KR20110025861A

KR20110025861A - 다능성 줄기세포의 제조방법

Info

Publication number: KR20110025861A
Application number: KR1020117002284A
Authority: KR
Inventors: 타츠지 에노키; 후미코 이와모토; 도시카츠 니시에; 타카히로 마루이; 후유코 다카시마; 이쿠노신 가토
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2008-07-07
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2011-03-11
Also published as: EP2295538A1; EP2295538A4; JP5688970B2; US20110117653A1; CN102144027B; KR101642790B1; WO2010004989A1; DK2295538T3; CN102144027A; US9238797B2; JPWO2010004989A1; EP2295538B1

Abstract

본 발명에 의하면, 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조시, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 및/또는 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정을 포함시킨다. 이것으로, 높은 빈도로 다능성 줄기세포를 유도, 육성시킬 수 있고, 다능성 줄기세포를 고효율로 제조할 수 있다. 당해 핵 초기화 인자로서는 예를 들면 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵 초기화 인자를 사용할 수 있다.

Description

다능성 줄기세포의 제조방법{METHOD FOR PRODUCTION OF PLURIPOTENT STEM CELL}

본 발명은 여러 종류의 세포에로의 분화능력을 유지한 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell)의 제조방법에 관한 것이다.

생물체의 모든 세포계열로 분화 가능한 다능성 줄기세포는 임의의 타입의 세포로 분화되고, 또 임의의 타입의 조직 또는 기관 등을 만들어 내는 잠재적 능력을 가지고 있다. 그 때문에 당해 세포를 사용하여 생물체에 있어서 소실된 세포를 재생하여 보충한다는 새로운 치료법(재생의료)에 응용하는 것이 기대되고 있다. 추가로 발생학, 분자생물학, 약학분야에 있어서의 연구툴로서도 이용 가능성을 지니고 있다.

다능성 줄기세포로서, 배반포와 불리는 단계의 초기 배아 중의 내부 세포괴로부터 수립되는 세포주인 배아 줄기세포(embryonic stem cell: ES 세포)가 알려져 있다. 그렇지만, 인간 배아를 파괴해서 제작되는 인간 ES 세포는 윤리적 관점으로부터의 반대도 많아, 그 연구가 제한되는 케이스도 적지않다.

이들 ES 세포의 문제점을 해소하기 위해서, 배아를 사용하지 않고 체세포에 인위적으로 유전자를 도입해서 유도되는 세포주인 다능성 줄기세포(유도 다능성 줄기세포: induced pluripotent stem cell: iPS 세포: 예를 들면 비특허문헌 1)가 개발되었다. 당해 세포는 세포의 전능성의 획득이나 유지에 관여하는 유전자를 인위적으로 체세포에 도입하는 것에 의해 제작된다. 현재, 그 제작수법, 이용방법에 관해서, 왕성하게 연구가 진행되고 있다.

상기 비특허문헌 1에는 OCT3/4, SOX2, c-MYC 및 KLF4의 4종의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 도입해서 인간 iPS 세포를 제작하는 방법이 개시되어 있다. 또, 다른 연구자로부터는 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28의 4종의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 도입에 의해 인간 iPS 세포를 제작하였다는 보고가 있다(비특허문헌 2). 그러나 이것들의 유전자가 도입된 모든 체세포가 iPS 세포에 유도되지 않고, 실제로는 그 일부만(총 세포수의 0.02% 이하)이 iPS 세포에 유도되는 것에 불과하다. 이 효율을 향상시키기 위해서, DNA의 메틸화를 저해하는 약제를 배지에 첨가하는 것이 시도되고 있다(비특허문헌 3). 또, c-MYC는 암 유전자로서, 의료에로의 응용을 실시할 때는, 도입된 세포의 암화(癌化)의 리스크가 불가피하기 때문에, c-MYC를 제거하여 iPS 세포를 유도하는 시도가 이루어지고 있지만, 그 경우, 유도효율은 더욱 저하된다(총 세포수의 0.001% 이하). 이렇게, 아직 iPS 세포 제작기술은 확립되었다고는 말할 수 없는 상황에 있다.

비특허문헌 1) 셀(Cell), 제131권, 861-872쪽, 2007년 사이언스(Science), 제318권, 1917-1920쪽, 2007년 네이쳐(Nature), doi:10. 1038/nature 07056, 2008년.

다능성 줄기세포의 이용을 도모하기 위해서는, 당해 세포를 효율적으로 제작하는 수법의 개발이 급선무이다. 본 발명의 목적은 다능성 줄기세포의 유도효율을 향상시키고, 당해 세포의 연구 및 이용을 촉진하는 것에 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의노력한 결과, 핵의 초기화에 관여하는 인자(본 명세서 중, '핵 초기화 인자' 라고도 언급한다)와 접촉시킨 체세포를 배양할 때, 당해 세포를 영양 기아 조건으로 처리하였을 경우에 ES 세포성 세포, 즉 다능성을 유지한 줄기세포가 고빈도로 유도되고, 다능성 줄기세포가 고효율로 안정적으로 제조할 수 있다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다. 또, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 유지하는 레트로바이러스 벡터를 체세포에 도입하였을 경우, 종래의 폴리브렌을 사용하는 방법에 비해서, 다능성 줄기세포의 유도효율이 향상되고, 고빈도로 다능성 줄기세포를 취득할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제 1 발명은, 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법에 관한 것으로, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 및/또는 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 제1 발명의 형태로서는, 영양 기아 조건으로 처리하는 공정이, 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정인 제조방법이 제공되고, 그 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정이, 저단백질 농도인 배지, 예를 들면 단백질 농도가 0∼0.5%인 배지를 사용해서 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포를 배양하는 공정인 제조방법이 제공된다. 또, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포가, 핵 초기화 인자가 첨가된 배양 배지에서 배양된 체세포, 핵 초기화 인자가 도입된 체세포, 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 체세포 및 약제에 의해 핵 초기화 인자의 발현을 유도시킨 체세포로 이루어지는 그룹에서 선택되는 체세포인 제조방법이 제공된다. 또, 핵 초기화 인자가 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵 초기화 인자인 제조방법도 제공된다.

본 발명의 제 2 발명은 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법에 관한다:

(1) 핵 초기화 인자를 체세포와 접촉시키는 공정, 및

(2) 상기 (1)에서 수득되는 체세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 및/또는 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정.

제 2 발명의 형태로서는, 상기　공정　(1)이, 핵 초기화 인자의 배양 배지에로의 첨가, 핵 초기화 인자 또는 당해 인자를 코딩하는 유전자의 체세포에의 도입 및 약제에 의한 체세포에 있어서의 당해 인자의 발현 유도로 이루어지는 군으로부터 선택되는 조작에 의해 실시되는 제조방법이 제공된다. 또, 공정　(2)의 영양 기아 조건으로 처리하는 공정이 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정인 제조방법이 제공되고, 그 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정이, 저단백질　농도의 배지, 예를 들면 단백질 농도가 0∼0.5%(w/v)인 배지를 사용한 배양에 의해 실시되는 제조방법이 제공된다. 또, 그 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정에 있어서, 사용하는 배지에 세포사 억제제를 함유시키는 것을 특징으로 하는 제조방법도 제공된다. 또, 핵 초기화 인자가 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵 초기화 인자인 제조방법도 제공된다.

본 발명의 제 3 발명은 제 1 또는 제 2 발명에 의해 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단을 제조하는 공정, 및 수득된 세포집단에서 다능성 줄기세포를 단리하는 공정을 포함하는 다능성 줄기세포의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 제 4 발명은, 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법에 관한 것으로, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 유지하는 레트로바이러스 벡터를 체세포에 감염시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 제4 발명의 형태로서는, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질이, 피브로넥틴, 섬유아 세포 증식인자, V형 콜라겐, 상기의 폴리펩티드의 프래그먼트, 폴리리신, DEAE-덱스트란 및 상기 물질유래의 레트로바이러스에 결합부위를 가지는 기능성 물질로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기능성 물질인 제조방법이 제공된다. 또 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질이 피브로넥틴의 헤파린-II 결합영역을 가지는 폴리펩티드인 제조방법도 제공된다. 또, 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자가 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자인 제조방법도 제공된다.

본 발명의 제 5 발명은, 제 4 발명에 의해 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단을 제조하는 공정, 및 수득된 세포집단에서 다능성 줄기세포를 단리하는 공정을 포함하는 다능성 줄기세포의 제조방법이 제공된다.

본 발명에 의해 수득된 다능성 줄기세포는 소망하는 세포에로의 분화능을 가지고 있으며, 또한 상기 다능성 줄기세포를 분화시켜서 수득되는 분화세포는 생체내에서 높은 생착성을 나타내기 때문에, 본 발명의 방법은 기초연구, 의료에로의 응용연구에 있어서 매우 유용하다.

도 1은 본 발명에 의해 수립된 iPS 세포 클론인 클론 #1 및 클론 #3, 및 포지티브 컨트롤인 253G1 및 네거티브 컨트롤인 인간 성인피부 섬유아 세포(NHDF-Ad)의 ES 세포의 마커 유전자 발현패턴을 나타내는 전기영동사진이다.
도 2는 수립된 iPS 세포 클론의 테라토마 형성능을 나타내는 3배엽 유래의 세포사진이다.
도 3은 수립된 iPS 세포 클론의 EB를 통한 분화유도에 의한 다분화능을 나타내는 사진이다.

이하에 본 발명에 대해서 상세하게 설명한다.

본 발명의 방법에 있어서, 체세포란 생물을 구성하는 세포 중, 생식세포 이외의 세포의 것을 나타낸다. 이들 체세포는 핵 초기화 인자를 접촉시키는 것에 의해, 리프로그래밍(reprogramming)이 일어나, 전능성을 획득할 수 있다.

체세포에 핵 초기화 인자를 접촉시키는 공정이란, 예를 들면 해당인자의 폴리펩티드를 체세포와 접촉하고 있는 배양 배지에 첨가하는 방법(예를 들면 셀스템셀(Cel lStem Cell), 제4권, 472-476쪽, 2009년), 당해 인자의 폴리펩티드를 체세포에 도입하는 방법, 당해 인자를 코딩하는 유전자를 체세포에 도입하는 방법, 혹은 화학물질 등(예를 들면, 5-아자-2' 데옥시시티딘, BIX-01294, PD0325901, 수버로일아닐라이드 하이드록삼산, 밸프로산 등)의 약제에 의해 체세포에 있어서 내재성의 당해 인자의 발현을 유도하는 방법, 또는 상기의 어느 하나의 방법의 조합 등에 의해 실시할 수 있다.

상기 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 체세포에 도입하는 방법으로서는, 예를 들면 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 통합한 벡터를 체세포에 도입하는 방법이 예시된다. 당해 벡터에는 특별하게 한정은 없고, 공지의 벡터에서 적절한 것을 선택해서 사용할 수 있다. 예를 들면 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 또는 비바이러스 벡터를 사용하는 방법의 어느 것이나 본 발명에 사용할 수 있다. 이것들의 벡터의 상세에 대해서는 이미 많은 문헌이 공표되고 있고, 이들 많은 문헌에서 적당하게 선택해서 사용할 수 있다.

상기에서 사용하는 바이러스 벡터에는 특별하게 한정은 없고, 통상, 유전자 도입 방법에 사용되는 공지의 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터, 슈도타입 벡터를 포함한다), 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 시미안바이러스 벡터, 백시니아바이러스 벡터 또는 센다이바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 상기 바이러스 벡터로서는 감염한 세포 중에서 자기복제할 수 없도록 복제능을 결손시킨 것이 바람직하다. 또, 유전자 도입 시에, 유전자 도입효율을 향상시키는 물질을 사용할 수도 있다. 유전자 도입효율을 향상시키는 물질로서는 바이러스 벡터에 결합하는 활성을 가지는 물질, 예를 들면 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프래그먼트 등의 물질을 들 수 있다. 적합하게는, 헤파린 결합부위를 가지는 피브로넥틴 프래그먼트, 예를 들면 레트로넥틴(등록상표, CH-296, 다카라바이오사)으로 시판되고 있는 프래그먼트를 사용할 수 있다. 또, 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 상기의 물질은 특히 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 유전자 도입에 호적하다. 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자는 1종류 또는 복수 종류의 바이러스 벡터에 통합해서 사용할 수 있다. 2종류 이상의 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 경우, 특히 복수 회의 바이러스 감염을 실시하는 경우에는, 상기의 유전자 도입효율을 향상시키는 물질, 특히 피브로넥틴 또는 피브로넥틴 프래그먼트를 사용하는 것이 호적하다.

종래, 다능성 줄기세포의 유도를 목적으로 한 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입에서는, 레트로바이러스의 세포에로의 감염효율을 향상시키는 작용을 가지는 합성 폴리 양이온인 폴리브렌이 사용되어 왔다. 본 발명자들은 폴리브렌을 사용하지 않고, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에, 레트로바이러스 벡터를 사용해서 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 체세포에 도입하였을 경우에는, 폴리브렌을 사용하였을 경우에 비교해서 다능성 줄기세포의 유도효율이 향상된 결과, 고빈도로 다능성 줄기세포를 취득할 수 있는 것을 처음올 발견하였다. 즉, 본 발명의 다른 형태로서, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 유지하는 레트로바이러스 벡터를 체세포에 감염시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법이 제공된다.

상기한 바와 같이, 본 형태에서는 렌티바이러스 벡터 또는 슈도타입 벡터를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

또, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질로서는, 당해 활성을 가지는 물질이라면 특별히 문제는 없지만, 예를 들면 피브로넥틴, 섬유아 세포 증식인자, V형 콜라겐, 상기의 폴리펩티드의 프래그먼트, 폴리리신 또는 DEAE-덱스트란 등이 있다. 또 상기물질유래의 레트로바이러스에 결합부위를 가지는 기능성 물질을 본 발명에 사용할 수 있다. 피브로넥틴의 프래그먼트로서는 분자내에 헤파린-II 결합영역을 가지는 것이 바람직한데, 그러한 프래그먼트는 예를 들면 국제공개 제97/18318호 팸플릿에도 기재되어 있다. 헤파린-II 결합영역을 가지는 피브로넥틴의 프래그먼트로서는 레트로넥틴(등록상표, CH-296, 다카라바이오사)이 예시된다. 또 이것들의 기능성 물질과 기능적으로 동등한 물질, 예를 들면 헤파린 결합성 부위를 가지는 기능성 물질도 사용할 수 있다. 또, 그 기능성 물질의 혼합물, 그 기능성 물질을 함유하는 폴리펩티드, 그 기능성 물질의 중합체, 또는 그 기능성 물질의 유도체 등을 사용할 수 있다.

또한, 레트로바이러스에 결합하는 활성과 함께 표적세포, 즉 유전자 도입하려고 하는 체세포에로의 결합 활성을 가지는 기능성 물질을 병용 하여도 좋고, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질 및 표적세포 결합활성을 가지는 기능성 물질을 병용 하여도 좋다. 표적세포 결합활성을 가지는 기능성 물질에도, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 표적세포에 결합하는 리간드를 가지는 물질을 들 수 있다. 그 리간드로서는 세포접착성의 단백질(피브로넥틴, 라미닌, 콜라겐 등) 혹은 그 프래그먼트, 호르몬, 사이토카인, 세포표면의 항원에 대한 항체, 다당류, 당 단백질, 당지질, 당 단백질 혹은 당지질 유래의 당쇄, 혹은 표적세포의 대사물 등을 들 수 있다.

본 발명의 호적한 형태에 있어서, 상기 기능성 물질은 적절한 고상, 예를 들면 세포배양에 사용되는 용기(플레이트, 배양접시, 플라스크 혹은 백 등) 또는 담체(마이크로 비드 등)에 고정화된 상태로 사용된다.

본 발명의 방법에 의하면, 저농도의 바이러스를 사용하여도 종래법에 비해서 고효율로 다능성 줄기세포를 취득할 수 있기 때문에, 사용 바이러스의 양을 대폭 삭감시키는 것이 가능하다.

또. 하기 실시예에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, OCT4, SOX2 및 KLF4의 3종류의 유전자만을 체세포에 도입한 경우에서도 종래법에 비해서 고효율로 다능성 줄기세포를 취득할 수 있다.

상기에서 사용하는 비바이러스 벡터로서는 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 플라스미드 벡터를 들 수 있고, 이것을 리포솜, 혹은 리간드-폴리리신 등의 담체를 사용해서 도입하는 방법, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법, 또는 입자총법 등으로 도입할 수 있다.

핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자는 통상, 적당한 프로모터의 제어하에 발현되도록 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터 등에 삽입해서 사용할 수 있다. 프로모터로서는 구성적으로 발현을 촉진시키는 것, 약제 등(예를 들면, 테트라사이클린 또는 독소루비신)에 의해 유도되는 것 등의 어느 것이나 사용할 수 있다. 또, 효율이 좋은 유전자의 전사를 달성하기 위해서, 프로모터 또는 전사 개시부위와 협동하는 다른 조절요소, 예를 들면, 인핸서 서열 또는 터미네이터 서열이 벡터 내에 존재할 수 있다. 또, 핵 초기화 인자 중, 1종류의 인자를 코딩하는 유전자만을 1개의 벡터에 통합할 수 있지만, 1개의 벡터에 복수의 인자를 코딩하는 유전자를 통합하여 사용할 수도 있다. 또, 당해 인자를 코딩하는 유전자에 부가하여, 당해 유전자의 도입을 확인하기 위한 마커가 될 수 있는 유전자(예를 들면. 약제내성 유전자, 리포터 효소를 코딩하는 유전자, 또는 형광 단백질을 코딩하는 유전자등)를 통합할 수도 있다.

본 발명에 사용 되는 핵 초기화 인자로서는 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG, 또는 LIN28 등이 알려지고 있고, 통상, 이것들의 복수, 바람직하게는 2∼3종 이상을 체세포에 접촉시킨다. 각종 생물(예를 들면, 인간, 마우스) 유래의 인자인 아미노산 서열정보, 당해 인자를 코딩하는 유전자의 염기서열 정보는 데이터베이스 상에 공개되어 있다. 상기 인자를 코딩하는 유전자는 데이터베이스에서 입수할 수 있는 서열정보를 바탕으로 단리하고, 혹은 인공적으로 합성하고, 취득할 수 있다. 또 이것들의 유전자를 도입한 형질전환체를 배양해서 수득되는 배양물에서 상기의 인자(폴리펩티드)을 취득할 수도 있다.

이하, 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 사용해서 다능성 줄기세포를 제작하는 방법에 대해서 설명한다.

(1) 핵 초기화 인자를 체세포와 접촉시키는 공정

본 발명에 사용되는 체세포에는 특별하게 한정은 없고, 임의의 체세포를 사용할 수 있다. 예를 들면 섬유아 세포, 전구지방세포, 간세포, 혈구세포, 피부각화세포, 간엽계 줄기세포, 조혈간세포, 또는 신경줄기세포 등의 체세포를 사용할 수 있다. 상기 체세포는 생체에서 채취된 것, 또는 세포주로서 수립된 것의 어느 쪽일 수 있다. 제작된 다능성 줄기세포 혹은 당해 세포에서 분화시킨 세포를 생체에 이식하는 것이 소망되는 경우에는, 그 생체 자신으로부터 채취된 체세포에서 다능성 줄기세포를 유도하는 것이 바람직하다.

핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자는 상기한 바와 같이 공지의 벡터를 사용해서 체세포에 도입되고, 도입된 유전자에서 상기 인자가 발현된다. 이렇게 해서 핵 초기화 인자와 체세포의 접촉이 달성된다.

핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 통합한 벡터를 복수 사용해서 유전자 도입을 실시하는 경우, 각 벡터를 차례로 체세포에 도입할 수도 있고, 또는 벡터의 혼합물을 제작해서 동시에 체세포에 도입할 수도 있다.

(2) 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정

핵 초기화 인자를 접촉시킨 체세포, 예를 들면, 상기 (1)에 기재된 공정에서 수득된 체세포를 영양 기아 조건에 폭로시키는 것에 의해, 다능성 줄기세포가 유도ㆍ육성되는 빈도 또는 수량을 향상시킬 수 있어, 다능성 줄기세포를 고효율로 제조할 수 있다. 여기에서, 영양 기아 조건에 폭로시킨다는 것은 배지 중의 세포의 영양원인이 되는 성분 중 특정한 성분, 예를 들면 아미노산, 단백질, 당질, 지질, 유기산, 또는 비타민류 등을 포함하지 않거나, 또는 그 농도가 저감된 배지(이하, '영양기아 배지' 라고 기재하는 경우가 있다) 중에서 세포를 배양하는 것을 의미한다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에서는 단백질을 포함하지 않거나, 또는 그 농도가 저감된 배지, 예를 들면 단백질 농도가 0∼0.5%(w/v)의 범위에 있는 배지(이하, '단백질 기아 배지' 라고 기재하는 경우가 있다), 적합하게는 0∼0.3%(w/v)의 범위에 있는 배지, 더욱 적합하게는 0∼0.1%(w/v)의 범위에 있는 배지 중에서 세포를 배양하는 조작이 예시된다. 단백질 기아 배지 중의 단백질 농도는 공지의 방법, 예를 들면, 로리(Lowry)법, 브래드퍼드법 또는 Bicinchoninic Acid(BCA)법에 의해 표준 단백질(예를 들면, 소혈청알부민) 환산값으로 측정할 수 있다.

단백질 기아 배지의 조제에 사용되는 기본배지는 아미노산, 당류 혹은 유기산과 같은 에너지원, 비타민류, pH조정을 위한 완충성분 또는 무기염류 등을 함유하는 것으로, 예를 들면, DMEM과 같은 공지의 배지 혹은 그 개변물(modified medium), 또는 기타 시판 중인 배지를 사용할 수도 있다. ES 세포 혹은 iPS 세포용 배지에 통상 첨가되고 있는 다능성을 유지시키기 위한 성분, 예를 들면 백혈병 억제인자(leukemiain hibitory factor: LIF), 염기성 섬유아 세포 증식인자(basic fibroblast growth factor: bFGF), 트랜스포밍 증식인자(transforming growth factor-β1: TGF-β1), 혹은 섬모성 신경영양인자(ciliary neurotrophic factor: CNTF) 등의 증식인자류 또는 기타 사이토카인류를 첨가할 수 있다. 추가로, 혈청 또는 혈장을 첨가할 수도 있다. 또, 상기의 각종 성분은 배지의 최종 단백질의 총량이 0∼0.5%(w/v)의 단백질 농도의 범위, 적합하게는 0∼0.3%(w/v)의 단백질 농도의 범위, 더욱 적합하게는 0∼0.1%(w/v)의 단백질 농도의 범위가 되도록 배지에 첨가된다.

단백질 이외의 성분 중 특정한 성분을 포함하지 않거나, 또는 그 농도가 저감된 영양기아 배지를 사용하는 경우, 상기의 단백질 기아 배지인 경우와 마찬가지로, 당해 성분을 포함하지 않거나, 또는 그 농도를 통상의 배지보다도 저감시키는 것 이외에, 공지의 배지 제작방법에 따라서 배지를 조제하고, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포의 배양에 적용할 수 있다. 또, 당해 성분은 단일 성분일 수도, 복수의 성분일 수도 있다. 또, 단백질 기아 배지에 있어서 다른 성분을 제외하거나, 또는 저감시킬 수 있다.

영양 기아 조건에서의 처리는, 핵 초기화 인자를 접촉시킨 체세포, 예를 들면 상기 (1)에 기재된 공정에서 수득된 체세포를, 통상의 피더세포와의 공배양에 적용한 후, 배지를 영양기아 배지로 교환하고 배양을 계속하는 것에 의해서 실시할 수 있다. 이 배지교환은 1회의 조작으로 수행할 수도 있고, 수회로 나누어서 영양성분의 함유농도를 단계적으로 저감시켜서 영양기아 배지에로의 치환을 실시할 수도 있다. 그 후에, 또 피더세포와의 공배양을 실시하는 배지로 교환해서 배양을 계속할 수 있다. 또, 상기 (1)에 기재된 공정에 있어서 수득된 체세포를, 처음부터 영양기아 배지를 사용해서 배양을 실시하고, 그 후, 피더세포와의 공배양을 실시하는 배지로 교환해서 배양을 계속할 수 있다. 영양기아 배지에서의 처리는 상기의 배지교환에 의해 실시하는 처리에 한정되는 것이 아니라, 실질적으로 동등한 조건으로 처리가능한 다른 방법일 수도 있다. 예를 들면, 단백질 분해효소를 배지에 첨가해서 단백질 농도를 저감시키는 방법, 또는 리파아제를 첨가해서 지질농도를 저감시키는 방법, 등의 조작에 의해 영양기아 상태를 달성할 수 있다.

또, 여기에서 말하는 피더세포란 유도되는 다능성 줄기세포의 생육에 유효한 성분을 공급할 수 있는 것이라면 특별하게 한정은 없지만, 섬유아 세포(예를 들면, 배아섬유아 세포) 등의 세포가 적합하게 사용된다.

상기 (1)에 기재된 공정에서 수득된 체세포를 피더세포 상에 파종하는 세포수(본 명세서에 있어서 '파종수' 라고도 한다)는 다능성 줄기세포가 효율적으로 유도되는 세포수라면, 특별하게 한정은 없고, 통상 c-MYC 유전자를 도입하지 않는 경우에는, 약 9,000 cells/㎠의 세포 수가 파종된다. 본 발명에 있어서는, 당해 체세포의 파종하는 세포수를 적게 하는 것에 의해, 다능성 줄기세포를 더욱 효율적으로 유도하는 것이 가능하다. 예를 들면, 100∼5000 cells/㎠의 세포 수일 수 있고, 적합하게는 250∼5000 cells/㎠의 세포 수이다.

상기 피더세포 대신에 세포외 매트릭스 단백질 또는 그 단편 등을 사용할 수도 있다. 그 단백질 또는 그 단편은 예를 들면 배양용 용기 등, 적절한 고상으로 고정화시킨 상태에서 사용되는 것이 바람직하다.

즉, 본 발명의 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법은, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포의 배양의 전체기간, 또는 임의의 일부의 기간에 있어서 세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포의 배양의 일부공정에 있어서, 영양 기아 조건에서의 배양을 포함하는 것이라면 본 발명에 포함된다. 본 발명의 바람직한 형태에 있어서는, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포의 배양공정의 기간에 있어서 적어도 12시간 이상, 바람직하게는 18시간 이상, 체세포가 영양 기아 조건에 폭로된다. 당해 처리시간은 특별히 상한은 없지만, 세포의 생존성의 관점으로부터는 8일 이내, 바람직하게는 6일 이내의 기간 처리된다.

또, 본 발명에 있어서, 상기 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 대신에, 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정을 사용할 수 있다. 사용하는 세포주기를 정지시키는 약제는 특별하게 한정은 없지만, 부티로락톤 I, 올로마우신(olomoucine), 로스코비틴, 푸르발라놀 A(purvalanol A), 프루발라놀 B, DRB(5,6-디클로로벤조이미다졸 1-β-D-리보푸라노사이드), SU9516, NU6102, NU6140, JNJ-7706621, CDK1/2 저해제 II, 후라보피리돌, PD0332991, CDK2 저해 펩티드(TAT-LFG 및 TAT-LDL) 등의 사이클린 의존성 키나아제 저해제, 마이토마이신, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 하이드록시 우레아, 염산 이리노테칸, 아드리아마이신, 액티노마이신 D, 에토포사이드, 파클리탁셀, 블레오마이신 등의 항암제, DHCP(4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1-온) 혹은 그 유도체, 또는 라파마이신 등을 사용할 수 있다. 세포주기를 정지시키는 약제의 사용량은 사용하는 약제에 의해 적당하게 결정할 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, 상기 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 및 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정의 양쪽을 수행할 수 있다.

또, 배양기간의 일부에 있어서, 세포사 억제제를 사용할 수 있다. 세포사 억제제로서는 특별하게 한정은 없지만, Y-27632[(R)(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카르복시아미드디하이드로클로라이드] 등을 사용할 수 있다.

영양 기아 조건, 세포주기를 정지시키는 약제로의 처리 조건, 또는 통상의 조건을 막론하고, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포의 배양조건에는 특별하게 한정은 없으며, 통상의 세포 배양조건을 채용할 수 있다. 예를 들면 습도 90∼98%, CO₂농도 3∼7%, 30∼40℃에서의 배양이 예시된다. 적절한 시간간격으로 신선한 배지로의 교환이 이루어질 수 있음은 말할 필요도 없다.

상기에 기재된 방법에 의해 수득된 다능성 줄기세포는, 그 형태 상의 특징에 의거하여 그 이외의 세포와 구별하는 것이 가능하다. 또, 알칼리포스파타아제, 단계특이적 태아항원(stage-specific embryonic antigen: SSEA, 예를 들면, SSEA-4 등), 종양거절 항원(tumor rejection antigen: TRA)-1-60, TRA-1-81, OCT4 또는 NANOG 등의 미분화 상태의 지표가 되는 마커 분자의 발현에 의거하여 확인할 수도 있다. 상기 분자의 발현은 예를 들면, 상기의 분자를 인식하는 항체를 사용해서 확인할 수 있다. 알칼리포스파타아제에 대해서는 그 효소활성에 의거하여 발현을 확인할 수도 있다.

또, 상기 조작에 의해 수득되는 세포집단에서 다능성 줄기세포를 단리하고, 다른 세포와 분리된 다능성 줄기세포를 취득할 수 있다. 이렇게 해서 단리된 다능성 줄기세포는 공지의 방법에 의해 세포주로서 수립할 수 있다. 즉, 본 발명의 형태의 하나로서, 본 발명의 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법의 공정 및 수득된 세포집단에서 다능성 줄기세포를 단리하는 공정을 포함하는 다능성 줄기세포의 제조방법을 들 수 있다.

이상, 본 발명에 의해 종래의 다능성 줄기세포(예를 들면, iPS 세포)의 제조방법과 비교하여, 높은 빈도로 다능성 줄기세포를 유도, 육성시킬 수 있고, 다능성 줄기세포의 수량을 향상시킨 제조가 가능하게 된다.

실시예

이하에 실시예를 가지고 본 발명을 더욱 구체적으로 나타내지만, 본 발명은 이하의 실시예의 범위만으로 전혀 한정되는 것은 아니다.

조제예 1 핵 초기화 인자 유전자 의 클로닝

(1) pDON-AI-2-Neo-SOX2 및 pDON-AI-2-Neo-KLF4 플라스미드의 구축

NCBI 데이터베이스 등록 번호(Accession No.) NM_003106.2의 서열정보에서, 서열목록의 서열번호 1 및 2에 기재된 염기서열을 가지는 SOX2 유전자 증폭용 합성 프라이머 hSOX2-F 및 hSOX2-R를 각각 합성하였다. 또, NCBI 데이터베이스 등록번호 NM_004235.3의 서열정보에서, 서열목록의 서열번호 3 및 4에 기재된 염기서열을 가지는 KLF4 유전자 증폭용 합성 프라이머 hKLF4-F 및 hKLF4-R를 각각 합성하였다.

HumanBrainPolyA+RNA(Clontech사)에서 합성한 cDNA를 주형으로 하고, hSOX2-F 및 hSOX2-R의 프라이머 쌍, hKLF4-F 및 hKLF4-R의 프라이머 쌍의 각각과 PrimeSTAR(등록상표) MAX PreMix(다카라바이오사)에 의해 PCR를 실시였다. 반응 종료후, 반응액을 1.0% 아가로스겔 전기영동에 적용하고, SOX2 유전자에 대해서는 약 1kbp, KLF4 유전자에 대해서는 약 1.5kbp의 DNA프래그먼트를 추출, 정제하였다. 다음에 수득된 DNA프래그먼트를 각각 제한효소 NotI(다카라바이오사) 및 SalI(다카라바이오사)로 소화하고, 정제하는 것에 의해 SOX2 프래그먼트 및 KLF4 프래그먼트를 얻었다.

SOX2 프래그먼트 및 KLF4 프래그먼트는 동일하게 NotI-SalI로 소화시킨 pDON-AI-2 Neo DNA(다카라바이오사)와 각각 혼합하고, DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(다카라바이오사)을 사용해서 연결하였다. 이 반응산물을 사용해서 대장균 JM109(다카라바이오사)를 형질전환하고, 형질전환체를 얻었다.

형질전환체에서 조제한 플라스미드 중에서 소망하는 DNA단편이 삽입된 플라스미드를 선택하고, 재조합 플라스미드 pDON-AI-2-Neo-SOX2 및 pDON-AI-2-neo-KLF4를 얻었다. 이 pDON-AI-2-Neo-SOX2는 NM_003106.2에 포함되는 SOX2 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩프레임을 포함하는 플라스미드이다. 또 pDON-AI-2-Neo-KLF4는 NM_004235.3에 포함되는 KLF4 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드이다.

(2) pDON-AI-2-Neo-OCT4, pDON-AI-2-Neo-LIN28 및 pDON-AI-2-Neo-NANOG 플라스미드의 구축

NCBI 데이터베이스 등록번호 NM_002701.4, NM_024674.4, NM_024865.2의 서열정보를 바탕으로, 각각 OCT4, LIN28, NANOG의 각 폴리펩티드를 코딩하는 인공합성 유전자를 합성하였다. 상기 인공합성 유전자는 각 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩프레임의 염기서열에 첨가하고, 5'-말단에 CDS의 직전의 3염기의 서열 및 제한효소 NotI의 인식서열, 3'-말단에 제한효소 SalI의 인식서열을 각각 가지고 있다. 3종의 인공합성 유전자는 NotI, SalI의 인식서열을 이용하여, 조제예 1-(1)과 마찬가지로 pDON-AI-2 Neo에 연결하고, 각 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드 pDON-AI-2-Neo-OCT4, pDON-AI-2-Neo-LIN28 및 pDON-AI-2-Neo-NANOG를 얻었다.

조제예 2 레트로바이러스 벡터의 조제

(1) pDON-AI-2, pDON-5 플라스미드 벡터에로의 전이

조제예 1에 의해 조제된 pDON-AI-2-Neo-OCT4, pDON-AI-2-Neo-SOX2, pDON-AI-2-Neo-KLF4, pDON-AI-2-Neo-LIN28, 및 pDON-AI-2-Neo-NANOG를 각각 제한효소 NotI 및 SalI에 의해 처리후, 1.0% 아가로오스 전기영동에 적용해서 발생한 프래그먼트를 겔 상에서 분리하였다. 겔에서 각 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩프레임을 포함하는 프래그먼트를 추출ㆍ정제후, 이 프래그먼트의 각각을 동일하게 NotI-SalI로 소화시킨 pDON-5 DNA(다카라바이오사)와 혼합하고, DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(다카라바이오사)를 사용해서 연결하였다. 이렇게 해서 제작된 재조합 플라스미드에서 각 유전자가 정확하게 삽입된 것을 선택하고, 각각 pDON-5-OCT4, pDON-5-SOX2, pDON-5-KLF4, pDON-5-LIN28, 및 pDON-5-NANOG라고 명명하였다.

OCT4, KLF4 및 LIN28의 3유전자에 대해서는 동일한 조작으로 이것들을 pDON-AI-2 DNA(다카라바이오사)에 각각 삽입한 재조합 플라스미드를 작성하고, 각각 pDON-AI-2-OCT4, pDON-AI-2-KLF4, 및 pDON-AI-2-LIN28이라고 명명하였다.

(2) IRES 프래그먼트의 조제

서열번호 5 및 6의 IRES 서열 증폭용 합성 프라이머 IRES-F-SalI 및 IRES-R-NotI를 합성하였다. IRES 서열을 증폭하기 위해서, 주형 DNA로서 pIRES2-ZsGreen1(Clontech사), 프라이머로서 IRES-F-SalI 및 IRES-R-NotI를 사용해서 PrimeSTAR(등록상표) DNA polymerase(다카라바이오사)에 의해 PCR를 수행하였다. 반응 종료후, 반응액을 1.0% 아가로스겔 전기영동에 적용하고, 약 0.6kbp의 DNA프래그먼트를 추출, 정제하였다. 다음에 이 DNA 프래그먼트를 제한효소 SalI 및 NotI로 소화하고, 정제하는 것에 의해 IRES 프래그먼트를 얻었다.

(3) SOX2, LIN28, 및 NANOG 프래그먼트의 조제

상기 조제예 2-(1)에서 조제한 pDON-5-SOX2, pDON-5-LIN28, 및 pDON-5-NANOG 플라스미드를 제한효소 NotI 및 HpaI에 의해 처리후, 1.0% 아가로오스 전기영동에 적용해서 발생한 프래그먼트를 겔 상에서 분리하였다. SOX2, LIN28,　또는 NANOG의 각유전자를 포함하는 프래그먼트(각각 SOX2, LIN28,및 NANOG　프래그먼트로 기재한다)를 겔에서 추출ㆍ정제하였다.

(4) pDON-AI-2-OCT4-IR-SOX2, pDON-AI-2-LIN28-IR-NANOG, pDON-5-OCT4-IR-SOX2, pDON-5-LIN28-IR-NANOG, 및 pDON-5-NANOG-IR-LIN28 플라스미드의 구축

상기 조제예 2-(1)에서 조제한 pDON-AI-2-OCT4, pDON-AI-2-LIN28, pDON-5-OCT4, pDON-5-LIN28, 및 pDON-5-NANOG을 제한효소 SalI 및 HpaI로 소화한 것, (2)에서 조제한 IRES 프래그먼트 및 (3)에서 조제한 SOX2, LIN28 및 NANOG 프래그먼트를 표 1의 조합으로 혼합하고, DNA Ligation Kit<Mighty Mix>(다카라바이오사)를 사용해서 연결하였다.

이렇게 해서 제작된 재조합 플라스미드에서 각 유전자가 정확하게 삽입된 것을 선택하고, 각각 pDON-AI-2-OCT4-IR-SOX2, pDON-AI-2-LIN28-IR-NANOG, pDON-5-OCT4-IR-SOX2, pDON-5-LIN28-IR-NANOG 또는 pDON-5-NANOG-IR-LIN28이라고 명명하였다. pDON-AI-2-OCT4-IR-SOX2는 pDON-AI-2에, 그 5'-단측에서 차례로 OCT4 유전자, IRES, SOX2 유전자가 삽입된 플라스미드이다. pDON-AI-2-LIN28-IR-NANO는 pDON-AI-2에, 그 5'-단측에서 차례로, LIN28 유전자, IRES 및 NANOG 유전자가 삽입된 플라스미드이다. pDON-5-OCT4-IR-SOX2 은 pDON-5에, 그 5'-단측에서 차례로 OCT4 유전자, IRES 및 SOX2 유전자가 삽입된 플라스미드이다. pDON-5-LIN28-IR-NANOG는 pDON-5에, 그 5'-단측에서 차례로 LIN28 유전자, IRES 및 NANOG 유전자가 삽입된 플라스미드이다. pDON-5-NANOG-IR-LIN28은 pDON-5에, 그 5'-단측에서 차례로 NANOG 유전자, IRES 및 LIN28 유전자가 삽입된 플라스미드이다.

(5) 레트로바이러스 벡터의 생산

G3T-hi 세포(다카라바이오사)를 5×10⁵ cells/㎖가 되도록 10F-DMEM[10% 소태아혈청(Invitrogen사) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(나카라이테스크사)함유 D-MEM(시그마사)]에 현탁하고, 그 4㎖를 6cm 콜라겐 코팅된 접시(이와키사)에 파종해서 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 24시간 배양하였다.

500㎕의 OPTI-MEM(Invitrogen사)에 10㎕의 TransIT(등록상표)-293(다카라바이오사)을 혼합하고, 실온에서 5분 방치후, 2㎍의 pGP플라스미드(다카라바이오사), 1㎍의 pE-Ampho플라스미드(다카라바이오사) 및 2㎍의 조제예 2-(1) 및 (4)에서 조제한 각 재조합 플라스미드를 각각 첨가하여 혼합하고, 추가로 15분간 실온에서 방치하였다. 이 혼합액을 상기의 G3T-hi 세포에 첨가하여 배양을 계속하고, 24시간 후에 4㎖의 10F-DMEM으로 교환하였다. 추가로, 24시간 배양을 계속한 후, 바이러스를 포함하는 배지를 회수하고, 0.45㎛의 필터로 여과해서 레트로바이러스 벡터를 포함하는 바이러스액을 조제하였다. 또, 10F-DMEM을 첨가해서 배양을 계속하고, 24시간 후에 바이러스를 포함하는 배지를 회수하고, 0.45㎛의 필터로 여과해서 조제한 바이러스액도 실험에 사용하였다. 바이러스액은 조제후 곧바로 사용하지 않는 경우에는 -80℃에서 동결보존하고, 사용시에 해동해서 사용하였다. 표 2에 각각의 재조합 플라스미드로부터 얻은 레트로바이러스 벡터의 명칭을 나타낸다.

조제예 3 형광 단백질 발현 레트로바이러스 벡터의 조제

(1) 플라스미드 벡터의 조제

pAcGFP1(Clontech사)에서 AcGFP1 유전자를 pDON-AI DNA(다카라바이오사)에 전이, pDON-AI-AcGFP1를 조제하였다. 마찬가지로, pmStrawberry Vector(Clontech사)에서 mStrawberry 유전자를 pDON-AI-2Neo DNA로 바꾸고, pDON-AI-2-Neo-mStrawberry를 조제하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터의 생산

조제예 2-(5)와 동일한 방법에 의해, pDON-AI-AcGFP1로부터는 레트로바이러스 벡터 DON-am-AcGFP1을, pDON-AI-2-Neo-mStrawberry로부터는 레트로바이러스 벡터 DONAI2-am-mStrawberry를 조제하였다.

조제예 4 마우스 ES 세포용 배지의 조제

(1) 100×LIF의 조제

10⁶ unit/㎖의 백혈병 억제인자(LIF; ESGRO, Invitrogen사) 0.5㎖에 대해서, 넉아웃 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium, Invitrogen사) 8.5㎖, 넉아웃 혈청 리플레이스먼트(Invitrogen사) 1.5㎖을 첨가해서 100×LIF를 조제하였다.

(2) 마우스 ES 세포용 배지의 조제

넉아웃 DMEM 425㎖에 대해서, 넉아웃 혈청 리플레이스먼트(Invitrogen사) 75㎖, 100×비필수아미노산 혼합물(NEAA mixture, Lonza사) 5㎖, 100mM 피루브산 나트륨(Lonza사) 5㎖, 200mM L-글루타민(Lonza사) 5㎖, 55mM 2-메르캅토에탄올(Invitrogen사) 0.91㎖, 및 (1)에서 조제한 100×LIF 5㎖을 첨가하는 것에 의해 마우스 ES 세포용 배지를 조제하였다.

실시예 1 다능성 줄기세포의 유도

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

난-트리트먼트(non-treatment) 6구-배양 플레이트(벡톤디킨슨사)의 각 웰에 20∼25㎍/㎖가 되도록, 인산완충 수용액(PBS)으로 희석한 레트로넥틴(등록상표, 다카라 바이오사제) 용액을 2㎖씩 첨가하고, 4℃ 에서 하룻밤 혹은 실온에서 2시간 고정화를 실시하였다. 그 후에, 각 웰에서 용액을 제거하고, PBS로 1회 세정한 후, 각 실험에 적용할 때까지 4℃에서 보존하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

조제예 2에서 조제한 바이러스액 700㎕씩을 표 3의 조합으로 (1)에서 조제한 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트의 각 웰에 각각 첨가하고, 32℃, 2,000×g으로 2시간 원심하였다.

그 후에 각 웰에서 상청액을 제거해서 PBS로 1회 세정후, 5×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 성인 피부섬유아 세포(Lonza사)를 2㎖씩 각 웰에 파종하였다. 32℃, 500×g으로 10분간 원심한 후, 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 배양을 개시하였다(배양 0일째).

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입은 배양 1일째에 수행하였다. 조제예 2에 의해 조제한 바이러스액 각 700㎕씩을 표 3의 조합으로 혼합하고, 최종농도 8㎍/㎖가 되도록 폴리브렌(헥사디메트린ㆍ브로마이드; Aldrich사)을 첨가해서 레트로바이러스 벡터 혼합액을 조제하였다. (2)에서 배양하고 있었던 배양 플레이트에서 상청액을 제거하고, 이 레트로바이러스 벡터 혼합액을 첨가하였다. 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 4시간 배양후, 10F-DMEM을 2㎖ 첨가하였다. 추가로, 2일간 배양후, 상청액을 제거하고 10F-DMEM을 2㎖ 첨가해서 배양을 계속하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종　

10cm 배양접시(이와키사)에 최종농도 1mg/㎖의 젤라틴(시그마사) 수용액을 첨가하고 실온 1시간 혹은 4℃에서 하룻밤 고정화후, 세정해서 젤라틴 고정화 배양접시를 제작하였다. 여기에 최종농도 12㎍/㎖의 마이토마이신 C(나카라이테스크사)로 처리한 SNL76/7세포(DS파마사)를 1×10⁶cells씩 파종하고, 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 배양하는 것에 의해 피더세포를 조제하였다.

(3)에서 제작한 배양 7일째의 유전자 도입세포를 회수하고, 5 ×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에 현탁하였다. 이 현탁액 10㎖을 상기의 피더세포 상에 파종하고, 배양을 계속하였다.

(5) 단백질 기아 혹은 메틸화 저해제 처리

배양 8일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후) 상청액을 제거하고, 단백질 기아 처리조건에서는, 혈청이 포함되어 있지 않는 DMEM(0F-DMEM: 10F-DMEM으로부터 소태아혈청을 제거한 것)을 10㎖ 첨가하였다. 한편, 메틸화 저해제 처리조건에서는, ES 세포용 배지[1% 페니실린/스트렙토마이신, 4ng/㎖ bFGF(R&D systems사)를 포함하는 영장류 ES 세포용 배지(ReproCELL사)]를 10㎖ 첨가하고, 추가로 최종농도 1㎛이 되도록 5-아자-2'-데옥시시티딘(시그마사)을 첨가하였다. 또, 실시예 1-(2)에 기재된 조건 A, B, C에 각각의 처리를 실시하였다.

단백질 기아 처리 혹은 메틸화저해 처리 개시로부터 2일후(배양 개시로부터 10일째)에 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지를 각 배양접시에 10㎖ 첨가하고, 배양 28일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 조건 A, B, C의 각각의 단백질 기아 처리 혹은 메틸화 저해제 처리의 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4에 나타내는 바와 같이, 어떤 레트로바이러스 벡터의 조합에 있어서도, 메틸화 저해제 처리한 군보다 단백질 기아 처리한 군쪽이 다능성 줄기세포 콜로니가 훨씬 많았다. 즉, 다능성 줄기세포 유도의 과정에 있어서, 단백질 기아 처리를 실시함으로써, 비약적으로 다능성 줄기세포의 유도효율이 높아지는 것이 분명하게 되었다.

또, 단백질 기아 처리한 군에서는, 어떤 조건에 있어서도 배양 16일째부터 다능성 줄기세포 콜로니를 확인할 수 있었던 것에 대해서, 메틸화 저해제 처리한 군에서는, 배양 26일째에 다능성 줄기세포 콜로니를 확인할 수 있었다. 즉, 단백질 기아 처리함으로써, 다능성 줄기세포의 유도기간도 대폭 단축할 수 있음이 분명하게 되었다.

(7) 배지에 함유되는 단백질의 농도의 측정

상기의 실시예에 있어서 사용된 10F-DMEM, DMEM 및 ES 세포용 배지에 대해서, 각각에 함유되는 단백질의 농도를 브래드퍼드법(Coomassie Plus Protein Assay Reagent; Pierce사)을 사용해서 측정하였다. 그 결과, 10F-DMEM, DMEM 및 ES 세포용 배지에는 각각 5.5mg/㎖, 0.633mg/㎖, 24.1mg/㎖(전부 소혈청알부민 상당)의 단백질이 함유되어 있음이 확인되었다.

실시예 2 단백질 기아 조건의 검토

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 1-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 단, 세포파종 후의 원심은 수행하지 않는다. 또, 레트로바이러스 벡터는 DON5-am-OCT4-IR-SOX2, DON5-am-LIN28-IR-NANOG 및 DONAI2-am-KLF4의 조합으로 각각 실시하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회재의 유전자 도입은 배양 1일째에, 실시예 2-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상으로의 파종

배양 6일째에 실시예 1-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 피더세포(마이토마이신 C 처리한 SNL76/7 세포 혹은 STO세포(다이니폰제약사))는 1.5×10⁶cells씩 파종하였다. 또, 유전자 도입세포는 2.5×10⁵cells씩 파종하였다.

(5) 단백질 기아 처리

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 배양접시로부터 상청액을 제거하고, 표 5에 나타내는 조건에 의해 세포를 처리하였다. 표 중, 0.5F-DMEM은 0.5% 혈청을 포함하는 DMEM을 나타낸다. 또, ES 세포용 배지로 교환 후는, 각 조건 모두 배양 28일째까지 배양을 계속하고, 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다.

표 6에 나타내는 바와 같이, 컨트롤(무처리)보다도 단백질 기아 처리한 군쪽이 다능성 줄기세포 콜로니가 훨씬 많았다. 즉, 다능성 줄기세포 유도의 과정에 있어서, 단백질 기아 처리를 실시함으로써, 비약적으로 다능성 줄기세포의 유도효율이 높아지는 것이 분명하게 되었다. 또, 단백질 기아 처리기간 동안에 세포사를 억제하는 물질의 하나인 Y27632[(R)(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카르복시아미드디하이드로클로라이드]를 첨가함으로써, 안정적으로 다능성 줄기세포 콜로니가 수득되는 것이 분명하게 되었다.

실시예 3 세포주기 정지제의 검토

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 1-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 단, 플레이트의 세정은 1.5% 인간 혈청알부민을 포함하는 PBS로 실시하고, 세포 파종후의 원심은 실시하지 않았다. 또, 레트로바이러스 벡터는 DON5-am-OCT4-IR-SOX2, DON5-am-LIN28-IR-NANOG, 또는 DON5-am-KLF4의 조합으로 실시하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입은 배양 1일째에, 실시예 3-(2)와 동일한 방법에 의해 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 7일째에 실시예 1-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다.

(5) 세포주기 정지제 처리

배양 8일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 배양접시로부터 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지으로 교환후, 각각 최종농도 0.1㎛, 0.5㎛, 또는 2㎛이 되도록 푸르발라놀 A(시그마사)를 첨가한 군, 최종농도 10㎛, 100㎛이 되도록 하이드록시우레아(시그마사)를 첨가한 군을 설정하였다. 또, 컨트롤에는 약제를 첨가하지 않았다. 2일간 배양후, ES 세포용 배지로 교환하고, 배양 22일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 22일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.

표 7에 나타내는 바와 같이, 컨트롤(무처리)보다도 세포주기 정지제 처리한 군쪽이 다능성 줄기세포 콜로니가 훨씬 많았다. 즉, 다능성 줄기세포유도의 과정에 있어서, 세포주기를 정지시키는 처리를 실시함으로써, 비약적으로 다능성 줄기세포의 유도효율이 높아지는 것이 분명하게 되었다.

실시예 4 유전자 도입세포의 파종 수의 검토

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 2-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 또, 레트로바이러스 벡터는 DON5-am-OCT4-IR-SOX2, DON5-am-LIN28-IR-NANOG, 또는 DON5-am-KLF4의 조합으로 실시하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입에서는, 배양 1일째에, 바이러스액 700㎕씩을 실시예 4-(2)의 조합으로 혼합하고, 최종농도 8㎍/㎖가 되도록 폴리브렌을 첨가해서 레트로바이러스 벡터 혼합액을 조제후, 세포를 배양하고 있었던 플레이트에서 상청액을 제거하고, 이 레트로바이러스 벡터 혼합액을 첨가하였다. 1일 배양후, 상청액을 제거해 10F-DMEM을 2㎖ 첨가해서 배양을 계속하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 2-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 유전자 도입세포는 0.62×10⁵, 1.25×10⁵, 2.5×10⁵, 또는 5×10⁵cells씩 파종하는 군을 설정하였다.

(5) 단백질 기아 처리

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 배양접시에서 상청액을 제거하고, 0F-DMEM 을 10㎖ 첨가하였다. 2일간 배양후, 상청액을 제거해서 ES 세포용 배지를 각 배양접시에 9㎖ 첨가하고, 배양 28일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 또, iPS 세포 유도효율(%)을, (iPS 세포 콜로니 수÷유전자 도입세포 파종수)×100으로 산출하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.

표 8에 나타내는 바와 같이, 유전자 도입세포의 파종수가 적을수록 다능성 줄기세포 콜로니의 유도효율이 높았다. 즉, 다능성 줄기세포 유도의 과정에 있어서, 유전자 도입세포의 파종수를 감소시킴으로써, 다능성 줄기세포의 유도효율이 높아지는 것이 분명하게 되었다.

실시예 5 단백질 기아 조건의 검토-2

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째).

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입은 배양 1일째에, 실시예 5-(2)와 동일한 방법에 의해 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 2-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 배양용기는 6구-배양 플레이트(코닝사)를 사용하고, 피더세포는 2.5×10⁵cells씩 파종하였다. 또, 유전자 도입세포는 2×10⁴cells씩 파종하였다.

(5) 단백질 기아 처리

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, 표 9에 나타내는 조건에 의해 세포를 처리하였다. 또, ES 세포용 배지로 교환후는, 각 조건 모두 배양 28일째까지 배양을 계속하고, 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 10에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 10에 나타내는 바와 같이, 컨트롤(무처리)보다도 단백질 기아 처리한 군쪽이 다능성 줄기세포 콜로니가 훨씬 많았다. 즉, 다능성 줄기세포유도의 과정에 있어서, 단백질 기아 처리를 실시함으로써, 비약적으로 다능성 줄기세포의 유도효율이 높아지는 것이 분명하게 되었다. 또, 단백질 기아 처리 기간 동안에 세포사를 억제하는 물질의 하나인 Y27632[(R)(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카르복시아미드디하이드로클로라이드]를 첨가함으로써, 안정적으로 다능성 줄기세포 콜로니가 수득되는 것이 분명하게 되었다.

실시예 6 유전자 도입세포의 파종수의 검토-2

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입은 배양 1일째에, 실시예 6-(2)와 동일한 방법에 의해 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 유전자 도입세포는 2.5×10³, 5×10³, 1×10⁴, 2×10⁴, 4×10⁴, 또는 8×10⁴cells씩 파종하는 군을 설정하였다.

(5) 단백질 기아 처리

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, 0F-DMEM 혹은 ES 세포용 배지(컨트롤)을 2㎖ 첨가하였다. 2일간 배양후, 상청액을 제거해서 ES 세포용 배지를 각 웰에 2㎖ 첨가하고, 배양 28일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 또, iPS 세포 유도효율(%)을, (iPS 세포 콜로니 수÷유전자 도입세포 파종수)×100으로 산출하였다. 그 결과를 표 11 및 표 12에 나타낸다. 또, 표 11은 대조군의 결과, 표 12은 단백질 기아군의 결과를 나타낸다.

표 11 및 12에 나타내는 바와 같이, 컨트롤(무처리)보다도 단백질 기아 처리한 군쪽이, 또 유전자 도입세포의 파종수가 적을수록 다능성 줄기세포 콜로니의 유도효율이 높았다. 즉, 다능성 줄기세포 유도의 과정에 있어서, 단백질 기아 처리를 실시하고, 유전자 도입세포의 파종수를 감소시킴으로써, 다능성 줄기세포의 유도효율이 높아지는 것이 분명하게 되었다.

실시예 7 유전자 도입방법의 검토

레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입에 대해서, 레트로넥틴 혹은 폴리브렌을 사용해서 1회 혹은 2회 도입을 실시하고, 다능성 줄기세포의 유도를 실시해 비교하였다. 설정한 조건을 표 13에 나타낸다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

레트로넥틴에 의한 유전자 도입에 대해서는 실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 폴리브렌에 의한 유전자 도입에 대해서는, 이하의 방법에 의해 실시하였다. 즉, 1일 전에 6구-배양 플레이트에, 5×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 피부 섬유아 세포를 2㎖씩 각 웰에 파종하고 1일 배양하였다. 조제예 2에 의해 조제한 바이러스액 700㎕씩을 표 3의 조건 C의 조합으로 혼합하고, 최종농도 8㎍/㎖가 되도록 폴리브렌을 첨가해서 레트로바이러스 벡터 혼합액을 조제후, 세포를 배양하고 있었던 플레이트에서 상청액을 제거하고, 이 레트로바이러스 벡터 혼합액을 첨가하고, 배양을 개시하였다(배양 0일째).

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입을 실시하는 군에 대해서는 배양 1일째에, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입은 실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 폴리브렌에 의한 유전자 도입에 대해서는, 실시예 7-(2)의 폴리브렌에 의한 유전자 도입과 동일한 방법으로 실시하였다. 즉, 세포를 배양하고 있었던 플레이트에서 상청액을 제거하고, 동일하게 조제한 레트로바이러스 벡터 혼합액을 첨가해 배양을 계속하였다. 1일 배양후, 상청액을 제거하고 10F-DMEM을 2㎖ 첨가해서 배양을 계속하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 유전자 도입세포는 1.75×10⁴cells씩 파종하였다.

(5) 단백질 기아 처리

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, 0F-DMEM 혹은 ES 세포용 배지(단백질 기아 처리없는 군)을 2㎖ 첨가하였다. 2일간 배양후, 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지를 각 웰에 2㎖ 첨가하고, 배양 28일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 14에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의한 유전자 도입을 실시하는 것 보다, 다능성 줄기세포의 유도효율이 훨씬 더 높았다. 또, 단백질 기아 처리를 실시함으로써, 유도효율을 더욱 높이는 것임이 분명하게 되었다.

실시예 8 다중유전자 도입시에 있어서의 유전자 도입방법의 비교

다능성 줄기세포 유도 시에는, 복수의 레트로바이러스 벡터를 사용해서 유전자 도입을 실시하는 경우가 있다. 그래서, 복수의 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입을 실시할 때의 방법으로서 레트로넥틴 혹은 폴리브렌에 의한 유전자 도입효율을 비교하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다. 단, 난-트리트먼트 24구-배양 플레이트(벡톤디킨슨사)를 사용하고, 레트로넥틴 용액은 각 웰에 500㎕씩 첨가하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

레트로넥틴에 의한 유전자 도입에 대해서는 실시예 3-(2)와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 단, 레트로바이러스 벡터는 DON-am-AcGFP1과 DONAI2-am-mStrawberry의 조합으로, 바이러스액 250㎕씩을 혼합하였다. 추가로, 10F-DMEM으로 50배 희석한 바이러스액 250㎕를 혼합하는 군도 설정하였다. 또 세포는 4×10⁴cells/㎖가 되도록 배지에 현탁하고, 500㎕씩 각 웰에 첨가하였다.

동일한 레트로바이러스 벡터의 조합에 의해, 폴리브렌에 의한 유전자 도입은 실시예 7-(2)의 폴리브렌에 의한 유전자 도입과 동일한 방법에 의해 실시하였다. 단, 세포는 4×10⁴cells/㎖가 되도록 배지에 현탁하고, 500㎕씩 24구-배양 플레이트(코닝사)의 각 웰에 첨가하였다. 또, 바이러스액은 250㎕씩 혼합하고, 최종농도 4㎍/㎖가 되도록 폴리브렌을 첨가해서 레트로바이러스 벡터 혼합액을 조제하였다. 1일 배양후에, 상청액을 제거하고 10F-DMEM을 500㎕ 첨가하여 배양을 계속하였다.

(3) 유전자 도입효율의 측정

유전자 도입조작으로부터 3일후, 세포를 회수하고, 플로우 사이토미터(CytomicsFC500, 베크만쿨터사)에 의해, AcGFP1 양성 및 mStrawberry 양성세포를 측정하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다. 표 15는 각각의 유전자 도입방법에 있어서의 양쪽 양성세포(both positive cell)의 비율을 나타낸다.

표 15에 나타내는 바와 같이, 2종류의 레트로바이러스 벡터를 사용해서 유전자 도입을 실시할 때에, 레트로넥틴에 의해 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의해 유전자 도입을 실시하는 경우와 비교해서, 양쪽의 유전자가 도입된 세포 비율이 훨씬 많았다. 즉, 다능성 줄기세포를 유도할 때는, 2종류 이상의 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우가 많기 때문에, 레트로넥틴을 사용함으로써, 복수의 유전자가 도입되는 비율이 높아지게 되고, 결과적으로 다능성 줄기세포의 유도효율을 높이는 것으로 생각되었다. 또, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시할 때, 바이러스액을 희석해서 사용하는 것에 의해, 유전자 도입효율을 더욱 향상시키고, 그 결과, 다능성 줄기세포의 유도효율을 더욱 높이는 것이 가능하다고 생각되었다.

실시예 9 다중유전자 도입시에 있어서의 유전자 도입방법의 비교-2

레트로넥틴 혹은 폴리브렌에 의한 복수의 레트로바이러스 벡터를 사용한 유전자 도입효율을 추가로 비교하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 8-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

실시예 8-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 단, 바이러스액의 희석은 10F-DMEM으로 10배 희석, 또는 100배 희석하는 군을 설정하였다.

(3) 유전자 도입효율의 측정

실시예 8-(3)과 동일한 방법에 의해 유전자 도입효율을 측정하였다. 단, 플로우 사이토미터에 의한 측정은 유전자 도입조작으로부터 5일 후에 실시하였다. 결과를 표 16에 나타낸다. 표 16은 각각의 유전자 도입방법에 있어서의 양쪽 양성세포의 비율을 나타낸다.

표 16에 나타내는 바와 같이, 2종류의 레트로바이러스 벡터를 사용해서 유전자 도입을 실시할 때에, 레트로넥틴의 존재 하에서 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의해 유전자 도입을 실시할 경우와 비교해서, 양쪽의 유전자가 도입된 세포의 비율이 훨씬 많았다. 즉, 다능성 줄기세포를 유도하는 때는, 2종류 이상의 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우가 많기 때문에, 레트로넥틴을 사용함으로써, 복수의 유전자가 도입되는 비율이 높아지게 되고, 결과적으로 다능성 줄기세포의 유도효율을 높이는 것으로 생각되었다. 또한 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시할 때, 바이러스액을 희석해서 사용하는 것에 의해, 유전자 도입효율을 더욱 향상시키고, 그 결과, 다능성 줄기세포의 유도효율을 더욱 높이는 것이 가능하다고 생각되었다.

실시예 10 유전자 도입방법의 검토-2

레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입에 대해서, 레트로넥틴 혹은 폴리브렌의 각각을 사용하는 조건으로, 추가로 레트로바이러스의 양을 변화시켜서 다능성 줄기세포의 유도를 실시하고 비교하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 7-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 단, 바이러스액은 10F-DMEM으로 10배 희석, 또는 100배 희석하는 군을 설정하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 7-(3)과 동일한 방법에 의해 2회째의 유전자 도입을 실시하였다. 다만 바이러스 희석군에 대해서는 실시예 10-(2)와 동일하게 희석한 바이러스액을 사용하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

실시예 7-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고, 배양을 계속하였다. 단, 유전자 도입세포는 2×10⁴cells씩 파종하였다.

(5) 배양

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지를 2㎖ 첨가하고, 배양 28일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 17에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 17에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의한 유전자 도입을 실시하는 것 보다, 다능성 줄기세포의 유도효율이 훨씬 높았다. 또, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시할 때, 바이러스액을 희석해서 사용하는 것에 의해, 유전자 도입효율을 더욱 향상시키고, 그 결과, 다능성 줄기세포의 유도효율을 더욱 높이는 것이 분명하게 되었다.

실시예 11 유전자 도입방법의 검토-3

도입하는 유전자를 OCT4, SOX2, KLF4의 3종류만으로 하고, 실시예 10과 동일한 시험을 실시하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 10-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 단, 레트로바이러스 벡터는, 조제예 2에서 조제한 레트로바이러스 벡터 DON5-am-OCT4-IR-SOX2 및 DON5-am-KLF4를 사용하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 10-(3)과 동일한 방법에 의해 2회째의 유전자 도입을 실시하였다. 다만 사용한 레트로바이러스 벡터는 실시예 11-(2)와 동일하다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

실시예 10-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고, 배양을 계속하였다.

(5) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해 실시하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 18에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 18에 나타내는 바와 같이, OCT4, SOX2 및 KLF4의 3종류의 유전자만을 도입한 경우에도, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의한 유전자 도입을 실시하는 것보다, 다능성 줄기세포의 유도효율이 훨씬 높았다. 또, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시할 때, 바이러스액을 희석해서 사용하는 것에 의해, 유전자 도입효율을 더욱 향상시키고, 그 결과, 다능성 줄기세포의 유도효율이 더욱 높아지게 되는 것은, 3유전자만을 도입한 경우에서도 동일하였다.

실시예 12 다중유전자 도입시에 있어서의 유전자 도입방법의 비교-3

레트로넥틴 혹은 폴리브렌에 의한 복수의 레트로바이러스 벡터를 사용한 유전자 도입효율을 추가로 비교하였다. 4명의 서로 다른 도너에 유래하는 인간 성인 피부섬유아 세포를 표적으로 하고, 다능성 줄기세포 유도실험과 동일하게 유전자 도입을 2회 실시하는 방법을 사용해서 형광 단백질 유전자의 도입을 실시하였다. 본 실시예 중, 세포 A는 28세 백인여성 유래, 세포 B는 42세 백인여성 유래, 세포 C는 51세 백인여성 유래, 세포 D는 48세 흑인여성 유래(전부, Lonza사)를 나타낸다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 8-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 단, 바이러스액의 희석은 10F-DMEM으로 10배 희석, 100배 희석, 또는 1000배 희석하는 군을 설정하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입은 배양 1일째에, 실시예 12-(2)와 동일한 방법에 의해 실시하였다. 단, 폴리브렌에 의한 유전자 도입에 있어서, 배양 2일째에 상청액을 제거하고, 10F-DMEM 을 500㎕ 첨가해서 배양을 계속하였다.

(4) 유전자 도입효율의 측정

실시예 8-(3)과 동일한 방법에 의해, 배양 6일째에 유전자 도입효율을 측정하였다. 결과를 표 19에 나타낸다. 표 19는 각각의 유전자 도입방법에 있어서의 각 세포에서의 양쪽 양성세포의 비율을 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 19에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴을 사용한 유전자 도입에 있어서, 인간 성인 피부섬유아 세포의 도너에 의한 도입효율에로의 영향은 거의 볼 수 없었다는 것이 처음으로 분명하게 되었다. 즉, 레트로넥틴을 사용해서 다능성 줄기세포를 유도할 때에도, 도너의 유래에 관계하지 않고 안정된 유전자 도입이 가능하다고 생각된다.

2종류의 레트로바이러스 벡터를 사용해서 유전자 도입을 실시할 때에, 레트로넥틴 존재 하에서 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의한 유전자 도입을 실시하는 경우와 비교해서, 양쪽의 유전자가 도입된 세포의 비율이 많았다. 즉, 다능성 줄기세포를 유도할 때는, 2종류 이상의 레트로바이러스 벡터를 사용하는 경우가 많기 때문에, 당해 유도 시에 레트로넥틴을 사용함으로써, 복수의 유전자가 도입되는 비율이 높아지게 되고, 결과적으로 다능성 줄기세포의 유도효율을 높이는 것이 가능하다고 생각되었다.

또, 표 19에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시할 때, 바이러스액을 100배 혹은 1000배 희석해서 사용해도, 높은 효율로 유전자 도입이 가능하게 된다. 즉, 다능성 줄기세포를 유도할 때에 레트로넥틴을 사용함으로써, 저역가 혹은 소량의 바이러스로도 높은 유도효율로 다능성 줄기세포를 유도하는 것이 가능한 것이 시사되었다.

실시예 13 도너(donor)차이의 검토

레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입에 대해서, 실시예 12와 같은 4종의 인간 성인 피부섬유아 세포를 표적으로 하고, 레트로넥틴 혹은 폴리브렌을 사용해서 다능성 줄기세포의 유도를 실시하여 비교하였다. 설정한 조건을 표 20에 나타낸다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다. 단, 난-트리트먼트 12구-배양 플레이트(벡톤디킨슨사)를 사용하고, 레트로넥틴 용액을 각 웰에 1㎖씩 첨가하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 7-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 단, 폴리브렌에 의한 유전자 도입에서는 세포 배양용 12구-플레이트(코닝사)를 사용하였다. 바이러스액은 3종의 벡터를 등량씩 혼합한 용액을 10F-DMEM으로 10배 희석하고, 각 웰에 1㎖씩 첨가하였다. 5×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 성인 피부섬유아 세포에 대해서도 1㎖씩 각 웰에 파종하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 13-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다. 단, 폴리브렌에 의한 유전자 도입에 있어서, 배양 2일째에 상청액을 제거하고, 10F-DMEM을 1㎖씩 첨가해서 배양을 계속하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해, 유전자 도입 된 세포를 피더세포 상에 파종하고 배양을 계속하였다.

(5) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해, 피더세포 상에서의 배양을 배양 25일째까지 실시하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 25일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 21에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 21에 나타내는 바와 같이, 모든 조건에 있어서 다능성 줄기세포의 형성이 인정되고, 어느쪽의 도너 유래의 세포에 있어서도, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의한 유전자 도입을 실시하는 것 보다도, 다능성 줄기세포의 유도효율이 훨씬 높았다.

실시예 14 도입유전자의 검토

레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입에 대해서, 레트로넥틴을 사용하고, 도입하는 유전자의 조합을 변화시키고, 다능성 줄기세포의 유도를 실시해 비교하였다. 설정한 조합을 표 22에 나타낸다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 13-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 바이러스액은 표 22에 있는 조합으로 각각의 용액을 등량씩 혼합하고, 10F-DMEM으로 100배 희석하고, 각 웰에 1㎖씩 첨가하였다. 5×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 성인 피부섬유아 세포에 대해서도 1㎖씩 각 웰에 파종하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 14-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해, 유전자 도입된 세포를 피더세포 상에 파종하고 배양을 계속하였다.

(5) 배양

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 25일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 23에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=4의 평균값을 나타낸다.

표 23에 나타내는 바와 같이, 여러 가지의 유전자의 조합에 있어서도, 레트로넥틴을 사용함으로써 다능성 줄기세포의 형성이 인정되었다.

실시예 15 다능성 줄기세포 클론의 수립

레트로넥틴을 사용한 유전자 도입에 의해 유도한 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니를 픽업하고, 각종 분석에 사용하기 위한 iPS 세포 클론을 수립하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 2-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 2-(3)과 동일한 방법에 의해 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

실시예 2-(4)와 동일한 방법에 의해, 유전자 도입 된 세포의 피더세포 상에로의 파종을 실시하였다. 단, 유전자 도입세포는 4×10⁵cells씩 파종하였다.

(5) 배양

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 배양접시로부터 상청액을 제거하고, 컨트롤 조건(ES 세포용 배지) 또는 단백질 기아 처리 조건(0F-DMEM에서 2일간 배양후 ES 세포용 배지로 교환)으로 이후의 배양을 실시하였다. 배지의 교환후는, 각 조건 모두 배양 29일째까지 배양을 계속하고, 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 픽업

배양 29일째의 각 조건의 10cm 배양접시 상에 형성된 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니를 실체현미경(SZ61; OLYMPUS사)하에서 픽업하였다. 픽업한 iPS 세포 콜로니를 미리 ES 세포용 배지를 100㎕ 첨가한 96구-배양 플레이트의 웰로 옮기고, 수회 피펫팅을 실시한 후, 피더세포를 1웰당 5.4×10⁴cells씩 파종한 24구-배양 플레이트에 계대하였다. 계대후는 매일 배지교환을 실시하고, 충분한 크기가 된 iPS 세포 콜로니를 수시 계대하고, iPS 세포 클론의 수립을 실시하였다. 또, 단백질 기아 처리를 실시하여 수득된 iPS 세포 클론으로서 클론 #1, #4, #5, #6, #10을 수립하고, 컨트롤 조건에서의 iPS 세포 클론으로 클론 #3을 수립하였다.

실시예 16 iPS 세포 클론이 게놈에 삽입된 프로바이러스 카피 수의 정량

수립한 각 iPS 세포 클론이 게놈에 삽입된 프로바이러스 카피 수의 정량을 실시하였다. 또, 컨트롤로서 쿄오토대학에서 수립된 iPS 세포 클론 「253G1」 [Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol, vol.26, NO.1, pp.11-106, 2008]에 대해서도 동일하게 해석하였다.

(1) 게놈 추출

6웰 플레이트의 1웰에 컨플루언트의 실시예 15에서 수립한 각 iPS 세포 클론(클론 #1, #3, #4, #5, #6, 또는 #10) 혹은 253G1을, ES 세포 박리액으로 회수하고, PUREGENE DNA Purification 키트(QIAGEN사)를 사용해서 게놈 추출을 실시하였다.

(2) 리얼타임 PCR

iPS 세포 클론의 게놈에 삽입된 프로바이러스 카피 수는, CycleavePCR Core Kit(다카라바이오사)를 사용해서 리얼타임 PCR에 의해 산출하였다. Provirus Copy Number Detection Primer Set, Human(for Real Time PCR)(다카라바이오사)에 부속된 프라이머 세트 및 DNA컨트롤ㆍ템플레이트를 사용하고, 실시예 16-(1)에서 추출한 게놈 DNA 200ng당 프로바이러스 카피 수 및 인간 IFNγ 카피 수를 각각 산출하고, (레트로바이러스 카피 수) / (인간 IFNγ 카피 수)×2에 의해 1세포당 삽입 레트로바이러스 카피 수를 산출하였다. 또, 전부 N=2에 의해 실시하고, 평균을 산출하였다.

그 결과, 컨트롤인 253G1은 약 19.3 카피이었지만, 클론 #1에서는 약 6.4 카피, 클론 #3은 약 10.2 카피, 클론 #4는 약 7.1 카피, 클론 #5는 약 11.4 카피, 클론 #6은 약 5.7 카피, 클론 #10은 약 13.3 카피이었다. 이것으로부터, pDON-5 벡터를 바탕으로 제작된 레트로바이러스를 사용하고, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시하고, 제작된 iPS 세포 클론 전부에 있어서, 폴리브렌을 사용하여 유전자 도입되어 제작된 253G1보다도 레트로바이러스의 삽입 카피 수가 분명하게 적음에도 불구하고, 상기의 방법에 의해 효율적으로 iPS 세포를 제작할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 17 ES 세포 마커 유전자의 발현 확인

수립된 각 iPS 세포 클론이 ES 세포의 마커 유전자를 발현하고 있는지의 여부를 RT-PCR에 의해 확인하였다. 또 클론 #1, 클론 #3의 iPS 세포 클론, 및 컨트롤로서 253G1의 iPS 세포 클론에 대해서 확인을 실시하였다.

(1) RNA 추출

각 iPS 세포 콜로니를 십수개 회수하고, FastPure(등록상표) RNA Kit(다카라바이오사)에 의해 Total RNA를 회수하였다. 방법은 Kit에 첨부된 배양세포로부터의 Total RNA 추출의 프로토콜을 따랐다.

(2) cDNA 합성

실시예 17-(1)에서 추출한 Total RNA를 주형으로 하고, cDNA의 합성을 실시하였다. PrimeScript(등록상표) RT reagent Kit(Perfect Real Time)(다카라바이오사)를 사용하고, SYBR Green Assay 경우의 프로토콜을 따라서 프리믹스를 조제하고, Total RNA 을 200ng 첨가하였다. TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient(다카라바이오사)를 사용해서 37℃에서 15분, 85℃에서 5초의 반응을 실시하고, cDNA를 얻었다.

(3) PCR 반응

우선, 서열목록의 서열번호 7∼10에 기재된 염기서열을 가지는 합성 프라이머 및 참고 문헌[Takahashi, K et al., Cell, vol.131, pp.861-872, 2007]에 기재된 염기서열을 가지는 합성 프라이머를 DNA 합성기로 합성하고, 통상의 방법에 의해 정제하였다.

실시예 17-(2)에서 수득된 cDNA 중 Total RNA량으로 환산해서 20ng분을 주형으로 하고 PCR를 실시하였다. 5㎕의 5×PrimeSTAR GXL Buffer(다카라바이오사), 2㎕의 dNTP Mixture(2.5mM each)(다카라바이오사), 5pmol의 포워드(forward) 프라이머, 5pmol의 리버스(reverse) 프라이머 및 0.5㎕의 PrimeSTAR(등록상표) GXL DNA Polymerase(1.25U/㎕)(다카라바이오사)를 첨가하고, 멸균 증류수를 첨가해서 전량을 25㎕로 하였다. 상기 반응액을 TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Gradient에 세팅하고, 98℃에서 10초, 60℃에서 15초, 68℃에서 15초를 1사이클로 하고, 30사이클의 반응을 하였다.

(4) 아가로스겔 전기영동에 의한 확인

반응 종료후, 그 반응액 5㎕을 3.0% 아가로스겔 전기영동에 적용하고, 증폭된 DNA 프래그먼트를 확인하였다. 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1로부터 분명한 바와 같이, 원래 인간 성인 피부섬유아 세포(도면 중에 나타내는 NHDF-Ad)에서는 확인되지 않는 각 ES 세포 마커가, 클론 #1, 클론 #3 및 253G1에서 확인되었다. 즉, 수립된 iPS 세포 클론은 ES 세포와 동일한 유전자발현 패턴을 나타내고 있는 것이 확인되었다.

실시예 18 in vivo 에 있어서의 iPS 세포 클론의 다분화능의 평가

수립된 iPS 세포 클론이 인간 ES 세포와 동일하게 다분화능을 가지는 것을 확인하기 위해서, 클론 #1에 대해서 SCID 마우스의 정소에 이식하고, 테라토마 형성능에 대해서 평가를 실시하였다.

(1) iPS 세포 현탁액의 제작

배양한 iPS 세포 클론(클론 #1)을 ES 세포 박리액(20% Knockout Serum Replacement, 1mM CaCl₂, 0.1mg/㎖ 콜라게나아제 IV, 0.25% 트립신)을 사용해서 회수하고, 그 일부를 사용해서 셀 카운트를 실시하였다. iPS 세포 현탁액을 원심후에 상청액을 제거하고, HANKS’ BALANCED SALT SOLUTION(시그마사)으로 5×10⁶cells/㎖가 되도록 조제하였다.

(2) iPS 세포 현탁액의 SCID마우스의 정소에의 투여

실시예 18-(1)에서 조제한 iPS 세포 현탁액을 SCID 마우스의 정소에 2.5×10⁵cells/50㎕로 투여하였다.

(3) 형성된 테라토마의 동결 절편제작

iPS 세포를 투여후, 10주째에 부검을 실시하고 SCID 마우스로부터 테라토마를 꺼내고, TISSU MOUNT(치바메디칼사)로 포매하여 동결 블록을 작성하였다. 동결 블록은 사용하기까지 -80℃로 보존하였다. 크라이오스태트를 사용해서 동결 절편을 제작하고, 표준적인 방법으로 HE염색후, 현미경 시험을 실시하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 3배엽 유래의 조직을 관찰할 수 있었기 때문에, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입에 의해 수립한 iPS 세포 클론은 다분화능을 가지는 것으로 평가되었다.

실시예 19 각 유전자 도입법에 있어서의 유전자 도입효율과 다능성 줄기세 포(iPS 세포) 콜로니 수와의 비교

핵 초기화 인자(iPS 세포 유도인자)를 코딩하는 유전자와 함께 각 레트로바이러스 벡터가 삽입된 세포의 존재율을 나타내는 지표로서 AcGFP1 유전자의 유전자 도입을 실시하고, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입법(레트로넥틴법)과 폴리브렌에 의한 유전자 도입법(폴리브렌법)에 있어서의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 유도효율과 AcGFP1 양성세포율의 비교를 실시하였다. 또, 일부의 조건에 대해서는, 게놈에로의 레트로바이러스 벡터삽입 카피 수의 정량을 실시하고, 카피 수와 다능성 줄기세포(iPS 세포) 유도효율과의 비교를 실시하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다. 단, 레트로넥틴을 코팅하는 플레이트에는 난-트리트먼트 12구-플레이트를 사용하고, 각 웰에 1㎖씩의 레트로넥틴 용액(25㎍/㎖)을 첨가하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

조제예 2 및 조제예 3에서 조제한 바이러스액을 표 24의 조합으로 등량씩 혼합하고, 조건 A에 대해서는 10F-DMEM으로 10배 희석 및 100배 희석, 조건 B에 대해서는 10배 희석으로 한 것을 조제하고, 유전자 도입에 사용하였다. 유전자 도입은 실시예 7-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 단, 레트로넥틴법에 있어서의 PBS에서의 플레이트의 세정에는 1㎖의 PBS를 사용하고, 레트로넥틴법 및 폴리브렌법에서의 감염에 사용하는 세포수는 4×10⁴cells/well, 레트로바이러스 벡터 용액은 1㎖/well로 하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 19-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종 및 AcGFP1 양성 세포율의 측정

실시예 10-(4)와 동일한 방법에 의해, 유전자 도입세포의 피더세포 상에로의 파종을 실시하였다. 단, 피더세포 상에로의 파종에 사용하지 않은 나머지의 세포를 사용해서 플로우 사이토미터에 의해 AcGFP1 양성세포율을 측정하였다.

(5) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해, 피더세포 상에서의 배양을 실시하였다. 단, 배양11일째에 조건 A의 일부 웰로부터 세포를 회수하여 게놈 추출을 실시하고, 레트로바이러스 벡터의 삽입 수를 정량하였다.

(6) 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니의 계측

　배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다.

실시예 19-(4), (5),및 (6)의 결과를 표 25에 나타낸다.

표 25에 나타내는 바와 같이, AcGFP1 양성율 및 삽입 카피 수에 거의 차이가 없는 조건에 있어서도 iPS 세포 콜로니 수에 차이가 인정되었다. 구체적으로는, 조건 A의 레트로바이러스 10배 희석으로 하는 조건에 있어서는 레트로넥틴법, 폴리브렌법의 AcGFP 양성율에는 차이는 없고, 삽입 카피 수에서도 레트로넥틴법이 0.9 카피만 많다는 결과에도 불구하고, iPS 세포 콜로니 수에는 3배 이상의 차이가 인정되었다. 또, 조건 A의 레트로넥틴법 100배 희석과 폴리브렌법 10배 희석을 비교하면, 삽입 카피 수는 레트로넥틴법 쪽이 약 2배 높지만, iPS 세포 콜로니 수는 9배라는 비약적으로 높은 값을 나타냈다. 조건 B에 대해서도 양쪽법에 있어서 AcGFP1 양성율에 차이는 없음에도 붉하고, iPS 세포 콜로니 수에는 레트로넥틴법 쪽이 2배 이상 높은 값이 되었다. 이것들로부터, 레트로넥틴법으로 유전자 도입효율이 향상되는 것은 확실하지만, 그것 만으로는 설명하기 어려울 만큼의 높은 다능성 줄기세포 유도효율을 나타내고 있어, 레트로넥틴에는 유전자 도입효율을 높이는 작용 이외에도, 다능성 줄기세포 유도효율을 높이는 작용이 있다는 것이 처음으로 명백하게 되었다.

실시예 20 레트로바이러스 벡터의 조제 로트 차이의 검토

5회의 일련의 조제조작에 의해 수득된 5종의 생산로트가 다른 레트로바이러스 벡터(이하, 각각 '바이러스 1∼5' 로 나타낸다)를 사용하여, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시하고, 다능성 줄기세포의 유도효율을 비교하였다. 바이러스 1은 조제, 회수 직후에 그대로 실험에 적용하고, 바이러스 2∼5는 조제후에 동결보존해 두고, 해동한 것을 실험에 적용하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 다만 바이러스액은 각 로트마다, 3종의 벡터를 등량씩 혼합한 용액을 10F-DMEM으로 10배 희석하고, 각 웰에 2㎖씩 첨가하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 20-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다.

(5) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해, 배양 25일째까지 피더세포 상에서의 배양을 실시하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 25일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 26에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 26에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴을 사용한 다능성 줄기세포 유도에 있어서, 바이러스 벡터의 생산로트에 의한 영향은 거의 볼 수 없었다. 또 동결보존, 해동후에 사용한 바이러스 벡터를 사용하였을 경우에도, 미동결의 것과 동등한 콜로니 수를 볼 수 있었다. 레트로넥틴을 사용해서 다능성 줄기세포를 유도하는 경우, 다소의 바이러스 용액의 역가의 변동이나, 동결 융해의 유무에 관계없이, 안정적으로 다능성 줄기세포의 유도가 가능한 것이 분명하게 되었다.

실시예 21 스탠딩 감염법( standing infecting method )에 의한 유전자 도입에 있어서의 레트로넥틴과 Native 피브로넥틴의 비교

레트로넥틴이 코팅 된 플레이트 및 Native 피브로넥틴이 코팅된 플레이트를 사용해서 유전자 도입을 실시하고, 다능성 줄기세포 유도를 실시하였다. 그리고, 사용하는 플레이트는 하기 실시예 21-(1)에서 작성한 플레이트, 미리 레트로넥틴이 코팅된 35mm 배양접시(다카라바이오사, T110A) 및 Native 피브로넥틴이 코팅된 35mm 배양접시(FALCON사, 354457)의 시판품을 사용하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다. 단, 배양용기에는 난-트리트먼트 35mm 배양접시(IWAKI사)를 사용하였다. 또 시판품인 레트로넥틴 및 Native 피브로넥틴을 코팅필의 배양접시(이하, 각각, ‘레트로넥틴 디쉬, 피브로넥틴 디쉬’라고도 기재한다)에는, 이것들의 고정화 조작은 실시하고 있지 않다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

제제예 2에서 조제한 바이러스액을, 표 27의 조합으로 등량씩 혼합한 후, 10F-DMEM으로 10배 희석하고, 실시예 21-(1)에서 조제한 레트로넥틴 고정화 배양 배양접시, 혹은 레트로넥틴, Native 피브로넥틴이 코팅된 배양접시에 각각 2㎖씩 첨가하고, 32℃의 CO₂ 인큐베이터 내에 4∼6시간 그대로 두었다.

그 후에 각 배양접시에서 상청액을 제거하고, PBS로 1회 세정후, 5×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 성인 피부섬유아 세포를 2㎖씩 각 배양접시에 파종한 후, 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 배양을 개시하였다(배양 0일째).

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 21-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

(5) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해, 배양 27일째까지 피더세포 상에서의 배양을 실시하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 27일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 28에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=3의 평균값을 나타낸다.

표 28에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴에 바이러스를 흡착시킬 때, 원심조작을 실시하지 않는 스탠딩(standing) 감염법에 있어서도, 레트로넥틴에서는 iPS 세포 유도가 가능하였다. 이에 대해서, Native 피브로넥틴에서는 다능성 줄기세포의 콜로니가, 레트로바이러스의 조합에 관계없이 하나도 얻을 수 없었다. iPS 세포 유도에 있어서의 레트로넥틴의 Native 피브로넥틴에 대한 우위성이 분명하게 되었다.

실시예 22 바이러스 혼합비율의 검토

다능성 줄기세포의 유도효율의 향상을 목적으로, 최적의 바이러스 벡터 혼합비율의 검토를 실시하였다. 또, 유도에 사용하는 유전자로서 OCT4, SOX2 및 KLF4의 3종류를 사용하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 11-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 11-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 단, 표 29에 나타낸 바와 같이, 바이러스 혼합비율을 변경하였다. 또, 유전자 도입법은 레트로넥틴법으로, 바이러스 용액을 100배 희석해서 감염에 사용하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 22-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

실시예 11-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다.

(5) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에서의 배양을 실시하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 27일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 30에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=3의 평균값을 나타낸다.

표 30에 나타내는 바와 같이, DON5-am-OCT4-IR-SOX2을 DON5-am-KLF4의 2배량 혼합한 바이러스 용액을 사용함으로써, iPS 세포의 유도효율이 비약적으로 상승하고 있고, 바이러스의 혼합비율을 최적화함으로써, iPS 세포의 유도효율을 더욱 향상시킬 수 있는 것이 분명하게 되었다.

실시예 23 마우스 태아섬유아 세포( mouse embryonic fibroblast ; MEF )에의 레트로바이러스 벡터 도입효율

레트로바이러스 벡터를 사용한 MEF에로의 유전자 도입효율을 레트로넥틴법 및 폴리브렌법으로 비교하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다. 단, 레트로넥틴을 코팅하는 플레이트에는 난-트리트먼트 12구-플레이트(벡톤디킨슨사)를 사용하고, 각 웰에 1㎖씩의 레트로넥틴 용액(25㎍/㎖)을 첨가하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

실시예 19-(2) 및 (3)와 동일한 방법으로 유전자 도입을 실시하였다. 레트로바이러스 벡터는 조제예 3와 동일한 방법으로 조제하였지만, pE-Ampho 플라스미드 대신에 pE-Eco 플라스미드(다카라바이오사)를 사용해서 제작한 DON-eco-AcGFP1을 사용하였다. 조제한 레트로바이러스 벡터를 원액으로부터 10F-DMEM으로 10배 희석씩 100000배까지 희석한 용액을 각각 감염에 사용하였다. 또, 표적세포에는 MEF(밀리포어사사)를 사용하였다.

(3) 배지교환

유전자 도입 다음날에 배지를 10F-DMEM로 교환하였다.

(4) 유전자 도입효율의 측정

유전자 도입조작으로부터 4일후, 세포를 회수하고, 플로우 사이토미터에 의해, AcGFP1 양성세포율을 측정하였다. 그 결과를 표 31에 나타낸다.

표 31에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴법에 의한 유전자 도입효율은 폴리브렌법에 의한 유전자 도입효율보다도 훨씬 높았다. 이것은, 인간 섬유아 세포와 마찬가지로, 마우스 섬유아 세포에 대해서도 레트로넥틴법에 의한 유전자 도입법은 유용한 것을 나타내고 있고, 효율적인 iPS 세포의 유도를 촉진할 수 있다는 것이 시사되었다.

실시예 24 인간 iPS 세포 유도인자를 사용한 MEF 로부터의 iPS 세포 유도

인간과 마우스의 iPS 세포 유도인자의 아미노산 서열은 매우 혹사하고 있고, 기능적으로도 고도로 보존되어 있는 것이 추측된다. 그래서, 인간 iPS 세포 유도인자를 사용해서 MEF로부터 마우스 iPS 세포를 유도 가능여부를 검토하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입

실시예 23-(2)와 동일한 레트로넥틴법에 의해 유전자 도입을 실시하였다. 유도에 사용하는 레트로바이러스 벡터의 조합은 표 32에 나타냈다. 또, 레트로바이러스 벡터는 조제예 2와 동일한 방법으로 조제하였지만, pE-Ampho 플라스미드 대신에 pE-Eco 플라스미드를 사용해서 제작한 레트로바이러스 벡터를 사용하였다.

(3) 배지교환

유전자 도입 다음날 및 3일째에 배지를 10F-DMEM으로 교환하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

실시예 10-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 계대일은 유전자 도입 4일째로 하고, 파종 세포수는 2×10⁵, 5×10⁴ 또는 1×10⁴cells씩 파종하는 군을 설정하였다.

(5) 배양

배양 5일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, 조제예 4에 의해 조제한 마우스 ES 세포용 배지를 2㎖ 첨가하였다. 배양 19일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 19일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표3 3에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 33에 나타내는 바와 같이, 인간 iPS 세포 유도인자를 탑재한 바이러스 벡터를 사용함으로써, MEF로부터도 마우스 iPS 세포를 유도 가능한 것이 분명하게 되었다. 이점으로부터 레트로넥틴을 사용한 iPS 세포 유도 시스템은 인간뿐만아니라, 마우스에 대해서도 유용한 것임을 알았다.

실시예 25 iPS 세포의 EB ( Embryoid body )을 통한 분화유도에 의한 다분화능의 확인

iPS 세포의 정의의 하나로 다분화능을 언급할 수 있고, in vitro에서는 EB를 통한 분화 유도에 의해 다분화능을 확인할 수 있다. 그래서, 제작한 iPS 세포의 다분화능을 평가하는 것을 목적으로 실험을 실시하였다.

(1) iPS 세포의 부유배양

실시예 15-(6)와 동일한 방법에 의해 피더세포와 ES 세포용 배지를 사용하고, 6구-배양 플레이트에서 배양한 iPS 세포 클론(클론 #3)을, ES 세포 박리액을 사용해서 회수하고, EB 형성배지(80% DMEM/F12, 20% knockout Serum Replacement, 2mM L-글루타민, 1×NEAA Mixture)에 현탁한 후, 난-트리트먼트 6구-배양 플레이트에서 부유 배양을 실시하였다. 또, 격일로 배지교환을 실시하였다.

(2) 젤라틴 코팅된 플레이트에로의 접착

배양 8일째에, 전날 젤라틴 코팅한 24웰 플레이트에 EB을 전량 파종하고, 플레이트에 접착시켜서 추가로 8일간 배양을 실시하였다. 또, 격일로 배지교환을 실시하였다.

(3) 면역염색

배양 16일째에, 세포를 4% 파라포름알데히드로 실온 10분간 고정을 실시한 후, PBS로 2회 세정하고, 1% BSA/PBS로 실온 1시간 반응함으로써 블록킹을 실시하였다. 그 후에 Mouse anti-βIII-tublin antibody(Millipore사) 또는 Mouse anti-α-smooth mucsle actin antibody(DAKO사)를 1% BSA/PBS로 50배 희석한 용액을 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트를 실시하였다. 다음날, PBS로 3회 세정후, 1% BSA/PBS로 실온 1시간 반응함으로써 블록킹을 실시하였다. Alexa Fluor 594 F(ab‘)2 fragment of goat anti-mouse IgG (H+L) antibody(invitrogen사)를 1% BSA/PBS에서 1000배 희석한 용액을 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이트를 실시하였다. 다음날, PBS에서 3회 세정후, 형광현미경에 의한 관찰을 실시하였다.

그 결과를 도 3에 나타낸다. 도 3에서 분명하게 나타내는 바와 같이, 본 방법으로 제작한 iPS 세포는 외배엽계의 세포인 βIII-tublin, 중배엽계의 세포인 α-smooth mucs leactin 양성의 세포로 분화가능하고, 다분화능을 가지는 것임이 나타났다.

실시예 26 유전자 도입후부터 피더세포에로의 계대까지의 배지검토

Calf serum(송아지 혈청)은 FBS(소태아혈청)보다도 분화 유도인자가 적다고 예상되고, iPS 세포유도에 더욱 적합할 가능성이 생각되었다. 그래서, 유전자 도입후로부터 피더세포에로의 계대까지 사용하는 배지 중의 혈청성분의 iPS 세포 유도효율에로의 영향에 대해서 검토를 실시하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 11-(2)와 동일하게, 레트로넥틴법에서 100배 희석한 용액을 사용해서 유전자 도입을 실시하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 11-(3)과 동일한 방법에 의해 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

실시예 11-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 단, 유전자 도입 2회째의 다음날로부터 피더세포 상에로의 파종까지의 배지 중의 혈청성분을, 표 34에 나타내는 조성으로 변경하였다.

(5) 배양

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 27일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 35에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 35에 나타내는 바와 같이, calf serum의 농도의존적으로 iPS 세포 유도효율이 증가하고, 5%, 10% 및 20%에서는 대조군인 조건 A보다도 높은 유도효율이 수득되었다. 이것d으로부터, calf serum은 iPS 세포 유도시의 세포의 확대에 효과적인 것임이 나타났다.

실시예 27 세포주기 정지제의 검토-2

실시예 3에서 다능성 줄기세포의 유도 촉진 효과가 확인 된 세포주기 정지제의 푸르발라놀 A에 대해서, 약제처리 기간의 연장과, 세포사를 억제하는 물질의 하나인 Y27632[(R)(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카르복시아미드디하이드로클로라이드]와의 병용을 검토하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 3-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 다만 바이러스액은 3종의 벡터를 등량씩 혼합한 용액을 10F-DMEM으로 10배 희석하고, 각 웰에 2㎖씩 첨가하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 27-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

(5) 세포주기 정지제 처리와 배양

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지로 교환후, 표 36에 나타내는 바와 같이, 약제 처리를 실시하였다. 약제처리 기간 종료후, ES 세포용 배지로 교환하고, 배양 26일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다. 4일간 또는 6일간의 약제 처리를 실시한 조건에 대해서는, 약제 처리기간 동안도 2일 걸러서 배지를 교환하고, 그때마다 약제를 동일한 농도로 첨가하였다.

6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 26일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 37에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 37에 나타내는 바와 같이, 푸르발라놀 A에 의한 약제처리 기간을 4일간으로 연장하는 것에 의해, 다능성 줄기세포의 유도효율이 더욱 높아지는 것이 분명하게 되었다. 또 푸르발라놀 A에 의한 약제처리 기간을 연장하였을 경우, 세포사를 억제하는 물질의 하나인 Y27632을 첨가함으로써, 안정적으로 다능성 줄기세포 콜로니가 수득되는 것임이 분명하게 되었다.

실시예 28 세포주기 정지제의 검토-3

다능성 줄기세포의 유도 배양에 있어서, 세포주기 정지제의 하나인 NU6140(ALEXIS BIOCHEMICALS사)에 의한 약제처리를 실시하고, 유도효율에로의 영향을 검토하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 1-(1)과 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다. 단, 난-트리트먼트 12구-배양 플레이트(벡톤디킨슨사)를 사용하고, 레트로넥틴 용액은 각 웰에 1㎖씩 첨가하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 다만 바이러스액은 3종의 벡터를 등량씩 혼합한 용액을 10F-DMEM으로 100배 희석하고, 각 웰에 1㎖씩 첨가하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 28-(2)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고, 배양을 계속하였다.

(5) 세포주기 정지제 처리와 배양

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지로 교환후, 각각 최종농도 0.1㎛, 1㎛이 되도록 NU6140을 첨가한 군을 설정하였다. 또, 컨트롤에서는 약제를 첨가하지 않았다. 2일간 배양후, ES 세포용 배지로 교환하고, 배양 28일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 28일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 38에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 38에 나타내는 바와 같이, 컨트롤(무처리)보다도 NU6140에 의한 약제처리를 실시한 군에서 다능성 줄기세포 콜로니의 수가 많아졌다. 즉, 다능성 줄기세포 유도의 과정에 있어서, 세포주기를 정지시킴으로써, 유도효율이 높아지는 것임이 재확인되었다.

실시예 29 DHCP 의 검토

다능성 줄기세포의 유도 배양에 있어서, 동식물유래의 우론산 화합물을 가열함으로써 생성한 화합물 DHCP(국제공개 제98/13328호 팸플릿), 및 DHCP에 글루타티온이 부가된 GM(국제공개 제98/39291호 팸플릿)에 의한 약제처리를 실시하고, 유도효율에로의 영향을 검토하였다.

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

실시예 28-(1)와 동일한 방법에 의해 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화를 실시하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

실시예 4-(2)와 동일한 방법에 의해 유전자 도입을 실시하였다(배양 0일째). 다만 바이러스액은 3종의 벡터를 등량씩 혼합한 용액을 10F-DMEM으로 10배 희석하고, 각 웰에 1㎖씩 첨가하였다.

(3) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

(4) 피더세포 상에로의 파종

(5) 약제처리와 배양

배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 6구-배양 플레이트로부터 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지로 교환후, 각각 최종농도 10㎛이 되도록 DHCP 및 GM을 첨가한 군을 설정하였다. 또, 컨트롤에서는 약제를 첨가하지 않았다. 2일간 배양후, ES 세포용 배지로 교환하고, 배양 26일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이에, 1∼2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(6) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 26일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 39에 나타낸다. 또, 표중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 39에 나타내는 바와 같이, 컨트롤(무처리)보다도 DHCP 및 GM에 의한 약제처리를 실시한 군에서 다능성 줄기세포 콜로니의 수가 많아졌다. 즉, DHCP 및 그 유도체인 GM에 다능성 줄기세포의 유도 촉진효과가 있는 것임이 분명하게 되었다.

실시예 30 스탠딩 감염법에 의한 유전자 도입에 있어서의 레트로넥틴과 Native 피브로넥틴의 비교-2

실시예 21과 마찬가지로, 레트로넥틴이 코팅된 플레이트 및 Native 피브로넥틴이 코팅된 플레이트를 사용해서 유전자 도입을 실시하고, 다능성 줄기세포유도를 실시하였다. 동시에 폴리브렌에 의한 유전자 도입도 실시하고, 바이러스액의 희석배율에 대해서도 검토하였다. 그리고, 사용하는 플레이트는 미리 레트로넥틴이 코팅된 35mm 배양접시(다카라바이오사, T110A) 및 Native 피브로넥틴이 코팅된 35mm 배양접시(FALCON사, 354457)의 시판품을 사용하였다.

(1) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

레트로넥틴 및 Native 피브로넥틴이 코팅 된 배양접시를 사용한 유전자 도입은, 실시예 21-(2)와 마찬가지로 실시하였다. 폴리브렌에 의한 유전자 도입에 대해서는 이하의 방법으로 실시하였다. 1일 전에 35mm 세포배양용 배양접시(IWAKI사)에, 5×10⁴cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 피부섬유아 세포를 2㎖씩 파종하고, 1일 배양하였다. 최종농도 4㎍/㎖가 되도록 폴리브렌을 첨가한 레트로바이러스 벡터 혼합액을 조제후, 세포를 배양하고 있었던 배양접시에서 상청액을 제거하고, 이 레트로바이러스 벡터 혼합액을 첨가하고, 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 어느쪽의 방법에 있어서도, 바이러스액은 실시예 21-(2)와 동일한 조합으로 등량씩 혼합하고, 그대로 사용하는 군과, 10F-DMEM으로 10배 희석, 또는 100배 희석하는 군을 설정하였다.

(2) 레트로바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

실시예 30-(1)와 동일한 방법에 의해, 배양 1일째에 2회째의 유전자 도입을 실시하였다.

(3) 피더세포 상에로의 파종

(4) 배양

실시예 10-(5)와 동일한 방법에 의해, 배양 25일째까지 실시하였다.

(5) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 25일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 40에 나타낸다. 또, 표 중의 숫자는 N=2의 평균값을 나타낸다.

표 40에 나타내는 바와 같이, 레트로넥틴을 코팅한 배양접시(표중, '레트로넥틴 디쉬' 라고 기재한다)를 사용한 스탠딩감염법에 의한 유전자 도입은, 폴리브렌에 의한 유전자 도입보다도, 다능성 줄기세포의 유도효율이 훨씬 높았다. 레트로넥틴을 코팅한 배양접시에 의한 유전자 도입에서는, 바이러스액을 희석해서 사용하였을 경우에도, 안정적으로 다능성 줄기세포 유도가 가능한 것에 대해, Native 피브로넥틴을 코팅한 배양접시(표중, '피브로넥틴 디쉬' 라고 기재한다)를 사용한 유전자 도입에서는, 다능성 줄기세포의 콜로니가 전혀 형성되지 않았다. 다능성 줄기세포 유도에 있어서의 레트로넥틴의 Native 피브로넥틴에 대한 우위성이 재확인되었다.

조제예 5 렌티바이러스 벡터의 조제

(1) pLenti6.3 플라스미드 벡터에로의 전이

조제예2-(1)에서 조제한 pDON-5-KLF4를 제한효소 NotI로 소화후, DNA Blunting Kit(다카라바이오사)를 사용해서 평활화하고, 추가로 제한효소 XhoI로 소화해서 KLF4 프래그먼트를 얻었다. 조제예2-(4)에서 조제한 pDON-5-OCT4-IR-SOX2를 제한효소 NotI로 소화후, DNA Blunting Kit를 사용해서 평활화하고, 추가로 BlnI로 소화시키는 것에 의해서 OCT4-IR-SOX2 프래그먼트 1을 얻었다. 동알히게, pDON-5-OCT4-IR-SOX2를 제한효소 BlnI 및 XhoI로 소화하고, OCT4-IR-SOX2 프래그먼트 2를 얻었다. 또, 조제예2-(4)에서 조제한 pDON-5-LIN28-IR-NANOG를 NotI로 소화후, DNA Blunting Kit를 사용해서 평활화하고, 추가로 XbaI로 소화시키는 것에 의해서 LIN28-IR-NANOG 프래그먼트 1을 얻었다. 동일하게, pDON-5-LIN28-IR-NANOG를 제한효소 XbaI 및 XhoI로 소화시킴으로써 LIN28-IR-NANOG 프래그먼트 2를 얻었다. pLenti-6.3/V5-TOPO 플라스미드(Invitrogen사)를 제한효소 EcoRV 및 XhoI로 소화하고, pLenti6.3 프래그먼트를 얻었다. 상기의 각종 프래그먼트를 1.0% 아가로스겔 전기영동에 적용하고, 목적 사이즈의 DNA프래그먼트를 추출, 정제하였다. pLenti6.3 프래그먼트를 KLF4 프래그먼트, OCT4-IR-SOX2 프래그먼트 1 및 2, 또는 LIN28-IR-NANOG 프래그먼트 1 및 2와 각각 혼합하고, DNA Ligation Kit<Mighty Mix>를 사용해서 연결하였다.

이렇게 해서 제작된 재조합 플라스미드에서 각 유전자가 정확하게 삽입된 것을 선택하고, 각각 pLenti6.3-KLF4, pLenti6.3-OCT4-IR-SOX2 및 pLenti6.3-LIN28-IR-NANOG라고 명명하였다.

(2) 렌티바이러스 벡터의 생산

조제예 2-(5)와 마찬가지로, G3T-hi 세포를 파종하고, 24시간 배양하였다. 500㎕의 OPTI-MEM에 10㎕의 TransIT(등록상표)-293(다카라바이오사)을 혼합하고, 실온에서 5분방치후, 4㎍의 Vira Power Lentiviral Packaging Mix(Invitrogen사) 및 1㎍의 조제예 5-(1)에서 조제한 각 재조합 플라스미드를 각각 첨가해서 혼합하고, 추가로 15분간 실온에서 방치하였다. 이 혼합액을 상기의 G3T-hi 세포에 첨가해서 배양을 계속하고, 24시간후에 4㎖의 10F-DMEM으로 교환하였다. 추가로, 24시간 배양을 계속한 후, 바이러스를 포함하는 배지를 회수하고, 0.45㎛의 필터로 여과해서 렌티바이러스 벡터를 포함하는 바이러스액을 조제하였다. 표 41에 각각의 재조합 플라스미드로부터 얻은 렌티바이러스 벡터의 명칭을 나타낸다. 3종의 바이러스액은 등량씩 혼합하고, 감염에 사용하였다. 혼합 바이러스의 일부는 바이러스액의 3분의 1량의 Lenti-X Concentrator(Clontech사)를 첨가해서 혼합하고, 4℃에서 1시간 방치하였다. 그 후 1,500×g으로 1시간 원심후, 상청액을 제거하고, 새롭게 10F-DMEM을 첨가하고, 20배 농축 바이러스액을 조제하였다. 농축전 혹은 농축후의 바이러스액은 조제 후 곧 바로 사용하지 않는 경우에는 -80℃로 동결보존 하고, 사용시에 해동해서 사용하였다.

실시예 31 렌티바이러스 벡터를 사용한 다능성 줄기세포의 유도

(1) 레트로넥틴의 배양 플레이트에로의 고정화

(2) 렌티바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 1회째

조제예 5에서 조제한 각혼합 바이러스액을 12구 레트로넥틴 고정화 배양 플레이트, 혹은 12구-배양 플레이트에 500㎕씩 첨가하고, 추가로 1×10⁵cells/㎖가 되도록 10F-DMEM에서 현탁한 인간 성인 피부섬유아 세포를 500㎕씩 각 웰에 첨가하였다. 폴리브렌 감염조건에 대해서는 최종농도 8㎍/㎖가 되도록 폴리브렌을 첨가하였다. 이것들의 플레이트를 32℃, 1,000×g로 30분 원심후, 37℃의 CO₂ 인큐베이터에서 배양을 개시하였다(배양 0일째). 설정한 조건을 표 42에 나타낸다.

(3) 렌티바이러스 벡터에 의한 유전자 도입 2회째

2회째의 유전자 도입을 배양 1일째에, 실시예 31-(2)와 마찬가지로 실시하였다. 추가로, 1일 배양후, 상청액을 제거하고, 10F-DMEM을 1㎖ 첨가해서 배양을 계속하였다.

(4) 피더세포 상에로의 파종

배양 6일째에 실시예 5-(4)와 동일한 방법에 의해 피더세포 상에 유전자 도입세포를 파종하고 배양을 계속하였다. 배양 7일째(피더세포 상에 파종하고나서 1일 배양후)에 상청액을 제거하고, ES 세포용 배지를 2㎖ 첨가하고, 배양 32일째까지 배양을 계속하였다. 그 사이, 2일 걸러서 배지를 교환하였다.

(5) 다능성 줄기세포 콜로니의 계측

배양 32일째에 각 조건의 다능성 줄기세포(iPS 세포) 콜로니 수를 계측하였다. 그 결과를 표 43에 나타낸다. 또, 조건A에 대해서는, 1웰의 결과뿐을 나타낸다.

표 43에 나타내는 바와 같이, 농축의 유무에 관계 없이, 레트로넥틴을 사용해서 감염을 실시하였을 경우에 있어서만, 다능성 줄기세포 콜로니를 얻을 수 있었다. 즉, 렌티바이러스 벡터를 사용하였을 경우에 있어서도, 레트로넥틴에 의한 유전자 도입을 실시함으로써, 폴리브렌에 의한 유전자 도입보다 효율적으로 다능성 줄기세포를 유도할 수 있는 것임이 밝혀졌다.

(산업상의 이용 가능성)

본 발명에 의해, 종래의 제조방법과 비교해서, 높은 빈도로 다능성 줄기세포를 제조하는 방법이 제공된다. 본 발명에 의해 수득된 세포집단에 함유되는 다능성 줄기세포는 공지의 수단에 의해 소망의 세포에 분화시킬 수 있기 때문에, 생체이식용 세포의 제작 혹은 기초연구에서의 사용에 매우 유용하다.

(서열표 프리텍스트)

SEQ ID NO: 1; Primer hSOX2-F to amplify the SOX2 gene.

SEQ ID NO: 2; Prime rhSOX2-R to amplify the SOX2 gene.

SEQ ID NO: 3; Primer hKLF4-F to amplify the KLF4 gene.

SEQ ID NO: 4; Primer hKLF4-R to amplify the KLF4 gene.

SEQ ID NO: 5; Primer IRES-F-SalI to amplify the IRES sequence.

SEQ ID NO: 6; Primer IRES-R-NotI to amplifyt he IRES sequence.

SEQ ID NO: 7; Primer OCT4EndoqP-F1 to amplify the endogenous OCT4 gene.

SEQ ID NO: 8; Primer OCT4EndoP-R1 to amplify the endogenous OCT4 gene.

SEQ ID NO: 9; Primer SOX2EndoP-F2 to amplify the endogenous SOX2 gene.

SEQ ID NO: 10; Primer SOX2EndoP-R2 to amplify the endogenous SOX2 gene.

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Method for producing pluripotent stem cells <130> 669203 <150> JP 2008-177155 <151> 2008-07-07 <150> JP 2008-230040 <151> 2008-09-08 <150> JP 2008-262861 <151> 2008-10-09 <150> JP 2009-010214 <151> 2009-01-20 <150> JP 2009-050694 <151> 2009-03-04 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hSOX2-F to amplify the SOX2 gene. <400> 1 cccggatccg cggccgcatg tacaacatga tggagacgga g 41 <210> 2 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hSOX2-R to amplify the SOX2 gene. <400> 2 cctctagagt cgactcacat gtgtgagagg ggcagtgtg 39 <210> 3 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hKLF4-F to amplify the KLF4 gene. <400> 3 cccggatccg cggccgcatg gctgtcagcg acgcgctgct cc 42 <210> 4 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer hKLF4-R to amplify the KLF4 gene. <400> 4 cctctagagt cgacttaaaa atgcctcttc atgtgtaagg c 41 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IRES-F-SalI to amplify the IRES sequence. <400> 5 taagtcgacg cccctctccc tcccc 25 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer IRES-R-NotI to amplify the IRES sequence. <400> 6 atatgcggcc gctgtggcca tattatcatc gtgtttttc 39 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OCT4EndoqP-F1 to amplify the endogenous OCT4 gene. <400> 7 ttcgcaagcc ctcatttcac 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer OCT4EndoP-R1 to amplify the endogenous OCT4 gene. <400> 8 ttggaagctt agccaggtcc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SOX2EndoP-F2 to amplify the endogenous SOX2 gene. <400> 9 aacagcatgg agaaaacccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer SOX2EndoP-R2 to amplify the endogenous SOX2 gene. <400> 10 gcaaacttcc tgcaaagctc 20

Claims

핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 및/또는 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 영양 기아 조건으로 처리하는 공정이 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정인 방법.
제 2 항에 있어서, 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정이 단백질 농도가 0∼0.5%(w/v)인 배지를 사용해서 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포를 배양하는 공정인 방법.
제 1 항에 있어서, 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포가, 핵 초기화 인자가 첨가된 배양배지에서 배양된 체세포, 핵 초기화 인자가 도입된 체세포, 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자가 도입된 체세포, 및 약제에 의해 핵 초기화 인자를 발현 유도시킨 체세포로 이루어지는 그룹에서 선택되는 체세포인 방법.
제 1 항에 있어서, 핵 초기화 인자가 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
(1) 핵 초기화 인자를 체세포와 접촉시키는 공정, 및
(2) 상기 (1)에서 수득되는 체세포를 영양 기아 조건으로 처리하는 공정 및/또는 세포주기를 정지시키는 약제로 처리하는 공정
을 포함하는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법.
제 6 항에 있어서, 공정 (1)이, 핵 초기화 인자의 배양 배지에로의 첨가, 핵 초기화 인자 또는 당해 인자를 코딩하는 유전자의 체세포에로의 도입 및 약제에 의한 체세포에 있어서의 당해 인자의 발현 유도로 이루어지는 군에서 선택되는 조작에 의해 실시되는 방법.
제 6 항에 있어서, 공정 (2)에 기재된 영양 기아 조건으로 처리하는 공정이 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정인 방법.
제 8 항에 있어서, 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정이 단백질 농도가 0∼0.5%(w/v)인 배지를 사용해서 핵 초기화 인자와 접촉시킨 체세포의 배양에 의해 실시되는 방법.
제 9 항에 있어서, 단백질 기아 조건으로 처리하는 공정에 있어서, 사용하는 배지에 세포사 억제제를 함유시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 핵 초기화 인자가 OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28로 이루어지는 그룹에서 선택되는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단을 제조하는 공정, 및 수득된 세포집단에서 다능성 줄기세포를 단리하는 공정을 포함하는 다능성 줄기세포의 제조방법.
레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 유지하는 레트로바이러스 벡터를 체세포에 감염시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단의 제조방법.
제 13 항에 있어서, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질이 피브로넥틴, 섬유아 세포 증식인자, V형 콜라겐, 상기의 폴리펩티드의 프래그먼트, 폴리리신, DEAE-덱스트란 및 상기 물질 유래의 레트로바이러스에 결합부위를 가지는 기능성 물질로 이루어지는 그룹에서 선택되는 기능성 물질인 방법.
제 14 항에 있어서, 레트로바이러스에 결합하는 활성을 가지는 기능성 물질이 피브로넥틴의 헤파린-II 결합영역을 가지는 폴리펩티드인 방법.
제 13 항에 있어서, OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG 및 LIN28로 이루어지는 그룹에서 선택되는 핵 초기화 인자를 코딩하는 유전자를 유지하는 레트로바이러스 벡터를 체세포에 감염시키는 방법.
제 13 항에 기재된 방법에 의해 다능성 줄기세포를 함유하는 세포집단을 제조하는 공정, 및 수득된 세포집단에서 다능성 줄기세포를 단리하는 공정을 포함하는 다능성 줄기세포의 제조방법.