JP2007297414A - 標的された部位特異的薬物送達組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】特定の組織部位に生物学的活性薬剤を送達する方法であって、タンパク質カプセル化し不溶性ガスを充填した微小気泡の溶液を形成する工程であって、該微小気泡が該生物学的薬剤に結合される、工程;該溶液を動物に投与する工程;および該生物学的薬剤が該部位に放出されるように、該組織部位を超音波に曝露する工程、を包含する方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、生物活性物質の送達のための新しいおよび改良された薬学的組成物および方法に関する。本発明の方法および組成物は、いくつかの薬剤とともに使用され得、そして生物学的に活性な物質の部位特異的送達を達成し得る。これは、薬物、特に標的された器官で治療濃度を達成する点で問題に悩まされるオリゴヌクレオチドのような薬剤での、より低い用量および改良された効能を可能にし得る。
薬物送達技術は、薬物の利用可能性を増大させ、薬物用量を減少させ、そしてその後の薬物で誘導される副作用を減少させるために、すべての薬物治療の処方に用いられる。これらの技術は、体における薬物の放出を制御し、調節し、そして標的するために作用する。この目的は、より頻度の少ない薬物投与を提供すること、全身循環においてまたは特定の標的器官部位での薬物の一定および持続的治療レベルを維持すること、望ましくない副作用の減少を達成すること、および所望の治療利益を認識するために必要とされる量および用量濃度の減少を促進することであった。
1.特定の組織部位に生物学的活性薬剤を送達する方法であって、タンパク質カプセル化し不溶性ガスを充填した微小気泡の溶液を形成する工程であって、該微小気泡が該生物学的薬剤に結合される、工程;該溶液を動物に投与する工程;および該生物学的薬剤が該部位に放出されるように、該組織部位を超音波に曝露する工程、を包含する方法。
2.前記タンパク質が、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、βラクトース、およびウレアーゼからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
3.前記不溶性ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
4.前記ガスがペルフルオロプロパンである、項目3に記載の方法。
5.前記不溶性ガスがペルフルオロブタンである、項目3に記載の方法。
6.前記微小気泡が、以下の工程によって形成される、項目1に記載の方法:5重量%から50重量%のデキストロースで約2倍から約8倍に希釈された約2重量%から約10重量%のヒト血清アルブミンを含む水性溶液を混合する工程;および該溶液中で特定の部位で空洞を生成するために該溶液を超音波処理ホーンに曝露し、それによって約0.1から10ミクロンまでの直径の安定な微小気泡を生成する工程。
7.前記アルブミンのデキストロースでの希釈が3倍希釈である、項目6に記載の方法。
8.前記ヒト血清アルブミンが5重量%溶液である、項目6に記載の方法。
9.前記デキストロースが5重量%溶液である、項目6に記載の方法。
10.前記生物学的薬剤が、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボザイム、ナプロキセン、ピロキシカム、ワーファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソン、およびミコナゾールからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
11.前記生物学的薬剤がオリゴヌクレオチドである、項目10に記載の方法。
12.前記オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、項目11に記載の方法。
13.前記ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、項目12に記載の方法。
14.生物学的薬剤の標的部位への送達のための組成物であって、タンパク質カプセル化し不溶性ガスを充填した微小気泡を含む水性懸濁液、および該タンパク質に結合した生物学的薬剤を含む、組成物。
15.前記タンパク質が、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、βラクトース、およびウレアーゼからなる群より選択される、項目14に記載の組成物。
16.前記タンパク質がアルブミンである、項目15に記載の組成物。
17.前記ガスが、ペルフルオロカーボンガスである、項目16に記載の組成物。
18.前記ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンからなる群より選択される、項目17に記載の組成物。
19.前記ガスがペルフルオロブタンである、項目18に記載の組成物。
20.前記ガスがペルフルオロプロパンである、項目19に記載の組成物。
21.前記タンパク質がアルブミンであり、そして前記生物学的薬剤が、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、リボザイム、ナプロキセン、ピロキシカム、ワーファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソン、およびミコナゾールからなる群より選択される、項目20に記載の組成物。
22.前記生物学的薬剤がオリゴヌクレオチドである、項目21に記載の組成物。
23.核酸生物学的薬剤の標的部位への送達のための組成物であって、アルブミンカプセル化し不溶性ガスを充填した微小気泡、および該アルブミン微小気泡に結合した核酸生物学的薬剤を含む、組成物。
24.前記微小気泡が、0.1から10ミクロンの直径である、項目23に記載の組成物。
25.前記ガスがペルフルオロカーボンガスである、項目24に記載の組成物。
26.特定の組織部位に核酸生物学的活性薬剤を送達する方法であって、アルブミンカプセル化し不溶性ガスを充填した微小気泡の溶液を形成する工程であって、該微小気泡が該核酸生物学的薬剤に結合される、工程;該溶液を動物に投与する工程;および該核酸生物学的薬剤が放出されるように、該組織部位を超音波に曝露する工程、を包含する方法。
27.前記核酸生物学的薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチ遺伝子オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、またはヌクレオチドベクター、ウイルスベクター、もしくはプラスミドからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
本発明によれば、新しい生物学的活性薬剤送達方法および組成物が開示される。組成物および方法は、オリゴヌクレオチドならびに伝統的薬剤のような送達問題に悩まされている治療剤または診断剤のような薬剤を送達するために使用され得、そして治療インデックスを増加させることおよびバイオアベイラビリティーを改良することのそれぞれの効果的用量を劇的に減少させ得る。これは、次に、薬物の細胞毒性および副作用を減少させ得る。さらに、本発明は、ヘパリン、ジルチアゼム、リドカイン、プロプラノロール(propanolol)、シクロスポリン、および血液プール活性化を必要とする化学療法剤のような他の血漿結合薬物の有効性を劇的に増大させ得る。例えば、ヘパリンの抗凝血特性が、最初に、超音波処理されたデキストロースアルブミンに曝露されたオロソムコイド標識したペルフルオロカーボンと医薬品とを合わせること、次いでこの組み合わせを静脈内に投与することによって、劇的に増強し得ることは、明らかである。
図1は、PESDA微小気泡についての結合データのPS-ODNに対するLineweaver-Burkeプロットである。微小気泡への結合についての平衡解離定数Km(2連で行った7濃度について計算した)は、1.76×10−5Mであった。これは、Srinivasan SKら,「Characterization of binding sites, extent of binding, and drug interactions of oligonucletides with albumin. Antisense Res. Devel. 5:131, 1995で既に報告される3.7〜4.8×10−5Mの溶液中のヒト血清アルブミンに対して、配列5'd(AACGTTGAGGGGCAT)-3'を有する15マーPS-ODNを結合することについてほぼ観察された範囲内である。
超音波イメージングは、治療手順における補助のための診断ツールとして長く使用されてきた。これは、音波エネルギーの波が、目的の領域に焦点を合わせそしてイメージを生じるように反映し得るという原理に基づく。一般的に、超音波変換器は、イメージされるべき領域に重なる体表面上に置かれ、そして音波を生成および受容することによって生成される超音波エネルギーに変換される。超音波エネルギーは、超音波イメージに翻訳される変換器に戻って反映される。反映されたエネルギーの量および特徴は、組織の音響的特性に依存し、そして音響生成性であるコントラスト剤が目的の領域で超音波エネルギーを生成しそして受容したイメージングを改良するするために優先的に使用される。コントラスト超音波器具使用の論議については、DeJongおよび「Acoustic Properties of Ultrasound Contrast Agents」, CIP-GEGEVENS Koninklijke BIBLIOTHEEK, Denhag (1993), 120頁以降を参照のこと。
薬物 アルブミン結合% 薬物クラス
ナプロキセン 99.7 NSAID+
ピロキシカム 99.3 NSAID+
ワーファリン 99.0 抗凝血剤
フロセミド 98.8 ループ利尿剤
フェニルブタゾン 96.1 NSAID+
バルプロ酸 93.0 抗てんかん剤
スルフイソキサゾール 91.4 スルフォンイミド抗生物質
セフトリアキソン 90〜95* 第3世代セファロスホ゜リン抗生物質
ミコナゾール 90.7〜93.1* 抗真あ菌剤
フェニトイン 89.0 抗てんかん剤
+非ステロイド性抗炎症薬物
*は患者対患者変化を表す。
オロソムコイドがデキストロースアルブミンに添加される場合、増強され得る薬物のリストはまた、エリスロマイシン(抗生物質)、リドカイン(抗不整脈剤)、メペリジン(鎮痛剤)、メサドン(鎮痛剤)、ベラパミルおよびジルチアゼム(抗狭心剤)、シクロスポリン(免疫抑制剤)、プロパノロール(抗高血圧剤および抗狭心剤)、およびキニジン(抗不整脈剤)を含む。
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド合成
鎖伸長合成を、ABI Model 391 DNA合成機(Perkin Elmer, Foster City, CA)で1μモルのカラム支持体で行った、またはLynx Therapeutics, Inc.(Hayward CA)によって提供された。1マイクロモル合成は、シアノエチルホスホロアミダイトおよびABI user Bulletin 58によりテトラエチルチウラムジスルフィドとの硫黄化を用いた。
微小気泡薬剤の調製
5パーセントヒト血清アルブミンおよび5パーセントデキストロースを、市販の供給源から得た。5%デキストロースの3部および1部の5%ヒト血清アルブミン(合計16ミリリットル)を、35ミリリットルMonojetシリンジ中に引き出した。各デキストロースアルブミン試料を、8±2ミリリットルのフルオロカーボンガス(デカフルオロブタン;分子量238グラム/モル)または8±2ミリリットルの室内空気のいずれかと手で撹拌し、次いで試料を、20キロヘルツで80±5秒間電気機械的超音波処理に曝露した。このように生成したペルフルオロカーボン曝露した超音波処理したデキストロースアルブミン(PESDA)微小気泡の4つの連続した試料の平均サイズは、ヘモサイトメトリーで測定すると、4.6±0.4ミクロンであり、そして平均濃度は、Coulterカウンターによって測定すると、1.4×109気泡/ミリリットルであった。次いで、微小気泡の溶液を、1000倍容量過剰の5%デキストロースで洗浄して、微小気泡と結合しないアルブミンを除去した。微小気泡を4時間上昇させた。次いで、下方の溶液を、洗浄した泡を残して除去した。次いで、洗浄した泡を、0.9%塩化ナトリウムと混合した。
放射活性な24マーPS-ODNを、PESDAおよび室内空気超音波処理したデキストロースアルブミン(RA-SDA)微小気泡の洗浄した溶液に、5nMの濃度で添加した。非放射活性PS-ODN20マーを、一連の漸増濃度(0、3.3、10、32.7、94.5、167、および626μM)で放射活性24マーを含むチューブに添加した。気泡の懸濁液を、転倒によって混合し、そして37℃にて60分間インキュベートする。
溶液中の放射活性を、液体シンチレーションカウンター(モデルLSC7500;Beckman Instruments GmbH, Munich, Germany)中で液体シンチレーションカウンティングによって決定した。試料容量は100μlであり、これに5mlのHydrocount生分解性シンチレーションカクテルを添加して混合した。試料を、各実験直後に、および次いで化学発光およびクエンチングの影響を減少させるために24時間後に再度カウントした。
PS-ODNの室内空気対ペルフルオロカーボン含有超音波処理したデキストロースアルブミン微小気泡結合の均一性を、フローサイトメトリーによって決定した。微小気泡の溶液を、1000倍過剰容量の滅菌生理食塩水で洗浄した。3つの群の試料を、以下のように3連で調製した;A群(コントロール)、100μlの微小気泡を900μLの生理食塩水に添加した、B群、100μLの微小気泡を900μLの生理食塩水に添加しそして2μLのFITC-標識した20マーを添加した(最終20マー濃度は151nMである)、そしてC群、100μLの微小気泡を800μLの生理食塩水、2μLのFITC-標識した20マー、および100μLの非標識20マーを添加した(最終濃度は151nMである)。インキュベーションを、すべて室温にて20分間行った。
本発明者らが以前に記載したMor-Avi V.ら「Stability of albunex microspheres under ultrasonic irradiation; and in vitro study」J Am Soc Echocardiogr 7:S29, 1994のものと同様の種々のフローマイクロスフェアスキャンニングチャンバーを、研究のために開発した。このシステムは、Masterflexフローシステム(Microgon, Inc., Laguna Hills California)に連結された環状のスキャンニングチャンバーからなる。スキャンニングチャンバーを、水を充填したチャンバーによって各側で囲い、そして音響透過性物質によって各側で結合した。PS-ODN標識したPESDA微小気泡(0.1ミリリットル)を、スキャンニングチャンバーの近くに1秒かけてボーラスとして注入し、次いでプラスチックチューブを介して水道水を充填したスキャンニングチャンバーに、100ml/分の制御された流速で流した。気泡がスキャンニングチャンバーを通る場合、スキャナー(2.0メガヘルツ周波数、1.2メガパスカルピークネガティブ圧力)を、従来の30ヘルツフレーム速度で超音波を送達するようにセットするかまたは遮断するかのいずれかにした。スキャンニングチャンバーを通った後、次いで、溶液を、同じサイズのプラスチックチューブを介して目盛りをつけたシリンダー中に通した。最初の10ミリリットルを捨てた。この後、次の10ミリリットルを、収集チューブ中に入れた。溶出した微小気泡を含む収集チューブを、試料の下方部分に存在する遊離のオリゴヌクレオチドから上部に微小気泡を分離するために、放置した。次いで、溶出液の上部および下部の操作の両方からの滴を、ヘモサイトメータースライド上に置き、そして10×拡大によって分析した。次いで、これらのスライドの写真を作成し、そして次いで、36平方センチメートル場の微小気泡の数を手でカウントした。次いで、残りの流出液の上層および下層を、以下に記載と同様にフローサイトメトリーを使用して、オリゴヌクレオチド含量の分析に使用した。
データの統計学的分析を、複数試料の比較のための非ペアード(unpaired)t-検定および試料の上部から底部のPS-ODNの分配の比較のためのペアード(paired)t-検定の両方でInStatソフトウエア(GraphPad, San Diego CA)を使用して得た。データのグラフでの分析を、Prismソフトウエア(GraphPad, San Diego CA )を使用して得た。
PS-ODNに対する、PESDA微小気泡(上層)、ならびに液体シンチレーションカウンティングによってカウントした非気泡の洗浄した下層(アルブミンなし)、および非洗浄の下層(非気泡アルブミン含有)の分配を、表1に示す。
表1: PESDA微小気泡のアルブミンに対するオリゴヌクレオチド結合
遊離アルブミンの存在における気泡
N 上部 底部 比
cpm/μl cpm/μl T/B
TTAGGG 6 125±6.4 92.3±6.4 1.35
c−myb 6 94.1±17.6 77.3±1.2 1.35
洗浄した気泡(遊離アルブミンなし)
N 上部 底部 比
cpm/μl cpm/μl T/B
TTAGGG 6 210±10.8 126±8.7 1.67
c−myb 6 200.3±37.4 92.7±15.7 2.16
これらのデータは、微小気泡と結合していない非洗浄溶液中のアルブミンが、PS-ODNに結合し、そのためPS-ODNの分配が微小気泡(上層)と周囲の溶液(下層;p=HS)との間で等価であることを示す。アルブミンを結合した非微小気泡(表1の洗浄した気泡)の除去は、PS-ODNのPESDA微小気泡との顕著な分配を示さない(TTAGGG PS-ODNについては1.67およびc-myb PS-ODNについては2.16)。表1に報告した実験における全放射活性の回収は、添加した放射活性の96%であり、これは100%とは有意に異ならない。
表2: オリゴヌクレオチド(PS-ODN)結合した微小気泡の分布
コントロールPS-ODN 151nM FITC PS-ODN 過剰の非標識ODN
番号 PE MI PE MI PE MI
1 99.5 2.38 98.9 2109.8 97.8 1753.1
2 99.3 4.07 99.1 2142.3 98.7 1710.9
3 99.4 3.52 99.1 2258.5 99.3 1832.2
平均 3.23 2170 1765
±SE ±0.50 ±461 ±361、2
PE=パーセント事象
MI=平均強度
SE=標準誤差
1は、この平均がコントロールとは有意に異なることを示す、p<0.001
2は、この平均が151nMとは有意に異なることを示す、p<0.001
過剰の非標識PS-ODNを含む試料の平均蛍光強度の有意な減少は、微小気泡の結合が飽和していることを示す。結局、結合が飽和しているので、PS-ODNの微小気泡表面との非特異的相互作用は制限される。PS-ODNの洗浄したPESDA微小気泡に対するGaussian分布は、これらの微小気泡上のアルブミンが、オリゴヌクレオチドについての結合部位を保持することを示した。洗浄したRA-SDAについてのGaussian分布の欠如は、このオリゴヌクレオチドについてのアルブミン結合部位1の喪失が、これらの微小気泡の超音波処理中に生じることを示した。オリゴヌクレオチドに特に関連するようなアルブミン結合特性の議論については、Kumar, Shashiら「Characterization of Binding Sites, Extent of Binding, and Drug Interactions of Oligonucleotides with Albumin」Antisense Research and Development 5: 131-139 (1995)(この開示は参考として本明細書中に援用される)を参照のこと。
懸濁液中のPS-ODN標識したPESDA微小気泡の2.0メガヘルツ診断超音波の観察された影響を、表3に提供する。
表3: 微小気泡への診断超音波曝露後のPS-ODNおよび微小気泡カウントの分析。
下部=超音波処理後の溶出溶液の下層
超音波への曝露後の上層に微小気泡の著しい喪失がある(超音波なしの219±54の微小気泡対診断超音波へ曝露した場合の溶出液の上層において53±21の微小気泡)。微小気泡カウントのこの喪失は、超音波が適用されなかった場合の上部気泡含有層へ接着したPS-ODN濃度にかかわりないことが明らかであった。しかし、診断超音波の存在下、下部気泡非含有層においてゲル電気泳動によって測定されたPS-ODN濃度は、著しく増加した。
1匹のイヌでは、1500ユニットのボーラス用量での静脈内ヘパリンを、3つの異なるセッティングで投与した。活性化部分トロンボプラスチン時間(PTT)のベースライン測定を測定し、次いで最小15分の各注射の後の5分間隔で測定した。セッティング1では、ヘパリンを遊離の薬物として投与した。セッティング2では、1500ユニットのヘパリンを、オロソムコイドPESDAに結合して投与したが、血液プールに超音波を適用しなかった。セッティング3では、ヘパリンの同容量(1500ユニット)を、オロソムコイドPESDAに結合して投与したが、血液プールに超音波を適用した。セッティング1では、PTTは5分で>106秒まで増加したが、15分で30と60秒との間に戻った。セッティング2では、PTTは10分まで>106秒に達しなかったが、15分で60と80秒との間に戻った。セッティング3では、PTTは15分でも>106秒のままであった。さらなる測定を行わなかった。
Claims (1)
- 本願明細書等に記載されるような、標的された部位特異的薬物送達組成物およびその使用。
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