HU220588B1 - Eljárás és bioreaktortöltet L(-)-almasav előállítására fumársavból - Google Patents
Eljárás és bioreaktortöltet L(-)-almasav előállítására fumársavból Download PDFInfo
- Publication number
- HU220588B1 HU220588B1 HU9602431A HUP9602431A HU220588B1 HU 220588 B1 HU220588 B1 HU 220588B1 HU 9602431 A HU9602431 A HU 9602431A HU P9602431 A HUP9602431 A HU P9602431A HU 220588 B1 HU220588 B1 HU 220588B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- cells
- bioreactor
- malic acid
- killed
- immobilized
- Prior art date
Links
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 title claims abstract description 79
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 25
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 34
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 62
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 51
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims description 20
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 20
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 18
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 16
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 claims description 15
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 12
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 10
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 9
- 108010083554 fumarase C Proteins 0.000 claims description 6
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 102000034238 globular proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108091005896 globular proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001057 ionotropic effect Effects 0.000 claims description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 claims description 3
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims description 2
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 claims description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 claims 1
- 229920002994 synthetic fiber Polymers 0.000 claims 1
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 abstract description 37
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 abstract description 36
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 4
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 abstract description 3
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 35
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 33
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 22
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 16
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 13
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 13
- 108010036781 Fumarate Hydratase Proteins 0.000 description 12
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 11
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 11
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 229940099352 cholate Drugs 0.000 description 7
- 229940050411 fumarate Drugs 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 5
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 5
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000001729 Ammonium fumarate Substances 0.000 description 4
- 235000019297 ammonium fumarate Nutrition 0.000 description 4
- CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N azane;(e)-but-2-enedioic acid Chemical compound N.N.OC(=O)\C=C\C(O)=O CKKXWJDFFQPBQL-SEPHDYHBSA-N 0.000 description 4
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100036160 Fumarate hydratase, mitochondrial Human genes 0.000 description 3
- 241000191948 Kocuria rosea Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 3-nitrobicyclo[2.2.1]hept-5-ene-2,3-dicarboxylic acid Chemical compound C1C2C=CC1C(C(=O)O)C2(C(O)=O)[N+]([O-])=O QJZYHAIUNVAGQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N D-Guluronic Acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 239000001744 Sodium fumarate Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000007444 cell Immobilization Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L disodium fumarate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C\C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-SEPHDYHBSA-L 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 2
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 2
- 125000005613 guluronic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000004021 humic acid Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 malate ions Chemical class 0.000 description 2
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 229940005573 sodium fumarate Drugs 0.000 description 2
- 235000019294 sodium fumarate Nutrition 0.000 description 2
- KPKNKBMTKJSYQP-WLHGVMLRSA-N (e)-but-2-enedioic acid;2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O.OC(=O)C(O)CC(O)=O KPKNKBMTKJSYQP-WLHGVMLRSA-N 0.000 description 1
- RWYRUDPAALLKPX-UHFFFAOYSA-N 2,2-difluoro-n-methylethanamine;hydrochloride Chemical compound Cl.CNCC(F)F RWYRUDPAALLKPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 description 1
- 241000228230 Aspergillus parasiticus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical class OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001749 Calcium fumarate Substances 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 241001337994 Cryptococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 241001465321 Eremothecium Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 229920005830 Polyurethane Foam Polymers 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L [(2r,3s,4r,5r,6s)-6-[[(1r,3s,4r,5r,8s)-3,4-dihydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-8-yl]oxy]-4-[[(1r,3r,4r,5r,8s)-8-[(2s,3r,4r,5r,6r)-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-5-sulfonatooxyoxan-2-yl]oxy-4-hydroxy-2,6-dioxabicyclo[3.2.1]octan-3-yl]oxy]-5-hydroxy-2-( Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H]2OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](CO)O[C@@H](O[C@@H]3[C@@H]4OC[C@H]3O[C@H](O)[C@@H]4O)[C@@H]1O)OS([O-])(=O)=O)[C@@H]2O ZNOZWUKQPJXOIG-XSBHQQIPSA-L 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N aldehydo-L-rhamnose Chemical compound C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-BXKVDMCESA-N 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019296 calcium fumarate Nutrition 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- OLOZVPHKXALCRI-DKWTVANSSA-L calcium;(2s)-2-hydroxybutanedioate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)[C@@H](O)CC([O-])=O OLOZVPHKXALCRI-DKWTVANSSA-L 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004098 cellular respiration Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N cholic acid Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 BHQCQFFYRZLCQQ-OELDTZBJSA-N 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000002301 combined effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003622 immobilized catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011090 industrial biotechnology method and process Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 description 1
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011496 polyurethane foam Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940095064 tartrate Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001256 tonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Catalysts (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás L(–)-almasav (az almasav természetesenantiomerje) folyamatos üzemű előállítására fumársavból, immobilizáltrekombináns baktériumok, adott esetben elöltsejtes bioreaktoralkalmazásával. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható új, magasféléletidejű bioreaktortöltet szintén a találmány tárgyát képezi. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás L(-)-almasav (az almasav természetes enantiomeije) folyamatos üzemű előállítására fiunársavból, immobilizált rekombináns baktériumok, adott esetben elöltsejtes bioreaktor alkalmazásával. A találmány szerinti eljárásban alkalmazható, magas féléletidejű bioreaktortöltet szintén a találmány tárgyát képezi.
A találmány szerinti eljárás és bioreaktor előnyösen alkalmazható a természetes almasav ipari méretű, költséghatékony, sztereoszelektív előállítására.
Az alábbiakban megadjuk néhány alkalmazott szakkifejezés leírás szerinti értelmezését. Az alább definiált szakkifejezéseket a találmány tárgyával és az igényelt oltalmi körrel kapcsolatosan akkor is a megadott értelemben kell figyelembe venni, ha az általunk használt definíció a szakirodalomban szokásostól esetleg eltérő.
„Molekuláris kompozitgél ”-nék. nevezzük azokat a makromolekulákból felépülő géleket, melyek egynél többféle típusú makromolekulát tartalmaznak oly módon, hogy azok a gélszerkezet kialakításában is szerepet játszanak.
Egy „bizonyos méretű globuláris fehérjéket át nem eresztő membrán ” olyan membrán, melyen keresztül a (molekulatömeg értékben) megadott méretű és annál nagyobb globuláris fehérjék nem facílitált diffúzióval 10 óra alatt szobahőmérsékleten csak 1%-nál kisebb mértékben képesek átjutni.
„Agrózzal rokon szerkezetű ”-nek nevezzük a leírás vonatkozásában az a-1-4 kötésekkel összekapcsolt, 6 szénatomos cukoregységekből (és módosított cukoregységekből) felépülő lineáris polimereket, melyek meghatározott olvadás-, illetve dermedésponttal bírnak.
A leírásban az „almasav’’ és „fitmársav” kifejezéseket olyan kibővített értelemben használjuk, hogy azok magukban foglalják az említett savak fiziológiás körülmények között (és a találmány szerinti eljárás végrehajtásakor) jelen lévő sóit is. Ilyen értelemben az említett kifejezéseket - sorrendben - a „malát” és „fumarát” kifejezések szinonimáiként is használjuk (amint az egyébként a biokémiai szakirodalomban megszokott). Az elmondottak értelmében például egy bizonyos pH-értékre puffereit 1 M-os „almasav”-oldat valójában (disszociált és disszociálatlan) „malát -ionokra nézve 1 M-os.
A természetes almasav minden élő sejtben előfordul, mint a sejtek egyik fő energetikai rendszerének, a Szent-Györgyi-Krebs-ciklusnak eleme. A ciklus reakciósorozatában az átalakulás iránya
L-malát—> fumarát+víz.
A reakciót a fumarázenzim (E.C.4.2.1.2.) katalizálja. A reakció egyensúlyi állandója 0,23. Az enzim abszolút specifikus a fumársavra és az L-almasavra. Természetes szabályzóinhibitorai a szukcinát (Kj=5,2 χ 10 2) és a citromsav (Kj=5,5 χ 10-3).
Az enzim által az élő sejtben beállított egyensúly biztosítja a biotechnológiai alkalmazhatóságot, azaz ha az élő sejtek környezetében a fumársav koncentrációját megemeljük, a rendszer az anyagcserére jellemző egyensúlyi érték felvételére törekszik. így a reakció iránya megfordul és nagy mennyiségű természetes almasav keletkezik.
A reakció sztereospecifikus, szemben a fumársavból vagy maleinsavanhidridből kiinduló kémiai szintézissel, amely racém almasavat eredményez. A fumarázenzim konstitutívan szabályozott, azaz a sejtek teljes életciklusában a genomról folyamatosan átíródik és szintetizálódik. Ennek ellenére mégis indukálható, azaz kópiaszáma az élő sejtben megnövelhető, amennyiben a tenyésztő közegbe fumársavat, malonsavat, tartarátot, vagy az enzim kompetitív inhibitorait tesszük. A fumarázenzim szintje azonban nem minden sejtben egyforma, és ez technológiai értelemben limitálja a szóba jöhető szervezetek számát.
Mind a fumársav, mind az almasav alkálisói vízben jól oldódnak és a biológiai membránokon képesek áthatolni.
Az L(-)-almasav felhasználási területe igen széles. Eves világtermelése körülbelül 50 000 tonna. Várhatóan az új technológiai igények miatt a közeljövőben ennek sokszorosára lesz szükség.
Az almasav alapvető energetikai szerepe mellett fontos élettani, biokémiai feladata még az egyes fémionok komplex formában történő tárolása és szállítása az élő szervezetben. Ezen a biológiai funkcióján alapul kalciumsójának gyógyászati alkalmazása is, az öregkori csontritkulás megelőzésére és terápiájára.
Mivel kitűnő kelátképző, az optimalizált humán mikroelem-készítmények (például Béres cseppek) alapvető alkotórésze.
Az aminosavkeverékeket tartalmazó roborálószerekben az aminosavak szintén L(-)-almasavas sóik formájukban kerülnek felhasználásra.
Jól ismert tény, hogy a húsok érlelése kapcsán azokban tejsav keletkezik, halmozódik fel. Az USA-ban elteqedóben van egy olyan eljárás, amely szerint a húsok érlelésének gyorsítására és a tartósításhoz természetes almasavat alkalmaznak. Ha ez a módszer széles körben elterjed (amit egyszerűsége indokol), akkor várhatóan világszerte jelentősen megnő az igény az almasav iránt.
A kozmetikai ipar is almasav-felhasználó, az almasavat az úgynevezett gyümölcssavakat tartalmazó arcápoló tonikkészítményekben alkalmazzák. (Megjegyezzük, hogy az említett készítmények hatásmechanizmusa a hámsejtek Krebs-ciklusának serkentésén alapszik).
Fontos szerepe lehet az almasavnak az üdítőital-előállításban is, ahol a citromsavat részben helyettesítheti. Ez olyan terméket eredményez, ami kézenfekvő biokémiai okok miatt nem hizlal, hiszen az almasav a SzentGyörgyi-ciklusból úgy lép ki, hogy a sejtlégzést aktiválja, míg a citromsav fogyasztása - mivel belőle acetilCoA keletkezik - a zsírsavszintézis irányában hat.
A közeljövőben várhatóan az almasav jelentős felhasználójává válik a vegyipar is, mert a természetes almasav alkalmas arra, hogy belőle biológiailag lebontható polimereket állítsanak elő.
A fumarát->malát reakció fontosságát számos szerző felismerte és napjainkra számos technológiát dolgoztak ki az L(-)-almasav előállítására.
Az almasav szervesvegyipari előállítása egyszerű, jól kidolgozott eljárás, amely a maleinsavanhidrid hidrolízisén alapul. A reakció során fumársav és almasav
HU 220 588 Bl keletkezik közel 50-50%-os arányban. A reakcióelegyből a keletkezett fumársav savanyítással egyszerűen eltávolítható, és visszamarad az anyalúgban a racém (DL-almasav). A racém elegy reszolválása azonban - optikailag tiszta almasav kinyerése céljából - igen körülményes.
Az élő szervezetek fumarázenzime azonban kiválóan alkalmas arra, hogy fumársavból kiindulva sztereospecifikusan (L-)-almasavat állítson elő. A (D+)-variáns előállítására szintén létezik biotechnológiai eljárás, mely a természetes izomer elbontásán alapul.
Shigeo Abe és munkatársai 1960-ban kaptak szabadalmat fermentáción alapuló eljárásukra (US 3 063 910). Az eljárásban az almasav előállítására különböző penészgombákat alkalmaztak: Aspergillus parasiticus, A. flavus A. orysae. Az említett penészfajok többféle szénforrásból fermentálhatják az almasavat, amely a fermentlében halmozódik fel. A szerzők szénforrásként glükózt, fruktózt, mannózt, xilózt, keményítőt és glicerint is alkalmaztak. A fermentációs közegbe CaCO3-ot is adagoltak. Megállapították, hogy a közegbe adagolt néhány kation, például Al3+, Cr3+ előnyösen befolyásolja az almasavképződést a fermentáció alatt. Egy-egy termelési ciklus 5-9 nap volt és az almasav 50 mg/ml mennyiségben képződött.
Dr. Fritz Schindler (1983) szintén penészgombák alkalmazásával állított elő fumársavból igen nagy koncentrációban (100-170 g/1) L(-)-almasavat (DE 3 310 849). Az alkalmazott fajok a következőek voltak: Aspergillus ventii, Helmintosporium sativum és Penicillium nalgiovensys. Eljárása „batch”-rendszerű (nem folyamatos üzemű) fermentáció, amelyben a semlegesített 12,5%-os fumársavoldatot tápanyag komponensekkel egészítette ki. így a fermentáció 3 nap alatt befejeződik. A konverzió 70% körüli.
Kitahara Kano (1959) elegáns eljárása lényegében azon alapszik, hogy a fumársav kalciumsójának oldékonysága nagyobb, mint a kalcium-L(-)-maláté. így a fermentorba szilárd filmársavat és kalcium-karbonátot adagolva a beoldódó kalcium-fumarát átalakul Ca-maláttá, amely szilárd formában kicsapódik. Minthogy a fumarázenzim közelítően 7:3 (malát: fumarát) mólarányban tolja el a rendszer egyensúlyát, és a kalciumL-malát a rendszerből rosszabb oldékonysága miatt folyamatosan eltávozik, közel 100%-os konverzió érhető el. A szerző adatai a fenti savak magnézium- és cinksóira is igazak. A biokonverziós átalakításhoz Lactobacillus delbrueckii és E. coli baktériumfajokat alkalmazott. A reakcióidő 16-32 óra volt, 15-45 °C hőmérséklet-tartományban.
Dr. Ludwig Degen és munkatársai (DE 2 363 285, 1973) az Enterobacteriaceae családba tartozó Paracolobactrum aerogenoides baktériumfajjal termeltettek almasavat fumársavból, és hangsúlyozták a tápközegbe tett fumársav jótékony hatását a termelésre (enzimindukciós effektus).
A DE 3 434 880 számú német szabadalmi leírás (1986) szerzői eljárásukban ammónium-fumarátot dolgoztak fel nagy koncentrációban és megállapították, hogy az általuk referált fonalasgomba-fajok között van olyan, amely 1,8 M ammónium-fumarát-oldatban is jól működik, továbbá ellentétben a különféle baktériumfajokkal nem képez melléktermékként aminosavakat a szubsztrátból. A kiválasztott törzseket először felszaporítják, a termelőreaktort 0,5-50 g/1 (szárazanyag) micéliummal oltják be, kevertetik és levegőztetik. A szerzők megállapítják, hogy az ammónium-fumarát átalakulása gyorsabb, mint a fumársav nátriumsójáé. További előny, hogy az ammónium-fumarát oldékonysága is jobb, mint a nátrium-fumaráté. Módszerükkel 170-400 g/1 természetes almasav is előállítható. A biomasszát 2-3-szor is felhasználják. Az alkalmazott fajok, melyeket szűrővizsgálatok segítségével választottak ki a következők: Aspergillus ventii, A. awamorii, Penicillium nalgiovensys, Hypopichia burtonii, Fusarium oxisporum.
Az 5 476 804 (1979) számú japán szabadalmi leírás szerzői a különféle élesztők előnyös alkalmazhatóságát bizonyítják az L(-)-almasav-termelésben. Közölt módszerükben legfigyelemreméltóbb az a megfigyelésük, hogy a különféle élesztők felhasználása esetén is a fumarát-»malát átalakulás melléktermékek képződése nélkül megy végbe. Szárított biomasszát is alkalmaztak biokatalizátorként cellulóz-acetát-membránba immobilizálva, bár folyamatos rendszerük féléletidejéről nem számolnak be. Vizsgálataikban a következő nemzetségekhez tartozó élesztőket alkalmazták: Candida, Cloechera, Hansenula, Trigonopsys, Sacharomyces, Endomycopsis, Subaniomyces, Sporomyces, Cryptococcus, Devarimyces, Nematospora, Pichia, Cruyferomyces, Rhodotorula és Thorulopsys.
Ichiro Chibata és munkatársai [Eur. J. Appl. Microb. 3:169 (1976)] iskolát teremtettek a rögzített biokatalizátorok területén végzett úttörő kutatásaikkal. Nekik köszönhető többek között, hogy Japánban napjainkban már folytonos-folyamatos üzemű rögzítettsejtes bioreaktorokkal ipari alkoholtermelő üzemek működnek, melyek produktivitása 10-40-szerese a hagyományos rendszerekének. Az L(-)-almasav előállításában is az élenjárnak.
Első L(-)-almasav termelésére szolgáló eljárásuk lényege, hogy a kiválasztott mikrobafajt (a szerzők itt legjobb eredményeiket Brevibacterium ammoniagenes alkalmazásával érték el) kíméletes eljárással poliakrilamid-gélbe immobilizálták [European J. Appl. Microbiol. 3: 169-183, (1976)]. A rögzítettsejtes biokatalizátort detergenssel kezelték, majd oszlopba töltötték és detergenstartalmú 1 M-os nátrium-fumarát-oldatot bocsátottak át az oszlopon. Optimalizálták az átfolyási sebességet. Az immobilizált Brevibacterium-töitettéi 430 pmol/g töltet/óra fumarázaktivitást értek el. Az idézett közlemény részletesen foglalkozik a különféle detergensek hatásának vizsgálatával is, mivel a kationos tenzidek hatására a sejtek belsejében a szukcinát dehidrogenáz-enzimkomplex disszociál, és így visszaszorul a szukcinátképződés, s ezen keresztül a mellékreakciók. További jótékony hatás, hogy javul a sejtmembránok átjárhatósága. A szerzők beszámolnak a rögzítettsejtes biokatalizátor pH- és hőmérséklet-optimumának kísérleti meghatározásáról és a folytonos-folyamatos rendszer féléletidejéről, amit 52,5 napnak találtak.
HU 220 588 Β1
Az említett technológiát éveken keresztül folyamatosan fejlesztették és 1983-ban a „Trends in Biotechnology” folyóirat [1(1), 1983] hasábjain már olyan eljárásról számolnak be, melynek relatív hatékonysága 20szorosa az eredeti módszerének. Ebben a technológiában már sejtbarát mátrixot, poli(etilén-imin)-nel stabilizált kappa-carrageenant alkalmaztak. A Brevibacterium ammoniagenes helyett Brevibacterium flavumot használtak. Töltetükkel 243 napos féléletidejű bioreaktort üzemeltettek 37 °C-on. Az ipari reaktor 1 m3es volt, 70%-os konverzióval üzemelt, 4501/h átfolyási sebesség mellett, 1 M nátrium-fümarát-oldatból kiindulva (pH=7). Ez az ipari eljárás a mai napig a legkorszerűbbnek mondható az üzemesített megoldások közül.
Poliakrilamid-gélbe immobilizált Sacharomyces cerevisiae almasavtermeléséről számolnak be közleményükben Elizabeth A. Oliveira és munkatársai az „Applied Biochemistry and Biotechnology” folyóiratban [47: 65-72 (1994)]. A szerzők a feladatot úgy kívánták megoldani, hogy élesztőben expresszálták a fümaráz gént, és ekképpen megnövelték az enzimmolekula kópiaszámát a sejtekben. A genetikailag módosított élesztő segítségével 60 mmol/gramm sejt/óra aktivitásértékről számolhattak be közleményükben. Ez az adat nagyságrendekkel jobb a korábbiaknál, s jól tükrözi a genetikai manipulációs eljárások hatékonyságát.
A szerzők azonban közölt adataikat híg szubsztrátoldaton mért reakciósebességekből számították, ami nem tükrözi híven az ipari körülmények között alkalmazott tömény (1 M vagy annál töményebb) szubsztrátoldatban elérhető hatékonyságot. Nem számolnak be továbbá a rendszer féléletidejéről, s ez azt sejteti, hogy módszerük valós hatékonysága elmarad a közölt adatokból következtethetőtől.
A technika állásának fenti összefoglalása alapján kijelenthetjük, hogy feltételezhetően az alábbi területeken történő fejlesztésekkel lehet az L(-)-malát biotechnológiai előállítási eljárását hatékonyabbá tenni:
1. A biokatalizátor kópiaszámának növelése a termelésre alkalmazott szervezetben.
2. Az enzim kinetikai paramétereinek javítása, hogy a már elért 7:3 mol/mol L(-)-malát-fümarát arány a feldolgozási műveletek könnyítése céljából az előnyösebb 9:1 arány felé tolódjon el.
3. A rendszer élettartalmának növelése, ami végső soron az aktív katalizátor megőrzését jelenti, így növelve meg az abszolút hatékonyságot.
4. A szubsztrát koncentrációjának növelése, ami az adott mennyiségű almasav előállításához szükséges térfogatáram csökkentését eredményezi.
Az L(-)-almasav előállítására szolgáló biotechnológiai eljárásokban korábban úgy igyekeztek a fumarázenzim szintjét a felhasználni kívánt szervezetekben növelni, hogy a tápoldatba fümársavat adtak egyedüli szénforrásként, kiváltva ezzel a fumarázenzim indukcióját.
Más megoldás is ismert, miszerint a fumarázenzim táptalajban oldott kompetitív inhibitora szintúgy kiváltja az enzim túltermelését a sejtekben. A biokémiai indukciós lépést azonban a sejtek finoman szabályozzák, ez végső soron azt jelenti, hogy a biokatalizátor szintje az alapszintnél egy nagyságrenddel magasabb értékre sohasem szökhet fel, ezért az enzim kópiaszámának drasztikus emelésére csak molekuláris biológiai módszerekkel van lehetőség.
1994-ben kidolgoztunk egy új biotechnológiai eljárást L(-)-almasav előállítására fümársavból az E. coli fümaráz-C-enzimét túltermelő rekombináns baktériumok alkalmazásával [magyar szabadalmi bejelentés, száma: P 9 402 689 (1994. szeptember 19.), közzétéve: 1996. június 28-án].
A módszer az eddig ismertetettekkel szemben két alapvető előnnyel bír.
Egyrészt az E. coli fúmaráz-C-enzimét amplifikáltuk, melyre jellemző, hogy bár az E. coliban fordul elő, kinetikai paraméterei a magasabbrendű szervezetek mitokondriális fümarázenziméhez hasonlóak, és az általa beállított kémiai egyensúly az L(-)-almasav javára az iparilag kívánatos 9:1 mólarányt mutatja.
A későbbiekben közölt eredményeinkből kitűnik, hogy ez az állítás az ipari termelőrendszerekre nem igaz teljes egészében, mert a nagy szubsztrátkoncentrációval üzemelő bioreaktorok konverziói optimális tartózkodási idő mellett nem emelkednek 80%-nál magasabbra.
A másik ipari szempontból nem elhanyagolható előny, hogy az enzim kópiaszámának megnöveléséhez szabályozatlan (azaz konstitutívan expresszáló) expressziós plazmidokat (pCKRIOl/FumC; pRK290/FumC) alkalmaztunk. Ez azért igen nagy előny, mert így a plazmidot tartalmazó sejtek teljes életciklusukban átírják a genetikai információt a plazmidról, és szintetizálják a biokatalizátort.
Ismert, hogy általában a genetikailag módosított szervezetek a termelt fehéijéket az úgynevezett korai log-fázisban állítják elő a legintenzívebben, hiszen ekkor még a szaporodáshoz felhasznált táptalaj a bioszintézishez szükséges anyagokban (aminosavak) gazdag, és az anyagcsere szabályozási trendje is szintetikus anyagcsereutakat részesít előnyben.
Ekkor még a sejtek száma a tápközegben alacsony, 105-107 sejt/ml, és ez a jelenség általában gazdaságtalanná teszi a fehérjetermészetű biokatalizátorok előállítását.
Egy jó fermentáció a folyamat végére 1010 sejt/ml biomasszát eredményez. Ez - amennyiben a megtermelt biomasszát tekintjük a biokatalizátomak (hiszen intakt formában immobilizálva használjuk fel) - a katalizátor mennyiségében legalább százezerszeres különbséget jelent, és ehhez járul még az enzim sejten belüli túltermelése az alapszinthez képest.
A szabályozatlan plazmidról történő folyamatos átíródás tehát lehetőséget teremt arra is, hogy a méretnövelési műveletek során fermentációval a maximális biomasszát produkálhassuk, mert szükségtelenné teszi a sejtek korai leszüretelését a fermentorból. Lehetőség nyílik továbbá arra is, hogy a rögzítettsejtes biokatalizátor előállításához a sejteket folyamatosan állítsuk elő, folyamatos fermentációval (1. ábra), amint azt újabb eredményeink is tükrözik.
Az 1. ábrán jól látható, hogy a kísérleti intervallumban a sejtek a késói logaritmikus fázisban sem veszítik el aktivitásukat, s az ehhez szükséges plazmidot.
HU 220 588 Bl
A harmadik lehetséges lényegi lépés az L(-)-almasav-termelés hatékonyabbá tételében, hogy a biokatalízis térfogatigényét alapvetően lecsökkentjük változatlan anyagáramok mellett, illetve hogy folytonos-folyamatos L(-)-almasav-termelési eljárást fejlesztünk ki.
Erre a sejtek immobilizálása ad lehetőséget. Az ismert irodalmi adatokra támaszkodva elmondhatjuk, hogy a sejtimmobilizálási lépés a fent említett két lényeges szempont miatt 10-40-szeres aktivitásnövekedést jelent, összehasonlítva egy szabadsejtes „batch”-művelettel (ipari alkoholtermelő rendszerekre például a hagyományos „batch”-fermentáció maximális produktivitása 2,2 kg/m3h etanol, míg folytonos-folyamatos rögzítettsejtes bioreaktor esetén ez az érték 50,4 kg/m3h).
Az ismert immobilizálási eljárások közül az úgynevezett bezárási technológiák tekinthetők a leggazdaságosabbnak, mert ezek képesek a legtöbb biomasszát rögzíteni egységnyi térfogatban. A különböző bezárási technikák közös jellemzője, hogy nagy belső pórusmérettel rendelkező gélszerkezetekbe zátják az élő sejteket.
A biokatalizátorok immobilizálására használt gélekkel szemben támasztott ipari követelmények a következők:
- nagy operációs stabilitás, kellő inertség (nem léphet kémiai reakcióba a biotechnológiai művelet anyagaival);
- kellő mechanikai szilárdság;
- megfelelő makro- és mikroporozitás;
- sejtbarát rögzítési technika.
Végül, de nem utolsó sorban, a bezárási műveleti lépés árának arányban kell állnia az előállítandó termék piaci árával.
A fenti követelmények mindegyikének az ismert gélszerkezetek és immobilizálási metodológiák egyike sem felel meg teljes egészében, ezért almasavtermelési technológiánk továbbfejlesztése céljából új immobilizálási módszert dolgoztunk ki, melyet az alábbiakban ismertetünk.
Az úgynevezett „soft” (lágy) gélekbe történő bezárási módszerek alapvetően két csoportba oszthatók. Az első csoportban olyan polimereket alkalmaznak a mátrixképzéshez, hogy az előállított gélszerkezetből a kiindulási anyagok visszanyerhetők legyenek.
Ilyenek általában az úgynevezett „ionotrop” bezárási technikák, ahol negatív töltésű polimerekből (alginátok, pektinek) különböző fémionok segítségével képezhető gélszerkezet. Olyan módszer is ismert, ahol polikationt stabilizálnak szerves savval. Ezen technikák közös erénye, hogy a bezárt biológiai aktivitást igen jól megőrzik, mert az eljárás egylépéses és igen kíméletes. Közös hátrányuk azonban, hogy az így nyert gélszerkezetek hosszú távú operációs stabilitása csak úgy biztosítható, ha a működtetőközegben folyamatosan fenntartjuk a gélszerkezet stabilitásához szükséges kationkoncentrációt. Ez a tény azonban erősen limitálja alkalmazhatóságukat.
A második csoportba azok a technikák sorolhatók, ahol a kialakított mátrix struktúrája olyan, hogy az eredeti komponensek változás nélkül belőle nem nyerhetők vissza. Ilyenek a különböző polimerizációs technikákkal előállított biokatalizátorok: például akrilamidgélekben, poliuretánhabokban történő immobilizálással előállított biokatalizátorok.
E módszerek hátránya, hogy a bezárt biológiai aktivitás tetemes hányada a műveletek során elvész, továbbá a gélek természetes öregedése miatt az aktivitás gyorsabban csökken a használat során, mint az egyéb eljárásoknál. (Például a poliakrilamidba zárt enzimek specifikus aktivitásának általában 70-95%-a a bezárás során elvész, s a bezárt enzim féléletideje 30-90 nap).
A fentiek alapján világos, hogy nem könnyű feladat az ismertetett kritériumok mindegyikének megfelelő gélszerkezet előállítása, tetemes hátrányok nélkül.
Az elmondottak alapján célul tűztük ki, hogy olyan hatékonyságú biotechnológiai eljárást munkálunk ki almasav előállítására fumársavból, amely laboratóriumi eszközrendszer felhasználásával is az ipari szintnek megfelelő aktivitású és termelékenységű technológiát eredményez.
Az ilyen és hasonló elveken működő technológiák alkalmazásával elmaradnak a fermentációs méretnöveléssel járó igen tetemes költségek, mert maga az eljárás olyan intenzív és hatékony, hogy az ipari méretnövelés lépései, melyek általában a biotechnológiai fejlesztésre szánt költségek mintegy 75-90%-át teszik ki, nagy részben elhagyhatók.
A költségkímélésen kívül nem elhanyagolható az intenzív biotechnológiai eljárás környezetkímélő hatása sem, mert az idézett kémiai technológiáknál kevesebb műveleti lépést tartalmaz, illetve annak melléktermékeként felfogható fumársavból állít elő optikailag tiszta almasavat mint fő terméket.
Célunk megvalósításához új, a korábbiaknál hatékonyabb immobilizálási eljárást dolgoztunk ki, melynek alkalmazásával a sejtek hosszabb féléletidővel működtethetők. Az új típusú reaktortöltet elöltsejtes reaktorként, azaz enzimbioreaktorként is működtethető, az immobilizáláshoz alkalmazott speciális szerkezetű kompozitgélszemcsék felületén kialakított burkolatnak köszönhetően, amely megakadályozza, hogy a biokatalizátor enzim a reaktortöltetből kiszabaduljon.
Az új immobilizálási eljárás kifejlesztését az a felismerésünk tette lehetővé, hogy amennyiben alginátból és egy agarózhoz hasonló szerkezetű, de savas csoportokat is tartalmazó polianionból (például GELRITE™ból) - megfelelően alkalmazott komplexképző felhasználásával - kétértékű fémionok által összetartott molekuláris kompozitgélszemcséket alakítunk ki, akkor különösen előnyös sajátságokkal (megnövekedett rugalmasság, szilárdság, ozmotikus stabilitás, ionellenállóság) bíró reaktortöltetet kapunk, melynek felületén polikationok (például kitozán) alkalmazásával rendkívül egyszerűen, előre meghatározott átlagos pórusátmérőjű membrán alakítható ki.
Az új immobilizálási eljárás kidolgozásához az alapötletet az agaróz és a GELRITE™ - az agar helyettesítőjeként forgalmazott biolpolimer - molekuláris szerkezetének hasonlósága és különbsége adta.
Az agaróz a-1-4 kötésekkel kapcsolódó lineáris glükózegységekből felépülő homopolimer. Melegítve fel5
HU 220 588 Β1 oldódik, és határozott dermedést ponttal rendelkezik. A dermedést hőmérséklet attól függ, hogy mekkora a homopolimerben előforduló szulfonált glükózegységek gyakorisága. A szulfonált glükózegységek, amelyeket a rendszerben előforduló nyomnyi mennyiségű, szennyező többértékű kationok össze tudnak kapcsolni, mint egy kristályosodási gócot képeznek a lehűlés során. Ezekből a gócokból indul ki a képződő gél laza, helikális elrendeződésű köztes molekuláris szerkezete, az úgynevezett nem rendezett régió.
A GELRITE™ molekuláris szerkezete az agarózzal rokon, de több savas karakterű molekularészletet tartalmaz. Nevezetesen a GELRITE™ L-rhamnózt, D-glükózt és guluronsavat tartalmaz, 1:2:1 mólarányban, s a polimer molekulalánc ezek repetitív szekvenciáiból épül fel (2. ábra). Csakúgy mint az agaróz, határozott dermedésponttal rendelkezik. A belőle készített gélek 0,8-1,5%-os koncentrációtartományban felelnek meg mechanikai szilárdságban a 2-4%-os agargéleknek. így például a GELRITE™-gélek nem érzékenyek a közeg ionkoncentrációjára, sem a jelen lévő egy- és kétértékű kationok arányára, nem úgy mint az ionotrop gélek. A GELRITE™-gélek azonban az agaróznál merevebbek, és fiziológiás körülmények között a dermedéspontjuk fölé melegítve nem oldódnak fel, hanem vizet vesztenek és zsugorodnak. A GELRITE™-ot ez a tulajdonsága az alginát típusú gélekkel rokonítja, és egyben gyakorlati felhasználását is behatárolja, mert eddig csak táptalajok készítésére használták fel olyan hőmérsékleteken, ahol az agar- és agarózgélek már nem stabilak (a 40-85 °C hőmérséklet-tartományban).
Megfigyeltük azonban, hogy komplexképzők jelenlétében a GELRITE™-ból, hasonlóan az alginátokhoz, szobahőmérsékleten és hidegen is folyékony oldatok készíthetők. így ez a gélképző anyag is alkalmassá vált sejtimmobilizálási célokra. Alkalmazhatósági koncentrációtartománya 0,05-4,01% szárazanyag-tartalomig terjed, amennyiben ügyelünk arra, hogy a komplexképző (EDTA) a rendszerben mindig feleslegben legyen.
Ilyen módon a GELRITE™-gélek, csakúgy, mint az alginátgélek igen egyszerű cseppképzési vagy szálhúzási művelettel készíthetők. Azaz a mátrixképző oldatban szuszpendáljuk a biomasszát, majd azt a megfelelő kation (fiziológiás körülmények között célszerűen CaCl2 0,005-0,2 M-os) oldatába csepegtetjük. A gélképződés itt is, mint az alginátok esetében befelé irányuló iondiffuzió hatására jön létre. A GELRITE™gélek merevségének csökkentésére is lehetőség nyílt azáltal, hogy komplexképzők alkalmazásával a dermedést pont megszűnik.
Ezt úgy értük el, hogy különböző koncentrációjú (szintúgy komplexképzőt tartalmazó) alginátoldatokkal elegyítve a GELRITE™-oldatot, a cseppképzés után molekuláris kompozitokat nyertünk, széles koncentrációtartományban (0,05-4,1%).
Az előállított kompozitgélek ozmotikusán stabilnak bizonyultak, nem érzékenyek a közeg ionkoncentrációjára és eloszlására, ugyanakkor rugalmasak, és mechanikai szilárdságuk meghaladja az alkotó komponensek azonos koncentrációjú géljeinek szilárdságát. Operációs stabilitásuk kitűnő, több mint háromszázhatvanöt napos folyamatos üzem után sem vesztettek lényegesen szilárdságukból.
E meglepő tulajdonságoknak az a valószínű molekuláris magyarázata, hogy a GELRITE™ úgy képes beépülni az alginátgél rendezett régióiba (3. ábra), hogy nem zavarja meg alapvetően azokat a tartományokat, amelyek az alginátmolekula guluronsav-homopolimerrégióiból keletkeznek a kalciumionok által létesített intermolekuláris sóhidak által (4. ábra).
Minthogy a GELRITE™-molekulában átlagosan minden második egység guluronsav, így jó eséllyel épülhet be a rendezett tartomány lineáris régióiba, fellazítva azt. Ugyanakkor könnyen ki is léphet onnan, és a tér távolabbi pontjain kapcsolódhat a gélszerkezet másik rendezett tartományaihoz (5. ábra). Továbbá, annak esélye is csökken, hogy az alginát- és GELRITE™-molekulák önmagukkal alkossanak rendezett régiókat, ami a szerkezet rigiditását növeli, hiszen az adott térrészben a partnermolekula jelenléte miatt a molekulák relatív koncentrációja lecsökken.
Az is valószínűsíthető, hogy az alginátgélekre jellemző „egg box” („tojástartó”) szerkezeti elemek átlagos hossza lecsökken, és a gélszerkezeten belüli átlagos gyakoriságuk nő. (Az alginátokban a guluronsavhomopolimerblokkok átlagosan 10-12 egységből állnak). Ez magyarázhatja a kompozitgél rugalmasságának növekedését a tiszta alginátgélekhez képest.
Minthogy a GELRITE™-molekula guluronsav egységei az alginátok úgynevezett „M box” régióival nem tudnak intermolekuláris kapcsolatot teremteni, így a szerkezet rendezetlen régióinak átlagos mérete és gyakorisága feltételezhetően nem változik, ezért a gél belső pórusmérete változatlan marad, a tisztán alginátgélekhez viszonyítva.
Minthogy a rendezetlen régiók határozzák meg a lágy gélek belső porozitását, és végső soron a szubsztrátok és termékek diffúzióját, ezért igen fontos az a tény, hogy alapvető szerkezetüket a kompozitgélekben is megőrzik.
Itt nem részletezendő mérési adataink szerint az alginát és az alginátkompozit-gélek belsejében egy 800 000 D maximális molekulatömegű algaeredetű színes fehérjekomplex még diffüzióképes. Ezzel szemben viszont az L(-)-almasav-termelő rögzítettsejtes biokatalizátor-szemcsékben a katalizátor a fiimarázenzim, melynek átlagos alegységmérete 50 000 D.
Könnyen belátható, hogy bár intakt élő sejteket zárunk be a biomátrix belsejébe, azok a rendszer működése során (kisebb mértékben már a bezárás közben is) lassan szétesnek, lizálnak s belőlük a katalizátor a közegbe diffundál. így végső soron a rendszer féléletidejét az határozza meg, hogy az enzimet mennyire tudjuk a gélszerkezet belsejében tartani. Az 50 000 D molekulatömegű fumaráz-C így a rendszerből gyorsan távozhat.
E kérdés megoldására az alginát-GELRITE™-mátrix felületén nagy molekulatömegű kitozán alkalmazásával, in situ aszimmetrikus membránszerkezetet alakítot6
HU 220 588 Bl tünk ki, melynek átlagos pórusátmérője olyan, hogy az 50 000 D molekulatömegű marha-szérumalbumint (bovine serum albumin, BSA) már nem engedi át.
A polianiongélek felületmódosítása polikationokkal önmagában ismert eljárás, de ahhoz, hogy az új típusú kompzitmátrix felületén a kívánt átlagos pórusátmérőjű membrán kialakítható legyen, az eljárást optimalizálni kellett.
A fentiek értelmében a találmány tárgyát képezi egy immobilizált sejteket és/vagy elölt vagy elpusztult sejtek immobilizált maradványait tartalmazó bioreaktortöltet, mely töltetre az alábbiak jellemzők:
i) a sejtek kétértékű fémionok által összetartott, legalább kétféle polianiont tartalmazó molekuláris kompozitgélszemcsékben vannak immobilizálva;
ii) adott esetben a kompozitgélszemcsék körül polikationok alkalmazásával meghatározott átlagos pórusátmérőjű membrán van kialakítva; és iii) adott esetben a sejtek immobilizálást követően végrehajtott detergenses és/vagy ultrahangos kezeléssel el vannak pusztítva.
A találmány szerinti bioreaktortöltet, előnyösen olyan kompozitgélszemcsékből áll, melyek polianionokként alginátot és agarózzal rokon szerkezetű, savas csoportokat is tartalmazó polianiont - például GELRITE™ márkanevű műagart (Kelco, USA) - tartalmaznak, adott esetben a gélszemcséket előnyösen kitozán alkalmazásával kialakított membrán burkolja, és adott esetben az immobilizált sejtek előnyösen Na-koláttal végzett és/vagy ultrahangos kezeléssel vannak elpusztítva.
A találmány szerinti reaktortöltet gélszemcséit előnyösen olyan membrán burkolja, melyen az 50 000 D molekulatömegű (és annál nagyobb) globuláris fehérjék számottevő mértékben nem képesek diffúzió útján keresztülhatolni.
A találmány szerinti reaktortöltet előnyösen olyan rekombináns sejteket tartalmaz - például rekombináns E. coli-sejteket - (vagy azok maradványait), melyek fumaráz-C-enzimet konstitutívan expresszáltató vektorral varnak transzformálva, előnyösen a pCKRIOl/FumC plazmiddal (lásd: P9402689). A találmány szerinti reaktortöltet előnyösen 5-20% biomasszát tartalmaz.
A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti bioreaktortöltetek alkalmazásával végrehajtott eljárások L(-)-almasav előállítására fumársavból. A találmány szerinti eljárást előnyösen folyamatos üzemben, 35 °C körüli hőmérsékleten hajtjuk végre. A találmány szerinti eljárások végrehajtásakor a kiindulási fumársavkoncentráció előnyösen legalább 1 M.
Az 1. ábrán látható grafikon a pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformált rekombináns E. coli DH5-a-sejtek specifikus fumarázaktivitásának időbeli változását mutatja egy 25 órás fermentáció során.
A 2. ábrán a „GELRITE™” (Kelco, USA) márkanevű műagar molekuláris szerkezetének vázlatát láthatjuk.
A 3. ábra az alginátgél úgynevezett „egg-box” (azaz „tojástartó”) szerkezeti modelljét szemlélteti.
A 4. ábrán az alginát-GELRITE™-gél feltételezett térszerkezetének vázlatát mutatjuk be.
Az 5. ábrán az alginát-GELRITE™ molekuláris kompozitgél térszerkezetének feltételezett, egyszerűsített „egg-box” modellje látható.
A 6a. és 6b. ábrákon a különböző koncentrációjú kitozánoldatok alkalmazásával burkolt 2%-os alginátGELRITE™-gélszemcsék külső burkának fehérjeáteresztő képességét meghatározó kísérletek eredményeit láthatjuk. A függőleges tengelyen a gélszemcsék eltávolítása után az oldatban maradt BSA (marha-szérumalbumin) extinkcióját ábrázoltuk.
A 7. ábrán a különböző töménységű kitozánoldatok alkalmazásával burkolt alginát-GELRITE™-gélszemcsék felületének feltételezett szerkezetét mutatjuk be.
A 8. ábra az intakt sejtes és a feltárt sejtes biokatalizátorokkal töltött bioreaktorok működési stabilitását szemlélteti, 140 napos időintervallumban.
A 9. ábrán a pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformáit rekombináns E. co/z'-sejtekkel töltött bioreaktor sebességoptimum-vizsgálatának eredményeit láthatjuk.
A 10. ábra a halofil Micrococcus roseus baktériumokkal töltött bioreaktor sebességoptimumának meghatározását szemlélteti.
A 11. ábrán a pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformáit rekombináns E. co/z'-sejtekkel töltött, és a Micrococcus roseus baktériumokkal töltött bioreaktorok specifikus aktivitásának összehasonlítását láthatjuk.
A 12. ábrán az állandó sebességgel működtetett, pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformált rekombináns E. co/í-sejtekkel töltött bioreaktor féléletidejének meghatározását láthatjuk.
A 13. ábra a biomassza mennyiségének optimalizálását mutatja, pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformált rekombináns E. co/z'-sejtekkel töltött bioreaktor esetén.
A 14. ábrán látható grafikon a pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformált rekombináns E. co/z-sejtekkel töltött bioreaktor almasavtermeló képességét mutatja a 0-60 °C hőmérséklet-tartományban.
A 15. ábrán a pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformáit rekombináns E. co/z'-sejtekkel töltött bioreaktor hőmérséklet-optimumának meghatározását láthatjuk.
1. példa
Optimális pórusátmérőjű membránnal burkolt kompozitgélszemcsék előállítása
Első lépésben 2% összes szárazanyag-tartalmú alginát-GELRITE™ polimermátrixot állítunk elő az alábbiak szerint.
100 ml 2%-os nagy molekulatömegű Na-alginát(Protanal HF) oldatot készítettünk úgy, hogy az alginátot 100 mg/ml EDTA-oldatban (pH=7) oldjuk fel. Hasonló módon, 10 ml 100 mg/l-es EDTA-oldatban 2% GELRITE™-ot szuszpendálunk fel, majd az oldatokat kuktában 20 percig sterilizáljuk.
A kész steril oldatokat forrón összeöntjük, majd hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre. A lehűlt polimerből 20-20 ml-t szilanizált kapillárisokat tartalmazó cseppképző fejen keresztül 50 mM-os CaCl2 oldatba (100-100 ml-be) csepegtetünk lassú kevertetés mellett. A felhasznált CaCl2-oldatokban előzetesen különböző koncentrációban nagy molekulatömegű kitozánt ol7
HU 220 588 Bl dunk fel (0,0001-0,5%). A cseppképzés után a gélszemcséket tartalmazó oldatot még harminc percig lassan kevertetjük, majd egy éjszakán át hűtőszekrényben tároljuk.
A különböző biomasszatartalmú géleket úgy készítjük, hogy a megfelelő állapotban lévő sejttenyészeteket 6000 fordulat/perc sebességgel 4 °C-on centrifugáljuk 5 percig, majd a biomassza tömegét leméqük. A mért tömeg 5%-ának megfelelő mennyiségű fiziológiás sóoldatot (0,85% NaCl) mérünk hozzá, és felszuszpendáljuk (óvatosan csomómentesre keveqük).
A fent leírt tömény baktériumszuszpenziót a lehűlt gélképző oldathoz keveqük a megkívánt 5-20 tömeg%os arányban, majd immobilizáljuk.
A kialakított aszimmetrikus membrán áteresztőképességét úgy vizsgálhatjuk, hogy a kezelt biopolimerek 5-5 g-ját 10-10 ml 1 mg/ml koncentrációjú BSA-oldatban szobahőmérsékleten lassan kevertetjük, és 280 nm-en mérjük a külső oldat extinciójának változását (6. ábra).
A 6. ábrán jól látható, hogy a felület aktuális módosulása a polikation koncentrációjától élesen függ, s csak 0,005% kitozánnal végzett kezelés eredményez a BSA számára gyakorlatilag átjárhatatlan membránt. A vizsgált széles koncentrációtartományon belül csak optimális koncentrációjú kitozánnal végzett kezelés esetén kaptunk változatlan extinkciókat. Az effektus valószínű magyarázatát a 7. ábrán mutatjuk be modellszerűen.
A modell szerint, a pozitív töltésű kitozán a gélszerkezet rendezetlen régióihoz kötődik, hiszen csak ott vannak szabad karboxilcsoportok, s mintegy összehúzza azokat. Szuboptimális koncentrációban alkalmazott polikation esetén maradnak szabad, eredeti méretű pórusok, melyeken át a fehérjék diffúndálni képesek (7b. ábra), miközben a polikation az oldatból elfogy (ez jól mérhető a szilárdító CaCl2-oldatból).
Optimális koncentrációban az összes felületi pórust lefedjük (7c. ábra).
Szupraoptimális koncentrációban a felületi membrán az eredeti struktúrát annyira eltorzítja, hogy a membrán elszakad, és ismét nagy pórusok jönnek létre, melyeken keresztül a BSA ismét diffúndálni képes. (Az ábrán a BSA-molekulákat körök jelzik.)
2. példa
Elölt rekombináns E. coli-sejteket tartalmazó bioreaktortöltet előállítása
Iparilag (elsősorban környezetvédelmi szempontból) előnyös, ha az immobilizált biokatalizátor nem tartalmaz élő sejteket. Technológiai szempontból az a megoldás az egyszerűbben kivitelezhető, ha az intakt sejteket előbb rögzítjük, reaktorba töltjük, és helyben elöljük.
A sejtek dőlésére a detergensekkel történő kezelés a legkézenfekvőbb megoldás, annál is inkább, mert Chibata és munkatársai (lásd 7. oldal) világosan kimutatták, hogy detergenssel végzett kezelés hatására a sejtmembránok fellazulnak az immobilizált rendszerben, továbbá a sejtplazmában található szukcinát dehidrogenáz enzimkomplex detergensek hatására irreverzibilisen károsodik, ezért a rendszerben visszaszorulnak a mellékreakciók.
Az alábbiakban ismertetett kísérlet célja az immobilizált baktériumok dőléséhez használt detergens mennyiségének optimalizálása volt.
A kísérlet során első lépésben regulálatlan plazmiddal (pCKRIOl/FumC) transzformált E. coli 935 K törzset fermentáltunk. A 16 órás tenyészetet 4 °C-on centrifugáltuk, majd a biomasszát két egyenlő részre osztottuk. Az egyik felét az 1. példában leírtak szerint immobilizáltuk úgy, hogy a töltet 20% biomasszát tartalmazott. A biomassza másik felét 5 térfogatszázaléknyi 10%-os Na-kolát-oldatban szuszpendáltunk, majd jégen három másodperces impulzusokkal és három másodperces szünetekkel 3 percig ultrahangoztuk, és a feltárás után azonnal immobilizáltuk. A két töltetből 11-11 ml hasznos térfogatú bioreaktort töltöttünk, és mindkét reaktort az üzemelés előtt 5% Na-kolátot tartalmazó 1 M Na-fúmarát-oldattal mostuk át (két oszloptérfogat, két óra tartózkodási idővel), majd a szubsztrátot 1 M-os (pH-7) Na-fúmarátra cseréltük, s a reaktorokat laborhőmérsékleten 2,37 órás tartózkodási idővel 100 napon át üzemeltettük.
A töltet legnagyobb hányadát 5-5 g-os részletekre osztottuk és 50-50 ml különböző kolátkoncentrációjú 1 M Na-fumarátba helyezve mértük a keletkezett L(-)almasav-mennyiségeket.
A méréseket mikrobiális analízissel egészítettük ki. A mintavételeket steril körülmények között hajtottuk végre, s a reakcióelegyből 0,1 ml-t agarlemezekre szélesztettünk.
A bioreaktorok esetében a detergenses kezdés időtartalma alatt 20 percenként az effluensből mintát vettünk és a fentiek szerint szélesztettük. Minthogy a kompozitgélszerkezet nem oldható vissza, a gélekben lévő sejtszámot úgy közelítettük, hogy mintavételenként két-két szemcsét (ez körülbelül 0,1 ml) sterilen eldörzsöltünk, és szélesztettünk.
Az alábbi I. táblázat adatai azt mutatják, hogy a Nakolát és az 1 M Na-fúmarát-szubsztrát együttes hatására a reaktorok 48 órás időtartam alatt sterillé válnak, s ezzel megszűnik az a veszély, hogy a genetikailag módosított E. coli a környezetbe kikerül az effluenssel.
A második fontos tény, amit ez a kísérletsorozat megmutatott az, hogy hosszú távon az intakt sejtek rögzítése jóval eredményesebb, mert amint azt a 8. ábra is mutatja az intakt módon immobilizált, majd detergenssel utóbb elölt sejteket tartalmazó biokatalizátorral töltött bioreaktor sokkal lassabban veszti el aktivitását, mint a feltárt nyers sejtklvonatot immobilizálva tartalmazó párja, bár mindkét reaktor azonos kezdeti aktivitási értékekről indult.
AII. táblázat adataiból kiderül, hogy a nyers sejtkivonatot tartalmazó töltetre a detergens különböző koncentrációi gyakorlatilag hatástalanok. Az intakt sejtek esetében azonban jelentős reakciósebesség-növekedés tapasztalható, már 0,5% Na-kolát hatására is. Lényegi különbség azonban a különböző koncentrációk között nem tapasztalható, és nem változik az egyensúlyban lévő rendszerben mérhető maximális almasav8
HU 220 588 BI mennyiség sem a detergens koncentrációnövekedésével.
A kapott eredmények alátámasztják kezdeti (és technológiai szempontból fontos) feltételezésünket, miszerint a töltött bioreaktorok egyszeri kezelése maximum 2% detergenstartalmú szubsztráttal szükséges és elégséges. Egyben a rekombináns szervezet környezetbe kikerülését is megakadályozza.
3. példa
Az elölt rekombináns E. coli-sejteket tartalmazó bioreaktor átfolyási sebességének optimalizálása
Az átfolyási optimum és a féléletidő megállapításához két azonos hasznos térfogatú (11 ml) almasavtermelő bioreaktort indítottunk be laborhőmérsékleten, 1 M szubsztrátkoncentrációval üzemeltetve őket. Az egyik reaktor változatlan sebességgel üzemelt, míg a másik esetében átlagosan hetente változtattuk az átfolyási sebességet, olyan tartományból indulva, ahol a biotechnológiai műveletekben szokásos tartózkodási időket mérik (3 óra), s növeltük egészen addig, míg az átfolyási sebességből számítható tartózkodási idő kisebb nem lett az átlagosan 2,4 mm átmérőjű gélszemcséken mért 20 perces diffúziós időnél (0,18 h).
Az adott sebességtartományban mért konverziós értékeket (melyek esetünkben egyenlők az effluensben mért almasav moláris mennyiségével) átlagoltuk. Az átlagértékeket ábrázoltuk az átfolyási sebesség függvényében (9. ábra).
A 9. ábrán jól látható, hogy a vizsgált sebességtartományban a görbének nincs olyan jellegű töréspontja, mely arra utalna, hogy a konverzió adott sebességhatárt átlépve lineárisan csökken az átfolyási sebesség növekedésével, így a sebességoptimum nem határozható meg egyértelműen. Még 30 ml óránkénti átfolyási sebesség esetén is a rendszer konverziója 50% körüli.
Ez a megfigyelés éles ellentétben áll a genetikailag nem módosított szervezetek esetén megfigyelhető és a biotechnológiai gyakorlatból ismert adatokkal. Korábban, független kísérletben hasonló vizsgálatot végeztünk genetikailag nem módosított halofil Micrococcus roseus-izolátummal. E rendszer esetében hasonló körülmények között a sebességoptimum egyértelműen számíthatónak adódott a görbe töréspontja alapján, és a 100 ml hasznos térfogatú bioreaktoron ez 33 ml/óra értéknek adódott (10. ábra).
Az E. co/i-rendszerben tapasztalt kinetikai anomália megértéséhez mindkét rendszer adott sebességtartományhoz rendelt specifikus aktivitásértékeit ábrázoltuk a tartózkodási idő függvényében (11. ábra).
Azt figyelhetjük meg az ábrán, hogy amíg a Micrococcus-rendszer specifikus aktivitása hiperbolikusán csökken a tartózkodási idővel, addig a rekombináns rendszer specifikus aktivitása lineárisan csökken. Ez egyértelműen arra utal, hogy a rekombináns rendszer fümaráza még extrém gyors átfolyási sebesség esetében sem működik szubsztráttelítettségi állapotban, mert az immobilizált katalizátor kópiaszáma igen magas. Viszont emellett a kis sebességtartományban sem éri el a konverzió az elméleti maximumot, a 90% feletti értéket, mert a hosszú tartózkodási idő alatt a visszaalakulás mértéke megnő.
Tehát a rekombináns töltet sohasem dolgozik maximális kapacitással a vizsgált sebességtartományban, azaz „túl jó”.
4. példa
Az elölt rekombináns E. coli-sejteket tartalmazó bioreaktor biomasszatartalmának optimalizálása és féléletidejének meghatározása
A 3. példában ismertetett eredmények tükrében szükségessé vált a rekombináns rendszer biomasszatartalmának optimalizálása.
Az állandó sebességgel működtetett reaktor mért konverziójának logaritmusát a kísérleti idő függvényében ábrázolva meghatároztuk a rekombináns rendszer féléletidejét (12. ábra). A laborhőmérsékleten mért 210 nap féléletidő azonban jóval kisebb, mint az élő, bár nem rekombináns sejteket tartalmazó töltet féléletideje (370 nap). Ezt a „veszteséget” azonban bőven kárpótolja a rekombináns töltet több mint negyvenszeres specifikus aktivitása.
A 3. példa szerinti két bioreaktort 50 nap üzemidő után 1,5 M ammónium-fümarát-oldattal üzemeltettük tovább (III. táblázat). A táblázat adataiból az átlagos konverzió az 51-62 napok átlagából számítva a 0,678nak adódott, azaz változatlannak, ami további bizonyítéka annak, hogy a bezárt enzimmennyiség nem dolgozik szubsztráttelítettségi állapotban, még 1,5 M szubsztrátkoncentrációnál sem. Ez a rendszer további belső tartalékait jelezte.
Független, „batch”-elrendezésü kísérletben újra optimalizáltuk a biomassza mennyiségét a kompozitgélszerkezetben. A kísérletben az 1. példa szerint készítettük a tölteteket úgy, hogy azok rendre 1, 5, 10, 15, 20 térfogatszázalék rekombináns E. coli-sejtét tartalmaztak. A töltetek 5-5 grammját 50 ml 0,5% Na-kolátot tartalmazó 1 M-os Na-fumarát oldatban teszteltük laborhőmérsékleten.
A 13. ábrán jól látható, hogy minimálisan 5% immobilizált biomassza elegendő ahhoz, hogy 10-szeres térfogati különbség esetén 80 perc alatt elérje „steady State” állapotot. Ez azt is jelenti, hogy az előző kísérletekben alkalmazott (és az ipari biotechnológiában megszokott) 20% biomasszatartalmú töltetekhez képest a biomassza negyedrésze is elégséges a kívánt paraméterek eléréséhez.
5. példa
Az elölt rekombináns E. coli-sejteket tartalmazó bioreaktor hómérsékletfüggése
Az irodalmi adatok szerint a fumaráz-C-enzim az E. coliban sokkal hőstabilabb, mint a korábban ismert fumarázok. így célszerűnek találtuk megvizsgálni, hogy a rögzítettsejtes töltet hőmérséklet-optimuma nem tolódik-e el a magasabb hőmérséklet-tartományok felé.
A kérdés vizsgálatát reaktortechnikával végeztük. A 3. példa szerinti módon 11 ml hasznos térfogatú bio9
HU 220 588 Bl reaktort töltöttünk, és a bioreaktort termosztáltuk. Egyegy hőmérsékleti értéken 6 napig inkubáltuk a reaktort, és minden nap mértük a termelt L(-)-almasav-menynyiségeket.
Az átfolyási sebességet a kísérlet időtartama alatt konstans értéken (5 ml/óra) tartottuk. A 14. ábrán a rendszerben mért adatokat mutatjuk be. Az ábra jól tükrözi, hogy a katalizátor működési optimuma a 35 °C körüli hőmérséklet-tartományban van. Az adatokból az is leolvasható, hogy, a termosztált rendszer „simább”, a mért értékek kevésbé ingadoznak, mint a laborhőmérsékleten mért adatok.
Az egyes hőmérsékleti periódusokhoz tartozó konverziós adatokat átlagoltuk, és a hőmérséklet függvényében ábrázoltuk (15. ábra). Megállapíthatjuk, hogy a rendszer széles hőmérséklet-optimummal rendelkezik.
Ez a hőmérséklet-optimum jellegzetesen eltért a várt értéktől, és az irodalomból ismert 37 °C hőoptimumtól.
Az elmondottakból és a bemutatott kísérleti adatokból egyértelműen kitűnik, hogy sikerült előállítanunk 20 egy új típusú, immobilizált biomasszát tartalmazó bioreaktort, melynek féléletideje az új immobilizálási eljárásnak köszönhetően jelentősen hosszabb a hagyományos reaktorok féléletidejénél. Az előállított új bioreak5 tor alkalmazásával minden eddiginél hatékonyabb, iparilag alkalmazható, folytonos-folyamatos üzemű sztereoszelektív almasav-előállítási eljárást valósítottunk meg.
I. táblázat
| Idő (óra) | Élősejt-szám a gyöngyben (lg (sejt/ml)) |
| 1 | 8,48 |
| 3 | 9 |
| 5 | 8 |
| 7 | 7,49 |
| 25 | 0 |
II a. táblázat Intakt sejtes rendszerek
| Mintavételi idő (perc) | ||||||||||
| 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 | 160 | 180 | |
| Na-kolát-koncentráció (%) | ||||||||||
| Kontroll | 0 | 0,072 | 0,263 | 0,349 | 0,52 | 0,508 | 0,608 | 0,546 | 0,6 | 0,609 |
| 0,5% | 0 | 0,212 | 0,393 | 0,495 | 0,554 | 0,563 | 0,619 | 0,561 | 0,575 | |
| 2% | 0 | 0,274 | 0,414 | 0,578 | 0,604 | 0,59 | 0,598 | 0,624 | 0,575 | |
| 5% | 0 | 0,281 | 0,418 | 0,568 | 0,56 | 0,577 | 0,554 | 0,558 | 0,585 | 0,563 |
| 10% | 0 | 0,272 | 0,358 | 0,55 | 0,581 | 0,559 | 0,514 | 0,524 | 0,565 | 0,633 |
II b. táblázat
| Feltárt sejtes rendszerek | ||||||
| Mintavételi idő (perc) | ||||||
| 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | |
| Na-kolát-koncentráció (%) | ||||||
| Kontroll | 0 | 0,348 | 0,561 | 0,695 | 0,692 | |
| 0,5% | 0 | 0,388 | 0,585 | 0,679 | 0,73 | 0,697 |
| 2% | 0 | 0,398 | 0,561 | 0,65 | 0,717 | 0,702 |
| 5% | 0 | 0,376 | 0,579 | 0,637 | 0,695 | 0,699 |
| 10% | 0 | 0,4 | 0,563 | 0,618 | 0,646 | 0,679 |
HU 220 588 Bl
III. táblázat
Ammónium-fumarát mint szubsztrát hatása a biokonverzióra
| Mintavétel (nap) | Teimelt malát (M) |
| 0 | 0,68 |
| 1 | 14 |
| 3 | 1,05 |
| 4 | 0,98 |
| 10 | 0,99 |
| 12 | 1,00 |
| 28 | 0,76 |
| 48 | 0,75 |
| 54 | 0,7425 |
| 61 | 0,6141 |
| 75 | 0,7471 |
SZABADALMI IGÉNYPONTOK
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Immobilizált sejteket és/vagy elölt vagy elpusztult sejtek immobilizált maradványait tartalmazó bioreaktortöltet, azzal jellemezve, hogyi) a sejtek kétértékű fémionok által összetartott, ionerősség-változásra rezisztens, ozmotikusán és mechanikusan stabil, legalább kétféle polianiont - melyek közül az egyik ionotropos gélképző anyag, egy másik pedig anionos oldalláncokat tartalmazó, agarózzal rokon szerkezettel bíró anyag - tartalmazó molekuláris kompozitgélszemcsékben vannak immobilizálva;ii) adott esetben a kompozitgélszemcsék körül polikationok alkalmazásával meghatározott átlagos pórusátmérőjű membrán van kialakítva; és iii) adott esetben a sejtek immobilizálást követően végrehajtott detergenses és/vagy ultrahangos kezeléssel el vannak pusztítva.
- 2. Az 1. igénypont szerinti bioreaktortöltet, azzaljellemezve, hogy a kompozitgélszemcsék ionotropos gélképző anyagként alginátot és agarózzal rokon szerkezetű anyagként műagart tartalmaznak, adott esetben a gélszemcséket polikationként kitozán alkalmazásával kialakított membrán burkolja, és adott esetben az immobilizált sejtek detergensként Na-koláttal végzett és/vagy ultrahangos kezeléssel vannak elpusztítva.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti bioreaktortöltet, azzal jellemezve, hogy a gélszemcséket 50 000 D molekulatömegű globuláris fehéijéket át nem eresztő membrán burkolja.
- 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti bioreaktortöltet, azzal jellemezve, hogy a reaktortöltet rekombináns E. co/z-sejteket és/vagy ilyen - elölt vagy elpusztult - sejtek maradványait tartalmazza.
- 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti bioreaktortöltet, azzal jellemezve, hogy a reaktortöltet fúmaráz-C-enzimet konstitutívan expresszáltató vektorral transzformált rekombináns sejteket és/vagy ilyen - elölt vagy elpusztult - sejtek maradványait tartalmazza.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti bioreaktortöltet, azzal jellemezve, hogy a reaktortöltet pCKRIOl/FumC plazmiddal transzformált rekombináns sejteket és/vagy ilyen - elölt vagy elpusztult - sejtek maradványait tartalmazza.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti bioreaktortöltet, azzal jellemezve, hogy 5-20% biomasszát tartalmaz.
- 8. Eljárás L(-)-almasav előállítására fumársavból, azzal jellemezve, hogy a fumársav L(-)-almasawá történő átalakítására, az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti bioreaktortöltetet alkalmazunk, és adott esetben az eljárást folyamatos üzemben hajtjuk végre.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást 35 °C-on hajtjuk végre.
- 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást legalább 1 M koncentrációjú fumársavból kiindulva hajtjuk végre.
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9602431A HU220588B1 (hu) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | Eljárás és bioreaktortöltet L(-)-almasav előállítására fumársavból |
| DE69721795T DE69721795D1 (de) | 1996-09-05 | 1997-09-05 | Verfahren und immobilisierter biokatalysator zur herstellung von l(-) apfelsäure |
| CA002265250A CA2265250A1 (en) | 1996-09-05 | 1997-09-05 | Method and immobilized biocatalyst for the production of l(-) malic acid |
| PCT/HU1997/000047 WO1998010061A2 (en) | 1996-09-05 | 1997-09-05 | Method and immobilized biocatalyst for the production of l(-) malic acid |
| AU43922/97A AU4392297A (en) | 1996-09-05 | 1997-09-05 | Method and immobilized biocatalyst for the production of l(-) malic acid |
| EP97942129A EP0931142B1 (en) | 1996-09-05 | 1997-09-05 | Method and immobilized biocatalyst for the production of l(-) malic acid |
| AT97942129T ATE239786T1 (de) | 1996-09-05 | 1997-09-05 | Verfahren und immobilisierter biokatalysator zur herstellung von l(-) apfelsäure |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9602431A HU220588B1 (hu) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | Eljárás és bioreaktortöltet L(-)-almasav előállítására fumársavból |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9602431D0 HU9602431D0 (en) | 1996-10-28 |
| HUP9602431A2 HUP9602431A2 (hu) | 1998-06-29 |
| HUP9602431A3 HUP9602431A3 (en) | 1998-10-28 |
| HU220588B1 true HU220588B1 (hu) | 2002-03-28 |
Family
ID=89994246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9602431A HU220588B1 (hu) | 1996-09-05 | 1996-09-05 | Eljárás és bioreaktortöltet L(-)-almasav előállítására fumársavból |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0931142B1 (hu) |
| AT (1) | ATE239786T1 (hu) |
| AU (1) | AU4392297A (hu) |
| CA (1) | CA2265250A1 (hu) |
| DE (1) | DE69721795D1 (hu) |
| HU (1) | HU220588B1 (hu) |
| WO (1) | WO1998010061A2 (hu) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4352883A (en) * | 1979-03-28 | 1982-10-05 | Damon Corporation | Encapsulation of biological material |
| AU4397593A (en) * | 1992-05-29 | 1993-12-30 | Vivorx, Inc. | Microencapsulation of cells |
-
1996
- 1996-09-05 HU HU9602431A patent/HU220588B1/hu not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-09-05 AU AU43922/97A patent/AU4392297A/en not_active Abandoned
- 1997-09-05 EP EP97942129A patent/EP0931142B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 CA CA002265250A patent/CA2265250A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-05 AT AT97942129T patent/ATE239786T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-09-05 DE DE69721795T patent/DE69721795D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-05 WO PCT/HU1997/000047 patent/WO1998010061A2/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU4392297A (en) | 1998-03-26 |
| ATE239786T1 (de) | 2003-05-15 |
| WO1998010061A3 (en) | 1998-04-23 |
| CA2265250A1 (en) | 1998-03-12 |
| DE69721795D1 (de) | 2003-06-12 |
| EP0931142A2 (en) | 1999-07-28 |
| HU9602431D0 (en) | 1996-10-28 |
| HUP9602431A3 (en) | 1998-10-28 |
| EP0931142B1 (en) | 2003-05-07 |
| WO1998010061A2 (en) | 1998-03-12 |
| HUP9602431A2 (hu) | 1998-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chibata et al. | Transformations of organic compounds by immobilized microbial cells | |
| Tosa et al. | Immobilization of enzymes and microbial cells using carrageenan as matrix | |
| JP2883635B2 (ja) | 新規トランスアミナーゼおよびその製法 | |
| Chibata et al. | [16] Immobilization of cells in carrageenan | |
| US5037740A (en) | Novel immobilized cells and fermentation method utilizing the same | |
| van der Pol et al. | Precultivation of Bacillus coagulans DSM2314 in the presence of furfural decreases inhibitory effects of lignocellulosic by-products during l (+)-lactic acid fermentation | |
| Gu et al. | Production of essential L‐branched‐chain amino acids in bioreactors containing artificial cells immobilized multienzyme systems and dextran–NAD+ | |
| Fukumura | Hydrolysis of L-α-amino-ε-caprolactam by yeasts | |
| ES2789328T3 (es) | Proceso para la propagación de una levadura capaz de fermentar glucosa y xilosa | |
| Adinarayana et al. | Production of alkaline protease by immobilized cells of alkalophilic Bacillus sp. | |
| HU220588B1 (hu) | Eljárás és bioreaktortöltet L(-)-almasav előállítására fumársavból | |
| Chibata et al. | Immobilized cells: Historical background | |
| GB2152503A (en) | Process for producing L-phenylalanine | |
| JP4300289B2 (ja) | 加水分解又は脱水縮合酵素、及び当該酵素の生産方法、並びに当該酵素を用いたアミドの合成方法 | |
| Kim et al. | Enhancement of operational stability of immobilized whole cell D-Hydantoinase | |
| JP2004113166A (ja) | ハロペルオキシダ−ゼ活性の安定化方法 | |
| RU2420581C1 (ru) | Способ получения биокатализатора, обладающего активностью в отношении синтеза цефалоспоринов-кислот | |
| Khachatourians et al. | Thymidine phosphorylase activity of anucleate minicells of Escherichia coli immobilized in an agarose gel matrix | |
| JPH01115901A (ja) | ゲル又は固定化ゲルの製造法 | |
| CN111951898A (zh) | 一种筛选能将l-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法 | |
| Anderson et al. | Optimization of growth conditions for the induction of tyrosine decarboxylase in Streptococcus faecalis | |
| Karube et al. | Bacteriolysis by immobilized enzymes | |
| Chibata et al. | Immobilized cells | |
| JPS62205781A (ja) | シユ−ドモナス属菌株の培養方法 | |
| JPH0591895A (ja) | Ｄ−セリンの製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: DR. PETHOE ARPAD, DANUBIA SZABADALMI ES VEDJEG, HU |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: BAY ZOLTAN ALKALMAZOTT KUTATASI KOEZHASZNU NON, HU Free format text: FORMER OWNER(S): BAY ZOLTAN ALKALMAZOTT KUTATASI ALAPITVANY BIOTECHNOLOGIAI INTEZET, HU |
|
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |