に関与する実質的に全ての酵素が、ヒト肝組織においてアセチル化されていることが分かり１５、これは、タンパク質アセチル化が、代謝を調節する主要な機構であることを強く裏付けるものであり１７、これにより、タンパク質アセチル化が、少なくとも部分的に、代謝リプログラミングを調節するという仮説が強化される。タンパク質アセチル化は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、並びにクラスＩ、ＩＩ、及びＩＩＩヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）によって調節され得る。これらの中でも、サーチュインと呼ばれるクラスＩＩＩＨＤＡＣは、細菌からヒトへと高度に保存されるＮＡＤ依存性タンパク質デアセチラーゼである１８、１９。サーチュインは、その活性が、細胞代謝の重要な補因子であるＮＡＤに依存する唯一のＨＤＡＣであるため、特定のサーチュインメンバーが、代謝リプログラミングを調節するのに重要な役割を果たし、多能性の誘導及び幹細胞の運命の制御に関連する可能性が高いという仮説がさらに立てられた。本明細書に示される実験データは、ＳＩＲＴ２下方制御による解糖酵素のアセチル化レベルの改変が、ヒトの多能性の誘導中に代謝リプログラミングを大いに調節し、プライミングされたｈＰＳＣにおける幹細胞機能及び調節に影響を与えることを示す。
結果
ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおけるＷａｒｂｕｒｇ様効果
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）とそれらの体細胞同等物との間でエネルギー代謝を比較するために、誘導性レンチウイルスを用いて４つのリプログラミング遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４）を導入することによって、ヒトｉＰＳＣを、新生児皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）から誘導し、得られるｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣにおいて基準多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１−６０、及びＳＳＥＡ４）の安定した発現を確認した（図１２Ａ）。さらに、これらのｈｉＰＳＣ及びｈＥＳＣは、大きい核及びわずかな細胞質などのほぼ同一のモルフォロジーを示し、３つ全ての胚葉への多能性分化を示した（図１２Ｂ及び１２Ｃ）。細胞内ＡＴＰレベルは、線維芽細胞と比較して、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣにおいて有意に低かった（図１２Ｄ）。代謝パラメータを、酸素消費速度（ＯＣＲ）として定義されるミトコンドリア呼吸レベルを比較することによって、Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｆｌｕｘ分析装置を用いてアッセイした２０。ＡＴＰシンターゼの阻害剤であるオリゴマイシンで細胞を処理したとき、ＯＣＲは、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣより線維芽細胞においてより効率的に低下した（図１２Ｅ）。酸素消費を最大にする脱共役試薬であるトリフルオロカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）を加えることにより、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣより線維芽細胞において有意に高いＯＣＲがもたらされ、これは、線維芽細胞におけるより高い最大呼吸能を示し（図１２Ｅ）、これは、複合体Ｉの阻害剤であるロテノンの添加によってほぼ完全にブロックされた。Ｗａｒｂｕｒｇ効果は、癌細胞におけるグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ）の上方制御による増加したグルコース取り込みに密接に関連しているため２１、ＧＬＵＴ遺伝子の発現レベルを比較した。図１２Ｆに示されるように、ＧＬＵＴ１−４ ｍＲＮＡのレベルが、線維芽細胞と比較して、ｉＰＳＣ及びｈＥＳＣの両方において有意に上方制御された。総合すると、これらの結果は、過去の知見１１、１３、２２、２３と一致して、Ｗａｒｂｕｒｇ様効果がプライミングされたｈＰＳＣにおいて機能することを実証している。
解糖酵素は、ｈＰＳＣにおいて高アセチル化される。
アセチル化の調節が、代謝の切り替えに影響を与えるという仮説に対処するために、ｈＥＳＣ及び皮膚線維芽細胞におけるタンパク質アセチル化を比較した。アセチル化タンパク質を、アセチル−Ｌｙｓ抗体を用いて免疫沈降によってプルダウンし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びゲル内トリプシン消化の後、それらを液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法に供した（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（図１２Ｇ）。このプロテオーム分析は、ｈＤＦ及びｈＥＳＣの両方において２００を超えるアセチル化タンパク質を同定した。非特異性を最小限に抑えるために、１０未満のペプチドヒットを有するタンパク質を除外し（図１Ａ）、これは、高度にストリンジェントなＩＤ基準を表す（９５％を超えるペプチド又はタンパク質確率、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ４における除外スペクトルカウントオプション（Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｃｏｕｎｔ ｏｐｔｉｏｎ）；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｏｍｅｓｏｆｔｗａｒｅ．ｃｏｍ／においてワールドワイドウェブ上で見られる）。図１Ａ中のグラフは、このプロテオーム分析を示し、ここで、ｈＥＳＣ又はｈＤＦにおいてより高いアセチル化（＞１．５倍）を有するタンパク質が示される。合計２８のタンパク質が、線維芽細胞と比較してｈＥＳＣにおいて、高アセチル化されており（表２）、合計１５のタンパク質が高アセチル化されていることが分かった（表３）。２つの十分に特徴付けられたＳＩＲＴ２基質、チューブリンα／β及び１４−３−３は、ｈＥＳＣにおける高アセチル化タンパク質の中の１つである２４、２５。これらの結果と一致して、ウエスタンブロット分析は、ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣが、ｈＤＦより高いレベルのアセチル化ａ−チューブリンを含有する一方、それらが、同様のレベルの総ａ−チューブリンを発現することを確認した（図１Ａ、嵌め込み図）。特に、この分析は、１０のうち５つの解糖酵素が、ｈＥＳＣにおいて高アセチル化されることを示した：アルドラーゼ（ＡＬＤＯＡによってコードされる）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨによってコードされる）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１によってコードされる）、エノラーゼ（ＥＮＯ１によってコードされる）、及びピルビン酸キナーゼ（ＰＫＭ１によってコードされる）（表２）。これらの解糖タンパク質に由来するアセチル化ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）スペクトルが、図１３に示される。
ＳＩＲＴ２の下方制御及びＳＩＲＴ１の上方制御が、プライミングされたｈＰＳＣの分子署名である。
次に、ＨＡＴ又はＨＤＡＣなどの任意のアセチル化調節因子が、ウェブベースのマイクロアレイデータベースのメタ分析によって、それらの同等物体細胞組織と比較してｈＰＳＣにおいて独自の発現パターンを示すかどうかを決定した。ｈＥＳＣ及び／又はｈｉＰＳＣの５つの独立した試験（ＧＳＥ２８６３３２６、ＧＳＥ１８２６５２７、ＧＳＥ２００１３２８、ＧＳＥ３９１４４（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ３９１４４においてワールドワイドウェブ上で見られる）、及びＧＳＥ９７０９２９）を、様々な組の分化細胞型（例えば、包皮線維芽細胞、ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣに由来する神経分化細胞、又は内皮細胞）に対して分析した。マイクロアレイデータセットを、ＧＥＯ２Ｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｇｅｏ２ｒ／においてワールドワイドウェブ上で見られる）を用いて分析して、発現が、それらの分化した同等物と比較してｈＰＳＣにおいて有意に異なるアセチル化調節因子を同定した１１。ｍＲＮＡ転写産物に対応する、４０，０００〜５０，０００のプライマーのうち、上位２０％のｍＲＮＡ転写産物のみを、ｐ値に基づいて、有意性を確認するためのカットオフ範囲として選択した。所与のデータベースにおける各遺伝子発現を、遺伝子発現変化を決定するために、ｈＰＳＣの複数の群にわたってさらにモニターした。アセチルトランスフェラーゼの発現が、ｈＰＳＣにおいて一貫して改変されるかどうかがまず決定されるが、５つ全てのメタ分析試験のいずれにおいても見出すことができなかった（表４）。全ての公知のデアセチラーゼを次に分析した；１１つのＨＤＡＣ（ＨＤＡＣ Ｉ、ＩＩ、及びＩＶに属する）及び７つのＳＩＲＴ（ＨＤＡＣ ＩＩＩに属する）。意外なことに、ＳＩＲＴ２は、複数の組のｈＰＳＣを用いて、５つ全ての独立したメタ分析において独自に及び一貫して下方制御されることが分かった（図１４Ａ及び１４Ｂ及び表５）。さらに、ＳＩＲＴ１が、４つのメタ分析においてｈＰＳＣにおいて上方制御される。さらに、別のウェブベースのデータベース分析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｎｅｘｔｂｉｏ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上で見られる）を用いて、ＳＩＲＴ２遺伝子発現の下方制御及びＳＩＲＴ１の上方制御が、１５のヒト体細胞と比較して２５のｈＥＳＣにおいて例外なく観察された（図１Ｂ及び表６）。対照的に、他のサーチュイン（ＳＩＲＴ３〜７）の発現レベルは、ｈＥＳＣ系列と体細胞との間で可変であった（図１４Ｃ〜１４Ｇ）。特定の理論に制約されることは意図されないが、これらの知見は、ＳＩＲＴ１及び／又は２による代謝酵素のアセチル化の改変が、代謝リプログラミング及び多能性幹細胞機能において重要な役割を果たすという仮説を強化した。これを試験するために、それらの遺伝子発現を、体細胞リプログラミング及びインビトロ分化中に調べた。図１Ｃ及び１Ｄに示されるように、ＳＩＲＴ２発現（ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方）が、著しく下方制御された一方、ＳＩＲＴ１発現は、線維芽細胞と比較してｈＰＳＣにおいて上方制御され、これは、多能性の誘導が、ＳＩＲＴ１誘導及びＳＩＲＴ２抑制に伴うことを示す。対照的に、自然発生的なインビトロ分化中、ＳＩＲＴ２発現が、高度に上方制御された一方、ＳＩＲＴ１発現が、多能性マーカーＯｃｔ４及びＳｏｘ２とともに下方制御された（図１Ｅ）。さらに、Ｔｕｊ １（ＴＵＢＢ３：チューブリンβ ３からコードされる）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、及び転写因子Ｌｍｘｌｂ（図１Ｆ及び１Ｇ）の発現の大幅な増加（これには、ＳＩＲＴ１、Ｏｃｔ４及びＮａｎｏｇ（図１Ｈ及び１Ｉ）の発現の確実な減少が伴う）によって明らかなように、ＳＩＲＴ２は、中脳ドーパミンニューロンへのｈＥＳＣの系列特異的インビトロ分化中に確実に上方制御された（図１Ｇ及び１Ｉ）。
ｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ２ノックダウンの機能的効果
解糖酵素（例えば、アルドラーゼ（ＡＬＤＯＡ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ１）、エノラーゼ（ＥＮＯ１）、及びピルビン酸キナーゼ）が、高アセチル化され、デアセチラーゼＳＩＲＴ２が、ｈＥＳＣにおいて確実に下方制御されるため、理論に制約されるのを望むものではないが、ＳＩＲＴ２下方制御が、それらの高アセチル化に関与し、Ｗａｒｂｕｒｇ様効果に直接寄与するという仮説が立てられた。これに対処するために、安定したｈＥＳＣ系列をまず生成し、ｈＥＳＣ系列において、ＳＩＲＴ２及びＥＧＦＰの発現が、レンチウイルスベクターを用いてドキシサイクリン（Ｄｏｘ）によって誘導され得る（図２Ａ及び１５Ａ）。正常なｈＥＳＣ培養条件下で、このｈＥＳＣ系列（Ｈ９−ＳＩＲＴ２ＯＥ）は、Ｄｏｘ処理あり又はなしで、野生型ｈＥＳＣ（Ｈ９）と同じモルフォロジーを示した（図２Ａ）。しかしながら、それらの自己複製及び多能性分化機能を、本明細書において後述されるように改変した。これらの解糖タンパク質のアセチル化及び酵素活性に対する改変されたＳＩＲＴ２発現の影響を調べるために、各解糖タンパク質を、それらのそれぞれの特異的抗体を用いた免疫沈降によってプルダウンし、ウエスタンブロット法を、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体を用いて行った。図２Ｂに示されるように、ｈＥＳＣにおけるＳＩＲＴ２の強制発現は、試験される４つ全ての酵素（アルドラーゼ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、及びＧＡＰＤＨ）を顕著に脱アセチル化した。タンパク質を、アセチル−Ｌｙｓ抗体を用いてまず免疫沈降した後、各タンパク質に対する特異的抗体を用いたウエスタンブロット法を行ったとき、同じパターンが観察された（図２Ｃ）。これらの酵素の改変されたアセチル化レベルと対照的に、それらの総タンパク質（インプット；図２Ｂ及び２Ｃを参照）及びｍＲＮＡ（図１５Ｂ）の発現レベルは変化しなかった。ＰＫＭ１及び２は、これらのアイソフォームを区別することができる特異的抗体の欠如のため、ここでは分析することができなかった。アセチル化の改変がそれらの酵素活性に影響を与えるかどうかを次に評価した。図２Ｄに示されるように、ｈＥＳＣにおけるＳＩＲＴ２過剰発現（ＯＥ）による解糖酵素の脱アセチル化は、試験される３つ全ての酵素（アルドラーゼ、エノラーゼ、及びＧＡＰＤＨ）について酵素活性の有意な減少をもたらした一方、総タンパク質は変化されなかった（図２Ｂ及び２Ｃ）。意外なことに、ＳＩＲＴ２は、アルドラーゼ及びエノラーゼに結合したが（図２Ｅ）、ＰＧＫ１又はＧＡＰＤＨ（データは示されていない）に結合せず、これは、本明細書において使用される抗体のそれらのより弱い相互作用及び／又はより低い親和性に起因する可能性が高い。
次に、ｈＤＦにおける解糖酵素に対するＳＩＲＴ２ノックダウン（ＫＤ）の影響を、レンチウイルスＳＩＲＴ２ ｓｈＲＮＡを用いて調べた。各タンパク質を、特異的抗体を用いてプルダウンし、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体を用いたウエスタンブロット法によって検出した。アルドラーゼ、エノラーゼ、ＰＧＫ１及びＧＡＰＤＨのアセチル化レベルが、元の線維芽細胞又はモック対照と比較して、ＳＩＲＴ２ ＫＤ線維芽細胞において実質的に増加された一方、それらの総タンパク質の発現レベルは同様であった（図２Ｆ）。さらに、それらの酵素活性が、有意に増加され、これは、それらのアセチル化レベルと活性との間の直接の相関を示す（図２Ｇ）。ＳＩＲＴ２と対照的に、ｈＤＦにおけるＳＩＲＴ１ ＯＥは、これらの酵素のアセチル化レベルにも活性にも影響を与えなかった（データは示されていない）。
アセチル化がほとんどの代謝酵素を阻害することが一般に知られているため３４、本明細書に示される知見は意外である。したがって、特定のリシン残基を同定し、例としてアルドラーゼ（ＡｌｄｏＡ）を用いて、ＳＩＲＴ２によるそれらの脱アセチル化の機能的効果を分析することが求められた。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析法を用いて、合計６及び８つのＬｙｓ残基が、それぞれモック−及びＳＩＲＴ２ ＫＤ細胞において高アセチル化されることが分かった（図３Ａ及び３Ｂ）。興味深いことに、２つの残基（すなわち、Ｋ１１１及びＫ３２２）が、ＳＩＲＴ２ ＫＤ細胞において富化されるが、対照細胞においては富化されない。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるＫ１１１及び３２２におけるアセチル化ペプチドの代表的なスペクトルがそれぞれ、図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、及び１６Ｄに示される。アセチル化及び非アセチル化形態のＡｌｄｏＡペプチドは、十分に分離し、アセチル化形態のＡｌｄｏＡでは、アセチル基のため４２倍高いｍ／ｚ値が示された。タンパク質ｂｌａｓｔ検索（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉにおいてワールドワイドウェブ上に見られる）によれば、Ｋ１１１残基が触媒ドメイン／サブユニット間境界に属するが、Ｋ３２２残基は属さない（図３Ｃ）３５。したがって、Ｋ３２２残基は、まだ同定されていないドメインを表す。さらに、ＡｌｄｏＡの配列アラインメントは、Ｋ１１１及びＫ３２２が、多様な種の間で高度に保存されることを示した（図３Ｃ）。Ｋ１１１及び／又はＫ３２２がＳＩＲＴ２標的部位を表し、ＡｌｄｏＡを調節するために役割を果たすかどうかをさらに決定するために、それらのそれぞれを、グルタミン（Ｑ；アセチル化模倣体）又はアルギニン（Ｒ；脱アセチル化模倣体）に突然変異させ、それらの活性を調べた。Ｑへの、Ｋ１１１の突然変異ではなく、Ｋ３２２の突然変異が、ｈＤＦ及び２９３Ｔ細胞の両方において野生型と比較してＡｌｄｏＡの触媒活性を確実に増加させることが分かった（図３Ｄ及び１６Ｅ）。さらに、ＳＩＲＴ２ ＫＤは、野生型ＡｌｄｏＡ及びＫ１１１Ｒ突然変異体を著しく活性化したが、Ｋ３２２Ｒ突然変異体（図３Ｅ及び１６Ｆ）を活性化せず、これは、Ｋ３２２が、アセチル化の重要な部位であり、ＳＩＲＴ２によるその脱アセチル化が、その活性を有意に下方制御することを実証している。この結果は、ＳＩＲＴ２レベルが、アルドラーゼのアセチル化及び酵素活性を調節するという知見をさらに裏付ける（図２Ｂ〜２Ｇ）。特に、ＡｌｄｏＡ構造モデルは、Ｋ３２２が、ＡｌｄｏＡの外面に曝されることを示し、これは、ＳＩＲＴ２に結合するその利用可能性を示す（ヒトアルドラーゼＡの結晶構造モデル、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋコード：１ ＡＬＤ）（図３Ｆ）３６。総合すると、これらの知見は、ＳＩＲＴ２が、解糖酵素のアセチル化レベル及び酵素活性を直接制御し、代謝リプログラミングに寄与することを示す。
ＳＩＲＴ２発現レベルが、ｈＰＳＣの代謝、細胞生存、及び多能性分化機能に影響を与える。
次に、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を測定することによって、ＳＩＲＴ２レベルの改変が、ｈＰＳＣにおける解糖代謝に直接影響を与えることかどうかが決定された２８。実際に、ｈＥＳＣ細胞におけるＤｏｘ誘導性ＳＩＲＴ２ ＯＥは、対照細胞と比較して、ＥＣＡＲ、基礎解糖速度（０．７７±０．０７対１．２１±０．０４ｍｐＨ／分／μｇタンパク質）及び解糖能（１．０４±０．０８対１．８４±０．１１ｍｐＨ／分／ｖｇタンパク質）の低下をもたらした（図４Ａ及び４Ｂ）。さらに、ＯＣＲレベルが、対照細胞と比較して、ＳＩＲＴ２ ＯＥによって増加された（図１７Ｇ）。同じパターンが、Ｈ７ ｈＥＳＣ及び２つの独立したｉＰＳＣ系列（上述されるｉＰＳＣ系列（ｈｉＰＳＣ−１）及びＷｉＣｅｌｌ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのｉＰＳ−ＤＦ１９−９−１１Ｔ系列（ｈｉＰＳＣ−２））で観察された（図１７Ａ〜１７Ｇ）。興味深いことに、このＤｏｘ誘導性ＳＩＲＴ２ ＯＥは、非分化条件下で、多能性マーカー（例えば、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、及びＲｅｘｌ）の発現レベル（図１５Ｃ）又はｈＥＳＣのモルフォロジー（図２Ａ）を変化させなかった。しかしながら、ＳＩＲＴ２過剰発現ｈＰＳＣの増殖速度は、対照細胞と比較して、有意に低下された（図４Ａ及び１７Ｈ）。次に、蛍光ベースの競合アッセイを行った３７、３８。野生型Ｈ９ ｈＥＳＣ（ＷＴ）を、ＧＦＰ過剰発現Ｈ９細胞（ＧＦＰ）と１：１の比率で混合したとき、ＧＦＰ＋／全細胞の比率は、５回までの継代で、各継代で５０％を保っていた。対照的に、ＷＴ細胞を、ＧＦＰ過剰発現（ＧＦＰ）及びＳＩＲＴ２過剰発現Ｈ９細胞（ＳＩＲＴ２）と１：１の比率で混合したとき、ＧＦＰ＋ ＳＩＲＴ２過剰発現細胞の比率は、徐々に低下した（図４Ｄ）。この低下された増殖／自己複製能が、改変された自己複製自体、細胞老化、及び／又は細胞死によって引き起こされ得るため、次に、細胞集団を、アポトーシスの最初期のマーカーであるアネキシンＶの存在下で調べた。興味深いことに、ＳＩＲＴ２ ＯＥが、試験される４つ全てのｈＰＳＣ系列においてアポトーシス細胞の集団を有意に増加させたことが分かった（図４Ｅ及び３Ｆ）。さらに、活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内レベルが、ＳＩＲＴ２ ＯＥによって増加されたことが分かった（図４Ｇ及び４Ｈ）。さらに、ＳＩＲＴ２誘導性細胞死が、強力なＲＯＳスカベンジャーであるＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）による前処理によって助けられ、これは、誘導されるＳＩＲＴ２レベルが、ＲＯＳ依存性アポトーシス細胞死を引き起こし、増殖／自己複製能の低下をもたらし得ることを示す。
次に、分化の初期における代謝リプログラミングに対するＳＩＲＴ２ ＯＥの影響を調べた。多能性及び系列特異的初期マーカーについてのｍＲＮＡ発現パターンを調べた。さらに、解糖の主な代謝産物である細胞外ラクテートの産生を、Ｈ９ ｈＥＳＣのインビトロ分化中に測定した。図５Ａ〜５Ｃに示されるように、ＳＩＲＴ２発現は、Ｐａｘ６、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｂ−Ｔ）、及びＳｏｘ１７を含む初期分化マーカーとともに、分化後２日以内に顕著に上方制御された。さらに、ｈＰＳＣにおけるＥＣＡＲレベルが、インビトロ分化中に３日目の時点で早くも減少された一方、ラクテート産生は、インビトロ分化中に４日目の時点で有意に減少された（図５Ｄ及び５Ｅ）。意外なことに、インビトロ分化中のＨ９ ｈＥＳＣにおけるＤｏｘ誘導性ＳＩＲＴ２ ＯＥは、対照細胞と比較して、ＥＣＡＲ及び細胞外ラクテート産生の有意な減少をもたらした（図５Ｄ及び５Ｅ）。同じパターンが、ｈｉＰＳＣ−１系列で観察された（図１８Ａ〜１８Ｅ）。これらの知見は、ＳＩＲＴ２発現の改変が、ｈＰＳＣの初期分化過程中の代謝リプログラミングに直接影響を与えた後、ラクテート産生の有意な変化が続くという仮説を強く裏付ける。ＳＩＲＴ２発現レベルが、ｈＥＳＣの多能性分化能に影響を与えるかどうかをさらに決定するために、様々な系統マーカーについてのｍＲＮＡ又はタンパク質発現パターンを、自然発生的なインビトロ分化中に０、３、６、９又は１２日目（ＤＯ〜Ｄ１２）に調べた。意外なことに、Ｏｔｘ２（外胚葉マーカー）、Ｓｏｘ１７（内胚葉マーカー）、及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ（中胚葉マーカー）に対する抗体で染色することによって明らかなように、ＳＩＲＴ２過剰発現ｈＥＳＣが、３つ全ての胚葉系統へと、ＤｏｘなしのＷＴ及びＨ９−ＳＩＲＴ２より効率的に分化した（図５Ｆ）。さらに、３つ全ての胚葉の多様な系統マーカー遺伝子の発現レベルが、試験される全ての時点（Ｄ３〜Ｄ１２）で、ＤｏｘなしのＷＴ及びＳＩＲＴ２ ＯＥと比較して、ＳＩＲＴ２ ＯＥ ｈＥＳＣ系列（Ｈ９及びＨ７）並びにｈｉＰＳＣ系列（ｈｉＰＳＣ−１及びｈｉＰＳＣ−２）において著しく増加した（図５Ｇ及び１８Ｆ）。総合すると、本明細書に示される結果は、ｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ２レベルが、エネルギー代謝に直接影響を与え、ｈＰＳＣの生存及び多能性分化能を調節することを示す。
ＳＩＲＴ２の発現レベルが、ｈＤＦにおけるエネルギー代謝を調節し、リプログラミング過程に影響を与える。
次に、ＳＩＲＴ２発現の適切な調節が、代謝リプログラミングを調節することによる多能性の誘導にとって重要であるかどうかを評価した。このために、ＳＩＲＴ２発現の改変が線維芽細胞における代謝の切り替えを誘導するかどうかをまず決定した。実際に、線維芽細胞におけるＳＩＲＴ２ ＫＤは、対照細胞と比較して、減少したＯＣＲ及び増加したＥＣＡＲを含む有意な代謝変化をもたらした（図６Ａ及び６Ｂ）。さらに、対照と比較して、基礎呼吸、ＡＴＰターンオーバー、最大呼吸、及び酸化予備能の減少並びにＦＣＣＰ処理後のＯＣＲ減少によって明らかなように、ＳＩＲＴ２ ＫＤ細胞は、有意に減少したＯＸＰＨＯＳ能力を示した（図６Ｃ〜６Ｅ）。しかしながら、線維芽細胞自体におけるＳＩＲＴ２ ＫＤは、任意のｉＰＳＣ様コロニーを生成することができなかった（データは示されていない）。したがって、ｈＤＦを、ＳＩＲＴ２ ＫＤと一緒にリプログラミング因子で処理した。特に、リプログラミング細胞は、ＳＩＲＴ２ ＫＤにより、対照リプログラミング細胞と比較して、３日目及び８日目の両方で、有意に減少された酸化的代謝を示した（図６Ｆ〜６Ｋ）。
また、改変されたＳＩＲＴ２発現による代謝変化の動力学を、リプログラミング過程中に調べた。図７Ａに示されるように、Ｙ４のトランスフェクションの６日後、ＳＩＲＴ２発現が、顕著に下方制御された。さらに、減少したＯＣＲ及び増加したＥＣＡＲレベルがまた、トランスフェクションの６日後の時点で早くも観察された一方、ラクテート産生は、トランスフェクションの９日後に有意に誘導された（図７Ｂ〜７Ｄ）。重要なことに、リプログラミング細胞は、ＳＩＲＴ２ ＫＤにより、対照リプログラミング細胞と比較して、ＯＣＲ及びＥＣＡＲレベルの有意に高められた変化及び細胞外ラクテート産生の誘導をもたらしたことが分かった（図７Ａ〜７Ｄ）。
次に、ＳＩＲＴ２発現の改変が、線維芽細胞からのｉＰＳＣの生成に影響を与えるかどうかを試験した。図７Ｅに示されるように、ｈＤＦにおけるＳＩＲＴ２ ＯＥは、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）陽性ｉＰＳＣコロニーの生成を約８０％妨げた。対照的に、ＳＩＲＴ２ ＫＤは、ｉＰＳＣコロニーの生成を有意に増加させた（図７Ｆ）。これらの結果は、リプログラミング過程中のＳＩＲＴ２の下方制御が、代謝リプログラミングを促進することによって、ｉＰＳＣの生成によって重要であることを示す。さらに、ＳＩＲＴ１ ＫＤが、ｉＰＳＣコロニーの数を顕著に減少させた一方、その過剰発現が、それを有意に促進したことが分かり（図１９Ｅ及び１９Ｆ）、これは、多能性の誘導のためのＳＩＲＴ１の重要な役割を示す過去の研究と一致している３２、３９。しかしながら、ｈＤＦにおけるＳＩＲＴ１レベルの改変は、３日目に酸化的代謝に影響を与えなかった（図１９Ｂ〜１９Ｄ）。さらに、ＳＩＲＴ１が、リプログラミング因子の存在下で過剰発現された場合、リプログラミング中の３日目に代謝変化は検出されなかった（図１９Ｇ）。特に、ＳＩＲＴ１ ＯＥは、６日目に代謝の切り替えを促進するようであり（図１９Ｈ）、これは、リプログラミング過程を促進することによる間接的な影響に起因する可能性が高い（図１９Ｅ及び１９Ｆ）。ＳＩＲＴ２ ＫＤによって促進されたリプログラミングが、解糖の上昇に依存するかどうかをさらに試験するために、解糖の一般的な阻害剤である、様々な濃度の２−デオキシ−グルコース（２ＤＧ）による処理の、ｉＰＳＣコロニーの代謝変化及び生成に対する影響を試験した。特に、０．２ｍＭの２ＤＧによる処理は、Ｙ４＋ＳＩＲＴ２ ＫＤにおける解糖フラックスを、２ＤＧなしのＹ４のみのレベルに減少させ（図７Ｈ）、ｉＰＳＣ様コロニーの生成を、２ＤＧなしのＹ４のみのレベルにした（図７Ｉ）。さらに、線維芽細胞が、０．５ｍＭの２ＤＧで処理された場合、ＳＩＲＴ２ ＫＤによるｉＰＳＣ様コロニーの代謝変化及び増加した生成が無効にされた（図７Ｇ〜７Ｉ）。線維芽細胞が、１ｍＭ又はより高い濃度の２ＤＧで処理された場合、ｉＰＳＣ様コロニーの生成が完全にブロックされた。総合すると、これらの結果は、ＳＩＲＴ２ ＫＤによって促進されるリプログラミングが、代謝リプログラミングに対するＳＩＲＴ２の影響に関連付けられることを示す。
ｍｉＲ−２００ｃが、ＳＩＲＴ２発現を抑制する。
最後に、多能性の誘導中のＳＩＲＴ２下方制御の根底にある分子機構を同定することが求められた。特に、ＳＩＲＴ２が、リプログラミング因子の少なくとも１つによって誘導される特異的ｍｉＲＮＡによって調節され得ると考えられた。これに対処するために、Ｒｎａ２２４０を用いたｍｉＲＮＡ標的−予測分析をまず行い、ＳＩＲＴ２遺伝子を標的にし得る可能性のある６５６のｍｉＲＮＡを同定した。これらの中でも、ｈＰＳＣ４１において最も高度に富化されたｍｉＲＮＡに属する４つのｍｉＲＮＡ（すなわち、ｍｉＲ−２５、−９２ｂ、−２００ｃ、及び−３６７）をさらに同定した。５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるそれらの可能な標的部位（ｍｉＲＮＡ応答要素；ＭＲＥ）及びＳＩＲＴ２遺伝子のアミノ酸コード配列（ＣＤＳ）（表７）も同定した。興味深いことに、Ｏｃｔ４４２によって誘導されることが知られている、これらの候補（ｍｉＲ−２００ｃ）の１つが、ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルの両方でＳＩＲＴ２発現を顕著に下方制御することが分かった（図８Ａ及び８Ｂ）。本明細書において使用される予測分析は、ＳＩＲＴ２が、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐによって標的にされ得るが、ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐによって標的にされないことを示したため（図８Ｃ及び表７）、線維芽細胞を、各前駆体ｍｉＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）オリゴマーでトランスフェクトし、内在性ＳＩＲＴ２遺伝子の発現レベルに対する影響を、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット分析を用いて測定した。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐのトランスフェクションが、ＳＩＲＴ２の発現レベルを有意に減少させた一方、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ又はスクランブルオリゴマー（Ｓｃｒ）は、ＳＩＲＴ２ ｍＲＮＡ又はタンパク質発現を変化させなかった（図８Ｄ及び８Ｅ）。ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐが、同定されたＭＲＥによってＳＩＲＴ２発現を抑制するかどうかを確認するために、これらの可能な部位のそれぞれを有するルシフェラーゼレポーター構築物を生成した。ｐｒｅ−ｍｉＲ−２００ｃ−３ｐ又はスクランブル配列ではなく、ｐｒｅ−ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐのトランスフェクションが、両方のＭＲＥのレポーター発現を有意に減少させたことが分かった（図８Ｆ）。これらの結果は、Ｏｃｔ４誘導性ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐが、ＣＤＳ内に存在するこれらの２つのＭＲＥを標的にすることによって、ＳＩＲＴ２発現を下方制御することを示す。総合すると、本明細書に示される結果は、ｍｉＲ−２００ｃが、ＳＩＲＴ２発現を抑制して、ヒトの多能性の誘導中に代謝リプログラミングをもたらすことを示す（図８Ｇ）。
説明
本明細書において、多能性の誘導にとって重要な、リプログラミング過程中のプライミングされたｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ２下方制御及びＳＩＲＴ１上方制御からなる分子署名を明らかにした。ヒト線維芽細胞におけるＳＩＲＴ２ ＫＤが、ｈｉＰＳＣコロニーの生成を有意に増加させる一方、そのＯＥは、それを顕著に阻害することが分かった。ＳＩＲＴ１発現の調節はまた、反対方向ではあるが、多能性の誘導にとって重要である：ＳＩＲＴ１ ＯＥが、ｈｉＰＳＣコロニーの生成を有意に増加させる一方、そのＫＤは、それを確実に妨げる。発現のそれらの反対方向と一致して、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２が、異なる機構及び標的を介して多能性の誘導を調節するようである。例えば、本明細書に示される結果は、解糖酵素（例えば、アルドラーゼ、ＰＧＫ１、エノラーゼ、及びＧＡＰＤＨ）のアセチル化レベル及び活性が、ＳＩＲＴ２によって確実に調節されるが、ＳＩＲＴ１によって調節されないことを強調している。本明細書に示される結果と一致して、過去の研究は、ｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ１の上方制御３１、３２及びマウスｉＰＳＣの生成のためのＳＩＲＴ１の重要な役割３２ ３９を示した。さらに、Ｓｉら３３による研究は、ＳＩＲＴ２が、マウスＥＳＣのインビトロ分化中に上方制御され、そのＫＤが、中胚葉及び内胚葉系統を促進する一方、外胚葉分化を低下させることを示した。対照的に、本明細書に示される結果は、ＳＩＲＴ２が、ｈＰＳＣにおける代謝、細胞生存／死、及び多能性分化能などのより基本的な幹細胞機能を調節することを示す。これらの２つの研究の間のＳＩＲＴ２の異なる機能的役割は、おそらく、種の相違（マウス対ヒト）を反映している。別の可能性は、ＳＩＲＴ２が、異なる幹細胞状態について異なる機能的役割を有することである。プライミングされた多能性状態を表すｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣと異なり、マウスＥＳＣは、ナイーブ多能性状態であり、且つエネルギー的に二価であることが知られており、要求に応じて解糖からＯＸＰＨＯＳへと動的に切り替える９。
最近の研究は、増加した解糖が、多能性の維持又は誘導にとって重要であることを示唆している６、７、１１〜１３。特に、Ｍｏｕｓｓａｉｅｆｆらは、ＢｒＰＡ又は２ＤＧによる解糖の阻害が、多能性の急速な低下を引き起こすことを見出した１２。対照的に、本明細書に示される結果は、ＳＩＲＴ２ ＯＥ ｈＰＳＣが、ＥＳＣ培養条件を用いて、非分化状態にまだ維持され得る一方、それらは、解糖酵素の減少したアセチル化レベル及び減少した解糖代謝を示すことを示した。ｈＰＳＣが、分化条件に曝された場合、ｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ２ ＯＥは、さらに減少した解糖を引き起こし、初期分化中に、解糖の主な代謝産物であるラクテートの減少した産生をもたらした。（ＥＳＣ維持及び分化の両方において）培養条件が、Ｍｏｕｓｓａｉｅｆｆら１２と本明細書に示される知見との間で有意に異なることが留意されるべきである。例えば、ＴＧＦＩ３を含有する化学的に定義される培養培地（Ｅ８ＴＭ）が、本明細書において使用され、これは、ｈＰＳＣの非分化増殖を補助することが知られている。実際に、ＴＧＦＯを含まないｈＰＳＣ培養条件におけるＳＩＲＴ２過剰発現は、多能性及び自然発生的分化の効率的な低下をもたらす（データは示されていない）。さらに、インビトロ分化中、Ｍｏｕｓｓａｉｅｆｆらが、２日間の分化の後、ラクテートの有意な減少を検出した一方、本明細書に示される実験においては、４日間の分化の後に初めて、それが明白になった。
重要なことに、本明細書に示される研究により、ＳＩＲＴ２が、ヒトの多能性の誘導中の代謝リプログラミング（Ｗａｒｂｕｒｇ様効果）の主要調節因子であり、幹細胞の運命及び機能を大いに調節することを示す複数の証拠が見出された。第１に、ｈＥＳＣにおけるＤｏｘ誘導性ＳＩＲＴ２ ＯＥは、解糖酵素のアセチル化レベル及び酵素活性を確実に改変して、解糖代謝を有意に低下させた。第２に、ｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ２ ＯＥは、促進されたＯＸＰＨＯＳ及び減少した解糖を引き起こし、ラクテート産生の減少をもたらした。結果として、ＳＩＲＴ２ ＯＥ ｈＰＳＣは、有意に減少した細胞増殖を示し、これは、少なくとも部分的に、ＲＯＳの産生の促進によって増加したアポトーシス細胞死によって引き起こされ得る。さらに、ｈＰＳＣにおけるＳＩＲＴ２ ＯＥは、促進された多能性分化能をもたらす。第３に、ヒト線維芽細胞におけるＳＩＲＴ２ ＫＤは、解糖酵素のアセチル化レベル及び活性を確実に増加させて、ＯＸＰＨＯＳから解糖代謝への顕著な代謝の切り替えをもたらした。第４に、ＳＩＲＴ２ ＫＤは、ヒト線維芽細胞へのリプログラミング因子の導入と一緒に、リプログラミング因子単独と比較して、より迅速且つ有効に代謝の切り替えを誘導して、ｈｉＰＳＣコロニーのより効率的な生成をもたらした。対照的に、ＳＩＲＴ１の発現の改変は、代謝状態に直接影響を与えず、これは、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２が、異なる機構を介してリプログラミング過程を調節することをさらに裏付ける。総合すると、本明細書に示されるデータは、多能性の誘導及び分化中のＳＩＲＴ２のレベルの改変が、反対方向にＯＸＰＨＯＳ及び解糖を調節し、したがって、代謝の切り替えを促進することを示す。特に、ＳＩＲＴ２は、主に細胞質内に存在する唯一のサーチュインであり１８、１９、これは、解糖酵素活性を調節することによって代謝リプログラミングを直接制御する独自の利点を提供し得る。
アセチル化がほとんどの酵素の活性に対して阻害性であることが示唆されているため３４、アセチル化レベルと酵素活性との間に直接の相関があるという知見は意外である。例えば、２つのグループが、ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２による解糖酵素（ホスホグリセリン酸ムターゼ）の脱アセチル化がその活性を下方制御することを示した４４、４５。しかしながら、別の研究は、同じ酵素が、ＳＩＲＴ２による脱アセチル化によって刺激され得ることを報告しており４６、最近の研究は、ＧＡＰＤＨが、そのＫ２５４残基のアセチル化によって活性化されることを示した４７。さらに、Ｐａｔアセチラーゼ処理によるサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）におけるＧａｐＡアセチル化の増加が、その解糖活性を増加させた１６。したがって、アセチル化の機能的効果は、酵素特異的及びおそらくリシン特異的であるようである。本明細書に示される知見をさらに確認するために、Ｍｙｃタグ化アルドラーゼＡ（ＡｌｄｏＡ−Ｍｙｃ）のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った。Ｋ１１１及びＫ３２２が、特異的ＳＩＲＴ２標的部位として同定され、Ｋ３２２が酵素活性を多いに調節することが分かった。不明の機能ドメインを有するＡｌｄｏＡの外面におけるＫ３２２残基、及び本明細書に示される新たな機能データが、この重要な酵素及び癌などの疾患におけるその調節に関する有用な洞察を提供するであろう。
興味深いことに、サーチュイン遺伝子コード配列における結合部位を介して、Ｏｃｔ４４２によって多能性幹細胞において誘導されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−２００ｃによって、ＳＩＲＴ２が抑制されることが分かった。このｍｉＲＮＡは、ＳＩＲＴ２抑制によって代謝リプログラミングを促進し、これは、多能性の誘導の重要な工程であるようである（図８Ｇ）。実際に、強化されたＳＩＲＴ２ ＯＥは、ヒト細胞におけるｉＰＳＣリプログラミングに対して高度に阻害性である。ｍｉＲ−２００ｃ−ＳＩＲＴ２軸による代謝のこの調節が、他のタイプの幹細胞（例えば、成体幹細胞、ナイーブ多能性幹細胞、及び癌幹細胞）の幹細胞機能においても重要であるかどうかを決定することが対象とされるべきである。このプロセスの欠陥は、幹細胞の機能不全及び胚における発生の障害又は成体における組織の機能不全につながり得る。さらに、ｍｉＲ−２００ｃ−ＳＩＲＴ２軸を介した細胞の運命及び機能の代謝制御の操作は、再生医療及び細胞置換療法のために幹細胞を使用する並行的手法（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）に役立ち得る。
材料及び方法
細胞培養。ヒト皮膚線維芽細胞（ｈＤＦ）を、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたダルベッコ改変最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で培養した。ｉＰＳＣ誘導のために、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭのｐ−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１倍非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０％のノックアウト血清代替物（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）（ＫＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地を、リプログラミング培地として使用した。ヒトＥＳＣ系列及びｈｉＰＳＣ系列を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を用いてＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持し、穏やかな解離のために０．５ｍＭのＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて継代培養した。
プラスミド構築及びレンチウイルス産生。ヒトＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２を、それぞれｈＥＳＣ（Ｈ９）又はｈＤＦからＰＣＲ増幅し、次に、ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）へとクローニングした。ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）結合ＥＧＦＰの２Ａ配列を、ＲＴ−ＰＣＲによってｐＣＸＬＥ−ＥＧＦＰプラスミド（＃２７０８２；Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から増幅し、ｐＧａｒ−Ｔ Ｅａｓｙベクターへとクローニングした。次に、ＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２断片を、対応するベクターから切り取り、ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＰに挿入して、それぞれｐＧＥＭ−Ｔ−ＳＩＲＴ１−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＰ及びｐＧＥＭ−Ｔ−ＳＩＲＴ２−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＰを生成した。ＳＩＲＴ１−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＰ及びＳＩＲＴ２−Ｔ２Ａ−ＥＧＦＰ構築物を、シークエンシングによって確認し、次に、それぞれＦＵＷ−ｔｅｔＯベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＩ部位に導入した。ヒトＡｌｄｏＡ−Ｍｙｃ構築物、ＡｌｄｏＡ断片を、ｈＥＳＣ（Ｈ９）からＰＣＲ増幅し、次に、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｍｙｃ／Ｈｉｓベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へとクローニングした。ｐｓｉｃｈｅｃｋ２構築物のために、ＣＤＳ断片を、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼオープンリーディングフレームの下流にクローニングした。ＡｌｄｏＡの点突然変異を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いて部位特異的突然変異誘発によって生成した。プライマーは、表６に列挙されている。Ｏｃｔ４（＃２０７２６）、Ｓｏｘ２（＃２０７２４）、Ｋ１ｆ４（＃２０７２５）又はｃ−Ｍｙｃ（＃２０７２３）についての他の個々のリプログラミング因子を含有するＦＵＷ−ｔｅｔＯベースのレンチウイルスベクターは、Ａｄｄｇｅｎｅから購入した。多シストロン性ヒトＳＴＥＭＣＣＡレンチウイルスベクター４８は、Ｄｒ．Ｇｕｓｔａｖｏ Ｍｏｓｔｏｓｌａｙｓｋｙ（ボストン大学（Ｂｏｓｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））によって厚意により提供された。ＳＩＲＴ１又はＳＩＲＴ２の遺伝子ノックダウンを、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）から入手したヒトＳＩＲＴ１（ＲＨＳ３９７９−２０１７５０１８６、ＲＨＳ３９７９−２０１７５０１８８、ＲＨＳ３９７９−２０１７５０１８９、及びＲＨＳ３９７９−２０１７５０１９０）又はヒトＳＩＲＴ２（ＲＨＳ３９７９−２０１７９７１６５、ＲＨＳ３９７９−２０１７６８９８１、ＲＨＳ３９７９−２０１７６８９８２、ＲＨＳ３９７９−２０１７６８９８３、ＲＨＳ３９７９−２０１７６８９８４、及びＲＨＳ３９７９−２０１７６８９８５）を標的にするレンチウイルスｓｈＲＮＡプラスミドを用いて行った。
レンチウイルス産生のために、製造業者の指示にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、１０％のＦＢＳが補充されたＤＭＥＭ中で維持された２９３Ｔ細胞中にプラスミドをパッケージングすることによって、レンチウイルスベクターを同時トランスフェクトした。ウイルス上清を、トランスフェクションの４８時間（ｈ）後の時点で採取し、０．４５ｐｍのＭｉｌｌｅｘ−ＨＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルタを用いてろ過して、細胞残屑を除去した。
ヒトｉＰＳＣ誘導。線維芽細胞中にＯＳＫＭ因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びｃ−Ｍｙｃ）を導入するために、誘導性レンチウイルスベクター又はＳＴＥＭＣＣＡベクターによって、レンチウイルス粒子を用いて、ヒトｉＰＳＣを生成した４９。ＥＳ様コロニーがウイルス感染の３週間後に形成され、観察されたＥＳ様コロニーを抜き取り、ｉＰＳＣ系列を生成するために、マウスフィーダー細胞（ＭＥＦ）プレート又はＭａｔｒｉｇｅｌ被覆組織プレートに移した。ｉＰＳＣコロニーを、ｉＰＳＣ系列が確立されるまで機械的に抜き取った。
生細胞代謝分析。酸素消費速度（ＯＣＲ）及び細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）を、製造業者の指示にしたがって、ＸＦｐ８又はＸＦ２４分析装置（Ｓｅａｈｏｒｓｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＭＡ）を用いて測定した。簡潔に述べると、細胞を、ＸＦ細胞培養マイクロプレートのウェル中で平板培養し、結合を確実にするために、２４時間にわたってＣＯ２インキュベータ中で、３７℃でインキュベートした。非ＣＯ２インキュベータ中で、１０ｍＭのグルコース、５ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び２ｍＭのグルタミンが補充されたＸＦアッセイ培地中で１時間にわたって細胞を平衡化した後、アッセイを開始した。ｈＤＦ及びｈＥＳＣ／親ｈＤＦ及びｉＰＳＣの間のミトコンドリア活性を、１μＭのオリゴマイシン、０．３ｐＬＭのＦＣＣＰ及び１μＭのロテノン／アンチマイシンＡの連続注入によってモニターして、基礎呼吸速度（ベースラインＯＣＲ−ロテノン／アンチマイシンＡ ＯＣＲ）、ＡＴＰ依存性（基礎呼吸速度−オリゴマイシンＯＣＲ）、最大呼吸（ＦＣＣＰ ＯＣＲ−ロテノン／アンチマイシンＡ ＯＣＲ）、及び酸化予備能（最大呼吸速度−基礎呼吸速度）を計算した。解糖過程を、１０ｍＭのグルコース、１μＭのオリゴマイシン、及び１００ｍＭの２−オキシグルコースの連続注入によって測定して、基礎解糖速度、解糖能（オリゴマイシンに応答した）、及び解糖予備能（解糖能−基礎速度）を計算した。それぞれのプロットされた値を、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量された総タンパク質に対して正規化した。
免疫沈降。免疫沈降アッセイのために、ｈＥＳＣ及びｈＤＦ溶解物を、４℃で一晩、アセチル−Ｌｙｓ、アルドラーゼ、エノラーゼ、ＰＧＫ１又はＧＡＰＤＨに対する特異的抗体とともにインキュベートした。タンパク質Ａ／Ｇ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ樹脂の添加の後、試料を、４℃で２時間インキュベートした。ビーズを、ＰＢＳで３回洗浄し、タンパク質を、ＳＤＳ−試料ローディングバッファー中で沸騰させることによってビーズから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）。アセチル化タンパク質の同定のために、ｈＥＳＣ又はｈＤＦ（対照）を、１００ｍｍの皿中で平板培養し、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）ｈＥＳＣ ＳＦＭ中で、６０〜７０％コンフルエンスになるまで成長させた。細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、溶解させた（５０ｍＭのトリス−ＨＣ１、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣ１、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１％のＳＤＳ、及びプロテアーゼ阻害剤混合物）。ｈＥＳＣ及びｈＤＦからの全細胞溶解物を、氷上で１０分間インキュベートした後、４℃で１５分間にわたって１４，０００×ｇで遠心分離した。上清を収集し、ペレットを廃棄した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定した。免疫沈降アッセイのために、５００μｇのｈＥＳＣ及びｈＤＦ溶解物を、４℃で一晩、抗アセチル−Ｌｙｓ抗体とともにインキュベートした。タンパク質Ａ／Ｇ ＵｌｔｒａＬｉｎｋ樹脂の添加の後、試料を４℃で２時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、ＳＤＳ−試料ローディングバッファーの添加によって、タンパク質をビーズから解離させた。溶離されたタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、ゲルをクマシーブルーで染色した。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、ゲルを脱染し、バンドをカットし、以下のように処理した。簡潔に述べると、アセチル化タンパク質バンドを、１０ｍｍの切片に分割し、トリプシンによるゲル内消化に供した。逆相ペプチド捕捉ＥＡＳＹ−Ｃｏｌｕｍｎ（１００μｍの内径、２ｃｍの長さ）及び逆相分析ＥＡＳＹ−Ｃｏｌｕｍｎ（７５ｇｍの内径、１０ｃｍの長さ、３ｐｍの粒径）（両方ともＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製）を用いた、オートサンプラを備えたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｅａｚｙ ｎａｎｏ ＬＣ ＩＩ ＵＨＰＬＣを用いた、オンライン逆相クロマトグラフィーによって、トリプシン消化物を分離した後、３０ｇｍ（ｉ．ｄ．）ナノ細孔ステンレス鋼オンラインエミッタ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び２．６Ｖに設定された電圧を用いた、３００ｎｌ／分の流量でのエレクトロスプレーイオン化を行った。クロマトグラフィーシステムを、ＬＴＱ質量分析計とオンラインで結合した。Ｓｏｒｃｅｒｅｒ ２ ＩＤＡ Ｓｅｑｕｅｓｔベースの検索アルゴリズムを用いて、ヒトＩＰＩ ｖ３．７ ＤＢに対してスペクトルを検索し、この試験において同定されたタンパク質の比較分析を、Ｓｃａｆｆｏｌｄ ４を用いて行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、ＭＩＴのＤａｖｉｄ Ｈ．コッホ研究所（Ｄａｖｉｄ Ｈ．Ｋｏｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のｔｈｅ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ＆ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ及びソウル大学校（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）のｔｈｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒにおいて行った。ｈＥＳＣとｈＤＦとの間でタンパク質アセチル化を比較するために、両方の試料におけるアセチル化タンパク質を、スペクトルカウントに基づいて定量した。スペクトルカウントを、タンパク質当たりの平均スペクトルカウントが２つのデータセットにおいて確実に同じになるようにまず正規化した５０。Ｇ検定を用いて、タンパク質存在度の差の統計的有意性を判断した５１。簡潔に述べると、各タンパク質のＧ値を以下のように計算した：
Ｇ＝２（Ｓｉ×ｌｎ［Ｓｉ／（（Ｓｉ＋Ｓ２）／２）］＋Ｓ２／ｌｎ［Ｓ２／（Ｓ１±Ｓ２）２１））；
式中、Ｓ１及びＳ２は、比較のための２つの試料のいずれかにおける所与のタンパク質の検出されたスペクトルカウントである。Ｇ値の理論分布は複雑であるが、これらの値は、７２分布（１自由度）におよそ適合し、関連するｐ値の計算を可能にする５１。ＡｌｄｏＡにおけるアセチル化部位の同定のために、空又はＳＩＲＴ２ ＫＤプラスミドと一緒にＡｌｄｏＡ−Ｍｙｃ過剰発現プラスミドに感染した２９３Ｔ細胞からのＭｙｃ抗体による免疫沈降によって、Ｍｙｃ共役ＡｌｄｏＡタンパク質をプルダウンした。ＡｌｄｏＡ−Ｍｙｃバンドを切除し、キモトリプシンで消化し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐイオン捕捉質量分析計によって分析した（Ｔａｐｌｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、ハーバード大学（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ；ｈｔｔｐｓ：／／ｔａｐｌｉｎ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅにおいてワールドワイドウェブ上で見られる）。
ウエスタンブロット分析。試料（５０μｇ）を、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に充填し、電気泳動によって分離した後、Ｉｍｍｕｎ−Ｂｌｏｔ ＰＶＤＦ膜の片（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）上に移動した。移動の後、３〜５時間にわたって０．１％のＴｗｅｅｎ−２０及び５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有するトリス−緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）で、室温で膜をブロックし、次に、一次抗体とともに、４℃で一晩インキュベートした。膜を、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）を含有するＴＢＳで３回洗浄し、次に、適切な二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）とともに２時間にわたってインキュベートした。ＴＢＳＴで２回及びＴＢＳで１回洗浄した後、結合抗体を、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、化学発光によって検出した。アセチル−Ｌｙｓ（＃９４４１；１：１０００）及びエノラーゼ（＃３８１０；１：１０００）に対する抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から購入し、アクチン（ａｂ８２２７；１：１０００）、チューブリン（ａｂ４０７４；１：１０００）、アセチル化チューブリン（ａｂ２４６１０；１：１０００）、全ＯＸＰＨＯＳ混合物（ａｂ１１０４１３；１：２５０）、ＳＩＲＴ１（ａｂ３２４４１；１：１０００）、及びＳＩＲＴ２（ａｂ５１０２３；１：１０００）は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入し、アルドラーゼＡ（ｓｃ−１２０５９；１：１０００）、ＰＧＫ１（ｓｃ−１３０３３５；１：１０００）、ＧＡＰＤＨ（ｓｃ−３２２３３；１：１０００）は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。１Ｐ二次抗体（ａｂ１３１３６６；Ａｂｃａｍ）のための西洋ワサビペルオキシダーゼ共役Ｖｅｒｉｂｌｏｔを用いて、ＩｇＧ重鎖及び軽鎖を同時に検出せずに、免疫沈降されたタンパク質の検出を促進した。ＰＶＤＦ膜を、ＴＢＳで３回洗浄することによって剥離させた後、ストリッピングバッファー（６２．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．７、１００ｍＭの１３−メルカプトエタノール、及び２％のＳＤＳ）中で振とうしながら、３０分間にわたって５０℃でインキュベーションを行った。インキュベーションの後、膜を、ＴＢＳＴで数回洗浄した。剥離した膜をブロックし、上述されるように、一次及び二次抗体を用いて調べた。
免疫蛍光。免疫蛍光アッセイのために、細胞を、１０分間にわたって直ぐに固定し（２％のホルムアルデヒド、１００ｍＭのＫＣ１、２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣ１２、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８）、ＰＢＳで洗浄し、次に、１０分間にわたって透過緩衝液（０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１００ｍＭのＫＣ１、２００ｍＭのスクロース、１ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８）で処理した。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、１５分間にわたってＰＢＳ中３％のＢＳＡを含有するブロッキング溶液とともにインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、４℃で一晩、ブロッキング溶液中で一次抗体とともにインキュベートした。Ｏｃｔ４（ｓｃ−５２７９；１：５００）及びＮａｎｏｇ（ｓｃ−３３７５９；１：５００）抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、ＳＳＥＡ４（ＭＡＢ４３０４；１：５００）及びＴＲＡ−１−６０（ＭＡＢ４３６０；１：５００）抗体は、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）から入手し、Ｏｔｘ２（ＡＦ１９７９；１：５００）、Ｓｏｘ１７（ＡＦ１９２４；１：５００）及びＢｒａｃｈｙｕｒｙ（ＡＦ２０８５；１：５００）抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から入手した。細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、ブロッキング溶液中で、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ共役二次抗体（Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗マウス（Ａ１１００１；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ロバ抗ウサギ（Ａ１００４２；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））とともにインキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Ｈ３５７０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。各画像を、共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いて調べた。
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。総ＲＮＡを、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いることによって細胞から抽出し、ｃＤＮＡを、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成した。定量分析のために、ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を、標的遺伝子特異的プライマーとともにＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。各遺伝子の発現レベルは、１３−アクチン遺伝子のものに対する正規化の後、相対値として示された。この試験において使用されるプライマーが、表８に列挙される。
ＡＴＰ決定アッセイ。細胞ＡＴＰ濃度を、ＡＴＰ決定キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いることによって測定した。細胞（ｉＰＳＣ及び親ｈＤＦ／ｈＥＳＣ及びｈＤＦ）を、ＰＢＳで３回洗浄し、水の添加によって溶解させ、５分間沸騰させた。細胞溶解物を、４℃で１５分間にわたる遠心分離によって収集した。ＡＴＰ化学発光検出を、ホタルルシフェラーゼ及びルシフェリンによって行い、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって測定した。細胞溶解物タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて決定し、ＲＬＵ（相対発光単位）を、タンパク質濃度にしたがって正規化した。
神経分化及び自然発生的分化。神経分化を、わずかな修正を加えた以外は上述されるように行った５２。簡潔に述べると、ｈＥＳＣを解離させ、ｂＦＧＦを含まないｈＥＳＣ培地中で、細菌皿上で平板培養した後、１週間にわたって胚様体（ＥＢ）を形成させた。ＥＢを組織培養皿に結合させ、神経前駆細胞を、３０日間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ（インスリン−トランスフェリン−セレン−フィブロネクチン）培地中でのインキュベーションによって選択した。ｈＥＳＣ及びｈｉＰＳＣインビトロ自然発生的分化を、ＥＢ形成なしで１２日までの異なる期間にわたって無血清ＩＴＳＦｎ培地中で培養することによって行った。
蛍光ベースの競合アッセイ。蛍光ベースの競合アッセイを、わずかな修正を加えた以外は上述されるように行った３７、３８。簡潔に述べると、ＧＦＰ発現ｈＥＳＣ（ＧＦＰ）又はＳＩＲＴ２（及びＧＦＰ）−誘導性ｈＥＳＣ（ＳＩＲＴ２）を、野生型ｈＥＳＣ（ＧＦＰ−）と混合し、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）被覆６ウェルプレート中で培養した。５日（１回の継代）置きに、細胞を、アクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）（Ａ６９６４；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて解離させ、再度平板培養した。各継代で、ＧＦＰ＋／ＧＦＰ−細胞の割合を、Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６データ分析ソフトウェア（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターにおいてフローサイトメトリーによって測定した。６回の連続した継代について分析を行った。
酵素活性アッセイ。アルドラーゼ（＃Ｋ６６５−１００）、エノラーゼ（＃Ｋ６９１−１００）、及びＧＡＰＤＨ（＃Ｋ６４０−１００）の酵素活性を、製造業者の指示にしたがって、酵素比色分析アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ）を用いて測定した。全ての試料を、３連のウェルにおいてアッセイし、データを平均±ＳＥＭとして示す。
増殖アッセイ。細胞を、１０分間にわたってアクターゼ（ａｃｃｕｔａｓｅ）を用いて脱離させ、ＥＳＣ培地中で懸濁させ、血球計を用いて計数した。等しい数の細胞（１×１０４個の細胞／ウェル）を、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）被覆１２ウェルプレートに播種した。ウェル当たりの細胞の総数を、血球計を用いて、播種の２、４、６日後の時点で決定した。
アネキシン染色。アポトーシス分析のために、細胞を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、次に、アネキシンＶ−ＰＥ及び７−ＡＡＤ（５５９７６３；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、フローサイトメーターによって分析した。
ルシフェラーゼレポーターアッセイ。Ｐｒｏｍｅｇａデュアルルシフェラーゼアッセイキットを用いて、製造業者の指示にしたがって、ルシフェラーゼアッセイを行った。簡潔に述べると、細胞溶解物を、デュアルルシフェラーゼシステムシステムを用いてルシフェラーゼ活性について分析し、ここで、２つのルシフェラーゼ酵素のうち、一方（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来）が実験用標的配列を含有し、他方（ホタル由来）が対照を含有する。ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）／ホタルルシフェラーゼの比率を、空ｐｓｉｃｈｅｃｋ−２ベクターに対して正規化し、６回の複製にわたって平均した。
細胞ＲＯＳ測定。細胞内ＲＯＳレベルを、製造業者の指示にしたがって、ＣｅｌｉＲＯＸ（登録商標）Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｓｔｒｅｓｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃ１０４２２；Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて測定した。
ラクテートアッセイ。細胞外ラクテート産生を、製造業者の指示にしたがって、Ｌ−ラクテートアッセイキット（７００５１０；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いて測定した。
統計的分析。グラフデータが、平均±ＳＥＭとして示される。複数の群の比較のために、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した後、ボンフェローニ事後検定分析を行った。２つの群の比較のために、スチューデントｔ検定を使用した。統計的有意差が、以下のように示される：＊ｐ＜０．０５；”ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１。
ＳＩＲＴ１をコードする核酸配列（配列番号２）
ＳＩＲＴ２をコードする核酸配列（配列番号３）
ｐＣＸＬＥ−ｍｉＲ−３０２ｓ／２００ｃをコードする核酸配列（配列番号１９９）
配列番号１９９中、太字で、二重下線を引かれた文字列は、ｍｉＲ−３０２ｓの配列を表し、太字で、下線を引かれた文字列は、ｍｉＲＮＡ−２００ｃの配列を表す。
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２３．Ｐｒｉｇｉｏｎｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．ＨＩＦ １ ａｌｐｈａ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅａｒｌｙ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ｓｈｉｆｔ ａｎｄ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＰＤＫ１−３ ａｎｄ ＰＫＭ２．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３２，３６４−３７６（２０１４）．
２４．Ｎｏｒｔｈ，Ｂ．Ｊ．，Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｂ．Ｌ．，Ｂｏｒｒａ，Ｍ．Ｔ．，Ｄｅｎｕ，Ｊ．Ｍ．＆ Ｖｅｒｄｉｎ，Ｅ．Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ Ｓｉｒ２ ｏｒｔｈｏｌｏｇ，ＳＩＲＴ２，ｉｓ ａｎ ＮＡＤ＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｂｕｌｉｎ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １１，４３７−４４４（２００３）．
２５．Ｌｙｎｎ，Ｅ．Ｇ．，ＭｃＬｅｏｄ，Ｃ．Ｊ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．Ｐ．，Ｂａｏ，Ｊ．＆ Ｓａｃｋ，Ｍ．Ｎ．ＳＩＲＴ２ ｉｓ ａ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ａｎｏｘｉａ−ｒｅｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｖｉａ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ １４−３−３ ｚｅｔａ ａｎｄ ＢＡＤ ｉｎ Ｈ９ｃ２ ｃｅｌｌｓ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５８２，２８５７−２８６２（２００８）．
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３８．Ｉｖａｎｏｖａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｓｅｌｆ−ｒｅｎｅｗａｌ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ ４４２，５３３−５３８（２００６）．
３９．Ｍｕ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｓｏｘ２ Ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｒｔｌ Ｉｓ Ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ３３，２１３５−２１４７（２０１５）．
４０．Ｍｉｒａｎｄａ，Ｋ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｐａｔｔｅｒｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘｅｓ．Ｃｅｌｌ １２６，１２０３−１２１７（２００６）．
４１．Ｓｕｈ，Ｍ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｅｔ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ２７０，４８８−４９８（２００４）．
４２．Ｗａｎｇ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲ−２００／ＺＥＢ２ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ Ｏｃｔ４／Ｓｏｘ２−ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １１０，２８５８−２８６３（２０１３）．
４３．Ｇｏｍｅｓ，Ｐ．，Ｏｕｔｅｉｒｏ，Ｔ．Ｆ．＆ Ｃａｖａｄａｓ，Ｃ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｉｒｔｕｉｎ ２ ｉｎ ｔｈｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ３６，７５６−７６８（２０１５）．
４４．Ｈａｌｌｏｗｓ，Ｗ．Ｃ．，Ｙｕ，Ｗ．＆ Ｄｅｎｕ，Ｊ．Ｍ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ−１ ｂｙ Ｓｉｒｔｌ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８７，３８５０−３８５８（２０１２）．
４５．Ｔｓｕｓａｋａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ ｉｎ ｉｔｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｂｙ ＳＩＲＴ２ ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｔｓ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ １９，７６６−７７７（２０１４）．
４６．Ｘｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ＳＩＲＴ２ ｔｏ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ ｍｕｔａｓｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４，３６３０−３６４２（２０１４）．
４７．Ｌｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｌｙｓｉｎｅ ２５４ ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｇｌｕｃｏｓｅ ｓｉｇｎａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８９，３７７５−３７８５（２０１４）．
４８．Ｓｏｍｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｅｘｃｉｓａｂｌｅ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃａｓｓｅｔｔｅ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２８，１７２８−１７４０（２０１０）．
４９．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ １３１，８６１−８７２（２００７）．
５０．Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｏｒｇａｎ ａｎｄ ｏｒｇａｎｅｌｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｏｕｓｅ：ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １２５，１７３−１８６（２００６）．
５１．Ｚｈｏｕ，Ｊ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｇａｌｅｃｔｉｎ−３ ｉｓ ａ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｂｙ ａ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ９，５１３３−５１４１（２０１０）．
５２．Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｅｌｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ４，４７２−４７６（２００９）．

Claims (49)

  1. 人工ヒト多能性幹細胞を生成するための方法であって、体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の１つ以上のリプログラミング因子及びさらにＳＩＲＴ２を下方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの人工ヒト多能性幹細胞を生成するのに十分な期間にわたって体細胞又は非胚細胞集団を培養することを含む方法。
  2. 前記体細胞又は非胚細胞集団に、有効量の、ＳＩＲＴ１を上方制御する薬剤を送達することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記リプログラミング因子が、前記細胞内のｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ−２８、又はＫｌｆ４の発現を増加させる薬剤である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記リプログラミング因子が、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（「ＳＶ４０ＬＴ」）、又はｐ５３を標的にする短ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ−ｐ５３」）の発現を増加させる薬剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ＳＩＲＴ２を下方制御する前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡｉからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである、請求項５に記載の方法。
  7. 前記マイクロＲＮＡが、ｍｉＲ−２００ｃ−５ｐである、請求項６に記載の方法。
  8. ＳＩＲＴ１を上方制御する前記薬剤が、小分子、ペプチド、及びＳＩＲＴ１をコードする発現ベクターからなる群から選択される、請求項２〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. ｍｉＲ−３０２／３６７から選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを前記細胞に送達することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 送達が、前記細胞集団を、薬剤又は前記薬剤をコードするベクターと接触させることを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 送達が、形質導入、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、直接注入、及び／又はトランスフェクションを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記ベクターが、非組み込み型又は組み込み型である、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、ＥＢＮＡ１ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型ＲＮＡ、及びセンダイウイルスからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ベクターが、エピソームベクターである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記培養が、７〜２１日間の期間にわたる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. ＳＩＲＴ２が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％下方制御される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. ＳＩＲＴ１が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍上方制御される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 適切な対照と比較して、人工多能性幹細胞の数の少なくとも２倍の増強がもたらされる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞を含む細胞株。
  21. 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞又はその集団と、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。
  22. 分化細胞を生成するための方法であって、多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤を送達すること、及び少なくとも１つの分化細胞を生成するのに十分な期間にわたって、分化条件下で前記集団を培養することを含む方法。
  23. 前記多能性細胞集団に、ＳＩＲＴ１を下方制御する薬剤を送達することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記多能性細胞集団が、胚性幹細胞集団、成体幹細胞集団、人工多能性幹細胞集団、及び癌幹細胞集団からなる群から選択される、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. ＳＩＲＴ１を下方制御する前記薬剤が、小分子、抗体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びＲＮＡｉからなる群から選択される、請求項２３又は２４に記載の方法。
  26. 前記ＲＮＡｉが、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである、請求項２５に記載の方法。
  27. ＳＩＲＴ２を上方制御する薬剤が、小分子、ペプチド、及びＳＩＲＴ２をコードする発現ベクターからなる群から選択される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 送達が、前記細胞集団を、前記薬剤をコードするベクターと接触させることを含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 送達が、形質導入、ヌクレオフェクション、エレクトロポレーション、直接注入、及び／又はトランスフェクションを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ベクターが、非組み込み型又は組み込み型である、請求項２８に記載の方法。
  31. 前記非組み込み型ベクターが、エピソームベクター、ＥＢＮＡ１ベクター、ミニサークルベクター、非組み込み型アデノウイルス、非組み込み型ＲＮＡ、及びセンダイウイルスからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ベクターが、エピソームベクターである、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２８に記載の方法。
  34. 前記培養が、７〜３００日間の期間にわたる、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. ＳＩＲＴ１が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％下方制御される、請求項２２〜３３のいずれか一項に記載の方法。
  36. ＳＩＲＴ２が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍上方制御される、請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. 適切な対照と比較して、分化細胞の数の少なくとも２倍の増強がもたらされる、請求項２３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記分化細胞が、適切な対照と比較して、有意に短い期間で生成される、請求項２３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記分化条件が、神経細胞を生成するための神経分化に特異的である、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の方法によって生成される分化細胞を含む細胞株。
  41. 誘導される集団から多能性幹細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ１の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ２の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法。
  42. ＳＩＲＴ１の前記レベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍増加される、請求項４１に記載の方法。
  43. ＳＩＲＴ２の前記レベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％減少される、請求項４１に記載の方法。
  44. 前記候補細胞が、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法によって誘導される、請求項４１に記載の方法。
  45. 誘導される集団から分化細胞を選択するための方法であって、候補細胞の集団におけるＳＩＲＴ１及びＳＩＲＴ２のレベル及び／又は活性を測定すること、及びＳＩＲＴ２の増加したレベル及び／又は活性及びＳＩＲＴ１の減少したレベル及び／又は活性を示す細胞を選択することを含む方法。
  46. ＳＩＲＴ２の前記レベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍増加される、請求項４５に記載の方法。
  47. ＳＩＲＴ１の前記レベル及び／又は活性が、適切な対照と比較して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％減少される、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記候補細胞が、請求項５０〜５３のいずれか一項に記載の方法によって分化される、請求項４５に記載の方法。
  49. 測定が、免疫蛍光によって行われる、請求項４１又は４５に記載の方法。
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