KR20110019727A - Ｒｎａ 간섭을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 - Google Patents

Ｒｎａ 간섭을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 Download PDF

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KR20110019727A
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케네스 제이. 에일러트센
레이첼 에이. 파워
종 에스. 임
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뉴포텐셜, 인크.
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Abstract

본 발명은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 한 실시예에 있어서, 본 발명은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에 있어서, 본 방법은 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 분화 세포 타입으로 재분화 또는 교차분화될 수 있는 ES계 세포의 특징을 가질 수 있는 재프로그래밍 세포 또는 재프로그래밍 세포의 농축 세포군에 관한 것이다.

Description

ＲＮＡ 간섭을 통한 다능 유전자의 유도에 의한 세포 재프로그래밍 {REPROGRAMMING A CELL BY INDUCING A PLURIPOTENT GENE THROUGH RNA INTERFERNCE}
본 출원은 2006년 8월 1일자 미국 특허 출원 제 11/497,064 호의 일부 계속 출원(CIP)으로서, 2005년 8월 1일자 미국 특허 가출원 제 60/704,465 호의 35 U.S.C.§119(e) 규정의 이익을 청구하고, 또한 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/042,890 호; 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/043,066 호; 2008년 4월 7일자 미국 특허 가출원 제 61/042,995 호; 2008년 11월 12일자 미국 특허 가출원 제 61/113,971 호의 35 U.S.C.§119(e) 규정의 이익을 청구하며, 그 전체 내용은 참고사항으로 본 명세서에 포함된다.
기술 분야
본 발명은 세포 생물학, 줄기 세포, 세포 분화, 체세포 핵이식 및 세포 치료법(cell-based therapeutics)에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 실시예는 세포를 재프로그래밍(reprogramming)하기 위한 방법, 조성물 및 키트, 그리고 세포 치료법에 관한 것이다.
재생 의학은 많은 인간의 질환에 대한 치료법으로서 높은 가능성을 가지나, 현대의 과학적 연구에서 대면하게 되는 가장 어려운 기술적 도전들이 수반된다. 재생 의학에 대한 기술적 도전은 낮은 클로닝 효율성, 잠재적 다능 조직 공급 부족, 및 세포 분화를 어떻게 조절하는지, 어떤 타입의 배아 줄기세포가 선별적 치료에 사용될 수 있는지에 대한 전반적 지식 부족 등을 포함한다. ES 세포는 대단한 가소성을 가지고 있는 반면, 미분화된 ES 세포는 조직 타입의 혼합체를 포함하는 기형종(양성 종양)을 형성한다. 또한, 한 소스에서 다른 소스로의 ES 세포 이식에는 새로운 세포에 대한 거부 반응을 방지하기 위한 약물 투여가 필요할 수도 있다.
태아에서 유래되지 않은 조직으로부터 줄기 세포를 형성하기 위한 새로운 방법을 찾아내려는 시도가 행해지고 있다. 한 방법은 자가 성체 줄기세포의 처리를 포함한다. 재생 의학에 자가 성체 줄기세포를 사용할 때의 이점은 이러한 줄기세포가 동일한 환자로부터 유도되고 다시 되돌아 갈 수 있으며, 따라서 면역-매개 거부반응을 겪지 않는다는 사실에 있다. 이 방법의 결점은 이러한 세포는 ES 세포의 가소성 및 다능성이 부족하기 때문에 그 잠재성이 불확실하다는 것이다. 또 다른 방법은 다능 ES 세포와 같은 세포를 생성하기 위해 성인 조직으로부터 체세포를 재프로그래밍하는 것이다. 그러나, 이 방법은 다세포 생물 내의 각 세포 타입이 일단 고정된 세포로 되거나 세포 주기로부터 벗어난 것으로 간주되는 고유의 후생적 특징(epigenetic signature)을 가지기 때문에 어려운 점이 있다.
세포 DNA는 일반적으로 세포핵과 단백질로 구성된 복합체인 염색질(chromatin)의 형태로 존재한다. 사실상, 대부분의 세포 RNA 분자도 핵단백질 복합체의 형태로 존재한다. 당해 분야에 숙련자에게 알려져 있는 바와 같이, 염색질의 핵단백질 구조는 광범위한 연구 대상이다. 일반적으로, 염색체 DNA는 뉴클레오솜(nucleosome)으로 패키징된다. 뉴클레오솜은 코어와 링커를 포함한다. 뉴클레오솜 코어는 코어 히스톤(H2A, H2B, H3 및 H4 중 각각 2개)의 옥타머와, 이것을 둘러싼 약 150개의 염기쌍의 염색체 DNA로 구성된다. 또한, 약 50개의 염기쌍의 링커 DNA 단편이 링커 히스톤 H1와 결합되어 있다. 뉴클레오솜은 고차원 염색사로 조직화되고, 염색사는 염색질로 조직화된다. 예를 들어, Wolffe "염색질:구조 및 기능(Chromatin:Structure and Function)" 3rd Ed.,Academic Press, San Diego, 1998 참조.
염색질 구조는 정적이지 않지만, 염색질 리모델링(chromatin remodeling)으로 알려진 공정에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 염색질 리모델링은 DNA 영역으로부터 뉴클레오솜의 제거, DNA의 한 영역으로부터 다른 영역으로 뉴클레오솜의 이동, 뉴클레오솜 사이의 공간의 변화, 또는 염색체 내의 DNA 영역에 뉴클레오솜의 첨가 등을 포함한다. 또한 염색질 리모델링은 고차원 구조의 변화를 야기함으로써 전사적으로 활성인 염색질(열린구조 염색질 또는 진정 염색질)과 전사적으로 불활성인 염색질(닫힌구조 염색질 또는 이질 염색질)사이의 밸런스에 영향을 줄 수 있다.
염색체 단백질은 다수 타입의 화학적 변형이 가능하다. 코어 히스톤의 번역단계후 수정의 한 메커니즘은 보유되는 고도의 염기성 N-말단 리신 잔기의 엡실런 아미노 기의 가역적 아세틸화이다. 히스톤 아세틸화의 안정 상태는 경쟁하는 히스톤 아세틸트란스퍼라제(들)과 히스톤 데아세틸라제(들)(본 명세서에서, HDAC라고 칭함) 사이의 동적 평형에 의해 달성된다. 히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화는 전사단계 조절과 관련되어 있다. 히스톤의 가역적 아실화는 염색질 리모델링을 가능하게 하고 유전자 전사의 조절 메커니즘으로서 역할을 할 수 있다. 일반적으로 히스톤의 과아세틸화(hyperacetylation)는 유전자 발현을 촉진시키는 반면, 탈아세틸화는 전사 억제와 관련이 있다. 히스톤 아세틸트랜스퍼라제는 전사 보조활성제(coactivator)로서 역할을 하는 것으로 밝혀진 반면, 데아세틸라제는 전사 억제 경로에 속하는 것으로 알려져 있다.
히스톤 아세틸화 및 탈아세틸화 사이의 동적 평형은 정상 세포 성장에 있어서 필수적이다. 히스톤 탈아세틸화의 억제는 세포 주기 정지(cell cycle arrest), 세포 분화, 아폽토시스 및 형질전환된 표현형의 역전을 유발한다.
유전자 발현에 관여하는 또 다른 그룹의 단백질은 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT)로서, 전사 침묵(transcriptional silencing)을 유도하는 게놈 메틸화 패턴을 형성하는 역할을 한다. DNA 메틸화는 배아 발달, X-불활성화, 게놈 각인(genomic imprinting) 및 유전자 발현 조절을 포함한 많은 포유동물의 프로세스에 중심이 된다. 포유동물에서 메틸화는 메틸기가 S-아데노실-메티오닌에서 시토신의 C5 위치로 이동함으로써 달성된다. 이 반응은 DNA 메틸트랜스퍼라제에 의해 촉매화되며, CpG 디뉴클레오티드내의 시토신에 특이적이다. 인간 게놈의 CpG 디뉴클레오티드내의 모든 시토신의 70퍼센트는 메틸화되어 탈아민화됨으로써, 시토신이 티민으로 전환된다. 이 과정은 구아닌과 시토신의 총 빈도수 감소가 모든 뉴클레오티드의 약 40%가 되도록 하며, 또한 CpG 디뉴클레오티드의 빈도수 감소가 예상 빈도수의 4분의 1이 되도록 한다.
4종의 활성 DNA 메틸트랜스퍼라제는 포유동물에서 확인된다. 즉, DNMT1, DNMT2, DNMT3A, 및 DNMT3B. 또한 DNMT3L은 구조적으로 DNMT3A 및 DNMT3B와 밀접하게 관련되어 있는 단백질로서 DNA 메틸화에 중요한 물질이지만, 그 혼자서는 불활성인 것으로 보인다. CpG 아일랜드(CpG island)를 포함하는 프로모터 영역내의 시토신의 메틸화는 척추동물 세포에서 다운스트림 코딩 서열의 전사적 불활성화를 유발한다.
메틸-CpG 결합 단백질로 알려져 있는 종류의 단백질(MBD 1 ~ 4)이 메틸화-매개 전사 침묵에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. MeCP2는 특성화된 이러한 종류의 첫번째 멤버로서, 메틸-CpG 결합 도메인(MBD) 및 전사 억제 도메인(TRD)을 함유하며, 메틸화 DNA와의 상호작용을 촉진하고 Sin3A/HDAC 복합체를 표적으로 삼는다. MeCP2와 마찬가지로, MBD1, MBD2, 및 MBD3도 잠재성있는 전사 억제제인 것으로 밝혀졌다. MBD4는 DNA 글리코실라제로서, G:T 부적당한 짝을 정정한다. 이러한 단백질 패밀리의 각 멤버는 MBD3를 제외하고는 포유동물 세포내에서 메틸화 DNA와 복합체를 형성하며, 모든 MBD1 및 MBD4는 알려진 염색질 리모델링 복합체내에 존재한다. Mi-2 복합체와 같은 몇몇 단백질 및 단백질 복합체는 DNA 메틸화를 염색질 리모델링 및 히스톤 탈아세틸화에 관련시킨다.
후생적 조절에 관여하는 또 다른 그룹의 단백질은 히스톤 메틸트랜스퍼라제(HMT)로서, 1개 내지 3개의 메틸기를 조효소 S-아데노실 메티오닌으로부터 히스톤 단백질의 리신 및 아르기닌 잔기로 이동하는데 촉매작용을 하는 히스톤-리신 N-메틸트랜스퍼라제 및 히스톤-아르기닌 N-메틸트랜스퍼라제 효소이다. 메틸화된 히스톤은 DNA와 더욱 단단하게 결합하며, 따라서 전사를 억제하게 된다.
염색질의 구조는 염색질 리모델링 복합체로서 알려져 있는 거대분자 어셈블리의 활성에 의해서도 또한 변경될 수 있다. 예를 들어, Cairns(1998) Trends Biochem. Sci. 23:20 25; Workman et al.(1998) Ann. Rev. Biochem. 67:545 579: Kingston et al.(1999) Genes Devel. 13:2339 2352 및 Murchardt et al.(1999) J. Mol. Biol. 293:185 197 참조. 염색질 리모델링 복합체는 뉴클레오솜 배치의 파괴 또는 개선과 관련이 있으며, 따라서 전사, DNA 복제 및 DNA 복구와 관련이 있다(Bochar et al.(2000) PNAS USA 97(3): 1038 43). 많은 이러한 염색질 리모델링 복합체는 서로 다른 서브유니트 조성을 가지지만, 모두 리모델링 활성을 위한 ATP아제 효소에 의존한다. 또한, 생체내에서 유전자 활성을 위한 염색질 리모델링 복합체의 작용에 대한 필수요건의 몇가지 예가 존재한다.
다능 또는 전능 세포의 분화 및 특수화된 표현형으로의 발달은 발달 과정 동안 발현되는 특정 유전자 세트에 의해 측정된다. 유전자 발현은 양의 조절 또는 음의 조절에 영향을 줄 수 있는 유전자 조절 단백질의 서열-특이적 결합에 의해 직접 유발된다. 그러나, 이러한 조절 단백질의 유전자 발현을 직접 유발할 수 있는 능력은, 적어도 부분적으로 세포 DNA 내의 결합 부위의 접근성에 의존한다. 앞서 기술한 바와 같이, 세포 DNA내의 서열의 접근성은 세포 DNA가 패키징되는 세포 염색질의 구조에 의존한다.
따라서, 전사 억제에 관여하는 유전자의 활성, 발현 또는 활성과 발현 둘 다를 억제할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 포함하여, 다능성에 필요한 유전자의 발현을 유도할 수 있는 방법, 조성물 및 키트를 알아내는 것이 유용하다.
본 발명은 세포를 재프로그래밍하기 위한 방법, 조성물 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 실시예는 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 또한 재프로그래밍된 세포를 생성하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 또한 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 추가적으로 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 세포, 세포군, 세포 배양액, 세포 배양액으로부터의 세포 서브세트, 균질성 세포 배양액 또는 이질성 세포 배양액을 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 작용제와 접촉시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 재프로그래밍하는 단계를 포함하는, 세포의 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 재분화시키는 단계를 추가적으로 포함한다.
전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 작용제에는 shRNA 분자, shRNAmir 분자, shRNA 분자들의 혼합물, shRNAmir 분자들의 혼합물, 및 shRNA 분자와 shRNAmir 분자의 혼합물 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자는 본 발명의 방법에 의해 저해될 수 있으며, 이에는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제, 리신 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데메틸라제, 리신 데메틸라제, 시르투인(sirtuin), 시르투인 활성제, 메틸 결합 도메인 단백질, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, SWI/SNF 복합체의 구성성분, NuRD 복합체의 구성성분, 및 INO80 복합체의 구성성분을 부호화하는 유전자가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 하나의 유전자 또는 하나 이상의 유전자는 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11- 20, 21-30, 31-40, 41-50 및 50개 초과의 유전자가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물(shRNA construct)에 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능(differentiation potential)이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물에 제 1 표현형을 노출시키는 단계, 세포의 제 1 표현형과, 세포를 상기 shRNA 구조물에 노출시킨 후에 얻어지는 표현형을 비교하는 단계, 및 재프로그래밍된 세포를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 세포를 상기 shRNA 구조물에 노출시키기 전의 세포의 유전자형과, 세포를 상기 shRNA 구조물에 노출시킨 후에 얻어지는 유전자형을 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 세포를 상기 shRNA 구조물에 노출시키기 전의 세포의 표현형 및 유전자형과, 세포를 상기 shRNA 구조물에 노출시킨 후의 표현형 및 유전자형을 비교하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 선택된 세포를 세포군으로 배양 및 확장시키는 단계를 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 부호화되는 단백질에 결합하는 항체, 혹은 만능 마커 또는 다능 마커(SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아님)에 결합하는 항체를 사용하여 세포를 분리하는 단계를 포함한다. 세포는 또한 세포를 분리하는데 효율적인 어떠한 방법에 의해서도 분리될 수 있으며, 이에는 형광 세포 활성화 선별기, 면역조직 화학법, ELISA 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 원 세포 보다 덜 분화된 상태인 세포를 선별하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 상기 shRNA 구조물에 노출시키기 전의 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조와 상기 구조물에 노출시킨 후에 얻어지는 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가적으로 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 shRNA 구조물에 제 1 전사 패턴을 가진 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 세포의 제 1 전사 패턴과 상기 shRNA 구조물에 노출시킨 후에 얻어지는 전사 패턴을 비교하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시예에서, 세포 선별은 배아 줄기세포로부터 분석된 전사 패턴과 적어도 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-94%, 95% 또는 95-99% 유사한 전사 패턴을 가진 세포를 확인하는 단계를 포함한다. 배아 줄기세포의 총 전사 패턴을 비교할 수도 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. 그 대신에, 배아 유전자의 서브세트를 비교할 수 있으며, 이에는 1-5, 5-10, 10-25, 25-50, 50-100, 100-200, 200-500, 500-1,000, 1,000-2,000, 2,000-2,500, 2,500-5,000, 5,000-10,000 및 10,000 초과의 유전자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전사 패턴은 이원 방식으로 비교될 수 있다. 즉, 유전자가 전사되는지 아닌지를 결정하기 위해 비교를 시행한다. 또 다른 실시예에서, 각 유전자 또는 유전자의 서브세트에 대한 전사 속도 및/또는 범위가 비교될 수 있다. 전사 패턴은 당해분야에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 결정될 수 있으며, 이러한 방법에는 RT-PCR, 정량적 PCR, 마이크로어레이(microarray), 서던 블로트(southern blot) 및 혼성화 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 하나 이상의 shRNA 또는 shRNAmir 서열이 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 메틸 결합 도메인 단백질, 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 shRNA 또는 shRNAmir가 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 단백질의 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 이러한 단백질에는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 메틸 결합 도메인 단백질, 또는 히스톤 메틸트랜스퍼라제가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 제 1 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물에 세포를 노출시키는 단계, 제 2 조절 단백질의 활성, 발현 또는 활성과 발현을 저해하는 제 2 작용제에 상기 세포를 노출시키는 단계로서, 상기 제 2 조절 단백질은 제 1 조절 단백질과는 완전히 다른 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 세포 또는 세포군이 제 1 및 제 2 작용제에 동시에 또는 순차적으로 노출될 수 있다. 제 2 작용제로는 소분자, 소분자 억제제, 소분자 활성제, 핵산 서열 및 shRNA 구조물 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기술한 방법에 따라 제조된 재프로그래밍된 세포를 사용하여 다양한 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 또한 재프로그래밍된 세포 및 재분화된 재프로그래밍 세포의 치료 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 실시예는 세포를 재프로그래밍하는데 관여하는 유전자를 선별하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 전사를 억제하는 단백질을 정보화하는 유전자를 선별하는 단계를 추가적으로 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자를 선별하는 단계를 포함한다. 이러한 선별은 적절한 스크리닝 시약(screening reagent)를 이용하여 수행될 수 있으며, 이러한 시약으로는 shRNA 라이브러리 또는 shRNAmir 라이브러리가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법에 의해 제조된 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다. 재프로그래밍된 세포는 하나의 계통(lineage) 또는 하나 이상의 계통으로 재분화될 수 있다. 재프로그래밍된 세포는 만능 또는 다능 세포일 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 발명은 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 shRNA 구조물에 세포를 노출시키는 단계, 세포를 선별하는 단계로서 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 단계, 상기 선별된 세포를 배양함으로써 세포군을 생성시키는 단계를 포함하는 방법에 따라 제조되는 농축 재프로그래밍 세포군에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세포표면 마커(cell surface marker)를 발현한다. 또 다른 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 다능 또는 만능 유전자로부터 단백질의 발현을 통해 선택될 수 있으며, 이러한 유전자에는 Oct-3/4, Sox-2, Nanog, 및 Klf4이 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 다른 한 실시예에서, 재프로그래밍된 세포는 농축 세포군의 적어도 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 96-98%, 또는 적어도 99%를 차지한다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 세포를 재프로그래밍하는데, 그리고 ES-유사 세포 및 줄기 세포-유사 세포를 생성하는데 사용될 수 있다.
도 1A는 shRNA로 감염된 세포내에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 1B는 shRNA로 감염되고 hES 배양액 내에서 배양된 세포내에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 2A는 DNMT1의 shRNA 넉다운 후에 형성된 배아 유사체(embryoid-like body)의 사진이다.
도 2B는 렌티바이러스 감염을 확인시켜주는 것으로, 도 2A에서 보여준 배아 유사체 내에 존재하는 세포에서 GFP가 위치하고 있는 것을 보여주는 사진이다.
도 2C는 DNMT1의 shRNA 넉다운 후에 형성된 배아 유사체의 사진이다.
도 2D는 도 2C에서 보여준 배아 유사체에서 DNMT1의 shRNA 넉다운에 의해 유도되는 Sox2 단백질의 발현을 보여주는 사진이다.
도 2E는 DNMT1의 shRNA 넉다운 후에 형성된 배아 유사체의 사진이다.
도 2F는 도 2E에서 보여준 배아 유사체에서 DNMT1의 shRNA 넉다운에 의해 유도되는 Oct4 단백질의 발현을 보여주는 사진이다.
도 2G는 배양액 내에서 성장시키는 섬유아세포의 사진이다.
도 2H는 도 2G에서 보여준 배아 유사체에서 DNMT1의 shRNA 넉다운에 의해 유도되는 SSEA4 단백질의 발현을 보여주는 사진이다.
도 3A는 DNMT1 shRNA로 감염된 태아 인간 피부 섬유아세포에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 3B는 DNMT1 shRNA로 감염되고 퓨로마이신의 존재하에 배양된 태아 인간 진피 섬유아세포(dermal fibroblasts)에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 3C는 DNMT1 shRNA로 감염되고 퓨로마이신 및 hES 배양액의 존재하에 배양된 태아 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 4A는 DNMT1 shRNA로 감염된 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 4B는 DNMT1 shRNA로 감염되고 퓨로마이신의 존재하에 배양된 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 4C는 DNMT1 shRNA로 감염되고 퓨로마이신 및 hES 배양액의 존재하에 배양된 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 발현 증가 및 DNMT1 발현 감소를 보여주는 그래프이다.
도 5A는 HDAC7a 및 HDAC11 shRNA의 존재하에 성인 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 mRNA 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 5B는 HDAC7a 및 HDAC11 shRNA의 존재하에 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 mRNA 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 5C는 HDAC7a 및 HDAC11 shRNA의 존재하에 태아 인간 진피 섬유아세포에서 Oct-4 mRNA 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 6A는 HDAC7a 및 HDAC11 shRNA의 존재하에 성인 인간 진피 섬유아세포에서 Nanog mRNA 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 6B는 HDAC7a 및 HDAC11 shRNA의 존재하에 신생아 인간 진피 섬유아세포에서 Nanog mRNA 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 6C는 HDAC7a 및 HDAC11 shRNA의 존재하에 태아 인간 진피 섬유아세포에서 Nanog mRNA 발현 증가를 보여주는 그래프이다.
도 7A는 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 7B는 DNMT1 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 7C는 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 7D는 DNMT1 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 7E는 DNMT1 및 HDAC11 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 7F는 HDAC11 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 7G는 인간 배아 줄기세포의 사진이다.
도 8A는 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8B는 DNMT1 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8C는 DNMT1 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8D는 DNMT1 및 HDAC11 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8E는 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8F는 HDAC11 및 HDAC7 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포의 사진이다.
도 8G는 인간 배아 줄기세포의 사진이다.
용어 정의
본 명세서에 수의 범위는 대략적인 것이며, 따라서 별도의 설명이 없는 한 범위 밖의 수치도 포함될 수 있다. 수의 범위는 한 단위씩 증가하고 범위 내의 모든 수치 및 하한치와 상한치를 포함하며, 낮은 수치와 높은 수치 사이에 적어도 두 단위로 분리가 되는 것을 전제로 한다. 한 보기로서, 예를 들어, 분자량, 점성도 등과 같은 조성적, 물리적 또는 다른 특성이 100 ~ 1,000이라면, 100, 101, 102 등과 같은 모든 각각의 수치 및 100 ~ 144, 155 ~ 170, 197 ~ 200 등과 같은 하위 범위도 특별히 열거될 수 있다는 것을 의미한다. 1보다 작거나 큰 소수(예를 들어, 1.1, 1.5 등)를 포함하는 범위인 경우, 한 단위는 경우에 따라 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1이 될 수 있다. 10보다 작은 한자리 수를 포함하는 범위인 경우, 한 단위는 통상적으로 0.1로 간주된다. 특별히 의도하는 것이 무엇인지에 대한 예로서 최저치와 최고치 사이의 모든 가능한 조합의 수치를 열거하는 것은 본 명세서에서 특별히 설명하고자 하는 의도가 있는 것이다. 수의 범위는 본 방법에서 인용되는 혼합물의 성분의 상대적 농도와 다양한 온도 및 다른 파라미터 범위에 대해 제공된다.
"세포" 또는 "세포들"은 특별히 그렇지 않다는 언급이 없는 한, 체세포, 배아 줄기(ES) 세포, 성체 줄기세포, 기관 특이적 줄기세포, 핵 이식(NT) 유니트 및 줄기계 세포를 포함한다. 세포 및 세포들은 인간 또는 다른 동물세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 생쥐, 기니아 피그, 집쥐, 돼지, 양, 염소 등의 세포일 수 있다. 또한 세포는 비인간 유인원 세포일 수 있다.
"배양 배지" 또는 "성장 배지"는 세포의 성장을 지지할 수 있는 적절한 배지를 의미한다.
"분화"는 배아 발달 동안 세포가 구조적으로 및 기능적으로 특수화되는 과정을 의미한다.
"DNA 메틸화"는 메틸기(--CH3 기)가 시토신에 결합되는 것을 의미한다. 이는 일반적으로 외부 DNA를 파괴하기 위해 생성되는 효소 및 화학물질로부터 자기 DNA를 보호하기 위한 수단으로서, 및 DNA에서 유전자 전사를 조절하기 위한 수단으로서 수행된다.
"후생적"은 뉴클레오티드 서열의 변화없이 기능 변화를 물려줄 수 있는 DNA 상태를 의미한다. 후생적 변화는 DNA의 뉴클레오티드 서열 변화없이 예를 들어 메틸화 및 탈메틸화에 의해 DNA를 수정함으로써 유발될 수 있다.
"히스톤"은 DNA가 핵 내에서 고정되기에 충분하도록 DNA를 응축하는 역할을 하며 염색체내에 존재하는 단백질 분자를 의미한다.
"유전자 발현을 억제 또는 저해"라는 용어는 유전자의 발현을 감소시키는 것을 의미한다. 몇몇 실시예에서, 이러한 유전자 발현 감소는 적어도 약 5 ~ 25%, 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%이다. 다른 실시예에서는, 유전자 발현이 적어도 95%까지 감소되며, 또 다른 실시예에서는, 유전자 발현이 적어도 99%까지 감소된다.
"넉다운"은 유전자 발현이 유전자-특이적 방식으로 억제되는 것을 의미한다. 하나 이상의 유전자 "넉다운"을 가진 세포는 넉다운 생물 또는 간단하게 "넉다운"이라고 칭한다.
"다능"이라는 것은 3 배엽 또는 기본조직 타입의 세포 타입으로 분화될 수 있는 것을 의미한다.
"다능 유전자"는 세포가 다능성이 되는데 기여하는 유전자를 의미한다.
"다능 세포 배양액"은 배아 또는 성인 유래의 분화된 세포와는 명백하게 구별되는 형태를 보이는 "사실상 미분화된" 것이다. 다능 세포는 일반적으로 핵/세포질 비가 높으며, 인이 두드러지고, 식별이 어려운 세포 연접부와 강한 콜로니를 형성하며, 당해 분야에 숙련자에게 널리 인식되고 있는 세포이다. 인지해야 할 점은 미분화 세포 콜로니는 분화된 주변 세포들에 의해 둘러 싸여져 있을 수 있다는 것이다. 그럼에도 불구하고, 적절한 조건하에 배양시에 사실상 미분화된 콜로니가 유지될 것이며, 배양 세포의 분열시에 성장하는 세포의 대부분은 미분화 세포가 차지한다. 본 명세서에서 기술되는 유용한 세포군은 이러한 기준을 가진 사실상 미분화된 다능 세포를 함유한다. 사실상 미분화된 세포 배양액은 미분화 다능 세포를 적어도 약 20%, 40%, 60% 또는 80%(세포군 중 총 세포의 퍼센트) 함유할 수 있다.
"조절 단백질"은 생물학적 변화과정을 조절하는 단백질을 의미하며, 이 조절은 양의 방향 및 음의 방향으로의 조절을 포함한다. 조절 단백질은 생물학적 변화과정에 직접 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있으며, 직접적으로 영향력을 행사하거나 복합체에 참여함으로써 영향을 줄 수 있다.
"재프로그래밍"은 핵 속의 후생적 마크를 제거하고, 다른 세트의 후생적 마크를 확립하는 것을 의미한다. 다세포 생물의 발달과정에서, 서로 다른 세포 및 조직은 서로 다는 유전자 발현 프로그램을 획득한다. 이러한 구별되는 유전자 발현 패턴은 DNA 메틸화, 히스톤 변형 및 다른 염색질 결합 단백질과 같은 후생적 변경에 의해 사실상 조절되는 것으로 보인다. 따라서, 다세포 생물내의 각 세포 타입은 통상적으로 일단 세포가 분화되거나 세포 주기를 벗어나면 "고정"되고 변경되지 않는 것으로 생각되는 고유의 후생적 특징을 가진다. 그러나, 일부 세포는 정상적인 발달과정 또는 특정 질환의 상황에서 중요한 후생적 "재프로그래밍"을 경험한다.
"전능성"은 완전한 배아 또는 기관으로 발육할 수 있는 능력을 의미한다.
본 발명의 실시예는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 세포가 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시예에서, 본 방법은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도하는 단계 및 다능성 또는 만능성이며 다중 계통(multiple lineage)으로 유도 분화될 수 있는 재프로그래밍 세포를 제조하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 염색질 구조를 변경시키는 단계 및 세포를 다능성 또는 만능성이 되도록 재프로그래밍하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 염색질 구조의 변경은 억제 복합체에 관여하는 단백질을 부호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함한다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 저해하는 단계 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 저해하는 단계 및 재프로그래밍된 세포를 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법은 활성 억제제, 기본 전사 기구(basal transcriptional machinery), 억제제를 모집하기 위해 구조를 변경시키는 단백질, 억제제를 모집시키는 단백질, 뉴클레오솜 또는 염색질 구조를 변경시키는 단백질, DNA를 변경시키는 단백질, 및 염색질 리모델링 복합체에 관여하는 단백질을 포함하여(이에 국한되는 것은 아님) 어떠한 타입의 억제에도 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물에 세포를 노출시키는 단계, 다능 또는 만능 유전자의 발현을 유도하는 단계, 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 세포 재프로그래밍 방법에 관한 것이다. 다능 또는 만능 유전자는 발현의 배수 증가가 0.25-0.5, 0.5-1, 1.0-2.5, 2.5-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-40, 40-50, 50-100, 100-200, 200-500, 및 500배 초과(이에 국한되는 것은 아님)까지 유도될 수 있다. 다른 한 실시예에서, 본 방법은 분화된 세포를 플레이팅하는 단계, 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물에 상기 분화된 세포를 노출시키는 단계, 상기 세포를 배양하는 단계, 및 재프로그래밍된 세포를 확인하는 단계를 포함한다. shRNA 구조물은 조절 단백질의 발현을 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 및 95-99%, 99-200%, 200-300%, 300-400%, 400-500% 및 500% 초과(이에 국한되는 것은 아님) 저해할 수 있다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 부호화되는 단백질 또는 단백질 단편, 혹은 다능 또는 만능 표면 마커에 대한 항체를 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 항체로는 어떠한 종류도 사용될 수 있으며, 이에는 모노클론 항체, 폴리클론 항체, 항체 단편, 펩티드 모방 항체, 활성 영역에 대한 항체, 단백질 보존 영역에 대한 항체 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 세포를 선별하고, 이 세포를 다능 세포 배양액 또는 만능 세포 배양액으로 확장 또는 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 다능 또는 만능 유전자에 의해 구동되는 리포터 혹은 다능 또는 만능 표면 마커를 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 리포터로는 어떠한 종류도 사용될 수 있으며, 이에는 형광 단백질, 녹색 형광 단백질, 시안 형광 단백질(CFP), 노란색 형광 단백질(YFP), 박테리아 루시퍼라제(bacterial luciferase), 해파리 에쿼린(jellyfish aequorin), 강화 녹색 형광 단백질, turbo GFP, 클로르암페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), dsRED, β-갈락토시다제, 및 알칼리성 포스파타제 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 선별가능한 마커로서의 저항물질을 이용하여 세포를 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 저항물질에는 항생제 저항물질, 살균제, 퓨로마이신, 하이그로마이신(hygromycin), 디하이드로폴레이트 환원제, 티미딘 키나제, 네오마이신 저항물질(neo), G418 저항물질, 마이코페놀산 저항물질(gpt), 제오신 저항 단백질 및 스트렙토마이신 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또 다른 실시예에서, 본 방법은 shRNA 구조물에 세포를 노출시키기 전의 세포의 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조와 상기 shRNA로 처리한 후에 얻어지는 다능 또는 만능 유전자의 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 염색질 구조의 어떠한 특징도 비교할 수 있으며, 이에는 진정 염색질, 이질 염색질, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화, 히스톤 또는 히스톤 구성성분의 존재 및 부재, 히스톤의 위치, 히스톤의 배열, 및 염색질과 관련이 있는 조절 단백질의 존재 또는 부재 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 모든 유전자 영역의 염색질 구조가 비교될 수 있으며, 이에는 강화물질 고유영역, 활성자 고유영역, 프로모터, TATA 박스, 전사 개시 부위의 업스트림 영역, 전사 개시 부위의 다운스트림 영역, 엑손, 및 인트론 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현 저해는 RNA 간섭(RNAi)(이에 국한되는 것은 아님)을 포함하여 적합한 메커니즘에 의해 달성될 수 있다. RNAi는 서열 특이적 방식으로 표적 mRNA의 분해에 의해 유비쿼터스 메커니즘(ubiquitous mechanism)을 통해 유전자 발현을 조절한다. 작은 간섭 RNA 가닥(siRNA)는 RNAi 과정에 중요하며, 표적 RNA 가닥에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 특이적 RNAi 경로 단백질은 표적 메신저 RNA(mRNA)에 대한 siRNA에 의해 지배를 받는데, 이 단백질은 표적을 "절단(cleave)"하여, 더 이상 단백질로 번역될 수 없는 보다 작은 부분으로 분해시킨다.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)와 세포를 접촉시키는 단계 및 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 재프로그래밍된 세포를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 재프로그래밍된 세포는 다능 또는 만능 세포일 수 있다.
shRNA는 유전자 발현을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 타이트 헤어핀 턴(tight hairpin turn)을 형성하는 RNA 서열이다. shRNA의 사용은 RNA 간섭을 달성하기 위한 한 방법이다. 몇몇 실시예에서, shRNA는 이 shRNA가 발현되는 것을 보장하기 위해 U6 프로모터(이에 국한되는 것은 아님)와 같은 프로모터를 구비한 벡터에 혼입될 수 있다. 벡터는 일반적으로 딸 세포로 이동함으로써 유전자 침묵이 계승되게 한다. shRNA 헤어핀 구조는 세포 기계(cellular machinery)에 의해 절단되어 짧은 간섭 RNA로 되며, 그 다음 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)에 결합된다. 이 복합체는 여기에 결합되어 있는 siRNA와 매치되는 mRNA와 결합하고 이를 절단한다.
shRNA는 렌티바이러스(lentivirus) 구조물에 혼입될 수 있다. 렌티바이러스는 레트로바이러스과의 느린 바이러스 속이며, 잠복 기간이 긴 것이 특징이다. 렌티바이러스는 상당한 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA로 전달할 수 있으며, 따라서 유전자 전달 벡터의 효과적인 방법이다.
다른 한 실시예에서, 전사 억제에 관여하는 인자, 염색질 리모델링에 관여하는 인자, 및 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 인자를 확인하기 위해 본 발명의 방법에 shRNA 라이브러리가 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, shRNA는 The RNAi Consortium(TRC)으로부터 입수할 수 있는데, 이 공동체는 기능 유전체학 연구를 위한 포괄적 수단을 생산하고 이를 전세계 과학자들이 광범위하게 이용할 수 있도록 하기 위한 목적으로, 11개의 국제적으로 명성있는 대학 및 법인의 생명 과학 연구 그룹으로 구성된 협력 그룹이다. MIT 및 Harvard의 Broad Institute에서 개발된 TCR 콜렉션은 현재 16,000개의 주석이 달린 인간 유전자를 표적으로 삼는 사전-클론화된 shRNA 구조물을 159,000개 보유하고 있다.
shRNA 구조물, 라이브러리 및 벡터는 주문 생산할 수도 있고 민간 제조사로부터 구매할 수 있으며, 예를 들어 Dharmacon RNAi Technologies(Thermo Scientific, Lafayette, CO)로부터 입수가능한 SMART 벡터 shRNA 렌티바이랄 테크놀로지, Sigma Aldrich(St. Louis,MO)로부터 입수가능한 MISSIONTM TCR shRNA, Open Biosystems(Huntsville, AL)로부터 입수가능한 TCR 렌티바이랄 shRNA 라이브러리, 렌티바이러스 및 안데노바이러스 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)로 구입할 수 있는 구성적 또는 유도성 프로모터, 서로 다른 선별 마커, 및 바이러스 전달 옵션의 특징을 갖는 BLOCK-iTTM RNAi 벡터 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한 특이적 표적을 향하는 shRNA 분자는 OriGene(Rockwell, MD) 및 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, California)와 같은 민간 제조사로부터 구입할 수 있다. 또한 유도성 shRNA는 Clonetech(Mountainview, CA)로부터 구입할 수 있다. 넉아웃 유도성 RNAi 시스템은 표적 유전자의 침묵을 위해서 포유동물 세포에서 기능성 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)의 발현을 견고하게 조절한다. 넉아웃 유도성 RNAi 시스템은 유전자 억제가 치명적이어서 그 분석을 방해하는 경우 유용하다. 구입가능한 여러 버전이 있다. 즉, 넉아웃 싱글 벡터 유도성 RNAi 시스템 및 넉아웃 데트 RNAi 시스템 H 및 P.
다른 한 실시예에서, 본 방법은 세포를 shRNAmir와 접촉시키는 단계 및 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 재프로그래밍 세포를 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 재프로그래밍된 세포는 다능 또는 만능 세포일 수 있다.
마이크로RNA(miRNA)는 약 21 ~ 23개 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥 RNA 분자로서 유전자 발현을 조절한다. miRNA는 DNA로부터 전사되는 유전자에 의해 코드화되며, 단백질로 번역되지 않는다(비부호화 RNA). 그 대신 miRNA는 pri-miRNA라고 알려져 있는 일차 전사물(primary transcript)에서 pre-miRNA라고 불리는 짧은 스템-루프 구조(stem-loop structure)로 프로세스되며, 마침내 기능성 miRNA로 된다. 성숙한 miRNA 분자는 하나 이상의 메신저 RNA(mRNA) 분자에 부분적으로 상보적이며, 그 주요 기능은 유전자 발현을 하향조절하는 것이다.
포유동물 RNAi의 shRNA 트리거는 내생적인 마이크로 RNA 생물발생 경로에 대한 현재 지식을 기초로 한다. shRNAmir 구조물은 천연 마이크로 RNA 일차 전사물을 모방하기 위한 것으로서, 내생적인 RNAi 경로에 의한 특이적 프로세싱을 가능하게 하며 효과적인 유전자 넉다운을 형성한다. 게놈-범주 shRNAmir 라이브러리는 다양한 RNAi 활용을 위한 해법을 제공하는 유전자 넉다운의 효율성 및 특이성을 증기시키기 위한 여러가지 특징을 가진다.
shRNAmir 라이브러리는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 다른 한 실시예에서 shRNAmir 라이브러리는 The RNAi Consortium(TRC)으로부터 입수할 수 있다.
shRNAmir 및 shRNAmir 라이브러리는 주문 생산할 수도 있고 민간 제조사로부터 구매할 수 있다. 예를 들어, Expression ArrestTM 마이크로 RNA-개작된 shRNA(shRNA 라이브러리), 레트로바이랄 shRNAmir 라이브러리, 렌티바이랄 shRNAmir 라이브러리, TRIPz 렌티바이랄 유도성 shRNAmir 라이브러리, pSM2 레트로바이랄 shRNAmir 라이브러리는 모두 Open Biosystems(Huntsville, AL)로부터 입수가능하다.
다른 한 실시예에서, 본 발명의 방법은 세포를 shRNA, shRNA 라이브러리, shRNAmir, shRNAmir 라이브러리, 또는 shRNA 구조물의 배합체와 접촉시키는 단계, 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계, 및 상기 억제된 유전자를 확인하는 단계를 포함한다.
단일 유전자의 억제를 표적으로 삼기 위해 단일 shRNA 또는 shRNAmir를 사용할 수도 있고, 하나 이상의 shRNA 또는 shRNAmir를 사용할 수 있다. 다른 한 실시예에서, 하나 이상의 유전자의 억제를 표적으로 삼기 위해 단일 shRNA 또는 shRNAmir를 사용할 수도 있다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 유전자의 억제를 표적으로 삼기 위해 하나 이상의 shRNA 또는 shRNAmir를 사용할 수 있다. shRNA 구조물와 shRNAmir 구조물의 혼합물을 사용할 수도 있다. 단일 유전자 또는 하나 이상의 유전자는 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11- 20, 21-30, 31-40, 41-50 및 50개 초과의 유전자가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
유전자 발현 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 어떠한 유전자도 본 발명의 방법에 의해 저해될 수 있으며, 이에는 히스톤 데아세틸라제, 메틸 결합 도메인 단백질, 메틸 아데노실트랜스퍼라제 및 메틸 사이클 효소, 핵 수용체, 고아 핵수용체, Esrrβ 및 EssRγ 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있는 유전자의 대표적인 목록은 하기 표 1에 제공된다.
예를 들어, 메틸 결합 도메인 단백질, 즉 MeCP2는 메틸화 시토신과 결합하여 히스톤 단백질을 탈아세틸화하는 히스톤 데아세틸라제를 모집함으로써 응축된 염색질 구조를 형성하며, 이로써 전사를 억제한다. 본 발명의 방법은 억제 복합체 내의 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해함으로써, 다능성 유전자의 전사를 유도할 수 있다. 표 1은 억제에 관여하는 유전자 및 억제 복합체의 대표적인 목록이다.
히스톤
데아세틸라제		 메틸 결합도메인 단백질 메틸 아데노실-트랜스퍼라제 DNA 메틸-트랜스퍼라제 히스톤 메틸-트랜스퍼라제 메틸 사이클 효소
클래스 I (HDAC 1-3,8,11) MBD1 MAT2A DNMT1 EHMT1 MTHFR
클래스 II
(HDAC 4-7,9,10)		 MBD2 MAT1A DNMT2 HDM G9A CBS
클래스 III
(SIRTI 1-7 )		 MBD3 MAT2B DNMT3B SUB39H1
클래스 IV
(HDAC 11)		 MBD4 DNMT3A SETB1
MeCP2 DNMT3L
예를 들어, shRNA는 MeCP2의 발현을 억제함으로써 HDAC가 염색질 구조로 모집되는 것을 현저히 감소시키는데 사용될 수 있다. 이는 세포가 다능 또는 만능으로 되는데 중요한 유전자의 상향 조절을 유도함으로써 체세포 내에서의 분화능을 증가시킬 수 있다. 마찬가지로, shRNAmir는 HDAC를 억제하기 위해 사용될 수 있으며, 마찬가지로 이는 다능성에 중요한 유전자의 상향 조절을 유도할 수 있다. 또한, DNA 메틸트랜스퍼라제에 지향적인 shRNAmir, 메틸 결합 단백질에 지향적인 shRNAmir, 및 HDAC에 지향적인 shRNAmir은 억제 복합체 내의 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하기 위해 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 상술한 기술 내용은 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
또한 염색질 리모델링에 관여하는 다른 복합체 내의 단백질을 부호화하는 유전자도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 SWI/SNF 복합체, NuRD 복합체, Sin3 복합체, INO80 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. hSWI/SNF 복합체는 염색질 접근성 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 다중 서브유니트 단백질 복합체이다. hSWI/SNF 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 SNF5/INI1, BRG1, BRM, BAF155 및 BAF170 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. SWI/SNF는 다양한 유전자의 활성화를 위해 필요한 것으로 원래 효모에서 확인되었다. hSWI/SNF 복합체는 수개의 발달상 특이적인 유전자 발현 프로그램의 조절에 필수적인 것으로 알려졌다.
Sin3 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 HDAC1, HDAC2, RbAp46, RbAp48, SinA3, SAP30, 및 SAP18 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
NuRD 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 Mi2, p70 및 p32 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
INO80 복합체의 어떠한 구성성분도 본 발명의 방법에 의해 억제될 수 있으며, 이에는 Tip49A, Tip49B, SNF2 종류 헬리카제 Ino80, 액틴 관련 단백질 ARP4, ARP5, 및 Arp8, YEATS 도메인 패밀리 멤버 Taf14, HMG-도메인 단백질, Nhp10 및 Ies 1 ~ 6으로 지정된 6개의 추가적인 단백질 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현을 유도하기 위해 다양한 수의 shRNA 또는 shRNA 서열을 사용할 수 있으며, 이에는 1-5, 6-10, 11-15, 16-20, 21-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50, 및 50개 초과의 shRNA 또는 shRNAmir 서열이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 재프로그래밍 세포는 다능 또는 만능 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조되는 재프로그래밍 세포는 배아 줄기세포와 유사한 특성을 포함한 여러가지 다른 특성을 가질 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍된 세포는 미분화 상태로 적어도 10, 15, 20, 30 또는 그 이상의 계대(passage) 동안 증식할 수 있다. 다른 형태로서, 재프로그래밍된 세포는 분화되지 않고 1년 초과의 기간 동안 성장될 수 있다. 또한 재프로그래밍된 세포는 증식 및/또는 분화 과정 동안 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 또한 몇몇 재프로그래밍된 세포는 미분화 상태로 생체내에서 무제한 증식할 수 있는 세포일 수 있다. 또한 몇몇 재프로그래밍된 세포는 장기간 배양을 통해 정상적인 핵형을 유지할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 장기간 배양 후에도 3가지 종류의 배아 생식층(내배엽, 중배엽 및 외배엽) 모두의 유도체로 분화되기 위한 잠재성을 유지할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 생물체 내에서 어떠한 세포 타입도 형성할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 미분화 증식을 유지하지 못하는 배지 상에서의 증식과 같은 특정 조건하에서 배상체(embryoid body)를 형성할 수 있다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 예를 들어, 배반포와의 융합을 통해 키메라를 형성할 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 다양한 마커에 의해 한정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 재프로그래밍된 세포는 알칼리성 포스파타제를 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및/또는 Tra-1-81을 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 Oct4, Sox2 및 Nanog를 발현한다. 몇몇 재프로그래밍된 세포는 mRNA 레벨로 발현할 것이고, 또한 다른 재프로그래밍된 세포는 예를 들어 세포 표면상에서 또는 세포내에서 단백질 레벨로 발현할 것이라는 것을 알아야 한다.
재프로그래밍된 세포는 어떠한 재프로그래밍된 세포 특성 또는 범주(들) 및 본 명세서에서 기술한 특성의 어떠한 조합도 가질 수 있다. 예를 들어, 재프로그래밍된 세포는 SSEA-1을 발현하지 않고 알칼리성 포스파타제를 발현할 수 있으며, 적어도 20 계대 동안 증식할 수 있고, 어떠한 세포 타입으로도 분화될 수 있다. 예를 들어, 또 다른 재프로그래밍된 세포는 세포 표면상에서 SSEA-1을 발현할 수 있으며, 내배엽, 중배엽 및 외배엽 조직을 형성할 수 있고, 분화없이 1년을 초과하는 기간 동안 배양될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 알칼리성 포스파타제(AP)에 양성, SSEA-1에 양성, SSEA-4에 음성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 Nanog에 양성, Sox2에 양성, Oct-4에 양성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 Tcl1에 양성, Tbx3에 양성을 나타낼 수 있다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 크립토(Cripto)에 양성, 스텔라(Stellar)에 양성, Daz1에 양성, 또는 프라길리스(Fragilis)에 양성을 나타낼 수 있다. 재프로그래밍된 세포는 모노클론 항체인 TRA-1-60(ATCC HB-4783) 및 TRA-1-81(ATCC HB-4784)의 결합 특이성을 가지는 항체와 결합하는 세포 표면 항원을 발현할 수 있다. 또한 앞서 기술한 바와 같이, 재프로그래밍된 세포는 영양 세포층(feeder layer)없이 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-25, 26-30, 31-40, 41-50, 51-60, 61-7-, 71-80, 81-90, 91-100의 계대 동안 또는 1년 초과의 기간 동안 유지될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 섬유아세포, 골아세포, 연골세포, 지방세포, 골격근, 내피, 엽록체, 평활근, 심근, 신경세포, 조혈세포, 췌장소도, 또는 사실상 신체의 세포를 포함하는 광범위한 세포 타입의 다른 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다. 재프로그래밍된 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6-10, 11-20, 21-30, 및 30 초과의 계통을 포함하는 다양한 수의 계통으로 분화될 수 있는 잠재성을 가진다.
세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 어떠한 유전자도 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 이러한 유전자로는 N-메틸트랜스퍼라제(Gnmt), Octamer-4(Oct4), Nanog, SRY(성별 결정 영역 Y)-박스 2(Sox2라고도 알려져 있음), Myc, REX-1(Zfp-42라고도 알려져 있음), 인테그린 α-6, Rox-1, LIF-R, TDGF1(CRIPTO), 프라길리스, SALL4(sal계 4), GABRB3, LEFTB, NR6A1, PODXL, PTEN, 백혈구 세포로부터 유도되는 케모탁신 1(LECT1), BUB1, 및 Klf4와 Klf5 같은 Kruppel계 인자(Klf) 등을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 다양한 수의 유전자는 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 이에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20, 21-30, 31-40, 41-50, 및 50 초과의 유전자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, Ramalho-Santos et al.(Science 298, 597 (2002)), Ivanova et al.(Science 298, 601 (2002)) 및 Fortunel et al.(Science 302, 393b(2003))의 3가지 타입의 줄기 세포가 각각 비교되고, 줄기 세포의 기능적 특성을 부여하는데 중요한 것으로 간주되는 통상적으로 "줄기세포성" 유전자라고 표현되는 유전자의 목록이 확인되었다(상기 인용된 참고문헌은 모두 그 전체가 기재되어 있음). 상기 언급된 연구에서 확인된 어떠한 유전자도 본 발명의 방법에 의해 유도될 수 있다. 하기의 표 2는 줄기 세포의 기능적 특성을 부여하는데 관여하는 것으로 생각되는 유전자의 목록을 제공한다. 표 2에 기재된 유전자 이외에도, 알려진 유전자와 상동관계가 거의 또는 전혀 없는 93개의 발현 서열 태그(EST) 클러스터도 Ramalho-Santos et al. 및 Ivanova et al.에 의해 확인되었으며, 이들 또한 본 발명의 방법에 포함된다. 표 2는 줄기 세포 특징을 부여하는데 관여하는 유전자의 목록이다.
기호 유전자 기능
F2r 트롬빈 수용체 G단백질 결합수용체, 응고과정,
맥관 발생에 필요
Ghr 성장호르몬 수용체 성장호르몬 수용체/결합 단백질, Jak2활성화
Itga6 인테그린 알파 6 세포부착, 세포표면 매개신호전달,
인테그린 b1과 결합가능
Itgb1 인테그린 베타 1
(파이브로넥틴 수용체)		 세포부착, 세포표면 매개신호전달,
인테그린 a6과 결합가능
Adam 9 디스인테그린 및
메탈로프로테이나제 도메인 9(멜트린 감마)		 세포부착, 세포밖 단백질분해,
점재적 융합 단백질
Bys 비스틴계(비스틴) 세포부착, 배아착상(태반)에 중요
Ryk 수용체계 티로신키나제 비전통적 수용체 티로신 키나제
Pkd2 다낭성 신종 2 칼슘채널
Kcnab3 전압차 개방 칼륨 통로,
세이커 관련 서브 패밀리, 베타 멤버3		 칼륨 채널의 조절 서브유니트
Gnb1 구아닌 뉴클레오티드 결합 단백질 베타1 G-단백질 결합 수용체 신호전달
Gab1 성장인자 수용체 결합 단백질2(Grb2)-관련 단백질 1 다수의 신호전달 경로의 통합
Kras2 키르스텐 쥐 육종 암유전자 2 GTP와 결합하여 성장인자 수용체로부터 신호전달
Ras p21단백질 활성제(Gap)와 매우 유사한 EST RAS기능 억제제
Cttn 코르악틴 액틴 세포골격 조절, 종양 내에서 과발현
Cops4 COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 4		 Cop9신호전달 복합체, 다수의 신호전달 경로의 통합, 단백질 분해조절
Cops7a COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 7a		 Cop9신호전달 복합체, 다수의 신호전달 경로의 통합, 단백질 분해조절
Madh1 Mad 동족체 1(Smad1) TGFb 경로신호 변환기
Madh2 Mad 동족체 2(Smad2) TGFb 경로신호 변환기
Tbrg1 TGFb 조절 1 TGFb에 의해 유도
Stam 신호변환 아덥터 분자(SH3 도메인 및 ITAM 모티브) 1 Jak티로신 키나제와 관련
Statip1 STAT 상호작용 단백질 1 Jak/Stat3결합을 위한 스캐폴드
Cish2 시토킨 유도성 SH2 함유 단백질(Ssi2) STAT 유도 STAT억제제-2,
Igf1R과 상호작용
Jak3와 적당히(moderately) 유사한 ESTs 잠재적 키로신 키나제
PPP2R1B와 매우 유사한 ESTs 단백질 포스파타제 2의 조절서브 유니트, 추정 종양 억제제
Rock2 Rho-관련 감긴 코일 형성 키나제 2 세린/트레오닌 키나제, Rho의 표적
Yes 야마구찌 육종 바이러스 암유전자 동족체 세포내 티로신 키나제, 전암유전자,
Src 패밀리
Yap Yes-관련 단백질1 Yes와 결합, 전사 공활성제
Ptpn2 단백질 티로신 비-수용체 포스파타제 2 데포스포릴레이트 단백질
Ppplr2 단백질 포스파타제 1,
조절(억제제) 2		 단백질 포스파타제 1의 조절 서브유니트
Ywhab 티로신/트립토판 모노옥시게나제 활성화 단백질 베타(14-3-3베타) 포스포세린-단백질과 결합, PKC 경로
Ywhah 티로신/트립토판 모노옥시게나제 활성화 단백질 에타(14-3-3에타) 포스포세린-단백질과 결합, PKC 경로
Axo 액스트로핀 PHD도메인 함유, 아데닐레이 시클라제 도메인 및 G-단백질 상호작용에 대한 일치 영역을 포함,
뉴런 유지에 필요
Trip6 갑상선 호르몬 수용체 상호작용제 6 TH 존재하에 THR과 상호작용,
Rel 전사인자에 대한 추정 공활성화제
Gfer 성장인자, erv1(맥주효모)계 (간재생 증진제) 설피드릴 옥시다제, 간재생 촉진,
EGFR 및 MAPK 경로 자극
Upp 우리딘 포스포릴라제 우리딘과 우라실 상호전환,
형질전환 세포 내에서 고도로 발현,
2-데옥시-D-리보즈 생성, 강력한 혈관 형성인자
Mdfi MyoD 패밀리 억제제 bHLH 및 베타-카테닌/TCF 전사인자의 억제제
Tead2 TEA 도메인 2 전사인자
Yap Yes-관련 65kD Yes와 결합, 전사 공활성제
Fhl1 4와 1/2 LIM RBP-J/Su(H)와 상호작용
Zfx 아연핑거X-결합 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp54 아연핑거 54 아연핑거, 추정 전사인자
아연핑거 단백질 아연핑거, 추정 전사인자
D17Ertd197e D17Ertd197e 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우 유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Zfp와 매우유사한 ESTs 아연핑거, 추정 전사인자
Rnf4 RING 핑거 4 스테로이드-매개 전사
Chd1 크로모도메인 헬리카제 DNA결합 단백질 1 염색질 구조의 변경,
SNF2/SW 12 패밀리
Etl1 증감제 트랩 유전자 부위 염색질 구조의 변경,
SNF2/SW 12 패밀리
Rmp Rpb5-매개 단백질 RNA와 결합, Pol II, 전사 억제
Ercc5 절제 수선 5 엔도뉴클레아제 UV-유도 손상의 억제
Xrcc5 X선 수선 5 (Ku80) 헬리카제, V(D)J 재조합에 관여
Msh2 MutS 동족체 2 미스매치 수선, 대장암에서 돌연변이
Rad23b Rad23b 동족체 절제수선
Ccnd1 시클린 D1 G1/S전이, CDk2 및 4 조절, 유방암에서 과다발현, 다른 암에 관련됨
Cdkn1a Cdk 억제제 1a P21 G1/S전이 억제, Cdk2 억제제,
HSC 유지에 필요
Cdkap1 Cdk2관련 단백질 DNA프리마제,
DNA복제의 잠재적 조절제(S상)
Cpr2 세포주기 이행 2 맥주 효모 내에서 G1중지 극복
Gas2 성장중지 특이적 2 성장중지 세포에서 고도발현,
액틴 세포 골격의 일부
CenpC 동원체 단백질 C 활성 동원체 내에 존재
Wig1 야생형 p53 유도1 P53표적, 종양세포 성장억제
Tmk 티미딜레이트 키나제 dTTP합성경로, S상 진행에 필수적
Umps 우리딘 모노포스페이트
합성효소		 피리미딘 생합성
Sfrs3 스프라이싱 인자 RS 리치 3 조직-특이적 차별 스프라이싱에 연관,
세포주기 조절
엑스포틴 1과 매우 유사한 ESTs 세포주기 조절 핵방출 단백질
CAD와 매우 유사한 ESTs 피리미딘 생합성의 3기능성 단백질, MAPK에 의한 활성화(포스포릴화)
Mapkkkk3와 유사한 ESTs Map키나제 캐스케이드
Gas2 성장중지 특이적 2 성장중지 세포 내에서 고도발현,
액틴 세포골격의 일부,
카스파제-3의 표적, p53을 안정화
Wig1 야생형 p53 유도 1 p53표적, 종양세포 성장 억제
Pdcd2 프로그래밍된 세포사멸 2 알려지지 않음
Sfr3 스플라이싱 인자 RS 리치3 조직-특이적 차별 스플라이싱 세포주기 조절
Sfrs6과 매우 유사한 EST 추정 스플라이싱 인자
전-mRNA 스플라이싱 인자 Prp6과 매우 유사한 EST 추정 스플라이싱 인자
Snrp1c 소핵 리보뉴클레오프로테인 폴리펩티드 C U1 snRNPs, 스플라이세오솜의 구성성분
Phax RNA방출에 사용되는 포스포릴화 아댑터 U snRNA 핵방출 매개
NOL5 핵인 단백질 5(SIK와 유사) 전-rRNA 프로세싱
Nop56과 매우 유사한 EST 전-rRNA 프로세싱
Rnac RNA 시클라제 알려지지 않음
Ddx1과 매우 유사한 EST DEAD-박스 단백질, 추정 RNA 헬리카제
Eif4ebp1 단백질 1과 결합하는 진핵생물 번역개시 인자 4E 전사억제제, 수개의 신호 전달경로에 의해 조절(포스포릴화)
Eif4g2 진핵생물 번역개시 인자 4, 감마2 전사 억제제, 장배형성 및 ESC분화에 필요
Eif3s1과 매우 유사한 EST 번역억제인자
Mrps31 미토콘드리아 리보솜 단백질 S31 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Mrpl17 미토콘드리아 리보솜 단백질 L17 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Mrpl34 미토콘드리아 리보솜 단백질 L34 리보솜의 구성성분, 미토콘드리아
Hspa11 열충격 70kD 단백질계 1 (Hsc70t) 샤페론, 고환-특이적
Hspa4 열충격 70kD 단백질 4
(Hsp110)		 샤페론
Dnajb6 DnaJ(Hsp40) 동족체, 서브패밀리 B, 멤버6(Dnaj의 포유동물족) 공-샤페론
Hrsp12 열반응성 잠재적 샤페론
Tcp1-rs1 서열 1에 관련한 T-복합 단백질 1 잠재적 샤페론
Ppic 펩티딜프롤릴 이소머라제 C(시클로필린 C) 펩티딜-프롤릴 결합의 이성체화
Fkbp9 FK506-결합단백질 9(63kD) 잠재적 펩티딜-프롤릴 이소머라제
Fkbp13과 적당히 유사한 ESTs 잠재적 펩티딜-프롤릴 이소머라제
Ube2d2 유비퀴틴-공액화 효소 E2D2 E2, 단백질의 유비퀴틴화
Arih1 아리아드네 동족체 E3 가능성, 유비퀴틴 리가제
Fbxo8 F-박스 온리 8 추정SCF 유비퀴틴 리가제 서브유니트
Ubc13과 적당히 유사한 ESTs(bendless) 잠재적 E2, 단백질의 유비퀴틴화
Usp9x 유비퀴틴 프로테아제 9,
X 염색체		 단백질로부터 유비퀴틴 제거
Uchrp 유비퀴틴 c-말단 하이드로라제 관련 폴리펩티드 단백질로부터 유비퀴틴 제거가능성
Axo 악소트로핀 E3와 유사한 RING-CH도메인 함유,
유비퀴틴 리가제
Tpp2 트리펩티딜 펩티다제 II 세린 엑스포펩티다제,
프로테아솜과 관련
Cops4 COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 4		 Cop9시그널로솜, 다수의 신호전달경로의 통합, 단백질 분해 조절
Cops7a COP9(구조적 광형태 형성)
서브유니트 7a		 Cop9시그널로솜, 다수의 신호전달경로의 통합, 단백질 분해 조절
프로테아솜 26S 서브유니트와 매우 유사한 ESTs, 비-ATP아제, 12(p55) 프로테아솜의 조절 서브유니트
Nyren18 NY-PEN 18항원(NUB1) 인터페론-9 유도, Nedd8의 하향조절, 유비퀴논계 단백질
Rab18 Rab18, 멤버 RAS 암유전자 패밀리 small GTPase, 소낭수송 조절
Rabggtb RAB 게란일게라닐 트랜스퍼라제 b 서브유니트 Rob 단백질의 막결합 조절
Stxbp3 신탁신 결합 단백질 3 소낭/막 융합
Sec23a Sec23a(S. cerevisiae) ER에서 골지로 수송
코아토머 델타와 적당히 유사한 ESTs ER에서 골지로 수송
Abcb1 다제-내성 물질 1(Mdr1) 독성 화학물질 축출
Gsta4 글루타티온 S-트랜스퍼라제 4 산화적 스트레스에 반응
Gslm 글루타메이트-시스테인 리가제 조절제 서브유니트 글루타티ㄹ온 생합성
Txnrd1 티오레독신 리덕타제 티오레독신에 대한 환원성 등가물 전달
Txn1 티오레독신계 32kD 산화환원 밸런스,
단백질의 디설파이드 브릿지 감소
Laptm4a 리소좀-관련 단백질
트랜스막 4A(MTP)		 소분자를 리소좀으로 임포트
Rcn 레티큘로칼빈 ER단백질 Ca+2결합,
종양세포계에서 과발현
Supl15h Lec15 동족체의 억제제 돌리콜 포스페이트-만노즈의 ER합성,
GPI 앵커의 전구물질, N-글리코실화
Pla2g6 포스포리파제 A2,
그룹 VI		 인지질의 가수분해
Acadm 아세틸-조효소 A
데히드로게나제, 중쇄(medium chain)		 지방산 베타-산화
Suclg2 숙시네이트-조효소 A 리가제, GDP-형성, 베타 서브유니트 조절 서브유니트, Krebs 회로
Pex7 페록시솜 생물발생 인자 7 페록시솜 단백질 임포트 수용체
Gcat 글리신 C-
아세틸트랜스퍼라제(KBL)		 트레오닌을 글리신으로 전환
Tjp1 폐쇄이음부 단백질 1 폐쇄이음부의 구성성분, 폐쇄이음부 결핍 세포 내에서 카드헤린과 상호작용
또한 본 발명의 실시예는 본 명세서에 기술한 방법에 따라 제조된 재프로그래밍된 세포를 이용하여 다양한 질병을 치료하는 방법을 포함한다. 당해 분야의 숙련자는 본 명세서에서 제공하는 기술을 기초로 하여, 광범위한 다혈증 질병을 치료하는데 있어서 재생 의학의 가치 및 가능성을 인정할 것이다. 이러한 질병에는 심장병, 당뇨병, 피부병 및 피부이식, 척추 손상, 파킨슨병, 다발성 경화증, 알츠하이머병 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명은 손상되지 않은 새로운 세포의 도입이 치료적 해소의 형태를 제공하는 병을 치료하기 위하여, 인간을 포함한 동물에 재프로그래밍된 세포를 투여하는 방법을 포함한다.
당해 분야의 숙련자는 재프로그래밍된 세포가 재분화된 세포, 예를 들어 뉴런으로서 동물에 투여될 수 있으며, 동물에 있어서 병들거나 손상된 뉴런을 대체하는데 유용할 것이라는 점을 쉽게 이해할 것이다. 또한, 재프로그래밍된 세포는 동물에 투여되어, 주위 환경으로부터 신호 및 큐를 받으면 주변 세포 환경에 의해 지시되는 원하는 세포 타입으로 재분화될 수 있다. 이와 다르게, 세포를 시험관 내에서 재분화시킨 다음, 이 재분화된 세포를 필요로 하는 포유동물에 투여할 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 생체내 환경에서 오랜 기간 생존할 수 있도록 하기 위해 외과이식용으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 세포가 성장 및 보존되고 증식하여 포화상태(confluence)가 되도록 하기 위해서, 전구 배지(progenitor medium)와 같은 적합한 배양 배지 내에서 세포를 번식시킬 수 있다. 이 세포를 예를 들어, 트립신을 불활성화시키기 위한 5% 혈청 플러스 1 mg/ml의 포도당, 0.1mg/ml의 MgCl2, 0.1mg/ml의 CaCl2로 보강시킨(완전 PBS) 0.05% 트립신을 함유하는 포스페이트 완충염(PBS)과 같은 완충 용액을 사용하여 배양 기질로부터 느슨해지게 한다. 이 세포를 원심분리를 이용하여 PBS로 세척한 다음, 트립신을 함유하지 않는 완전 PBS 내에서 주입을 위해 선택된 밀도로 재현탁시킬 수 있다.
복막 투여에 적합한 약제 조성물은 활성 성분과 함께 멸균수 또는 멸균 등장수를 함유한다. 이러한 조성물은 일괄 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 주사투여용 조성물은 보존제를 함유하는 수회 사용량의 용기 또는 앰플과 같은 단위 사용 형태로 제조, 포장 또는 판매될 수 있다. 복막 투여용 조성물은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 부형제 중의 유화액, 페이스트, 및 매몰식 지속-방출 또는 생분해성 조성물을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 조성물은 또한 1종 이상의 추가 성분을 추가로 함유하며, 이러한 성분에는 현탁제, 안정화제, 또는 분산제가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 CNS, PNS, 피부, 간, 신장, 심장, 췌장 등을 포함한 신체의 질병 또는 외상을 치료하기 위해서 다른 치료적 절차와 함께 재프로그래밍된 세포를 외과이식하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 다른 세포와 함께 동시-외과이식될 수 있으며, 이 두 세포는 모두 환자에 유익한 영향을 주는 유전적으로 변형된 또는 비유전적으로 변형된 세포로서, 예를 들어 부신의 크롬친화성 세포, 태아 뇌조직 세포 및 태반 세포 등이 있다. 따라서 본 발명의 방법은 본 명세서에 제공되는 기술 내용을 인지한 당해 분야 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이 다른 치료적 절차와 함께 병행될 수 있다.
본 발명의 재프로그래밍된 세포는 각각 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 5,082,670 호 및 제 5,618,531 호에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 "나체 상태"에서 환자에게 또는 신체의 다른 적합한 부위에 이식될 수 있다.
재프로그래밍된 세포는 단일 세포들로 구성되는 혼합물/용액 또는 세포 응집체의 현탁액을 함유하는 용액으로서 이식될 수 있다. 이러한 응집체는 약 10 ~ 500마이크로미터, 보다 바람직하게는 약 40 ~ 50 마이크로미터의 직경을 가질 수 있다. 재프로그래밍된 세포 응집체는 구체 당 약 5 ~ 100, 보다 바람직하게는 약 5 ~ 20의 세포를 포함할 수 있다. 이식 세포의 밀도는 마이크로리터 당 약 10,000 ~ 1,000,000의 세포, 보다 바람직하게는 약 25,000 ~ 500,000의 세포의 범위를 가질수 있다.
본 발명의 재프로그래밍된 세포의 이식은 당해 분야에 잘 알려져 있는 기술, 더욱이 미래에 발전될 기술을 이용하여 달성될 수 있다. 본 발명은 재프로그래밍된 세포를 동물, 바람직하게는 인간에 이식, 외과이식, 주입 또는 도입하는 방법을 포함한다.
또한 재프로그래밍된 세포는 미세캡슐화(예를 들어, 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 4,352,883 호; 및 제 5,084,350 호 참조) 또는 거대캡슐화(예를 들어, 본 명세서에서 참고문헌으로 소개되는 미국 특허 제 5,284,761 호; 제 5,158,881 호; 제 4,976,859 호 및 제 4,968,733 호; 및 국제 공보 WO 92/19195; WO 95/05452 참조)를 포함하여 공지된 캡슐화 기술에 따라 캡슐화되어 생물학적 활성 분자를 전달하는데 사용될 수 있다. 거대캡슐화의 경우, 기구 내의 세포 수는 다를 수 있는데, 각 기구는 바람직하게는 103 ~ 109 세포를 포함하며, 보다 바람직하게는 약 105 ~ 107 세포를 포함한다. 몇몇 거대캡슐화 기구는 환자에 이식될 수 있다. 세포의 거대캡슐화 및 이식 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 미국 특허 제 6,498,018 호에 기술되어 있다.
또한 본 발명의 재프로그래밍된 세포는 치료 목적을 위해 또는 환자의 조직속에서 통합 및 분화를 추적하기 위해 외부 단백질 또는 분자를 발현하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 예를 들어 Sambrook et al.(1989, Molecular Coloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 Ausubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & sons, New York)에 기술한 바와 같이, 재프로그래밍된 세포 내로 외인성 DNA를 도입하는 방법 및 발현 벡터와 함께 재프로그래밍된 세포 내에서 외인성 DNA의 발현을 포함한다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법에 의해 제조되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 다른 한 실시예에서, 본 발명은 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 하나 이상의 유전자의 발현을 저해함으로써 재프로그래밍되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 하나 이상의 유전자의 발현을 유도함으로써 재프로그래밍되는 세포를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명의 실시예는 전사 억제에 관여하는 하나 이상의 유전자에 지향적인 하나 이상의 shRNA 또는 shRNAmir를 세포와 접촉시킴으로써 제조되는 재프로그래밍된 세포에 관한 것이다.
또한 본 발명의 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 재프로그래밍된 세포를 제조하고 ES계 세포 및 줄기세포계 세포를 생성하는데, 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자의 발현을 유도하는데, 및 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는데 사용될 수 있다. 키트는 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자에 지향적인 하나 이상의 shRNA 또는 shRNAmir를 함유할 수 있다. 키트는 다수의 shRNA 또는 shRNAmir 서열 또는 구조물을 함유할 수 있다. shRNA 또는 shRNAmir 구조물은 단일 용기 또는 다수 용기 내에 제공될 수 있다.
키트는 또한 세포가 재프로그래밍 되었는지를 결정하는데 필요한 시약을 함유할 수 있으며, 이러한 시약에는 세포가 다능성 또는 만능성이 되는데 기여하는 유전자가 유도되었는지를 테스트하기 위한 시약, 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자를 저해하는지를 테스트하기 위한 시약, 및 염색질 구조의 리모델링을 테스트하기 위한 시약이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
키트는 또한 재프로그래밍된 세포를 특정 계통 또는 다중 계통으로 분화시키기 위해 사용될 수 있는 작용제를 함유할 수 있으며, 이러한 계통으로는 뉴런, 골아세포, 근육세포, 상피세포 및 간세포 등이 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
키트는 또한 그 속에 제공되는 구성성분의 용도를 설명해 놓은 이해지도 자료를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "이해지도 자료"는 키트 속에 포함되는 본 발명의 방법의 유용성을 전달함으로써 분화된 세포의 재프로그래밍에 영향을 줄 수 있는데 활용될 수 있는 공보, 기록, 도표 또는 다른 표현 매체를 포함하는 의미로 사용된다. 이해지도 자료는 임의로 또는 번갈아서, 본 발명의 세포를 재분화 및/또는 교차분화(transdifferentiating)시키는 방법을 하나 이상 기술할 수 있다. 본 발명의 키트의 이해지도 자료는 예를 들어, 본 발명의 shRNA 또는 shRNAmir 혹은 그 구성성분이 들어있는 용기에 첨부될 수 있다. 아니면, 이 이해지도 자료는 수령인이 이해지도 자료와 shRNA 또는 shRNAmir 혹은 그 구성성분을 조합해서 사용하도록 하는 의도에서 용기와는 별도로 배달될 수 있다.
이제 본 발명은 다음의 실시예를 통해 설명될 것이다. 본 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 실시예로 인해 제한을 받지 않으며, 본 명세서에 제공되는 기술내용의 결과로서 이루어지는 것이 명백한 모든 변경을 포함한다. 미국 특허, 출원이 인정된 미국 특허 출원서 또는 공개된 미국특허 출원서를 포함한 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 참고사항으로서 본 명세서에 기재된다.
실시예
본 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 하기의 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1
DNA 메틸화, 히스톤 탈아세틸화 및 히스톤 메틸화에 기여하는 후생적 조절 구성성분(표 1 참조)을 침묵시키기 위해서, SMART 벡터인 shRNA-GFP-렌티바이러스를 인간의 일차 및 BJ 섬유아세포 배양액에 도입한다. 그러나, 어떠한 조절 구성성분도 본 발명의 방법을 이용하여 표적으로 될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 주요 후생적 조절 구성성분의 단일 효과 및 시너지 효과는 shRNA을 단독으로 및 2, 3, 4, 및 5개(이에 국한되는 것은 아님)를 배합하여 도입함으로써 테스트한다. 퓨로마이신-기초로 하는 선별을 행한 후에, 정량적인 실시간 RT-PCR으로 표적 유전자 침묵을 확인하기 위해서, 표적 shRNA를 구조적으로 발현하는 세포를 수확한다.
방법
세포 배양: Cell Applications, Inc.(San Diego, CA) 및 American Type Culture Collection(Manassas, VA)으로부터 각각 인간의 일차 섬유아세포(계대 1) 및 인간의 BJ 섬유아세포를 구매하고, 이것을 10% 소태아 혈청(FBS, Hyclone) 및 0.5% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Hyclone) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지한다. 세포를 성장시키고, 트립신 처리(trypsinization)한 후에 카운팅한 다음, shRNA를 도입시키기 전에 적당한 플레이팅 밀도를 달성하기 위해서 상기 표준 성장 배지 내에서 희석시킨다.
shRNA 렌티바이러스 제조 및 감염: 표 1에 기재되어 있는 구성성분의 불활성화를 위해, 고도 적정된 SMART 벡터인 shRNA 렌티바이러스(≥108 트랜스펙션 단위/ml)를 Dharmacon(Thermo Fisher Sceintific, www.dharmacon.com)로부터 입수할 수 있다. Dharmacon으로부터 고도의 기능성 장기간 유전자 침묵 기술을 활용하는데, 이는 기술된 바와 같이 녹색 형관 단백질(turboGFPTM) 시각화 및 퓨로마이신 선별을 위한 것이다. shRNA 렌티바이러스 감염 하루 전에, 인간 섬유아 세포를 2 ×105 세포/ml의 밀도로 살포한다. 그 다음날, 배지를 3ug/ml 폴리브렌(Sigma) 및 SMART 벡터인 shRNA 렌티바이러스(25 MOI)를 함유하는 예열된 배지로 대체한다. 감염시킨 후 8시간 후에, 배지를 새로운 배지로 대체하고, 감염 효율성을 측정하기 위해서 형광 현미경법에 의해 turboGFP 발현에 대해 세포를 평가한다. 감염시킨 후 3일 후에, 배양 배지에 퓨로마이신을 첨가함으로써 퓨로마이신 선별을 개시한다. 정량적인 실시간 RT-PCR를 이용하여 유전자 발현 정도를 측정함으로써 표적 유전자 침묵을 확인하기 위해서 선별된 세포를 수확한다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 shRNA-표적 유전자의 발현을 측정한다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technology) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조한다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)은 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen)를 이행한다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystem) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응의 템플릿(template)으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. 발현 정도는 사이클로필린(cyclophillin)에 대해 비처리된 대조용 세포와 비교한다.
억제 복합체의 구성성분의 발현을 저해하는 shRNA 서열 및 구조물을 확인한다. shRNA 서열 및 구조물의 다양한 배합은 앞서 기술한 방법을 이용하여 테스트되고 최적화될 수 있다. 또한 shRNAmir 서열 및 구조물이 사용할 수 있다. 억제 복합체의 구성성분의 발현을 저해하는 서열에 대한 선별을 위하여, shRNA 라이브러리 및 shRNAmir 라이브러리를 사용할 수 있다.
실시예 2
DNA 메틸화, 히스톤 탈아세틸화 및 히스톤 메틸화에 기여하는 단백질(이에 국한되는 것은 아님)을 포함한 후생적 억제성 조절 구성성분에 의해 다능 유전자가 체세포 내에서 전사적으로 침묵한다. DNA 메틸화, 히스톤 탈아세틸화 및 히스톤 메틸화를 유도하기 위해, 상기 구성성분을 shRNA에 의해 억제시킴으로써 염색질 구조를 변경시키고 다능 유전자의 전사를 가능하게 한다.
도 1에서 확인한 바와 같이 후생적 억제 복합체 표적을 염색질 변경에 대해 분석한다. 또한, 표적 shRNA를 구조적으로 발현시키고 표적 유전자 발현의 현저한 넉다운 또는 침묵을 유발하는 인간의 체세포를 다능 유전자의 상향 조절에 대해 분석한다.
전체적인 및 다능성 전사-특이적 DNA 탈메틸화, 히스톤 아세틸화 및/또는 히스톤 탈메틸화는 하기에 기술되는 방법을 이용하여 비처리된 대조용 세포와 비교함으로써 확인된다. 또한 다능 유전자인 Oct4, Nanog 및 Sox2(및 다른 줄기성-관련 유전자)에 대한 발현의 상향 조절은 정량적인 실시간 RT-PCR을 이용하여 비처리된 대조용 세포와 연방정부 승인의 인간 배아 줄기세포를 비교함으로써 확인된다.
전체적인 DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화 및 히스톤 메틸화의 정량화: 전체적인 DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화 및 히스톤 메틸화의 정도는 각각 Epigentek (Brooklyn, NY)의 MethylampTM 글로벌 DNA 메틸레이션, EpiQuickTM 글로벌 히스톤 아세틸레이션, 및 EpiQuickTM 글로벌 히스톤 메틸레이션 분석 키트에 의해 정량화된다. 간단히 기술하면, 세포 배양액로부터의 게놈 DNA(200ng)을 분석 웰 상에서 2시간 동안 37℃에서 배양시킨 후에, 30분 동안 60℃에서 배양시키고, 블로킹 완충액을 첨가하여 차단함으로서 부동화시킨다. DNA 메틸화의 양은 제조사의 프로토콜에 따라 고친화성 메틸시톤 항체 및 HRP-혼성 이차 항체를 이용한 반응을 기초로 하는 ELISA로부터 OD 강도(OD intensity)에 의해 측정된다.
전체 히스톤 아세틸화의 양을 측정하기 위해서, 제조사의 프로토콜에 따라 추출된 히스톤을 분석 웰상에 안정하게 스포팅(spotting)한다. 아세틸화된 히스톤 H3 또는 H4에 대한 항체로 배양한 후에, ELISA 리더(BioRad, Hercules, CA) 상에서 HRP-혼성 이차 항체-색상 전개를 통해 아세틸화 히스톤의 양을 정량화한다.
전체 히스톤 H3-K27 메틸화의 양을 측정하기 위해서, 제조사의 프로토콜에 따라 추출된 히스톤 단백질을 분석 스트립 웰상에 안정하게 스포팅한다. 메틸화된 H3-K27에 특이적인 항체로 배양한 후에, ELISA 리더(BioRad, Hercules, CA) 상에서 HRP-혼성 이차 항체 색상 전개를 통해 H3-K27의 양을 정량화한다.
전사-특이적인 메틸화의 비설파이트 시퀀싱( bisulfite sequencing ) 분석: 다능 유전자 프로모터의 메틸화는 비설파이트 시퀀싱에 의해 분석된다. 간단하게 기술하면, 페놀클로로포름-이소아밀알콜 추출에 의해 DNA를 정제한다. 제조사의 프로토콜(Zymo Research)에 따라 EZ DNA 메틸화 키트를 이용하여 비설파이트 전환을 수행한다. 비-CpG 디뉴클레오티드 내의 모든 시토신의 우라실로의 전환율은 100%이다. 전환된 DNA를 인간 Oct4, Nanog 및 SOX2에 대한 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시킨다. PCR 산물을 TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 의해 E.Coli로 클로닝시킨다. SP6 및 T7 프라이머로 시퀀싱함으로써 각 샘플의 10개 클론을 확인한다. 관심 대상인 각 프로모터에 대한 전체 메틸화 퍼센트 및 제시된 CpG에 대한 메틸화 시토신의 수를 대응 t-검정(paired t-test)을 이용하여 세포군 간에 비교한다.
히스톤 변형의 Q 2 ChIP 분석: 염색질 면역침강은 Dahl 및 Collas(Stem Cells: 25(4): 1037-46, 2007)에 의해 기술된 바와 같이 필수적으로 수행된다. Q2ChIP은 다능 유전자의 5' 조절 영역에서 히스톤 H3 변형의 변화를 모니터링하기 위해 사용된다. 간단하게 기술하면, 항체-비드 복합체를 제조하기 위해서, 상자성 비드(Dynabeads protein A; Dynal Biotech, Oslo, Norway)를 방사선면역침강 분석(RIPA) 완충액으로 세척한 다음, RIPA 완충액에 재현탁시킨다. 2.4㎍의 일차 항체를 함유하는 RIPA 완충액에 비드를 가한 다음, 4℃에서 2시간 동안 회전로 상에서 배양한다. DNA-단백질 교차 결합을 위해, 세포를 수확하기 직전에 20mM의 히스톤 데아세틸라제 억제제 부틸산 나트륨을 세포에 가한다(그 후 모든 용액에). 세포를 1 ~ 2×106 세포/ml의 수준으로 1% 포름알데히드를 함유하는 현탁액 내에서 고정시킨다. 교차결합된 세포를 PBS/20mM 부틸산염 내에서 세척한 다음, 부틸산염을 함유하는 용해 완충액 내에 용해시킨다. ~500개의 염기쌍의 염색질 단편을 생성하기 위해 분량(aliquots)을 초음파분해한다. 용해물을 침강시키고 그 상등액을 회수하여, 희석 분량으로부터 A260에 의해 염색질 농도를 측정한다. RIPA 완충액/부틸산염 속의 염색질을 항체-비드 복합체(상술한 내용 참조)가 들어있는 튜브로 이동시키고, 샘플을 상기와 같이 배양한다. 면역 복합체를 RIPA 완충액, 그 다음 TE 완충액으로 세척한다. 1% SDS 및 50㎍/ml 프로테이나제 K를 함유하는 용리 완충액 내에서 ChIP 물질을 배양하고, 1300rpm의 서모믹서(thermomixer) 상에서 2시간 동안 68℃에서 배양한다. 용리 완충액을 회수하고, ChIP 물질을 재추출한 다음, 두 상등액을 합한다. 한번은 페놀-클로로포름 이소아밀 알콜로, 한번은 클로로포름 이소아밀 알콜로 DNA를 추출한 다음, 에탄올 침강시킨다. 5㎕의 DNA로 개시되는 실시간 PCR에 의해 면역침강된 DNA를 삼중으로 분석한다.
다능 유전자 발현 분석을 위한 정량적인 RT - PCR : Oct4, Nanog, SOX2, 글리신 N-메틸트랜스퍼라제(Gnmt), REX-1(Zfp-42라고도 알려져 있음), 인테그린 α-6, Rox-1, LIF-R, TDGF1(CRIPTO), SALL4(sal-유사 4), LECT1, BUB1, Klf4 및 Kl5와 같은 다능 유전자의 발현은 Aim 1에서 기술한 바와 같이 실시간 RT-PCR에 의해 필수적으로 정량화된다. 발현 정도는 사이클로필린에 대해 비처리된 대조용 세포와 연방정부 승인의 인간 배아 줄기세포(ATCC)를 비교한다.
택맨 저밀도 어레이 분석( TLDA , Taqman Low Density Array analysis ): 다능 유전자 및 줄기성-관련 유전자의 상대적인 발현 정도를 정량화하기 위해, 정량적인 실시간 RT-PCR에 배아 줄기세포와 발생 유전자(developmental gene)를 포함하는 TLDA를 이용한다. 정량적인 실시간 RT-PCR에, 90개의 배아 줄기세포와 발생 유전자를 포함하는 Applied Biosystem Human Embryonic TaqmanTM Low Density Array(인간 배아 TLDA)를 이용한다. 간단하게 기술하면, ABI 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 RNA를 역전사한 후에, 인간 배아 TLDA 미세유동 카드의 포트 각각에 50㎕의 뉴클레아제가 없는 물 및 50㎕의 ABI Universal Taqman 2× PCR Master Mix 중 50ng 샘플 cDNA를 피페팅하고, ABI 7900HT Fast Real Time PCR System(Applied Biosystems, Foster City, CA)상에서 분석한다. 비처리된 대조용 세포 및 연방정부 승인의 인간 배아 줄기세포와 비교해서 처리된 세포의 유전자 발현 정도의 상대적인 양(배수 변화)를 계산하기 위해서 ΔΔCT법을 이용한다.
웨스턴 블로팅 : 다능 유전자 발현의 번역은 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯에 의해 확인된다. 간단하게 기술하면, 프로테아제 저해제 칵테일로 보강시킨 RIPA 완충액(Sigma, St. Louis, MO)을 세포 배양액에 가함으로써 총 세포 용해물을 제조한다. Abcam(Cambridge, MA)으로부터 구입한 MEL-1 hES 세포 용해물을 양성 대조군으로 사용한다. 세포 용해물(50㎍)을 전기영동에 의해 분리하고, PVDF 막(Millipore, Billerica, Nebraska)으로 이동시킨다. 이 블롯을 1시간 동안 블로킹 완충액(Licor Biosceince, Lincoln, Nebraska)으로 차단시키고, 린스한 다음, 4℃에서 밤새 일차 항체로 배양한다. 제조사의 프로토콜에 따라 IRDye800TM 또는 Cy5.5(Rockland, Philadelphia, PA)와 같은 형광 라벨을 붙인 이차 항체를 포함하는 오디세이(Odyssey) 영상 시스템(Licor Biosceince, Lincoln, Nebraska)을 이용하여 밴드를 가시화한다. 웨스턴 블로팅에 사용되는 항체는 여러 제조사로부터 입수가능하다. 즉, Oct3/4(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California); Sox(Chemicon, Temecular, CA); β-액틴, 로딩 콘트롤(BD Biosceinces, San Jose, CA); Alexa 혼성화 항 생쥐 및 염소 IgG(Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA); IRDye800TM 혼성화 항 토끼 IgG(Rockland, Philadelphia, PA); 및 Nanog(R&B Systems, Minneapolis, MN).
실시예 3
다능 유전자(즉, Oct4, Nanog, Sox2 및/또는 다른 줄기성-관련 유전자)에 대한 상향 조절을 유발하는 표적 shRNA를 구조적으로 발현하는 퓨로마이신-선별 인간 체세포의 시험관내 및 생체내 분화 능력, 및 인간 ES 세포 배양액 조건하에 콜로니 단위를 형성하는 능력을 평가함으로써, 후생적 억제 표적을 분석한다. 이를 달성하기 위해서, 인간 (ES) 세포 배양액 조건하에 세포를 배양하고 배아 줄기세포-유가 콜로니 형성을 정량화한다. 그 다음, 하기에 기술한 칵테일을 이용하여 다중 계통으로의 시험관내 유도 분화를 위해 콜로니를 수확한다. 또한 생체내 기형종 형성 능력을 평가하기 위해, 콜로니 세포를 면역 결핍된 누드 마우스(nude mouse)에 투여한다. 전술한 바와 같이 평가된 표현형을 비처리된 대조용 세포와 연방정부 승인의 인간 배아 줄기세포와 비교한다.
콜로니 단위 형성을 위한 인간 ES 세포 배양액: 억제 복합체의 구성성분에 지향적인 shRNA를 구조적으로 발현하는 퓨로마이신-선별 체세포를, 4ng/ml의 bFGF(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 함유하는 인간 ES 세포 배지(hSC Medium; Invitrogen, Carlsbad, CA) 속에서 확립하고 유지한다. 생쥐 배아 섬유아세포(MEF, CF1 균주)는 ATCC(Manassas, VA)로부터 구매하고, 이것을 10㎍/ml의 미토마이신 C(Roche, Basel, Switzerland)로 처리함으로써 유사분열 불활성화시킨다. 이 세포들을 플레이팅하기 직전에, MEF를 PBS로 2회 린스한다. 콜로니의 크기 및 양에 의해 결정되는 계대에 대한 준비가 될 때까지 매일 세포에 영양공급을 한다. 세포를 계대하는 동안, PBS로 2회 세척하고 DMEM/F12 중의 필터-멸균된 1 mg/ml 콜라게나제 IV로 배양한다. 콜로니가 분리되기 시작하면, 이것을 수거하여 적절한 용량의 배양 배지로 세척한다. 4일 내지 7일마다 1:3과 1:6 사이의 비율로 세포를 계대한다.
시험관내 유도 분화:
1. 신경세포/신경교세포 분화: 신경세포 분화를 유도하기 위해서, 당해 분야에 알려진 유도물질 칵테일에 처리된 세포를 노출시킨다. 간단하게 기술하면, 예를 들어 2 ~ 5 계대와 같은 계대로부터의 탈분화된 세포를 80% 포화도(confluence)가 될 때까지 증식시키고, PBS로 신속하게 세척한 후에 신경세포 유도 배지(NIM)를 가한다. NIM은 혈청이 없는 α-MEM으로 구성되며, 여기에 부틸화 하이드록시아니졸(200μM), KCL(5nM), 발프로산(2mM), 포스콜린(10μM), 하이드로코르티존(1μM), 및 인슐린(5㎍/ml)이 첨가된 배지이다. 신경세포 유도 배지에 노출시킨 후 5시간 내지 15일 이내에 실험을 수행한다.
신경세포 분화 분석
A. 생존성 검사: 신경세포 유도 배지에 노출시킨 후 탈분화된 세포의 생존성을 측정하기 위해서, 색소 배제 검사(dye exclusion assay)를 이용한다. 유도 후 1 ~ 5일에 매일 Hoechst 염료(200㎍/ml)(Intergen; Purchase, NY)를 배양액 속의 세포에 첨가한다. 신경으로 유도된 세포와의 비교를 위해 대조용 배지 속에서 증식된 세포의 생존성을 측정한다. 생존성은 예를 들어, 쓰리 논오버래핑 필드와 같은 논오버래핑 필드(non-overlapping field)에서 상 현미경법을 이용하여 살아있는 세포를 카운팅함으로써 결정된다. 대조용 세포와 유도 세포 사이의 차이는 스튜던트 t-검정(Student's t-test)을 이용하여 비교한다. 이 검사는 모든 분화 유도 처리에 있어서 표준이 된다.
B. NMDA-유도 흥분세포독성(excitotoxicity) 검사: 글루타메이트 길항물질 N-메틸-D-아스파르트산(NMDA)에 대한 탈메틸화 세포의 반응을 측정하기 위해서, NMDA가 세포 생존성에 미치는 영향을 정량화한다. 세포의 트리플리케이트 배양액을 억제 또는 유도 배지 내에서 24시간 동안 증식한다. 이 세포를 500 ~ 1000μM NMDA에 30분 동안 노출시킨다. 대조용으로서, 한 그룹의 세포를 1000μM NMDA 및 NMDA 길항물질인 Dizocilpine(MK-801)(10μM) 둘 다에 30분 동안 노출시킨다. NMDA에 노출 후 세포를 Hoechst 염료로 배양시키고 나서, ±SD로 표현되는 수치를 사용하여, 예를 들어 쓰리 논오버래핑 필드와 같은 논오버래핑 필드에서 상 현미경법에 의해 살아있는 세포를 카운팅함으로써 세포 생존성을 조사한다.
C. 면역세포 화학: 표현형을 결정하기 위해, 챔버 슬라이드(LabTek, Napersville, IL) 상에서 억제 또는 유도 조건하에 세포를 증식시킨다. 신경세포 유도 후(5시간 ~ 15일) 다양한 시점에서, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시킨다. 고정 후에, 세포를 다음과 같은 신경세포 및 신경교세포 마커에 대항성인 특이적 모노클론 항체로 배양시킨다. 즉, 네스틴, GFAP, S-100, NeuN, MAP2, β-투불린 III, 타우, NMDAR-1, g-아미노부틸산(GABA), 5HTP, TH, DDC, GAP-43, 시납신I, panα-1 전압차-개방 칼슘 채널(이 모든 것은 Chemicon, Inc로부터 구입가능함; Temecula, CA) 및 NMDAR-2(Santa Cruz Biotechnology) 등이 있다. ABC 증폭 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA 및 Santa Cruz Biotechnology)는 모든 항체와 함께 사용할 수 있다. NeuN와 GFAP, 또는 MAP2와 타우의 동시 발현을 확인하기 위해서, 세포를 각 항체로 순차적으로 배양한다. 항체를 라벨링하기 위해서, Texas Red 및 형광 아비딘(Vector Laboratories 및 Santa Cruz Biotechnology)을 구비하는 아비딘/qdhxls 블로킹 키트를 사용한다. 신경세포 유도 후 1 ~ 15일에, 브라이트 필드 및 상-대조 현미경법을 이용하여 형태를 검사하고 사진을 찍는다. 두명의 독립적인 조사자가 3개의 다른 실험의 최소치로부터의 배양액을 이용하여, 임의의 논오버래핑 비주얼 필드에서 필드 당 양성 세포의 퍼센트를 계산한다.
웨스턴 블롯: 뉴런 유도 후의 단백질 발현을 확인하기 위해서, 뉴런 유도 후 1 ~ 15일 후에 대조용 및 실험용 조건하에 증식된 세포를 수확하고, 필수적으로 앞서 기술한 바와 동일한 절차를 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행한다. 쥐의 뇌 추출물은 양성 대조용으로서 역할을 하고, 액틴은 내부 단백질 대조용으로서 역할을 한다.
실시간 택맨 RT-PCR: 또한, 네스틴, 중간필라멘트(intermediate filament)M 및 NeuN, S-100, MAP2, β-III 투불린 및 글루타메이트 수용체 서브유니트 NR-1 및 NR-2와 같은 신경세포 관련 마커를 필수적으로 앞서 기술한 바와 같은 실시간 택맨 PCR에 의해 선별한다.
2. 골세포 분화: 탈메틸화 세포의 골아세포류 세포로의 분화 능력을 결정하기 위해, 포화 세포(대조용 및 실험용)를 10% FBS, 200μM 아스코르브산 2-포스페이트, 100nM 데크사메타존, 7mM β-글리세로포스페이트 및 1nM 1α, 25-디하이드록시비타민 D3로 보충시킨 DMEM-F12 내에서 20일 동안 증식시킨다. 유도 후에, 세포는 시험관 내의 세포 밖 매트릭스의 광물화 증거를 나타내기 시작하며, 표현형과 관련된 유전자 및 단백질을 발현한다. 알파 1(I)-프로콜라겐, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, 골 타액단백질(bone sialoprotein), ALP 및 cbfa1(이에 국한되는 것은 아님)을 포함한 골세포 분화를 암시하는 마커는 필수적으로 앞서 기술한 바와 같은 방법을 이용하여 실시간 택맨 PCR 및 면역화학법에 의해 분석된다. 추가로, 제조사의 프로토콜(Sigma, St. Louis, MO)에 따라 시그마 진단 키트 85를 이용하여 골아세포를 검출하기 위해, 세포를 10% 완충 포르말린 내에서 고정시키고, 알칼리성 포스파타제 조적화학법을 수행한다.
3. 근육세포 분화: 대조용 및 실험용 세포의 근육세포류 계통으로의 분화는 10% 말 혈청으로 보충시킨 DMEM-F12로 배양한다. 근육 마커인 MyoD, 미오게닌, 트로포닌T, 티틴 및 미오신의 발현은 필수적으로 앞서 기술한 바와 같은 방법을 이용하여 분석된다.
4. 간세포 분화: 간세포 분화는 Talens-Visconti et al(World J Gastroenterol., Sep 28;12(36):5834 -45, 2006)에 의해 기술되는 바와 같이 성장 인자 및 시토킨을 순차적으로 첨가하는 2-단계 프로토콜을 이용하여 수행된다. 간단하게 기술하면, 간세포 분화의 유도 전에, 세포 증식을 중지시키기 위해서, 20ng/ml EGF 및 10ng/ml bFGF로 보충시킨 혈청없는 DMEM 내에서 세포(85% 포화도)를 배양한다. 2일 후에, 다음과 같이 2-단계 프로토콜을 수행한다. 1 단계 분화에서, 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF, 및 4.9μM/L 니코티아미드로 보충시킨 DMEM을 함유하는 배지 내에서 7일 동안 배양하고, 그 다음, 2단계 분화에서, 10ng/ml 온코스타틴M(OMS), 1μM/L 데크사메타존 및 10μM/ml 인슐린/트랜스페린/셀레늄(ITS, Sigma, St.Louis MO)+ 사전혼합물(최종 농도: 100μM/ml 인슐린, 6.25㎍/ml 트랜스페린, 3.6μM/L 아셀렌산, 1.25mg/ml BSA 및 190μM/L 리놀레산)으로 보충시킨 DMEM을 함유하는 배지 내에서 12일까지 배양하여 세포 성숙이 달성된다. 배지는 매주 2회 교체되며, 간 분화는 앞서 기술한 바와 같이 간-관련 유전자(C/EBP, HNF4, CYP3A4)에 대한 RT-PCR에 의해 평가된다.
생체내 기형종 형성: 표적 shRNA, 비처리된 대조용 세포, 및 연방정부 승인의 인간 ES 세포를 구조적으로 발현하는 퓨로마이신-선별 인간 체세포로부터 확립된 콜로니 세포를 약 10 밀리온 세포/ml의 농도로 250㎕의 멸균 BD Materigal(BD Biosceinces, San Jose, CA) 내에서 재현탁시키고, 이것을 6주된 암컷의 면역결핍 무흉선 누드 마우스(Charles River; 25/그룹)에 투여한다. 추가적 서브세트의 생쥐에는 부형제 대조용 그룹으로서 역할을 하기 위해 Materigal 만을 투여한다. 이소플루란(isoflurane) 마취 하에, 일상적인 피하 삽입 후에 바늘 끝을 오른쪽과 왼쪽으로 흔들어서 피하 포켓을 형성함으로써 생쥐에 세포 현탁액을 투여하고 난 다음, 제조사의 지시사항에 따라 이 포켓 속으로 Materigal 세포 현탁액을 투여한다. 투여 부위는 일반적으로 조사되며, 각 그룹의 5마리 생쥐는 투여 후 2, 4, 6, 8, 및 12주 후에 안락사시킨다. 안락사 후에, 계통- 및 조직-특이적인 염색에 의해 입증되는 바와 같이 다중 분화 세포 타입 및 계통 특이적 조직을 포함하는 기형종을 확인하기 위하여, 조직 검사를 위해 투여 부위 및 또렷이 보이는 덩어리를 절개하고 고정시킨다.
배양액 중 세포는 다능 세포를 나타내며, 예를 들어 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 및 95-100% 다능 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 배양액 중 세포는 만능 세포를 나타내며, 예를 들어 1-5%, 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 및 95-100% 만능 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 배양액 중 세포는 다양한 세포군을 나타내며, 예를 들어 다능 세포, 만능 세포, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11-20, 21-30 및 30 초과의 계통으로 분화될 수 있는 세포를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다능성 또는 만능성과 관련된 세포 표면 마커의 발현을 기초로 하는 세포를 분리하기 위해서 FACS를 이용하여 그 잠재성이 복원되는 세포를 풍부하게 하는 프로토콜을 사용할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 본 방법은 억제성 후생적 표적을 확인하기 위해서 사용될 수 있다. 다른 한 실시예에서, 억제성 후생적 구성성분, 예를 들어 단백질의 저해는 DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화 및/또는 히스톤 메틸화(이에 국한되는 것은 아님)를 포함한 후생적 변화를 유도할 수 있으며, 세포가 모든 계통으로 재분화될 수 있는 것을 확인시켜 준다. 또 다른 실시예에서, 본 방법은 염색질 구조의 변경 및 분화능의 체세포로의 복원을 가능하게 한다.
실시예 4:
다능 유전자의 발현에 미치는 효과를 알아보기 위해 DNMT1에 지향적인 shRNA 구조물을 조사하였다. 이 실험에서, shRNA는 DNA 메틸트랜스퍼라제에 지향적이지만, 하나 이상의 다능 유전자의 발현을 증가시키는 어떠한 shRNA 구조물도 사용될 수 있다.
방법
세포 배양: 성인 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications, Inc.(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 성인 인간 진피 섬유아세포를 DNMT1에 지향적인 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. 렌티바이러스 구조물은 Turbo GFP 리포터를 함유하였다. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였으며, 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GTCTACCAGATCTTCGATA
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리젤(matrigel; BD Biosceinces, San Jose, CA)이 첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에서 배양되었다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-4 및 DNMT1의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-4 및 DNMT1의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
면역조직 화학: 면역조직 검사를 위해서, 표적 shRNA-감염 세포 및 대조용 세포를 챔버 슬라이드(LabTek, Napersville, IL) 상에서 증식시켰다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 다능 마커(Oct-3/4, Nanog, Sox-2, 및 SSEA4; Abcam, Cambridge, MA)에 대항적인 특이적 항체로 배양시켰다. 녹색 형광 광선을 구비한 현미경(Nikon Corporation, Tokyo, Japan) 상에서 세포를 관찰하였다.
결과
도 1A에 도시한 바와 같이, Oct-4 발현은 DNMT1 shRNA로 감염된 HDF에서 증가되었다. 이와 반대로, DNMT1 발현은 DNMT1 shRNA로 감염된 HDF에서 감소되었다. Oct-4 발현의 증가는 트랜스펙션 후 5일에 피크를 나타내었다.
도 1B는 퓨로마이신 존재하에 DNMT1 shRNA로 감염되고 배양된 HDF의 데이터를 보여준다. Oct-4 발현은 증가되었으며, 테스트된 기간 동안 유지되었다. DNMT1 발현은 DNMT1 shRNA의 존재하에 감소되었다.
콜로니 내에서의 turboGFP, Oct4, Sox-2, 및 SSEA4 발현은 특이적 항체 및 녹색 형광 현미경을 이용한 면역조직 화학에 의해 가시화되었다. 도 2A는 DNMT1의 shRNA 넉다운 후에 형성된 배아 유사체의 사진이다. 도 2B는 렌티바이러스 감염을 확인시켜주는 것으로, 도 2A에서 보여준 배아 유사체 내에 존재하는 세포에서 GFP가 위치하고 있는 것을 보여주는 사진이다. 도 2C는 DNMT1의 shRNA 넉다운 후에 형성된 배아 유사체의 사진이다. 도 2D는 도 2C에서 보여준 배아 유사체에서 DNMT1의 shRNA 넉다운에 의해 유도되는 Sox2 단백질의 발현을 보여주는 사진이다. 도 2E는 DNMT1의 shRNA 넉다운 후에 형성된 배아 유사체의 사진이다. 도 2F는 도 2E에서 보여준 배아 유사체에서 DNMT1의 shRNA 넉다운에 의해 유도되는 Oct4 단백질의 발현을 보여주는 사진이다. 도 2G는 배양액 내에서 증식하는 섬유아세포의 사진이다. 도 2H는 도 2G에서 보여준 배아 유사체에서 DNMT1의 shRNA 넉다운에 의해 유도되는 SSEA4 단백질의 발현을 보여주는 사진이다.
이러한 데이터는 shRNA 렌티바이러스 감염을 이용한 DNMT1 mRNA 간섭으로 인해 Oct4, Sox-2, 및 SSEA4 항체로 양성적으로 염색되는 배아 유사체를 형성할 수 있다는 것을 입증한다. DNMT1 shRNA 감염 후 인간의 진피 섬유아세포로부터 몇몇 콜로니가 관측되었다. shRNA 발현 마커로서 녹색 형광 단백질을 이용하였다.
실시예 5:
방법
세포 배양: 태아 및 신생아 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications, Inc.(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 성인 인간 진피 섬유아세포를 DNMT1에 지향적인 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. 렌티바이러스 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였으며, 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GTCTACCAGATCTTCGATA
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리젤(BD Biosceinces, San Jose, CA)이 첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에 배양되었다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-4, DNMT1 및 Sox-2의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-4 및 DNMT1의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과
도 3A에 도시한 바와 같이, Oct-4 발현은 DNMT1 shRNA로 감염된 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 증가하였다. Oct-4 발현은 약 2일에 피크를 나타내었다. DNMT1 발현은 DNMT1 shRNA로 감염된 세포에서 감소하였다. Oct-4 발현은 퓨로마이신 존재하에 증식된 DNMT1 shRNA 감염 세포에서(도 3B) 및 퓨로마이신과 hES 배양액 내에서 증식된 세포에서(도 3C) 증가하였다. 모든 배양 조건하에서, DNMT1 발현은 감소하였다(도 3A ~ 3C).
shRNA 렌티바이러스의 인간 진피 섬유아세포로의 초기 감염 효율성은 약 70 ~ 80%이다. 퓨로마이신을 함유하는 배지 내에서 세포를 배양하면, shRNA 구조물이 퓨로마이신 저항 유전자를 포함하고 있기 때문에, 오직 shRNA 렌티바이러스 감염 세포들만 선별할 수 있다. hES 세포 배양 조건하에서의 배양은 재프로그래밍 세포의 효능과 효율성에 기여하며, 분화능을 세포에 복원시켜 주는데 기여한다.
Oct-4 발현은 또한 DNMT1 shRNA로 감염된 다른 세포 타입에서도 증가하였다. 예를 들어, Oct-4 발현은 DNMT1 shRNA로 감염된 신생아 인간 진피 섬유아세포(HDFn)에서 증가하였다(도 4A ~ 4C). Oct-4 발현의 증가 정도는 다른 여러 배양 조건에 따라 달라지는데, 예를 들어 퓨로마이신과 hES 배양액 존재하에 배양된 HDFn 세포에서는 Oct-4 발현이 크지않은 수준으로 증가하였음을 보여준다. 감염된 HDFn 세포에 대해 테스트된 모든 배양 조건하에서, DNMT1 발현은 감소하였다.
이러한 결과는 다능 유전자의 침묵 및/또는 전사 억제에 관여하는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하기 위해 shRNA를 사용함으로써 다능 유전자의 발현이 증가될 수 있다는 것을 입증한다. DNA 메틸트랜스퍼라제에 지향적인 shRNA는 다능 유전자의 발현을 증가시켰다. 이러한 방법론은 세포를 프로그래밍하는데 및 분화능을 세포로 복원시키는데 사용될 수 있다. 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 어떠한 shRNA 구조물도 사용될 수 있다. 당해 분야에 숙련자는 본 실시예의 방법이 DNMT1의 범위를 넘어서까지 확장되며, 조절 단백질 또는 조절 단백질 패밀리 멤버에 지향적일 수 있다.
실시예 6
조절 단백질을 부호화하는 유전자에 지향적인 shRNA가 다능 유전자의 발현을 증가시키는 능력이 있는지를 조사하였다. 본 실시예에서는 Oct-4 및 Nanog를 분석하였다. 당해 분야의 숙련자는 본 방법이 세포를 프로그래밍하는데 및 분화능을 세포에 복원시키는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
방법
세포 배양: 성인, 태아 및 신생아 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications, Inc.(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 성인 인간 진피 섬유아세포를 HDAC7a 또는 HDAC11에 지향적인 shRNA 렌티바이러스로 감염시켰다. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였다. HDAC7a에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.2: GCTTTCAGGATAGTCGTGA
다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.3: AGCGAGAGGATAGTCGTGA
또한, 다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.4: TGGTGGTATACAATGCAGG
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신없이 배양되었다.
정량적인 RT - PCR : 실시간 RT-PCR에 의해 Oct-3/4 및 Nanog의 발현을 측정하였다. 간단히 기술하면, 제조사의 프로토콜에 따라 DNase I 분해에 의해 Trizol Reagent(Life Technologies, Gaithersburg, MD) 및 RNeasy Mini kit(Qiagen)를 사용하여 배양액으로부터 총 RNA를 제조하였다. 각 샘플로부터의 총 RNA(1 ㎍)는 올리고(dT)-프라이밍 역전사(Invitrogen; Carlsburg, MD)를 이행하였다. 7300 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems; Foster City, CA) 상에서 PCR 마스터 믹스를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행한다. 각 샘플에 있어서, PCR 반응에서 템플릿으로서 1㎕의 희석된 cDNA(1:10)를 가한다. Oct-3/4 및 Nanog의 발현 정도는 글리세랄데히드 3-포스페이트-데하이드로게나제(GAPD)에 대해 표준화되었다.
결과
서로 다른 2종의 히스톤 데하이드로게나제에 지향적인 shRNA 구조물을 조사하였다. 도 5A에 도시된 바와 같이, Oct-3/4 발현은 HDAC7 또는 HDAC11 shRNA로 감염된 성인 인간 진피 섬유아세포에서 약 2배 증가하였다. 발현 증가는 HDAC7a shRNA를 포함하는 퓨로마이신 존재하에 배양된 세포에서는 크지않은 수준이었다. 퓨로마이신 존재하에 및 부재하에 배양된 신생아 인간 진피 섬유아세포에서도 유사한 결과가 관찰되었다(도 5B). Oct-3/4 발현 증가는 태아 인간 진피 섬유아세포에서 특히 크지않은 수준을 보이는데(도 5C), 이는 태아 인간 진피 섬유아세포가 Oct-3/4 발현에 있어서, 성인 및 신생아 인간 진피 섬유아세포 보다 약 4배 높다는 사실로부터 줄기일 수 있다는 것을 보여준다.
Nanog 발현은 HDAC7a 또는 HDAC11 shRNA로 감염된 성인 인간 진피 섬유아세포에서 증가하였다(도 6A). 발현 증가는 퓨로마이신 존재하에 및 부재하에 배양된 세포에서 관찰되었다. 퓨로마이신 존재하에 또는 부재하에 배양된 신생아 인간 진피 섬유아세포에서도 유사한 결과가 관찰되었다(도 6B). Nanog의 발현은 태아 인간 진피 섬유아세포에서 증가하였으나, 테스트된 모든 세포 타입의 경우처럼 급격한 수준은 아니었다. HDAC7a shRNA 및 HDAC11 shRNA 둘 다 Nanog 발현의 증가를 유발시키지만, HDAC7a에 대항하는 shRNA는 shRNA HDAC11과 비교했을 때, 보다 강한 효과를 제공하였다.
여기서 제시된 데이터에 의해 입증되는 바와 같이, HDAC에 지향적인 shRNA 구조물은 다능 유전자의 발현을 증가시킨다. Oct-3/4 및 Nanog 둘다는 HDAC7a 및 HDAC11에 지향적인 shRNA 구조물로 감염된 세포에서 증가하였다. 이러한 결과는 조절 단백질(양성 및 음성 조절제 모두)을 부호화하는 유전자에 지향적인 shRNA가 세포를 프로그래밍하는데 및 분화능을 세포에 복원시키는데 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7
다능 유전자의 발현을 위해, HDAC7, HDAC11 또는 DNMT1에 지향적인 렌티바이러스 shRNA로 감염된 세포를 염색하고 가시화하였다. 이 실시예에서는 Oct-4 및Sox-2의 단백질 발현을 분석하였으나, 당해 숙련자는 본 발명의 방법이 세포를 프로그래밍하는데 및 분화능을 세포에 복원시키는데 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
방법
세포 배양: 태아 인간 진피 섬유아세포를 Cell Applications, Inc.(San Diego, CA)로부터 구매하고, 이것을 섬유아세포 성장 배지(Cell Applications, San Diego, CA) 내에서 습도 95%, 5% CO2 하에 37℃에서 유지하였다.
렌티바이러스 감염: 태아 인간 진피 섬유아세포를 다음과 같은 조성을 가진 shRNA 중의 하나로 감염시켰다. 즉, (1) DNMT1에 지향적인 렌티바이러스 shRNA; (2) HDAC7에 지향적인 렌티바이러스 shRNA; (3) DNMT1 및 HDAC7에 지향적인 렌티바이러스 shRNA; 및 (4) HDAC7a 및 HDAC11에 지향적인 렌티바이러스 shRNA. shRNA 구조물은 Dharmacon으로부터 입수하였다. DNMT1에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.1: GTCTACCAGATCTTCGATA
HDAC7a에 지향적인 shRNA 구조물은 다음과 같은 서열을 가진다.
SEQ ID NO.2: GCTTTCAGGATAGTCGTGA
다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.3: AGCGAGACTTCATGGACGA
또한, 다음과 같은 서열을 가지는 shRNA 구조물은 HDAC11에 대항적이다.
SEQ ID NO.4: TGGTGGTATACAATGCAGG
인간 진피 섬유아세포를 제조사의 지시사항에 따라 shRNA으로 감염시켰다. HDF는 퓨로마이신 선별없이 마트리젤(BD Biosceinces, San Jose, CA)이 첨가된 hES 배양 조건(mTeSR Medium, Stem Cell Technology, Vancouver, BC, Canada)하에서 배양되었다.
면역조직 화학: 면역조직 검사를 위해서, 표적 shRNA-감염 세포 및 대조용 세포를 챔버 슬라이드(LabTek, Napersville, IL) 상에서 증식시켰다. 그 다음, 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 제조사의 프로토콜에 따라 다능 마커인 Oct-3/4(Abcam, Cambridge, MA)에 대항적인 특이적 항체로 배양시켰다. Oct3/4의 염색은 적색으로서 가시화되었다. 핵은 DAPI 염색(Vectorshield)으로 가시화되었으며, 청색으로 보인다.
결과
Oct-4 단백질 발현은 shRNA 간섭에 의해 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 증가하였다. 도 7A는 감염되지 않은 HDFf(음성 대조용)의 사진이며, 도 7G는 감염된 인간 배아 줄기세포(양성 대조용)의 사진이다. 음성 대조용 세포에서는, Oct-4 단백질 발현이 거의 검출되지 않았다. 도 7B는 DNMT1에 지향적인 shRNA로 감염된 HDFf 세포의 사진이다. 세포가 DNMT1 shRNA에 노출되면, Oct-4 단백질 발현이 명백히 증가한다. HDAC7 shRNA로 감염된 HDFf 세포에서는 Oct-4 단백질이 최소수준으로 검출되는 것을 보여준다(도 7C). 이는 이러한 특정 샘플의 프로세싱 때문으로 보인다.
DNMT1 및 HDAC7 shRNA로 감염된 세포는 Oct-4 단백질 발현의 급격한 증가를 보여주었다(도 7D). DNMT1 및 HDAC7 shRNA 둘 다로 처리된 세포는 인간 배아 줄기세포(Invitrogen, Carlsbad, CA)와 매우 유사한 발현 패턴을 나타내었다(도 7G). 이러한 데이터는 Oct-4 유전자 발현의 증가가 Oct-4 단백질 발현의 증가를 유발한다는 것을 보여주는 본 실시예의 데이터와 일치한다. DNMT1 및 HDAC11은 전사 조절 및 염색질 리모델링에서 별개의 기능을 가진다. 두 개의 별도의 조절 그룹의 멤버의 저해로 인해 Oct-4 발현의 급격한 증가가 이루어졌다. DNMT1 및 HDAC11로 감염된 세포에서도 Oct-4 단백질 발현이 증가하였다(도 7E). DNMT1 및 다중 HDAC의 저해로 인해 Oct-4 단백질 발현이 증가하였다.
HDAC7 및 HDAC11 shRNA로 감염된 세포에서는 Oct-4의 발현 증가가 전혀 검출되지 않았다(도 7F). 이러한 결과는 실험 시스템의 제한으로 인해 나타날 수 있다. 다른 면에서, 이러한 결과는 다능 유전자 발현의 적절한 증가를 암시하는데, 이때 다중 경로가 억제되어야 한다. 별개의 조절 복합체 내에서 기능을 가지는 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해함으로써, 다능 유전자의 발현 정도를 증가시킬 수 있다. 이러한 조절 복합체의 멤버는 억제될 수 있다.
Sox-2 단백질 발현은 shRNA 간섭에 의해 태아 인간 진피 섬유아세포(HDFf)에서 증가하였다. 도 8A는 감염되지 않은 HDFf(음성 대조용)의 사진이며, 도 8G는 감염된 인간 배아 줄기세포(양성 대조용)의 사진이다. 음성 대조용 세포에서는, Sox-2 단백질 발현이 거의 검출되지 않았다. 도 8B는 DNMT1에 지향적인 shRNA로 감염된 HDFf 세포의 사진이다. 핵 염색은 뚜렷하게 눈에 보이지만, Sox-2 단백질은 단지 미미한 양이 검출되었다. HDAC7 및 DNMT1 shRNA로 감염된 HDFf 세포에서는 Sox-2 단백질이 최소수준으로 검출되는 것을 보여준다(도 8C). 이는 이러한 특정 샘플의 프로세싱 때문으로 보인다.
DNMT1 및 HDAC11 shRNA로 감염된 세포는 Sox-2 단백질 발현의 급격한 증가를 보여주었다(도 8D). 두 개의 별도의 조절 그룹의 멤버의 저해로 인해 Sox-2 발현의 급격한 증가가 이루어졌다. HDAC7 shRNA로 감염된 세포는 Sox-2 단백질 발현을 최소수준으로 보여주었다(도 8E). HDAC7 및 HDAC11로 감염된 세포에서도 Sox-2 단백질 발현이 증가하였다(도 8F). DNMT1 및 다중 HDAC의 저해로 인해 Sox-2 단백질 발현이 증가하였다.
본 명세서에서 특정 실시예를 설명 및 기술하고 있지만, 당해 분야 숙련자는 같은 목적을 달성하는 것으로 생각되는 어떠한 배합도 기술된 특정 실시예를 대체할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 출원서는 본 발명의 원리에 따라 이루어질 수 있는 어떠한 수정 또는 변경도 포함한다. 그러므로, 본 발명은 본 출원서의 특허청구범위 및 그 균등물에 의해서만 제한된다. 본 출원서에서 인용한 특허, 참고문헌 및 공개자료에 대한 기술은 참고문헌으로 포함된다.

Claims (19)

  1. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물에 세포를 노출시키는 단계; 다능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며, 분화능(differentiation potential)이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 상기 shRNA 구조물에 노출시키기 전과 후의 세포의 표현형을 비교하는 단계 및 복원된 분화능과 일치하는 표현형을 가진 세포를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 선별된 세포를 세포군으로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자에 의해 부호화되는 단백질 또는 세포 표면 마커에 지향적인 항체를 이용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 세포 표면 마커는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계 전에, 상기 shRNA 구조물에 노출시키기 전의 상기 다능 유전자의 염색질 구조와 상기 shRNA 구조물에 노출시킨 후에 얻어지는 염색질 구조를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 조절 단백질을 부호화하는 유전자는 DNA 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데아세틸라제, 리신 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 데메틸라제, 리신 데메틸라제, 시르투인, 메틸 결합 도메인 단백질, 히스톤 메틸트랜스퍼라제로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Sox-2 및 Nanog로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 소분자 억제제에 제 1 전사 패턴을 가진 세포를 노출시키는 단계; 다능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 세포의 제 1 전사 패턴과 상기 억제제에 노출시킨 후에 얻어지는 전사 패턴을 비교하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 억제제에 노출시킨 후의 전사 패턴이 배아 줄기세포로부터 분석된 전사 패턴과 적어도 50% 유사한 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항에 있어서,
    전사 패턴을 비교하는 단계 전에, 상기 shRNA 구조물에 노출시키기 전과 후 세포의 표현형을 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9 항에 있어서,
    상기 선별된 세포를 세포군으로 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 다능 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 다능 마커에 지향적인 항체를 이용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서,
    상기 세포를 선별하는 단계는 선별가능한 마커에 대한 저항물질 또는 리포터 분자를 이용하여 세포를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 9 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Sox-2 및 Nanog로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 조절 단백질을 부호화하는 유전자의 발현을 저해하는 shRNA 구조물에 세포를 노출시키는 단계; 다능 유전자의 발현을 유도하는 단계; 및 세포를 선별하는 단계를 포함하며 분화능이 상기 세포에 복원되는 것을 특징으로 하는 방법에 따라 제조되는 농축 재프로그래밍 세포군.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 재프로그래밍 세포는 SSEA3, SSEA4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 세포 표면 마커를 발현하는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.
  18. 제 16 항에 있어서,
    상기 다능 유전자는 Oct-4, Nanog, 및 Sox-2 로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.
  19. 제 16 항에 있어서,
    상기 재프로그래밍 세포는 세포군의 적어도 60%를 차지하는 것을 특징으로 하는 농축 재프로그래밍 세포군.





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