KR100649035B1

KR100649035B1 - 표적화된 부위특이적 약물 송달 조성물 및 사용방법

Info

Publication number: KR100649035B1
Application number: KR1020017000589A
Authority: KR
Inventors: 포터토마스알.; 이베르센파트릭엘.; 메이어게리디.
Original assignee: 더 보드 오브 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 네브라스카
Priority date: 1998-07-13
Filing date: 1999-07-13
Publication date: 2006-11-24
Also published as: KR20010071902A; JP2010095541A

Abstract

본 발명은 약학적 조성물과 치료 약물의 송달 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물과 방법은, 필요한 치료학적 수준으로 표적화된 부위에 도달하는 문제를 갖는 특히 올리고뉴클레오티드와 같은 약물에 대하여 더 낮은 용량과 개선된 효능을 갖도록 하는, 치료제 물질의 부위 특이적 송달을 달성할 수 있다. 초음파의 표적화된 도입은 치료 약물의 방출을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 이 송달체계는 질소가 고갈되거나 질소가 없는 환경에서 형성된 단백질 캡슐화 기체 충전 미세기포를 포함한다. 이들 미세기포는 실내공기의 존재하에서 초음파처리된 미세기포보다 더 작고 더 안정하다.

올리고뉴크레오티드, 부위 특이적 송달, 미세기포, 초음파처리

Description

표적화된 부위특이적 약물 송달 조성물 및 사용방법{TARGETED SITE SPECIFIC DRUG DELIVERY COMPOSITIONS AND METHOD OF USE}

본 발명은 약제조성물과 생체활성물질의 송달 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법과 조성물은 생물학적으로 활성인 물질의 부위특이적 송달을 실현하기 위해 사용될 수 있다. 이 특이성은 더 낮은 약물용량과, 특히 표적으로 하는 기관에서 치료학적 농도를 달성하는 데에 있어서 전형적으로 괴롭히는 문제인 올리고뉴클레오티드와 같은 약물에 대한 개선된 약효를 허용한다.

약물송달 기술은 약물 효용도를 증가시키고, 약물용량을 감소시키고, 결과적으로 약물로 야기된 부작용을 줄이기 위한 약물 요법에서 이용된다. 이들 기술은 체내에서 약물의 방출을 조절하고 통제하고 표적으로 가게 하는 역할을 한다. 약물송달의 발전하는 목표는 덜 빈번한 약물 투여, 전신 혈액순환이나 특정한 표적 기관부위에서 약물의 일정하고 계속적인 치료 수준의 유지, 원하지 않는 부작용의 감소, 그리고 원하는 치료효과를 달성하기 위해 요구되는 양과 약물농도의 감소를 포함해 왔다. 마침내 표적기관에 원하는 약물의 송달을 비침입적으로 표적으로 가게 하는 방법이 요망된다.

오늘날까지, 약물송달시스템은 단백질, 다당류, 합성 폴리머, 적혈구, DNA 및 리포좀에 기초한 약물담체를 포함한다. 모노클론 항체, 유전자 요법 벡터, 탁솔과 같은 항암제, 바이러스에 기초한 약물, 그리고 올리고뉴클레오티드(ODN)와 폴리뉴클레오티드와 같은 신세대 생물학적 약제는 송달에 관해 몇 가지 문제를 나타내었다. 사실, 약물송달은 이들 약물의 주류가 되는 치료용도를 실현하는데에 근원적인 장애가 될 수 있는데, 그들의 초기의 가능성은 제한이 없는 것 같았으나 그들의 치료학적 변수는 충분한 효과의 달성을 방해했다.

핵산분해효소 내성을 주기 위해 화학적으로 변형된 합성 올리고데옥시리보뉴클레오티드(ODN)의 사용은 약물요법에 대한 근본적으로 다른 접근을 나타낸다. 지금까지 가장 일반적인 용도는 특이적 표적화된 mRNA서열에 상보적인 서열을 갖는 안티센스 ODN을 사용한다. 치료법에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 접근은 ODN이 변역의 과정에서 기계적인 간섭이나 조기 프로세싱 사건을 유발하는 간단하고 특이적인 약물디자인개념을 포함한다. 이 접근의 이점은 상대적으로 낮은 용량과 표적으로 하지 않는 부작용의 최소화에 반영되어야 하는 유전자 특이적 작용에 대한 가능성이다. 그러나 생물학적 연구에서 현재 가장 일반적으로 사용되는 유사체인 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 단백질에 대한 비특이적인 결합을 빈번히 나타낸다. 일반적으로, 안티센스 접근(낮은 용량과 최소화한 부작용)의 근원적인 잠재된 잇점은 기대에 못미쳤다.

올리고뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드의 약물송달은 두 가지 핵심 도전, 즉 세포로의 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션과 체내에서의 올리고뉴클레오티드의 분포의 변경에 초점을 두어 왔다. 트랜스펙션에 관해, 체외에서의 세포 섭취를 개 선하기 위한 생물학적인 접근은 리포좀과 같은 비히클과 재구성된 바이러스와 가성비리온과 같은 바이러스 벡터의 사용을 포함하였다. 생체분배를 개선하기 위한 방법은 대부분의 세포의 음으로 하전된 표면에 양으로 하전된 지질 인력때문에 약물의 세포 흡수를 증가시키도록 요구되는 양이온성 지질과 같은 약물에 초점을 두어 왔다.

양이온성 리포좀은 카테테르에 의해 투여될 때 체내에서 혈관세포내로 유전자가 이동하는 것을 고양시킨다고 보고되어 왔다(Muller, D. W. et al., Circ. Res. 75(6):1039-49, 1994). 또한 양이온성 지질 DNA복합체는 기관내 투여후에 마우스 폐내로 효과적인 유전자 이동을 가져오는 것으로 보고되었다. 아시알로글리코프로테인 폴리(L)-리신 복합체는 센다이 바이러스 코트 단백질 함유 리포좀과 복합체형성하는 것처럼 한정된 결과와 마주쳐 왔다. 독성과 생체분배는 중요한 이슈를 남겨 왔다.

앞서 말한 것에서, 생물학적 약제, 특히 폴리- 및 올리고뉴클레오티드의 송달을 위한 보다 효과적인 표적화된 약물송달시스템이 이들 약물로 하여금 충분한 잠재력을 실현하기 위해 필요함을 알 수 있다.
여러 가지 참고 문헌은 조영제로써 가스 충전된 미세기포의 사용을 기술한다. 미국 특허 No. 5,567,415, Porter는 퍼플루오르카본 기체를 소개하는 동안 dextrose-albumin 현탁액에 초음파 처리에 의해 제조된 미세기포를 기술한다. Porter et al.(J. Am. Coll. Cardiol. 25(2):509,1995)는 (a) 따르는 공기안에서 초음파 처리 함으로써 (b) 주사기안에 선택된 기체를 가지고 계속적으로 혼합하므로써 공기, 질소, 헬륨 또는 SF6에 노출된 가스 포함 미세기포를 가르킨다. 다른 참고 문헌은 치료상의 송달을 위한 미세기포를 기술한다. Unger(WO 96/39197)는 불소화된 양쪽 친매성 화합물 안에서 캡슐화된 미세기포를 경유로 약물 송달을 가르킨다. 캡슐화된 가스는 아마도 플루오르카본, 질소, 산소 또는 공기를 포함한다. 전형적인 준비에는, 미세기포는 플로오르카본과(또는) 질소를 가지고 불소화된 양쪽 친매성 화합물의 수성 현탁액 위의 헤드 스페이스 안에서 흘려 보내고 용기를 흔듦으로써 형성된다. Porter et al.(Circulation 96(8):L401, 1997)은 올리고뉴클레오티드의 전달을 위하여 실내공기 또는 플루오르카본중 하나를 포함한 미세기포를 밝혀냈다. Porter and Iversen(WO 98/00172)은 질소, 헬륨, SF6와 같은 다른 기체를 포함한 단백질 캡슐화된 미세기포를 비교했다. 미세기포는 실내공기안에서 초음파 처리, 혈액한 락커 위에 각각의 기체와 함께 혼합함으로써 제조된다. Marsden(WO 97/18498)는 진당상의 영상 그리고/또는 치료상에서의 사용을 위한 목적된 초음파 조영제를 기술한다. 참고 문헌은 약물이 아마도 많은 기체: 기체는 실제로 35 작업 실시예안에서 이용된 실제 기체는 퍼플루오르카본, SF6 또는 공기를 포함한다. Porter et al.(WO 97/33474)는 초음파와 함께 하는 구성안에서 미세기포에 접합에 의한 약물 송달을 가르킨다. PESDA(perfluorocarbon exposed sonicated dextrose/albumin) 미세기포는 공기안에서 초음파 처리에 의해 퍼플루오르카본과 함께 수동 혼합에 의해 제조된다.

발명의 개요

하나의 관점에서, 본 발명은 특정한 조직부위에 생물학적 약물을 송달하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 실내공기 초음파 처리에 의하여 얻어지는 것보다 미세기포내에서의 N₂의 더 낮은 부분압과 증가된 산소 함유량을 생성하는 조건하에서, 생물학적 약물이 단백질에 결합되는 다수의 단백질 캡슐화된 불용성기체 함유 미세기포의 수성현탁액을 형성하는 단계, 그리고 (b) 단백질이 미세기포와 결합된 약물을 단백질의 바이오프로세싱의 부위로 향하게 하고, 미세기포의 분해시, 생물학적 약물을 방출하도록 동물에 현탁액을 투여하는 단계로 구성된다. 바람직하게는, 미세기포는 N₂가 고갈되고, 더 바람직하게는 산소와 같은 N₂가 없는 환경에서 형성된다.

바람직한 구체예에서, 미세기포를 캡슐화하는 단백질은 알부민, 인간 감마 글로불린, 인간 아포트랜스페린, β-락토오스 및 우레아제로 구성되는 그룹으로부터 선택되어지는데, 알부민이 특히 바람직하다. 불용성 기체는 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 또는 퍼플루오로펜탄과 같은 퍼플루오로카본이 바람직하며, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄이 특히 바람직하다. 예를 들면 조직 부위는 동물의 간 또는 신장이 될 수 있다.

단백질에 결합되는 바람직한 생물학적 약물은 나프록센, 피록시캄, 와르파린, 퓨로세미드, 페닐부타존, 발프로산, 술피속사졸, 셉트리악손 및 미코나졸 뿐만이 아니라 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 리보자임을 포함한다. 선택된 구체예에서 생물학적 약물은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항원 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 프로브, 벡터, 바이러스 벡터 또는 플라스미드와 같은 폴리뉴클레오티드이다. 폴리뉴클레오티드의 바람직한 종류는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명은 또한 특정한 조직 부위에 생물학적 약물을 송달하기 위한 관련된 방법을 제공하는데, (a) 생물학적 약물이 단백질에 결합되는 단백질 캡슐화 불용성 기체 함유 미세기포의 수성 현탁액을 형성하는 단계, (b) 동물에 현탁액을 투여하는 단계, (c) 조직 부위를 초음파에 노출시키는 단계로 이루어진다. 바람직하게는, 실내공기 초음파 처리에 의해 얻어진 것보다 미세기포내의 낮은 질소 부분압과 증가된 산소 함유량이 생성되는 조건 아래에서 형성된다. 미세기포는 따라서 바람직하게는 질소고갈, 더욱 바람직하게는 산소와 같은 질소가 없는 환경에서 형성된다.

이러한 방법중 어느 방법이든 실행하는데 있어서, 미세기포 현탁액은 다음의 (a) 인간 혈청 알부민 약 2 내지 약 10wt%, 바람직하게는 약 5wt%로 이루어진 알부민 수용액을 덱스트로스 약 5 내지 약 50wt%, 바람직하게는 약 5wt-%로 이루어지는 덱스트로스 수용액으로 약 2배 내지 약 8배, 바람직하게는 약 3배 희석하는 단계, (b) 불용성 기체로 용액을 교반하는 단계, 그리고 (c) 용액안의 입자 부위에 공동화를 생성시키기 위하여 바람직하게는 질소 고갈 환경에서 초음파 혼에 용액을 노출시켜 지름이 약 0.1 내지 10미크론인 안정한 미세기포를 발생시키는 단계를 수행함으로써 형성되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, (b) 단계의 질소 고갈환경은 초음파 혼과 용액 사이의 계면으로 불어 넣어지는 산소와 같은 질소가 없는 환경이다.

다른 면에서, 본 발명은 초음파 영상화에 유용한 미세기포 조성물을 제공하는데, 다수의 단백질-캡슐화 불용성 기체 함유하는 미세기포의 수성 현탁액을 포함하며, 미세기포내의 질소의 부분압은 실내공기 초음파 처리된 미세기포내의 질소 부분압보다 낮다. 관련된 면에서 본 발명은 단백질에 결합된 생물학적 약물을 가진 이러한 미세기포의 수성 현탁액을 포함하는 생물학적 약제의 표적 부위 송달에 유용한 조성물을 제공한다. 미세기포의 바람직한 크기는 약 0.1∼10미크론이다.

이들 조성물에서, 단백질은 바람직하게는 알부민, 사람 감마 글루불린, 사람 아포트랜스페린, β-락토오스 및 우레아제로부터 선택하며, 특히 알부민이 바람직하다. 불용성 기체는 바람직하게는 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로펜탄과 같은 퍼플루오로카본이 바람직하며, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄이 특히 바람직하다. 단백질로 캡슐화한 미세기포를 캡슐화하는 단백질에 결합에 적합한 생물학적 약물은 나프록센, 피록시캄, 와르파린, 퓨로세미드, 페니루타존, 발프로산, 술피속사졸, 셉트리악손 및 미코나졸 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 리보자임을 포함한다. 올리고뉴클레오티드가 특히 바람직하다.

본 발명은 또한 특히 혈관 외상을 앓는 동물에서 경동맥 협착증을 방지하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 알부민 캡슐화된 불용성 기체함유 미세기포를 형성하는 단계, 여기서 미세기포에 충전되어 있는 기체는 질소 고갈되거나, 더 바람직하게는 질소가 없는 상태이고, 알부민은 평활근의 증식을 조정하는 조절효소를 암호화하는 유전자의 발현을 저해하는 핵산 생물학적 약물이 결합되어 있고, (b) 동물에 현탁액을 투여하는 단계로 이루어진다. 바람직한 방법은 (c) 생물학적 약물의 방출을 촉진시키기 위하여 외상 부위를 초음파에 노출시키는 단계를 포함한다. 저해 유전자는 바람직하게는 c-myc 또는 c-myb이다.

위에서 언급한 바와 같이, 이들 조성물 및 방법은 생물학적 약물의 효과적인 투여량을 상당히 감소시켜, 치료 지수를 증가시키고 생체 효용성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 투여량의 감소는 차례로 약의 세포독성 및 부작용을 감소시킬 수 있다. 더욱 더, 본 발명은 헤파린, 딜티아젬, 리도카인, 프로판올롤, 시클로스포린 및 혈액 푸울 활성화를 요구하는 화학요법 약물과 같은 다른 혈장-결합된 약물의 효과를 향상시킬 수 있다. 예를 들면, 헤파린의 항응고제 성질은 오로소뮤코이드-라벨된 퍼플루오로카본 노출된 초음파 처리된 덱스트로오스/알부민과 의약을 먼저 조합한 다음, 조합물을 정맥내에 투여함으로써 극적으로 높아질 수 있다.

결합물은 수성 현탁액으로서 비경구 투여로 디자인된다. 투여 후 및 관심 부위에 주입된 환약(bolus)의 도착과 일치하는 시간에 맞추어, 아마도 에너지는 미세기포가 공동화를 일으키는 음파의 형태로 투여되며, 약물은 그리고 나서 방출되고, 기관 또는 다른 부위 또는 관심 부위에 송달된다. 알부민 또는 다른 단백질로 캡슐화된 미세기포와 생물학적 약제의 결합은 전통적으로 단백질과 상호 작용하는 것들을 포함하는 특정 조직에 생물학적 약제의 표적화된 송달을 허용할 수 있다.

개선된, 기체로 채워진 미세기포는 질소 고갈 또는 질소가 없는 환경에서 미세기포를 형성시킴으로써 달성된다. 그러한 환경은 더 작지만, 정맥 및 동맥 혈액 안에서 더 안정하다. 더욱 작은 미세기포는 심장 근육층에서 더 큰 진단학적 초음파 조영을 내며, 치료학적 구체예에서 이들 영역에 약물을 더 큰 효율로 운반할 수 있다.

본 발명은 진단학적 초음파 영상화에 전통적으로 사용된 약물 및 방법을 사 용하고, 그 자체가 치료약의 송달을 위한 표적 부위에 치료약의 시각화의 수단을 제공한다.

발명의 이들 목적 및 특징은 다음의 발명의 상세한 설명을 첨부된 도면과 함께 읽었을 때 더욱 더 분명하게 된다.

도 1은 PS-ODN과의 PESDA(퍼플루오로카본 노출된 초음파처리된 덱스트로스/알부민)에 대한 결합데이터의 Lineweaver-Burke 플롯이다. 미세기포에의 결합을 위한 평형 해리 상수 K_m(2벌로 실행한 7가지 농도에 대해 계산된 것; 실시예 5 참조)은 1.76×10^-5M이다. 이 값은 거의 용액중의 인간 혈청 알부민에의 서열 5'd(AAC GTT GAG GGG CAT)-3'; SEQ ID NO:1)을 가진 15량체 PS-ODN을 결합하는 것에 대해 보고된 3.7∼4.8×10^-5M 범위이내이다(Srinivasan, S. K. et al., "결합부위의 특성화, 결합의 크기, 및 알부민과 올리고뉴클레오티드의 약물상호작용", Antisense Res. Devel. 5:131, 1995).

Ⅰ. 초음파의 치료학적 용도

초음파 영상은 치료학적 과정에 도움을 주는 진단도구로 오랫동안 사용되었다. 이것은 음파에너지를 관심 부위에 집중시킬 수 있고, 반사되어 영상을 낼 수 있다는 원리를 기초로 한다. 일반적으로, 초음파 변환기를 영상화할 영역 위에 있는 신체 표면에 놓고, 음파를 발생시키고 받음으로써 나오는 초음파 에너지가 투과 된다. 초음파 에너지는 변환기에 되반사되고, 거기서 초음파 영상으로 번역된다. 반사된 에너지의 양 및 특성은 조직의 음향학적 성질에 의존한다. 아마도 관심있는 부위에서 초음파 에너지를 생성시키고, 받은 영상화를 개선시키는데 반사성(echogenic)인 조영제가 바람직하게 사용된다. 조영 반사성의 기기에 대한 논의는 Dejong의 "초음파 조영제의 음향학적 성질", Cip-Gegevens Koninklijke Bioliotheek, Denhag(1993), PP. 120 이하 참조.

조영 초음파 심장 검사법은 심장내의 구조를 묘사하고, 판막의 능력을 평가하고, 심장내의 단락을 증명하는데 사용되어왔다. 심근 조영 초음파 심장 검사법(MCE)은 인간의 관상 혈류의 역류를 측정하는데 사용되어져 왔다. MCE는 심근의 관류의 상대적인 변화를 평가하고 위험 영역을 묘사하는데 안전하고 유용한 기술임이 발견되었다.

초음파 진동은 또한 다양한 약품의 흡수를 증가시키기 위해 의학분야에서 치료학적 수준에서 사용되어졌다. 예를 들면, 일본 공개번호 52-115591은 의약품의 경피 흡수가 초음파 진동에 의해 증진된다는 것을 개시한다. 미국 특허 No. 4,953,565와 5,007,438은 초음파 진동의 도움으로 의약품의 경피 흡수 기술을 또한 개시한다. 미국 특허 No. 5,315,998은 의약품의 분산 또는 침투를 허용하도록 초음파 에너지와 조합하여 미세기포로 이루어지는 약물 요법을 위한 부스터를 개시한다. 이 참고 문헌은 결합된 생체 활성 약물의 방출을 촉진시키기 위하여 훨씬 더 짧은 시간기간동안의 노출로 초음파의 진단 수준을 사용하는 본 발명의 어떤 구체예와는 반대로 20분 동안까지의 초음파의 치료학적 수준의 사용을 개시한다.

본 발명에 따르면, 전통적인 진단 초음파 요법 조영제를 사용하여 결합한 다음 구체적으로 지정된 관심 부위에서 치료제를 방출하여 이로써 약물 분포를 변경시킬 수 있다. 이 목적은 어떤 진단학적 초음파의 사용없이 조영제 단독으로 달성될 수 있다. 여기서 이러한 조영제는 관심있는 부위에서 치료 약물의 방출을 촉진시키기 위하여 전통적인 진단 초음파 요법(예를 들면, 0.1 내지 3.5MPa 범위의 최고 음압과 1.0 내지 40MHz 범위의 투과 주파수를 포함한다)과 함께 사용된다. 이 방법의 바람직한 구체예에서, 1MHz 미만, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 KHz의 낮은 주파수의 초음파를 사용한다.

Ⅱ. 치료학적 조성물

발명의 약제 조성물은 바람직하게는 지름이 0.1 내지 10미크론이고, 혈액-불용성 기체를 포함하는 미세기포의 액상 현탁액, 바람직하게는 수성 현탁액으로 이루어진다. 미세기포는 액체 안으로 그러한 기체의 미세기포를 포획함으로써 형성된다. 미세기포는 플루오로카본 또는 육플루오르화황 기체와 같은 다양한 혈액 불용성 기체를 포함한다. 일반적으로, 비독성이고, 체온에서 기체상인 어떤 불용성 기체도 사용될 수 있다. 기체는 약제 조성물을 미세기포를 형성하기 위하여 초음파 처리할 때, 지름이 0.1 내지 10㎛ 사이의 평균 크기를 갖는, 안정한 미세기포를 형성해야만 한다. 이 범위의 평균 지름을 가진 미세기포는 폐경유 통과에 적합하고, 정맥내의 주입후 및 표적 부위로 전이의 동안에 미세기포내의 기체의 상당한 확산을 방지하기에 충분히 안정하다.

불용성 기체는 또한 혈관의 내부 분위기에 확산되는 질소 또는 산소보다 낮 은 확산 계수 및 혈중 용해도를 가져야 한다. 유용한 기체의 예는 플루오로카본 기체 또는 육플루오르화황 기체이다. 일반적으로 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 및 퍼플루오로펜탄과 같은 퍼플루오로카본 기체가 바람직하다. 이러한 기체 중에서 퍼플루오로프로판 및 퍼플루오로부탄은 인간의 안내(眼內) 주입시에 안전성이 증명되었기 때문에 특별히 바람직하다(예를 들면 Wong and Thomson, Ophthalmology 95:609~613 참조).

기체상 미세기포는 필모겐 단백질 코팅에 의해 안정화된다. 적당한 단백질은 알부민, 인간 감마글로불린, 인간 아포트란스페린, β-락토오스와 우레아제와 같은 자연발생 단백질을 포함한다. 본 발명은 바람직하게는 자연발생 단백질을 사용하는 것이 바람직하나, 합성 단백질도 또한 사용된다. 특히 바람직한 것은 인간 혈청 알부민이다. 이 단백질은 신체내에서 쉽게 대사되고, 조영제로서 광범위하게 사용된다.

앞서 기술한 단백질과 조합하여 약학적으로 승인된 당류, 예를 들면 덱스트로스의 혼합물을 함유하는 수용액을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용에 적합한 다른 당류의 예는 단당류(헥소스당, 덱스트로스, 프룩토스 또는 그것의 혼합물과 같은 분자식 C₆H₁₂O₆을 가진 것), 이당류(수크로스, 락토스, 말토스 또는 그것의 혼합물과 같은 분자식 C₁₂H₂₂O₁₁을 갖는 것) 또는 다당류(아밀라제 또는 덱스트란 또는 그것의 혼합물과 같은 분자식 (C₆H₁₀O₅)n을 갖는 수용성 녹말; 여기서 n은 20 내지 200의 정수)이다. 그러나, 당류는 발명의 결과를 성취하는데는 필수적인 것은 아니다.

본 발명의 치료 약물은 선택적으로 초음파요법과 관련하여 숙주에 말초 투여를 위한 약학적으로 효과적인 투여량 형태로 조제된다. 개 또는 말과 같은 다른 포유류 숙주도 이 요법에 대상이 될 수 있을지라도, 일반적으로 그러한 숙주는 인간 숙주이다.

Ⅲ. 미세기포 조성물의 제조

바람직한 구체예에서 본 발명의 조성물은 상업적으로 구입되는 알부민(인간) U.S.P.용액(일반적으로 5wt-% 또는 25wt-% 멸균수용액으로 공급됨)과 상업적으로 구입되는 덱스트로스(정맥내 투여를 위한 U.S.P.)의 혼합물로부터 조제된다. 가장 바람직한 구체예에서, 혼합물은 2 내지 10wt-%의 인간 혈청 알부민 용액을 5 내지 50wt-%의 덱스트로스 용액으로 이 2 내지 8배 희석된 것으로 이루어진다.

미세기포는 실온 및 주위압력으로 전형적으로 초음파 혼으로 초음파 처리에 의해 형성된다. 그러한 초음파 처리는 유체 안에서 기체 또는 입상 물질의 부위에서 덱스트로스/알부민 용액 안에 공동화를 일으킨다. 이러한 공동화 부위는 궁극적으로 반향하고, 붕괴되지 않고 안정한 작은 미세 기포들을 생성한다. 초음파 처리동안, 용액을 불용성기체, 바람직하게는 퍼플루오로카본 기체로 약 80초 동안 관류시킨다. 일반적으로 지름이 약 0.1 내지 10㎛, 바람직하게는 지름이 5 내지 6 ㎛인 미세기포가 4×10⁸M 보다 큰 농도를 만드는 초음파 처리 조건이 바람직하다. 결과적인 미세기포는 적어도 약 120±5분동안 실온에서 농축시키고, 이때 과잉의 용액은 초음파 처리 주입기 안에 남는다.

실시예 2에서 기술된 바와 같이, 변경된 제조방법에서는 초음파 처리된 덱스트로스/알부민 15±2mL를 초음파 처리 전에 퍼플루오르카본 기체 8±2mL와 함께 손으로 교반한다. 그리고 나서 초음파 처리는 80±5초동안 진행한다.

많은 혈장-결합된 약물을 위한 미세기포의 친화성을 개선하도록 디자인된 3번째 제조방법은 초음파 처리전에 알부민/덱스트로스 용액에 오르소뮤코이드(α-산 당단백질)을 5∼30mg의 첨가를 포함한다.

본 발명에 따르면, 미세기포는 전형적으로 초음파 혼과 용액 사이의 경계면으로 질소 고갈(실내공기에 비해서) 또는 질소가 없는 기체를 도입함으로써, 질소 고갈, 바람직하게는 질소가 없는 환경에서 형성되는 것이 바람직하다. 더욱 더 아래에서 논의하는 바와 같이, 이러한 방식으로 형성된 미세기포는 실내공기에서 형성된 것들 보다 상당히 작다. 이들의 더 작은 미세기포가 더 안정되고, 치료제 및 진단제의 개선된 송달을 가져온다.

그 다음, 미세기포를 생물학적 활성 약물과 함께 배양하여, 의약을 단백질 코팅된 미세기포와 함께 결합(전형적으로 비공유 결합)된다. 알부민 코팅된 미세기포에 올리고뉴클레오티드의 결합 연구는 실시예 4-7에 기술되어 있다. 이러한 연구는 예를 들면 결합이 포화가능하였고, 따라서 비특이적 상호작용이 제한됨을 나타내었다(실시예 6). 실시예 7에서는 조영제에 종래에 사용된 것과 같은 미세기포 형태의 필모겐 단백질이 미세기포가 불용성 기체로 채워질 때 화합물에 결합하는 능력을 계속 유지함이 증명되었다. 이러한 발견은 그러한 미세기포 조영제에서 단백 질 구가 변성 단백질로 구성되어 있다는 초기 보고서와는 반대이다. 예를 들면 미국 특허 No. 4,572,203 및 4,718,433 및 4,774,958 참조. 여기서 증명된 바와 같이 공기보다는 불용성 기체, 예를 들면 퍼플루오로카본이 미세기포에 사용될때, 단백질은 그것의 결합 능력을 보유한다. 이 효과는 초음파 처리 에너지의 많은 부분이 불용성 기체에 의해 흡수되었다는 사실에 기인하는 것같다. 그래서 알부민과 같은 단백질은 미세기포/약물 결합체를 형성하기 위하여 생물학적 활성 의약품에 결합할 수 있다. 반면에 공기 충전 미세기포는 그들의 결합 능력을 거의 보유하지 못한다.

Ⅳ. 치료 약물(Therapentic Agents)

본 발명에서 유용한 치료 약물은 필모겐 단백질과 결합하는 능력에 의하여 선택되고, 그 역도 성립한다. 예를 들면, 만약 필모겐 단백질이 알부민이라면, 치료제는 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 또는 리보자임을 포함할 수 있는데, 이들은 모두 알부민과 결합할 수 있고 그 자체가 미세기포와 결합을 형성할 수 있다. 본 발명 조성물 및 방법에서 원래대로 남아 있는 것으로 확인되는 부위 1에서 알부민과 결합하는 약물의 목록은 아래와 같다.

약물 알부민 결합 % 악물 종류

나프록센 99.7 NSAID^a

피록시캄 99.3 NSAID^a

와르파린 99.0 응고방지제(Anticoagulant)

퓨로세미드 98.8 루프 이뇨제(Loop diuretic)

페닐부타존 96.1 NSAID^a

발프로산 93.0 항전간제(Antiepyreptic)

술피속사졸 91.4 설폰아미드 항생제

셉트리악손 90∼95^b 제 3 세대 세파로스포린 항생제

미코나졸 90.7∼93.1^b 항균제(Antifungal)

페니토인 89.0 항전간제

^a 비스테로이드성의 항염증 약물

^b 환자 대 환자 변동을 나타낸다.

만약 오로소뮤코이드가 알부민/덱스트로스에 첨가되어지면, 또한 잠재적으로 사용될 수 있는 약물의 종류는 에리트로마이신(항생제), 리도카인(항부정맥제), 메페리딘(진통제), 메타돈(진통제), 베라파밀 그리고 딜티아젬(항협심증제), 시클로스포린(면역억제제), 프로판올롤(항고혈압 및 항협심증제) 및 퀴니딘(항부정맥제)를 포함한다.

특히 부위 1에서 알부민과 함께 결합하는 다른 약물도 또한 이 구체예에서 유용할 것이며, Berney Olin에 의해 발간되고 매분기마다 개정되는 "Drug Imformation" AHFS 1999(American Society of Health System) 또는 "Drug Fact and Comparisons" 같은 본 분야 약리학 표준서와 약물 상호작용을 통해 당업자에 의해 확인될 수 있다. 적절한 단백질-생물학적 약물 조합의 결정을 위한 분석(assay)이 거기에 개시되어 있고, 어떤 조합을 본 발명의 방법과 함께 사용되는 능력을 시험하는데 사용할 수 있다.

아래에서 증명되는 바와 같이, 효과적인 안티센스, 안티유전자, 프로브 진단학 또는 바이러스 또는 플라스미드 뉴클레오티드 송달을 사용하는 유전자 요법까지도 주장애가 치료효과를 달성하기 위해서는 매우 높고 충분한 농도로 표적 부위에 치료제가 도달하는 능력이었기 때문에, 본 발명은 올리고뉴클레오티드와 폴리뉴클레오티드 요법을 위한 특히 관련이 있다. 본 발명은 유전자 요법 벡터, 진단용 뉴클레오티드 프로브 형태 또는 표적 세포에서 유전자발현을 궁극적으로 변경 또는 검출하는 안티센스 또는 안티 유전자 형태의 전략에서 뉴클레오티드 서열의 송달에 특히 유용하다.

본 발명에서 사용된 올리고뉴클레오티드는 이 부위에서 핵산 염기, 당 부분, 인터뉴클레오시드 포스페이트 결합의 하나 또는 그 이상의 수정 또는 수정의 조합을 포함한다. 인터뉴클레오시드 포스페이트 결합은 예를 들면 포스포로티오에이트, 포르포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 포스프로디티오에이트 또는 그러한 유사 결합들의 조합(혼합된 골격 변형된 올리고뉴클레로티드를 생성함)일 것이다. 다른 올리고 뉴클레오티드 유사체는 모르폴리노 올리고뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 2-O-알킬 변형 올리고뉴클레오티드와 N3'→P5' 포스포르아미데이트를 포함한다. 바람직한 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드이다.

올리고뉴클레오티드 합성에 대해 알려진 어떤 방법도 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 사용될 수 있다. 그것들은 제조자의 프로토콜을 따라 포스포르아미데이 트 화학을 사용하여 Applied Biosystem, Inc. 상업적으로 구입되는, DNA 합성기(모델 380B)와 같은 자동화된 핵산 합성기를 사용하여 가장 편리하게 제조된다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 Stek and Zon(J. Chromatography, 326:263-280)과 Applied Biosystems DNA Synthesizer User Bulletin, Models 380A-380B-381A-391-EP, December 1989에서 기술된 방법에 의하여 합성되고 정제될 수 있다. ODN은 당업자들에게 공지되어 있다. 예를 들면, Iversen, 1991, "in vivo Studies with Phosphorothioate Oligonucleotides:Pharmacokinetics Prologue", Anticancer Drug Des. 6:531-8 참조.

Ⅴ. 송달 방법

발명의 송달 요법을 실행하는 바람직한 방법에서, 본 발명의 약학적 액체 약물은 바람직하게는, 약물의 활성의 표적 부위 가까이에 정맥내 주사, 정맥내 주입, 경피, 또는 근육내에 의해 포유류의 숙주안에 도입된다. 치료 부위는 특정 종양의 위치, 특정 감염의 위치, 차등 유전자 활성화에 기인하여 특정한 유전자 산물을 발현하는 기관, 상처 또는 혈전부위, 치료제의 더 이상의 프로세싱 및 분배를 위한 부위 등과 같은 부위들을 포함한다.

A. 초음파 없이

발명의 하나의 구체예에 따르면, 불용성(예를 들면, 퍼플루오로카본)의 단백질(예를 들면, 알부민) 코팅된 미세기포는 올리고뉴클레오티드와 안정한 결합체를 형성하는 것으로 나타났다(실시예 4-6 참조). ODN 결합된 기포를 동물에 도입하여, 그것으로 인하여 단백질 코팅이 상호작용 부위로 결합된 약물을 이끌 수 있다. 궁극적으로, 기포가 분산함에 따라, 약물은 조직 부위에서 방출된다. 본 발명자들은 초음파의 이용이 생물학적 물질의 단백질 코팅의 바이오프로세싱 부위로의 표적화된 송달에는 불필요하다는 것을 보여준다. 이것은 실시예 9에 나타나 있는데, 이 경우 ODN 결합 미세기포는 간 및 신장으로 향했고 헥소바르비탈의 대사를 변경시키는데 효과적이었다. 단백질은 미세기포 및 결합체를 프로세싱의 부위로 가게 하고, 기포가 분산함에 따라 올리고뉴클레오티드 또는 다른 생물학적 물질이 부위에서 방출되어 상호작용하고 생물학적 약물의 부분으로 하여금 종래의 투여와 비교하여 같은 생물학적 효과를 달성하게 한다.

일반적으로 표적 부위는 필모겐 단백질의 바이오프로세싱에 기초하여 선택된다. 예를 들면, 신장 및 간은 알부민을 흡수하고, 알부민 미세기포가 특이적으로 결합된 생물학적 활성 약물의 투여를 특이적으로 이들 영역으로 향하게 한다. 이러한 생체분배는 위에 언급하였듯이 실시예 9에서 증명되었다. 다른 필모겐 단백질의 대사와 바이오프로세싱은 "Basic and Clinical Pharmacology", 7th ed., Bertram G. Katzung, ed., Appleton & Lange, 1997과 같은 표준 약리학서에 기술되어 있다.

B. 초음파와 함께

본 발명의 하나의 구체예에서는, 주입된 환약이 표적 부위에 도달할 때 진단용 초음파장이 도입된다. 실시예 8에서 증명된 것처럼, 진단 초음파에 PS-ODN 표지된 퍼플루오로카본함유 미세기포의 노출은 PS-ODN의 통합성을 변경시키지 않았고, 그것의 알부민 결합으로부터 ODN을 방출하였다.

초음파의 이용은 다양한 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들면, 초음파 변 환기를 표적 부위에 직접 위치시킬 수 있다. 종래의 초음파 기기는 20kHz에서 수 MHz의 초음파 신호를 공급할 수 있다. 이 신호는 일반적으로 진단 초음파를 위하여 약 3 내지 약 5MHz가 가해지고, 치료용 초음파를 위해서는 1MHz보다 낮은 수준이며 바람직하게는 20kHz이다. 초음파에 의해 제공된 에너지는 미세기포가 치료 부위 또는 혈액 푸울로 약물을 방출하게 할 것이다. 이 방법은 또한 환약이 초음파 장에 들어왔을 때 가시화된다.

또 다르게는, 초음파 변환기는 미세기포가 혈행을 통과함에 따라 미세기포의 일정한 노출을 허용하는 혈액 푸울의 부위에 위치될 수 있다. 이 과정은 실시예 13에서 본 것과 같이 헤파린과 같은 어떠한 약물의 전신적인 효과를 증진시킨다.

초음파 증진이 사용되는 장소 부위의 예는 신장, 심방, 대동맥, 대정맥을 포함한다. 실시예 12는 미세기포가 접합된 표지된 ODN 결합된 미세기포의 송달과 조합된 신장의 표적화된 음파처리를 기술한다. 단일 신장에 제한된 음파처리는 이 부위에서 검출된 ODN의 상당한 증가를 가져왔다. 작용된 지역의 음파처리에 의한 동반된 c-myc에 안티센스의 투여에 의한 동맥 재협착의 억제에 표적화된 음파처리의 사용을 아래의 섹션 Ⅵ에서 더욱 더 자세히 설명한다.

다른 구체예에서, 주입물을 감시하고, 표적 영역에 도달할 때까지 시간을 맞춘다. 조영제는 투여로부터 치료 부위로 가는 시간에 맞춰 단독으로 사용될 수 있다. 치료제의 투여후에, 적당한 도플러 또는 초음파 반향 장치를 사용하여, 낮은 주파수(20kHz 내지 약 2MHz)의 초음파를 적절한 시간 간격후에 표적 부위에 도입하여, 초음파장이 표적 부위를 둘러싸고, 약품이 미세기포로부터 방출된다. 시간 기 간은 일반적으로 주입 부위 뿐만이 아니라 관심있는 기관에 따라서 다양할 것이다.

Ⅵ. 재협착증의 억제

A. 배경

몇몇의 조사자는 평활근세포의 이동과 증식의 결과로서 혈관의 풍선손상후에 신생내막 과형성이 발생하는 것을 밝혀냈다(Austin, G.E. et al., "Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as an Explanation for Recurrent Coronary Angioplasty", J Am. Coll. Cardiol. 6:369-75, 1985; Lybby, P. et al., "A Cascade Model for Restenosis: A Special Case of Atherosclerosis Progression", Circulation 86:III47-III52, 1992; Clowes, A. W. et al., "Regulation of Smooth Muscle Cell Growth in Jnjured Artery", J. Cardiovasc. Pharmacol. 14:S12-S15, 1989). 이 신생내막형성은 풍선손상과 혈관내 스텐팅 두 가지의 발생후에 나타나는 재협착의 혈관조영술 관찰시에 역할을 한다(Mintz, G. S. et al.,"Intravascular Ultrasound Insights into Mechanisms of Stenosis Formation And Restenosis", Cardiol.-Clin. 15:1:17-29,1997). 혈관평활근세포증식의 원인이 되는 원시종양유발유전자의 합성을 방해하는, 합성된 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)는 관상동맥의 또는 경동맥의 손상의 결과인 협착형성을 성공적으로 억제하여 왔다(Shy, Y. et al., "C-myc 안티센스 올리고머의 트랜스카테테르 송달이 관상동맥 풍선 손상의 돼지모델에서 신생내막 형성을 감소시킨다", Circulation 90: 944-51, 1994; Morishita, R. et al., "혈관 손상후 내막 과다형성은 안티센스 CDK2 키나제 올리고뉴클레오티드에 의해 억제된다" J. Clin. Invest. 93:1458-64, 1994). 이점에서 그런 처치는 직접적인 혈관내 또는 주변외막의 송달을 필요로 하였다. 본 발명자들은 ODN(특별히 c-myc와 c-myb에 대한 ODN)이 과플루오로탄소-노출된 초음파처리된 덱스트로즈/알부민 (PESDA) 미세기포에 결합된다는 것을 증명하였다(Porter, T. R. et al., "Interaction of Diagnostic Ultrasound with Synthetic Oligonucleotide-Labeled Perfluorocarbon-Exposed Sonicated Dectrose Microbubbles", J. Ultrasound. Med. 15:577-584, 1996). 계속된 연구결과 경피의 저주파 초음파가 고주파음파발사의 장내에 함유된 혈관내로의 ODN의 침착을 증가키는 것으로 나타났다(Porter, T. R. et al., "The Effect of Microbubble Gas Composition and External Ultrasound Frequency on the Non-Invasive Enhancement of Antisense Oligonucleotide Delivery to the Vascular Wall in Pigs", Circulation Suppl. 2249, 1997). 실시예 14에서 설명된 연구는 저주파 초음파로써 증강된 이 혈관 침전과 PESDA 미세기포에 결합된 c-myc에 정맥내로 주입된 ODN이 경동맥의 풍선손상의 결과로 인한 신생내막 형성을 억제할수 있는지를 측정하기 위해 수행되었다.

이전의 연구에서 동맥의 손상에 따른 ODN 송달의 이전의 방법은 직접적인 동맥내 송달 또는 동맥혈관외막단부 적용을 필요로 하였다(Shi. Y. et al., 1994, 상기 동일; Morishita, R. et al., 1994, 상기 동일; Bennett, M. R. et al., "쥐 경동맥에서 신생내막의 형성에 미치는 포스포로티오에이티드 올리고뉴클레오티드의 효과", Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17;2326-32, 1997).

B. 현재의 연구

실시예 14는 본원에서 기술된대로, c-myc 원종양유전자에 대한 안티센스를 함유하는 정맥내의 미세기포 송달체계와 경피성 초음파를 사용하는 돼지에서의 경동맥 신생내막 형성의 억제를 설명한다. 우측 경동맥위의 영역은 풍선팽창 직후 및 3일째에 행한 총 6분동안의 각 주입의 전과 후에 고주파음파로 처리되었다. 실시예에서 증명된대로, PESDN 미세기초에 결합된, 정맥내로 투여된 ODN의 초음파 표적화된 침착이 루멘 직경에 대한 현저히 작은 내막 두께비를 형성하는 것 뿐만 아니라 내막 과다형성을 억제함으로써 협착형성을 억제하였다.

비-침입적인 것외에도, 초음파 표적 접근은 손상후 다양한 시간간격으로 반복될 수 있기 때문에 유리하다. c-myc에 대한 안티센스의 동맥혈관 외막 단부 적용은 배지의 복제를 억제하지만, 이 억제는 쥐에서 경동맥의 손상후 4일째에는 더 이상 명백하지 않다(Bennett M. R, et al., 1997, 상기 동일). 본 발명에서 실시예 12에서 기술한대로, PESDA에 결합된 ODN의 두번째 0.5밀리그램 용량은 손상이후 3일간 정맥내로 투여되었다. 감소된 내막 이상형성과 더 큰 혈관 루멘 둘다 ODN-PESDA기에서 30일에 관찰되었다. 풍선 시술전 손상 IVUS 데이터를 얻을 수 없으므로, 커진 루멘크기가 ODN-PESDA 그룹에서의 혈관 성장때문인지 또는 대조그룹에서의 수축때문인지는 알려져 있지 않다.

혈관확장은 발생되는 내막 고혈압의 양보다 더 중요한, 풍선손상에 수반되는 협착형성의 정도를 측정하는데에 결정적인 요소가 된다고 보여진다(Kaskuta, T. et al., "보상성 혈관확장에서의 차이, 내막을 형성하지 않는 고콜레스테롤혈증 토끼모델에서 혈관조영술후의 재협착에 대한 기술" Circulation 89: 2809-15, 1994). 초음파 표적화된 송달로 처리된 기체내에서의 더 큰 루멘영역은 c-myc에 대한 ODN의 중요한 효과가 동맥경화에 대한 부적당한 보상성 확장을 방지하는 것이라는 것을 나타낼 수 있따. ODN이 루멘확장을 발생할 수 있는 하나의 방식은 배지밖으로 c-myc 중재된 세포이동을 방해하는 것에 의한다. 그 과정은 c-myc에 대한 안티센스의 직접적 적용에 의해 방해되어 왔다(Bennett M. R. et al., 1997, 상기 동일; Biro, S. et al., "Inhibitory Effects Antisense Oligonucleotides Targeting c-myc mRNA on Smooth Muscle Cell Proliferation and Migration", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:654-58, 1993). ODN이 혈관의 크기를 변경할 수 있는 다른 메카니즘은 강력한 혈관수축제이고 분열촉진성 물질인 엔도텔린-1 생성을 자극할 수 있는 c-myc의 능력을 억제하는 것에 의한다(Shichiri. M. et al., "c-myc에 의한 프레프로엔도텔린-1 유전자의 2상성 조절", Endocrinology 138(11): 4584-90, 1997).

이 연구는 초음파의 존재하에서 PESDA 미세기포에 결합된 ODN의 증가된 흡수가 경동맥의 풍선 손상에 따르는 협착형성에 대해 중요한 효과를 갖는다는 것을 확인하며 송달 체계로서 초음파와 미세기포의 생리학적 효능을 입증한다.

초음파는 올리고뉴클레오티드가 양이온성 리포좀과 같은 다른 담체 체계에 송달될때 배양된 HeLa 세포내에서 유전자발현을 강화하는 것으로 밝혀졌다(Unger. E. C. et al., "초음파는 리포좀성 형질전환의 유전자 발현을 강화한다", Invest. Radiol. 32: 723-27, 1997). 초음파의 존재하에서 이런 강화된 세포 흡수에 대한 메카니즘은 세포막의 공동화에 의해 유도된 이중층 장애라고 주장되어 왔다(Mitragotri, S. et al., "Transdermal Drug Delivery Using Low-Frequency Sonophorsis", Pharmaceutical Research 13:411-20, 1996). 그러므로 미세기포는 이 공동화 역치를 저하시키는 그것들의 능력에 의해 다른 담체 체계를 능가하는 고유의 잇점을 가질 수 있다(Holland, C. K., et al., "Thresholsd for Transient Cavitation Produced by Pulsed Ultrasound in a Controlled Nuclei Enviromnemt", J. Acoust. Soc. Am. 88:2059-69, 1990). 만일 공동화가 ODN의 강화된 흡수를 위한 메카니즘이라면, 이 연구에서 사용된 미세기포의 존재와 더 낮은 초음파의 주파수(20㎑)는 둘다 향상된 흡수력을 가질 것이다.

결론적으로, 정맥내 ODN-PESDA와 경피성의 저주파수 초음파는 풍선손상에 따르는 혈관벽에 대한 안티센스의 직접적 적용에 유사한 방식으로 경동맥의 협착형성을 억제한다고 밝혀졌다. 이들 데이터는 ODN을 함유하는 미세기포체계와 초음파는 풍선 혈관조형술이나 혈관내 스텐팅에 따르는 협착형성을 억제하는 강력하고 비침입적인 방법일 것이다.

Ⅶ. N ₂ 가 고갈된 환경에서 미세기포제조의 이점

알부민 쉘을 포함하는 미세기포는 그것들의 막을 가로질러 가용성 기체가 빠르게 확산되는 것을 가능하게 한다. 그들의 더 높은 분자량 기체의 느린 확산속도와 혈액내에서 그것들의 불용성때문에 과플루오로탄소를 함유하는 미세기포는 동일한 막을 가지고 있는 실내공기-함유 미세기포보다 더 길게 생존한다.

그러나 퍼플루오로카본을 함유하는 미세기포는 대기 초음파처리(다시 말해, 초음파처리 환경의 어떤 변형도 없음)에 의해 제조될 때의 대기기체의 상당한 양을 여전히 함유할 수 있다. 이러한 관점에서 본원에서 사용된 "불용성 기체를 함유하는" 은 예컨대 퍼플루오로카본와 같은 혈액에 불용성인 기체와 함께 교반됨으로써 형성되지만, 초음파처리되는 동안 존재하는 다른 기체들을 또한 함유할 것으로 기대되는 미세기포를 의미한다. 대기에서 초음파처리된 미세기포는 그러므로 알부민 막을 가로질러 존재하는 농도 구배에 의해 영향을 받을 것이다.

수학적 모델은 만일 조직과 혈액이 질소를 함유한다면 불용성 기체를 함유하는 미세기포가 더길게 잔존한다고 제안해 왔다(Burkard, M. E. et al., "Oxygen Transport to Tissue by Persistent Bubbls: Theory and Simulations", J. Appl. Physiol. 2874-8, 1994). 혈액에 질소가 없는 경우(즉 산화된 혈액), 질소는 PCMB내로부터 PCMB의 밖으로 그들의 크기를 줄이면서 확산될 것으로 기대된다.

따라서 실시예 10에서 보여진대로, 100% 산화된 동맥혈액에 노출된 PCMB는 크기면에서 실내공기혈액에 노출된 PCMB 보다 현저히 더 작았다(표 4, 실시예 10).시험관내에서의 이 연구는 산화된 혈액내로 미세기포를 확산시키는 질소처럼, 정상혈액에 비교하여, 산화된 혈액이 퍼플루오로카본을 함유하는 MB의 크기를 감소켰다는 것을 확인한다. 그러나, 산화된 혈액은 미세기포 밖으로의 가용성 기체들의 빠른 확산때문에, 순수한 실내공기를 함유하는 알부민 미세기포로 볼 수 있는 것처럼 퍼플루오로카본을 함유하는 미세기포를 완전히 파괴하지 않았다(Wible J. Jr. et al., "Effects of Inspired Gas on the Efficacy of Albunex

in Dogs", Circulation 88(suppl):1-401(1993)).

미세기포직경이 감소함에 따라, 표면장력과 흡수압력이 증가되기 때문에 정맥내의 PCMB에 의해 생성되는 화상강도가 미세기포 안과 밖의 질소와 산소의 농도 변경에 의해 또한 영향을 받았을 것이라고 가정되었다. 미세기포의 산소 함유량을 증가시킴에 의해서(따라서 미세기포내에 질소의 부분압력을 낮게 함으로써), 혈액내에서 미세기포의 생존은 연장될 수 있었다는 것이 주장되었다. 이것은 질소가 고갈되거나 질소가 없는 환경에서 미세기포를 형성함으로써 달성된다.

본원에서 사용된 용어 "N₂- 고갈된"이나 "질소가 고갈된"은 그런 환경에 직면한 초음파처리에 의해 형성된 기체충전 미세기포내에서 질소의 부분압력이 실내공기가 있을 때의 초음파처리로부터 달성된 부분압력보다 더 낮은 것과 같이, 실내공기의 N₂ 함유량보다 낮은 N₂ 함유량을 말한다(실내공기는 전형적으로 대략 75.5중량% 또는 78부피%의 질소를 함유한다). 전형적으로 질소가 고갈된 환경은 실내공기의 그것보다 더 높은 산소 함유량을 가지고 있다. 질소가 고갈된 환경은 실질적으로 질소가 없는때, 예컨대 상업적으로 제공되는 순수한 산소와 같이 "질소가 없는" 것이다.

따라서 미세기포는 전형적으로 초음파 혼과 용액간의 계면내로 산소와 같은 질소가 고갈되거나 질소가 없는 기체를 불어넣는 것에 의해서 질소가 고갈되거나 질소가 없는 상태에서 초음파처리된다. 이 경우, "불용성기체를 함유하는" 미세기포는 퍼플루오로카본같은 불용성기체를 함유하고 그리고 질소가 고갈되거나 없는 기체를 약간 함유하는 것으로 기대된다(이들 조건하에서 실내공기의 다소 작은 양이 미세기포에 고루 들어갈 수 있다 할지라도, 미세기초에 함유된 기체는 실질적으로 질소가 없는 것으로 고려된다).

이 변형은 혈류내에서 더 안정하고, 향상된 조영과 약물송달을 초래하는 실질적으로 작은 미세기포를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 그런 효과는 실내공기가 있을 때 초음파처리된 PCMB보다 더 큰 심근 조영을 초래하며, 실시예 11에서 기술된 폐쇄된 가슴 연구에서 일관되게 관찰된다. 100밀리초(10㎐ 영상화)만큼 짧은 맥동 간격을 사용하는 간헐적인 영상화로 할지라도, 육안으로도 명백한 심근조영은 질소가 없는 환경에서 초음파처리된 미세기포로써도 여전히 달성된다. 본 발명은 표적화된 송달체계로서 조성물 중에 이러한 조영제의 사용 및 초음파의 적용을 포함한다. 조영제의 제조에 있어서 N₂ 고갈 환경 또는 N₂ 가 없는 환경의 사용은 또한 심근의 영상화에 있어서 조영제 효과를 개선한다.

이하의 실시예는 단지 예증의 목적이고 본 발명을 어떤 방식으로든지 한정하기 위해 의도된 것이 아니다. 매우 많은 다른 단백질-생리활성 약물 조합이 본 발명에서 사용될 수 있고 본원에서 예상될 수 있음이 당업자들에 의해 인정될 것이다. 예컨대, 만일 필모겐 단백질이 α1 산 당단백질이라면 생리활성약물은 리도카인, 인데랄, 또는 헤파린일 수 있다.

다음 모든 실시예에서 모든 부와 퍼센티지는 다른 언급이 없는 한 중량에 의해 명기되고 모든 희석은 부피에 의해 명기된다.

실시예 1. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 합성

사슬 연장 합성은 ABI Model 391 DNA 합성(Perkin Elmer, Foster City, CA) 또는 Lynx Therapeutics, Inc(Hayward CA)에 의해서 제공된 1μmole 칼럼 지지체상에서 수행하였다. 1μmole 합성은 시아노에틸 포스포로아미다이트와 ABI User Bulletin 58로서 테트라에틸티우람 다이설파이드를 사용한 황화반응을 이용했다. 방사성표지된 뉴클레오티드는 Glen Research(Bethesda, MD)에 의해서 하이드로겐 포스포네이트 물질로서 합성되었다.

실시예 2. 미세기포 현탁액의 제조

5% 인간혈청 알부민과 5% 덱스트로스는 상업적 공급원에서 얻어졌다. 5% 덱스트로스용액의 3부와 5% 인간혈청 알부민 용액의 1부(총합 16밀리리터)를 35밀리리터 Monojet

주사기내로 주입된다. 각각의 덱스트로스와 알부민 샘플을 데카플로오로부탄이나 실내공기의 8±2밀리리터와 함께 손으로 교반하고, 그리고나서 80±5초동안 20킬로헤르츠로 전기기계적 초음파처리에 노출시켰다. 이 방식으로 생성된 퍼플루오로카본에 노출된 초음파처리된 덱스트로스 알부민(PESDA) 미세기포의 네개의 연속되는 샘플의 평균크기는 혈관조영측정법에 의해 측정된대로 4.6±0.4마이크론이고, 평균농도는 Coulter 계수기에 의해 측정된대로 1.4×10⁹bubbles/mL이었다.

실시예 3. 미세기포/ODN 포합체의 제조

서열 5'-TAT GCT GTG CCG GGG TCT TCG GGG 3'(c-myc에 상보하는 24-량체)(SEQ ID NO:2)와 5'TTAGG3'(SEQ ID NO:3)을 균일하게 ³⁵S-표지된 PS-ODNs(포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드)과 함께 37℃에서 30분간 퍼플루오로카본에 노출된 초음파처리된 덱스트로스와 알부민(PESDA) 미세기포 용액과 함께 최종 0.5㎖ 부피로 인큐베이션하였다. 그 용액을 기포가 꼭대기에서 일어날 수 있도록 방치하였고, 그리고나서 샘플은 미세기포를 포함하는 꼭대기층으로부터 또는 바닥의 깨끗한 용액으로부터 제거될 수 있었다.

실시예 4. 세척되거나 세척되지 않은 PESDA 미세기포에 결합하는 포스포로티오에이트 ODN

세척된 미세기포를 생성하기 위하여 실시예 1에서 제조된 미세기포의 용액을 5% 덱스트로스의 1000배 과량의 부피로 세척하여 미세기포와 결합하지 않는 알부민을 제거하였다. 미세기포는 4시간동안 떠오르도록 방치하였다. 세척된 거품을 남기면서 하부용액을 제거하고, 거품을 0.9% 염화나트륨과 혼합하였다. 세척된 미세기포중의 알부민단백질 농도는 Bradford 검정에 의해 측정된대로 0.28±0.04mg/ml이었다(Bradford, M. et al., "A Rapid and Seneitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding," Anal. Biochem. 72: 248, 1976)

방사성이 있는 것으로 표지된 24-량체 PS-ODN을 세척되거나 세척되지 않은 PESDA의 현탁액에 5nM의 농도로 첨가하였다. 이 용액에서의 방사능은 액체 신틸레이션 카운터로 측정하였다(model LSC 7500; Beckman Instrument GmbH, Munich, Germany). Hydrocount 생분해성 신틸레이션 칵테일(5ml)을 100μl 샘플에 첨가되었다. 샘플은 각 실험후에 즉시 카운팅하고 그리고나서 다시 퀀칭과 화학발광의 영향을 감소시키기 위하여 24시간후에 카운팅하였다.

PESDA 미세기포(꼭대기층)에 대한 PS-ODN의 분배와 세척되고(알부민-유리) 세척되지 않은(알부민 함유) 저층은 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 측정된 대로 표 1에 보여진다.

유리 알부민의 존재 또는 부재하에서 PESDA 미세기포의 알부민에의 올리고뉴클레오티드 결합

세척되지 않은 기포 (유리 알부민 존재)
Oligo	N	정상 (cmp/μL)	바닥 (cmp/μL)	비율, T/B
TTAGGG	6	125±6.4	92.3±6.4	1.35
c-myb	6	94.1±17.6	77.3±1.2	1.35
세척된 기포 (유리 알부민 없음)
TTAGGG	6	210±10.8	126±8.7	1.67
c-myb	6	200.3±37.4	92.7±15.7	2.16

데이터는 미세기포와 결합되지 않은, 세척되지 않은 용액내의 알부민이 PS-ODN에 결합하는 것을 나타낸다. 비 미세기포-결합된 알부민(세척된 기포)의 제거는 PESDA 미세기포를 가지는 PS-ODN의 분배의 증가를 초래하였다(ratio= 1.67 for TTAGGG PS -ODN and 2.16 for c-myb PS-ODN).

실시예 5. 세척된 알부민 코팅된 미세기포에 대한 ODN의 결합 친화력

실시예 4의 세척된 미세기포에 대한 PS-ODN의 결합의 친화력을 평가하기 위하여 혼합물을 결합부위에 대한 경합 리간드로서 과량의 비방사성 PS-ODN의 증가하는 양을 함유하도록 제조하였다. 서열 5'-d(CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC)-3'(SEQ ID NO:4)인 비방사성 PS-ODN 20량체를 증가하는 농도의 시리즈(0, 3.3, 10, 32.7, 94.5, 167, 및 626μM)의 방사성 24량체를 함유하는 튜브에 첨가하였다. 기포의 각 현탁액을 거꾸로 하여 혼합하고 60분동안 37℃에서 인큐베이션하였다.

관찰된 결합 데이터를 도 1에서 Lineweaver-Burke 플롯으로 나타낸다. 미세기포에의 결합에 대한 평형 해리 상수 K_m(7가지 농도에 대해 이중으로 게산함)은 1.76×10^-5M이었다.

실시예 6. ODN-미세기포 경합 결합연구

샘플의 세개 그룹은 3개 한발로 제조하였고 각 샘플을 20분동안 실온에서 인큐베이션하였다.

그룹 A(대조표준): 미세기포의 100㎕ / 900μL 함염물 + 표지되지 않은

20량체 2μL

그룹 B: 미세기포의 100㎕ / 900μL 함염물 + 2μL FITC-표지된 20량체

(최종 20량체 + 농도 = 151nM)

그룹 C: 미세기포의 100㎕ / 800μL 함염물 + 2μL FITC-표지된 20량체

+ 100μL 표지되지 않은 20량체

흐름세포분석은 100mW 공기 냉각 아르곤 레이저와 LysisⅡ 포착과 분석 소프트웨어가 장착된 FACStar Plus(Becton Dickinson)을 사용하여 수행하였다. 리스트 모드 데이터를 최소한 10⁴선택된 미세기포에 대해 사용하였고, 독립적인 분석을 각 샘플에 대해 수행하였다. FITC-표지된 미세기포의 분포는 표 2에 제공된다.

올리고뉴클레오티드 결합 미세기포의 분포

샘플번호	대조표준 (PS-ODN)		151nM FICT PS-ODN		+과량의 미표지 ODN
샘플번호	PE	MI	PE	MI	PE	MI
1	99.5	2.38	98.9	2109.8	97.8	1753.1
2	99.3	4.07	99.1	2142.3	98.7	1710.9
3	99.4	3.52	99.1	2258.5	99.3	1832.2
평균±SE		3.23±0.50		2170±46¹		1765±36^1,2
PE=퍼센트 이벤트; M1=평균 세기 ; SE=표준 에러 ¹평균은 대조표준과 현저히 다르다; P＜0.001 ²평균은 151nM 샘플과 현저히 다르다; P＜0.001

과량의 표지되지 않은 PS-ODN을 함유하는 샘플에서 평균 형광 세기에서의 주요한 감소는 미세기포와의 결합이 포화시킬 수 있다는 것을 의미한다. 결과적으로 미세기포 표면과 PS-ODN의 비특이적 상호작용은 제한된다.

실시예 7. 실내공기를 함유한 미세기포에 대한 ODN 의 결합 대 퍼플루오로카본-함유 미세기포에 대한 ODN의 결합

실내공기를 함유한 초음파처리된 덱스트로스/알부민 미세기포에 대한 PS-ODN 의 결합의 균일성 대 퍼플루오로카본을 함유한 초음파처리된 덱스트로스/알부민 미세기포에 대한 PS-ODN 의 결합의 균일성은 흐름세포분석법에 의해 측정하였다. 세척된 PESDA 미세기포에 PS-ODN의 가우스분포는(보여지지 않은 데이터는 제시하지 않음) 이들 미세기포상의 알부민이 올리고뉴클레오티드에 대한 결합부위를 보유하고 있음을 나타냈다. 세척된 RA-SDA 미세기포에 대한 가우스분포의 부재는 이들 미세기포의 초음파처리동안에 이 올리고뉴클레오티드에 대한 알부민결합부위의 상실이 일어났다는 것을 나타냈다(알부민 결합특성, 특히 그것들의 올리고뉴클레오티드에 대한 결합특성의 논의를 위해서는 문헌 참조: Kumar et al., "Characterization of Binding Sites, Extent of Binding, and Drug Interactions of Oligonucleotides with Albumin" Antisense Res. Dev. 5:131-139(1995)).

상술한 것에서 나타내는 PS-ODN은 PESDA 미세기포의 알부민에 결합하고, 그것은 알부민상의 결합부위 1은 전기기계적 초음파처리에 의한 이들 기포의 생성후에도 생물학적으로 활성임을 가리키는 것임을 알 수 있다. 그러나, 전기기계적 초음파처리가 실내공기만으로 수행될때 이 결합부위 친화력은 상실된다. 더 나아가, PESDA 미세기포와 결합하지 않은 알부민의 세척에 의한 제거는 미세기포와 PS-ODN의 상당한 분배를 초래한다(표 1). 이들 관찰은 알부민 변성이 공기의 존재하에서 초음파처리로 제시된 것과 같이, 초음파처리동안 퍼플루오로카본을 함유하는 덱스트로스/알부민용액과 함께 일어나지 않는다는 것을 증명한다.

PESDA 미세기포에서 알부민의 보유된 생리활성(특히 부위 1)은 결합부위에 대한 경합 리간드로서 과량의 비방사성 PS-ODN의 증가하는 양의 존재하에 세척된 PESDA 미세기포에 대한 PS-ODN의 결합 친화력에 의해 확증되었다(표 2). 과량의 표지되지 않은 PS-ODN을 함유하는 샘플에서 평균 형광 세기의 상당한 감소는 미세기포에 대한 결합이 포화될 수 있는 것이라는 것을 나타낸다.

실시예 8. 올리고뉴클레오티드가 결합된 미세기포의 초음파에 대한 노출

가변성 흐름 미소구 스캐닝 쳄버를 앞에서 기술된 것(Mor-Avi, V.et al., "Stability of Albunex

Microspheres under Ultrasonic Irradiation; an in vitro Study", J. Am. soc. Echocardiology 7:S29, 1994)과 유사하게 사용하였다. 이 체계는 Masterflex

흐름체계에 연결된 원형의 스캔닝 챔버를 함유한다(Microgon, Inc., Laguna Hills, CA). 스캐닝챔버는 청각상 투과성 물질에 의해 각 측면에서 결합되었고 물이 채워진 챔버에 의해 각 측면으로 둘러싸여졌다. PS-ODN 표지된 PESDA 미세기포(0.1밀리리터)를 스캐닝챔버에 가깝게 1초이상 환약(blous)으로서 주입한 후, 조절된 유속 100ml/min로 수돗물로 채워진 스캐닝챔버내로 플라스틱 튜브를 통해 흐르게 하였다. 스캐닝챔버를 통해 기포가 통과함에 따라, 스캐너(2.0㎒ 주파수, 1.2㎫ 피크 네가티브 압력)를 전통적인 30 ㎐ 화면율(frame rate)로 초음파를 송달하도록 세팅하였다. 또한 초음파가 송달되지 않은 상태에서 대조표준을 작동시켰다.

스캐닝챔버를 통한 통과에 이어서, 용액을 눈금을 매긴 실린더내로 같은 크기의 플라스틱 관을 통해 통과시켰다. 첫번째 10mL는 버렸다. 다음 10mL는 모아, 샘플의 하부부분에 존재하는 유리 올리고뉴클레오티드로부터 꼭대기에 있는 미세기포를 분리하기 위하여 방치하였다.

유출물의 상부 및 하부 작동으로 부터의 방울을 혈관조영기 슬라이드위에 놓고, 10X확대를 사용하여 분석하였다. 이들 슬라이드의 사진을 만들고 36제곱센티미터영역에 걸쳐 있는 미세기포의 수를 계수하였다. 유출물의 상부 및 하부 부분을 또한 EDTA와 포름아마이드 용액과 15(v/v) 혼합하였고 5분동안 95℃로 가열하였다. 그런 다음 샘플을 20% 폴리아크릴아마이드 겔이 포함된 Applied Biosystems모델 373A DNA 서열기에서 조사하였다. 데이터는 곡선아래의 형광세기영역을 측정할 수 있도록 GeneScanner

software로 얻었다.

PS-ODN의 분석과 초음파노출후 미세기포 총계(미세기포 수는 괄호로 표시함)

	PS-ODN 농도 (미세기포 수)
	초음파 없음			초음파와 함께
ODN, nM	정상^a	바닥	T/B비율	정상	바닥	T/B비율
0.015	189	158	1.2	188	187	1.0
0.015	(112)	(16)	(7.0)	(56)	(12)	(4.7)
0.10	169	94	1.8	184	191	1.0
0.10	(256)	(8)	(8.0)	(16)	(32)	(2.0)
1.0	209	198	1.1	254	255	1.0
1.0	(288)	(8)	(36)	(88)	(40)	(2.0)
평균±S.E.	203±19	147±25	1.5±0.2	210±18.6	219±20.0	1.0±0.0
평균±S.E.	(219±54)	(19±7)	(17±10)	(53±21)	(±)	(3±1.0)
^a정상= 초음파 처리후 유출용액의 상부층; 바닥=초음파 처리후 바닥층

초음파에 노출한 결과 상부층에서 미세기포의 상당한 상실이 있다(초음파없이 219±54 미세기포 vs 진단용 초음파에 노출될때 유출물의 상부층에서 53±21 미세기포). 이 미세기포수의 상실은 상부의 기포-함유 층의 초기 PS-ODN의 농도에 관계없이 명백했다. 겔 전기영동에 의해 측정된, 하부의 비기포함유층의 PS-ODN 의 농도는 상당히 증가했다. 데이터는 진단용 초음파에 PS-ODN- 표지된 PESDA 미세기포의 노출이 PS-ODN의 통합성을 변경하지 않는 한편, 알부민결합으로부터 그것을 방출시킨다는 것을 보여준다.

실시예 9. 안티센스 올리고의 미세기포 송달을 통한 변경된 생체내 분포

시토크롬 P450 ⅡBI유전자서열에 대한 안티센스 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 헥소바비탈의 대사를 변경시키기 위해 디자인하였다. (PB는 CYP ⅡBI mRNA를 자극하고, 그 결과 CYP ⅡBI에 의해 하이드록실화된 헥소바비탈은 더 빨리 대사되었고 그의 진정효과는 감소되었다. 안티센스 올리고는 이 효과에 반대 작용할 것으로 된다.)

올리고뉴클레오티드는 서열이 알려지고 다음의 서열: GGA GCA AGA TAC TGG GCT CCA T (SEQ ID NO:5)와 AAA GAA GAG AGA GAG CAG GGA G (SEQ ID NO:6)을 갖는 쥐의 시토크롬 P450 ⅡBI에 따라서 합성하였다. 올리고는 앞서 기술한대로 과불화프로판노출된 초음파처리된 덱스트로스/알부민 미세기포(PESDA)에 포합되었고 정맥내로 쥐에게 송달되었다. 210에서 290g의 수컷 Spague-Dawley 쥐를 이 연구를 위해 사용하였다. 그것들은 AAALAC 승인된 동물자원기관인 Univrsity of Nebraska Medical Center에 있는 동물 쿼터에서 길러졌다. 그 동물들을 12시간 빛/어둠 순환에 노출시켰고 Purina 쥐 음식과 수돗물에 자유롭게 접근시켰다.

표시된 그룹이 쥐에게 페노바비탈(PB) (Mallinckrodt, St. Louis)을 2일동안 80mg/kg/day로 복강내에 주입하였다. PB주입은 ODN 미세기포주입에 의해 동시에 주어진다. 포스포로티오에이트 ODN주입은 2일동안 1 mg/kg/day이었다. 수면시간은 첫번째 주입후에 48시간으로 측정되었다.

각 쥐에게는 PB 및/또는 ODNs의 처치의 2일의 끝에 복강내로 헥소바비탈 (Sigma, St.Louis)이 100mg/kg 주입되었다. 동물들은 헥소바비탈에 의한 진정상태하에 여전히 있었다는 것을 보증하기 위해서 그들의 등에 배치되었다.: 수면시간은 그들이 한바퀴 도는 때에 그들의 등에 배치되는 시간으로서 한정된다.

결과는 올리고 뉴클레오티드 결합된 미세기포에 접합된 올리고뉴클레오티드의 송달이 약물의 효능을 아주 향상시켰다는 것을 나타낸다. 대조 쥐는 약23분의 수면시간을 갖는다. PB의 투여는 수면시간을 11.4 4.5분으로 감소시켰다. 그러나 올리고에 접합된 미세기포가 1/20용량으로 주어진 쥐들은 50분 더많은 수면시간을 경험했다. 대조적으로, 올리고에 접합된 비미세기포의 투여는 수면시간에서의 변화가 거의 없었다(약 13분).

올리고의 생체내분포를 측정하기 위하여 동물을 에틸에테르를 사용하여 궁극적으로 희생시켰고, 마이크로좀은 Franklin과 Estabrook(1971)에 의해 기술된 대로 제조되었다. 간은 정맥입구를 경유하여 4% 함염물의 12ml로 관류되었고 그리고나서 동물로부터 제거되었다. 간은 저며졌고 0.25M 슈크로스(Sigma)에서 균질화되었고, Sorvall RC2-B 원심분리기(Dupont, Wilmington, DE)내에서 4℃에서 20분동안 8000 x g로 원심분리되었다. 상층액은 저장되었고 0.25M 슈크로스에서 다시 현탁되어 Sorvall OTD55B초 원심분리기(Dupont)내에서 4℃에서 45분동안 100,000 x g로 원심분리되었다. 정제는 1.15% KCL(Sigma)에 다시 현탁되었고 1시간동안 4℃에서 100,000 x g로 원심분리되었다. 최종 정제는 평형부피 완충용액에 다시 현탁되었고(10mM Tris-아세테이트, 1mM EDTA, 20% 글리세롤; Sigma), -80℃에서 냉각되었다.

단백질 농도는 Bradford 측정법에 의해 결정되었다(Bradford 1976). 균질의 분취액(80㎕)은 96웰 플레이트에 첨가되었다(Becton, Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ). Bradford 시약(Poul; Bio-Rad, R: chmond, CA) 첨가하고 플레이트는 마이크로 플레이트판독기에서 595nm에서 판독한다(Molecular Devices을 Newport MN). 데이터는 소의 혈청 알부민(Sigma)의 공지의 농도로 산출된 표준곡선에 비교된다.

CYP ⅡBI함유량은 펜톡시레소루핀 O-탈알킬화(PROD) 활성에 의해 결정된다(see e.g. Lubcl R.A er ol Arch Biochem Biophys, 238(1):43-8 1985). 각 미세소체의 샘플에 대해, 0.1M potassium phosphate 완충용액내의 1mg단백질, 1ml 2 μM 5-펜톡시레소루핀 (Pierce,Rockford, IL), 17μM 60mM NADPH 를 혼합하고 37℃에서 10분동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서 혼합액은 2ml 큐벳에 첨가되었고 530nm의 여기파장과 585nm의 방출파장을 사용하는 RF 5000U 형광광도계(Shimadzu, Columbia, MD)에서 판독된다. 알려지지 않은 농도는 레소루핀(Pierce, Rockford, IL) 표준의 표준곡선에서 계산되었다. 결과는 nmol 레소루핀/mg 단백질/min으로 기록되었다.

CYP ⅡBI단백질의 직접적 측정은 CYP ⅡBI 단백질에 대해 지시된 항체를 사용하는 ELISA 측정법에 의해 측정되었다(Schuurs and Van Weeman, Clino Chim. Acta 81(1): 1-40, 1977). 간 샘플(50μg/well)은 100㎕ 0.35% 중탄산나트륨 완충용액에서 96 well nunc- immuno plate 위에 플레이팅되었다(InterMed, Skokie,IL). 마이크로좀은 PBS중의 소의 알부민 혈청 1%로 3번 세척되었고 200 ㎕ PBS/BSA로 37℃에서 1시간동안 인큐베이션되었다. PBS/BSA는 제거되었고 50㎕의 CYP ⅡBI 항체(Oxygene, Dallas,TX)는 첨가되었고 37℃에서 1시간동안 배양되었다. 마이크로좀은 함염물/ Tween

20(Sigma)로 5회 세척되었고 50㎕ 양고추냉이 페록시다제 항체(Bio-Rad)가 첨가되었다. 마이크로좀은 37℃에서 1시간동안 인큐베이션되었고 함염물/ Tween

으로 5회와 85%함염물로 2회 세척되었다. 양고추냉이 페록시다제 기질(100 ㎕; Kirkegaard& Perry Labs, Gaithersburg, MD)이 첨가되었고 플레이트는 계속적으로 마이크로 평판 판독기( Molecular Devices)에서 1시간동안 405nm에서 판독된다. 결과는 mOD/min으로 양고추냉이 페록시다제 활성으로서 기록되었다.

결과는 미세기포에 포합된 올리고는 올리고가 페노바비탈의 대사부위인 간과 신장으로 지시되었다는것을 증명하였다.

실시예 10. 정상상태 및 산소가 풍부한 동맥혈액에서 초음파처리후에 PESDA 미세기포의 크기와 농도

동맥혈액은 희생 직전에 실내공기 흡입의 조건하에서 4마리의 개와 3마리의 건강한 돼지로부터 취해졌다. 그 동물중 4마리에서, 첨가되는 동맥혈액은 그동물이 최소한 10분동안 100%산소를 흡입한 후에 얻어졌다. 그 혈액은 60ml 헤파린첨가된 주사에서 응축되었고 스캐닝챔버내로 주입될때까지 37℃에서 따뜻한 물 욕조에서 보존되었다. 스캐닝 챔버내로 혈액의 주입직전에 퍼플루오로카본을 함유하는 미세기포(PCMB)의 0.2ml가 혈액의 60ml 주사기내로 스탑코크를 경유하여 주입되었다. 그리고 전위와 손으로 주사기를 굴리는것에 의해 부드럽게 혼합되었다.

그리고나서 샘플은 50ml/min의 유속으로 스캐닝 챔버내로 주입되었다. 일단 챔버가 가득차면 주입을위해 사용된 플라스틱 관에 스캐닝 챔버를 연결하는 폐쇄된 스탑코크가 열렸다. 그리고 초음파 노출이(단속적인 1㎐화면율 또는 30-45Hz의 종래 화면율) 시작되었다. 초음파 노출후에 유출된 혈액은 눈금이 표시된 실린더에 연결된 관 내로 스캐닝 챔버에서 흘러 나왔다. 첫번째 10ml의 혈액은 폐기되었고 다음 15ml의 혈액은 전위된 뚜껑덮인 주사기내로 3개의 5ml 표본으로 농축되었다. 마지막 5ml샘플의 수집후 3분 후에, 투베르클린 주사기가 혈구계 슬라이드에 배치된 방울과 방출된 혈액의 꼭대기층내로 잠겨졌다. 이 시간의 길이는 방출된 혈액내에서 미세기포가 꼭대기로 일어나도록 하고 그리고 농축되도록 선택되었다. 그리고나서 혈구계 슬라이드는 광학 현미경(Olympus America Inc., Woodbury, NY)으로 40배 확대되어 조사되었고, 미세기포의 가장 높은 농도를 함유하는 영역이 혈구계에서 촬영되었다.

사진은 후에 확대되었고, 25㎠ 영역은 그 영역내에서 미세기포의 평균직경과 농도를 분석하도록 선택되었다. 농도는 전체의 슬라이드내 기포의 총합을 세는 것에 의해 결정된다. 이 기술로 측정된 미세기포의 농도는 Coulter 계수기 측량과 매우 가깝게 연관되고, 이 기술에 의한 크기측정은 공지의 5 마이크론 스피어로 측정되었다(Coulter Size Standards Nominal 5 ㎛ Microspheres, Miami, FL).

시험관내에서의 스캐닝 챔버: 스캐닝 챔버 시스템은 연동식 Masterflex 흐름 시스템(Microgon, Inc., Laguna Hills, CA)에 연결된 35ml 원통형의 스캐닝 챔버로 구성된다. 스캐닝 챔버의 폐쇄된 양 측면은 두께가 6.6 마이크론인 청각적으로 투과성인 라텍스 재료에 의해 결합되고, 원통형의 함염물로 채워진 챔버이다(Safeskin, Inc; Boca Raton, FL). 초음파 노출동안 스캐닝 챔버내의 압력은 스캐닝 챔버 가까이에 위치한 압력 변환기에 의해 측정되었고 (model 78304A; Hewlett Packard Co., Andover, MA) 그 시험의 전부를 통해 7±3Hg로 평균화되었다.

두 개의 다른 2.0 메가헤르츠 초음파 변환기가 시험관내 연구를 위해 사용되었다(Hewlett, Packard 1500; Andover, Massachusetts; and HDI 3000, Advanced Technology Laboratories, Bothell, Washington). 산출된 최대 네가티브 압력은 Hewlett Packard 변환기에 대해 1.1Mpa였고, HDI 3000 스캐너에 대해 0.9Mpa였다. 이 연구에 대한 영상심도는 8.2 센티미터였고, 양 변환기에 대한 촛점은 8센티미터였다. 각 변환기에 대한 화면율은 종래 (30-42㎐) 또는 주기적(1㎐)이었다. 스캐닝 챔버에 대한 모든 이미지는 고성능 비디오테이프에 기록되었다.

결과: 표 3은 동맥혈액(실내공기와 100% 산소)내에 초음파에 노출된후 PCMB에 대한 미세기포의 평균 크기의 차이를 증명한다. PCMB가 100% 산화된 동맥혈액에 노출되었을때 고주파음파 주사후에 평균 미세기포 크기의 상당한 감소가 있었다(P=0.01). 더 작은 미세기포 크기는 단속적인 영상(7.3±3.7㎛ 실내공기 vs.6.4±3.2㎛ 100% 산소)과 전통적인 영상(7.5±3.5㎛ 실내공기 vs.6.3±3.0㎛ 100% 산소 )후에 볼 수 있었다.

실내공기 동맥혈액에서의 단속적인 영상에 비교해 보면 미세기포 농도는 전통적인 화면율에 노출된 후에 현저히 감소되었다(표 3). 그러나 같은 변환기 출력에서 전통적인 화면율은 그들이 산화된 동맥혈액내에 있을 때의 많은 PCMB처럼 파괴되지 않았다.

정상상태(실내공기)와 산화된 동맥혈액에서의 초음파에 노출된후 유출물 PESDA 미세기포 크기의 비교

	MB 크기, ㎛	MB 농도 (No/hpf)
	MB 크기, ㎛	종래	단속적
동맥	7.4±3.6	6±8	16±11^a
동맥+산소	6.3±3.1	11±9	14±9^b
No/hpf=고배율장 당 미세기포의 수 종래=종래의 화면율 (80-43㎐) Inter=1 ㎐에서 단속적인 영상 종래의 동맥과 비교된¹P＜0.05 동맥 샘플과 비교된 r 테스트²P＜0.05

실시예 11. N ₂ 를 함유하지 않는 환경에서 형성된 미세기포 vs 대기환경에서 형성된 미세기포의 생체내 영상연구

퍼플루오로카본을 함유하는 미세기포(PCMB)는 실시예 1에서 기술된 대로 제조된다. 5% 인간혈청알부민의 한 부분과 5% 덱스트로스의 세부분(토탈 16ml)은 데카플로오로부탄의 8ml와 손으로 교반되었다. 80초 초음파 처리 과정은 두가지 다른 환경에서 수행된다. 즉, 실내공기(RA) 또는 100% 산소(질소가 없는 환경)은 초음파처리동안에 초음파 혼과 퍼플루오로카본 덱스트로스/알부민 용액간의 경계면내로 흘러들었다.

체내에서의 영상: 단백질 수용액을 초음파처리함에 의해 형성된 미세기포가 예정된 영역의 청각적 특성을 변경시키기 위하여 포유동물내로 주입된 후 의학적과정에서 사용하기 위한 영상을 얻기 위해 초음파 스캐닝되는 진단용 초음파영상 방법은 잘 알려져 있다. 예를 들면 미국특허번호 4,572,203, 4,178,433과 4,774,958에 예시된다.

초음파처리동안 100% 산소(O₂PCMB) 또는 실내공기(RA PCMB)에 노출된 미세기포의 샘플은 개에서 정맥내로 주입된다. 영상은 1.7㎒ 조화 변환기(HDI 3000; Advanced Technology Laboratories; Bothell, Washington)에 의해 수행된다. 변환기 출력은 0.1-0.8㎫에 놓여졌고 두 개의 다른 미세기포 샘플로부터 비데오세기 (videointensity)의 모든 비교에 대한 상수를 유지했다. 배경이 제거된 심근의 videointensity의 비교를 위한 화면율은 43㎐ (전통적) 또는 10㎐ (주기적)이었다.모든 절차는 Institutional Animal Care and Committee에 의해 승인되었고, Position of American Heart Association on Research Animal Use에 따랐다.

RA(실내공기) PCMB와 O₂PCMB의 거환 주입은 0.0025 또는 0.005ml/kg이었다. 샘플에서의 미세기포의 농도는 같은 것으로 결정된다. 앞과 뒤의 심근의 비데오세기의 최대치는 1내지 255 중간범위 이상 비데오세기를 정량화하는 Tom-Tech 검열 방송주파수(Louisville, Colorado)를 사용하는 오프라인에 의해 얻어진 디지탈화된 슈퍼 VHS 비디오테이프영상(Maxell, Japan)으로부터 측정되었다. 관심 분야는 각 단편의 중간의 심근에 배치되었다.

이 정량적인 분석에 덧붙여, 짧은 축면에서 앞부분의, 경막의, 그리고 후면의 영역에서 국부적인 심근조영 증강의 시각적 평가는 2명의 독립적인 검열자에 의해 만들어진다. 각 영역은 0(심근조영 없음), 1+(중간정도의 심근조영 증가) 또는 2+(구멍 세기에 접근된 밝아진 심근조영 증강)로 특정된다.

O₂ PCMB와 RA PCMB간의 최대치 심근의 비데오세기의 6개 비교의 합은 3마리 개에서 만들어진다. 표 5에서 주입에 앞서서 100% 산소의 존재하에서 초음파 처리된 PCMB는 실내공기의 존재하에서 초음파처리된 PCMB와 크기와 농도에 있어서 유사하다는 것으로 보여질수 있다. 그러나 모든 3마리 개에서 10㎐ 화면율(주기적 영상)을 사용하는 최대치 심근의 비데오세기는 100% 산소의 존재하에서 초음파처리된 PCMB에 대해 현저히 더 높았다.

오로지 산화된 PCMB만이 경흉부위 영상에 대해 사용된 용량에서 일관된 균질 심근조영을 나타냈다. 시각적인 심근조영은 RA PCMB의 같은 용량에 의한 9 또는 24영역에 비교되는 O₂ PCMB 정맥내 주입에 의한 24영역의 20에서 2+였다.(p=0.001)

100% 산소 또는 실내공기에서 초음파처리된 PCMB를 함유하는 플루오로카본의 IV 주사후 PMVI(최대치 심근의 비데오세기)의 비교

	PMVI(유닛)		미세기포
	Ant	Post	크기(㎛)	농도(No./hpf)
실내공기 PCMB	54±12	19±9	4.0±2.4	109±30
O₂ PCMB	70±6^a	31±5^a	3.9±2.3	108±50
Ant=앞부분의 심근; Post=후면의 심근 Conc=초음파처리후 즉각적인 MB conc; No/hpf= 고출력 영역당 MB의 수 RA PCMB에 비교하여^aP＜0.05

오로지 산화된 PCMB만이 경흉부위 영상에 대해 사용된 용량에서 일관된 균질 심근조영을 나타냈다. 시각적인 심근조영은 RA PCMB의 같은 용량에 의한 9 또는 24영역에 비교되는 O₂ PCMB 정맥내 주입에 의한 24영역의 20에서 2+였다(p=0.001).

기대된 대로 실내공기 혈액에서 미세기포 농도는 더 높은 화면율에 노출될 때 현저히 감소되었다. 그러나 더 빠른 화면율에 의한 이런 파괴는 PCMB가 산화된 혈액에서 있었을 때 다소 줄어들었다. 이 차이에 대한 이유는 명백하지 않다. 하나의 가능성은 산화된 혈액에서 미세기포 밖으로 질소의 더 빠른 확산은 퍼플루오로카본의 더높은 복용의 농도를 만들었고, 그리고 불용성의 퍼플루오로카본에 대한 확산 기울기를 증가시켰다는 것이다. 그의 낮은 용해도 때문에, 미세기포 밖으로의 증가된 확산이 더 작은 봉해지지 않은 퍼플루오로카본의 형성을 이끌 것이다. 혈구계 분석은 봉해지지 않은 미세기포로부터 봉해진 것을 구별하는 것을 가능하지 않게 할것이여 따라서 양자를 세야할 것이다. 이 설명은 또한 100% 산화된 동맥 혈액에 노출된 PCMB에 대한 관찰된 더 작은 평균 미세기포 크기를 계산할 것이다.

통계 분석: 짝짓지 않은 T테스트는 초음파처리동안 다른 기체에 노출된 PDMB샘플의 농도와 크기를 비교하기 위해 사용되어졌다. 이것은 또한 체내에서 연구에서 최대치 심근 비데오세기에 있어서 차이를 비교하기 위하여 사용되어졌다. 데이터가 정상적으로 분포되지 않았다면 비 매개변수적 테스트가 수행되었다. O₂ PCMB 와 RA PCMB의 정맥내주사에 의한 시각적 심근조영 증강의 비교는 분할표(Fisher's Exact Test)를 사용하여 이루어졌다. 0.05를 밑도는 p 값은 중요하게 고려되었다.

변이계수는 체내 연구에서 미세기포의 크기와 농도를 측정하는데 있어서 내 부관측자 변이성을 측정하기 위해 사용되었다. 비의존적인 검열자들간에 평균 차이는 최대치 심근의 비데오세기에서 내부관측자 변이를 비교하기위해 사용되었다.

2명의 독립적인 관측자는 각각 단속적이거나 전통적인 초음파 화면율에 노출된 6개의 다른 슬라이드의 미세기포 크기와 농도를 측정했다. 6개의 다른 샘플에서 2명의 독립적인 관측자에 의한 미세기포크기의 측정에 대한 변이계수는 8%(r=0.95; p=0.004)이었다. 반면 미세기포 농도의 비의존적인 측정에 대한 변이계수가 9%(r=0.99; p＜0.001)이었다. 경흉부 영상에 대한 2명의 독립적인 검열자에 의한 최대치심근의 비데오세기에서 보고된 평균 차이는 4±4유닛이다.(r=0.94, SEE=5 유닛; p＜0.001 n=24비교) O₂ PCMB와 RA PCMB간의후면의 최대치심근의 비데오세기에서 13유닛 평균차이와 앞에서의 16유닛 평균 차이 아래에 있는 두 연구자는 44영역 (84%)의 37영역에서 조영 증강의 시각적 정도의 조화에 있다. 5가지 불일치는 RA PCMB 심근조영 증강(두 영역에서 0 vs1+, 세 영역에서 1+vs 2+)의 시각적 분류에 있다. 1+가 있는 불일치가 있는 세 영역은 통계분석에서 2+로 정해졌다.

실시예 12. 미세기포로부터 ODN의 흡수에 미치는 표적된 초음파처리의 효과

미세기포가 포합된 PS-ODN의 신장 흡수에서 초음파처리의 효과의 체내에서의 연구는 3마리개에서 수행되었다. 형광표시된 PS-ODN PESDA 미세기포(0.2ml)의 정맥내주사는 대퇴골부의 혈관에서 이루어졌다. 같은 시간, 좌측 신장은 외부로 배치된 2.0-2.5㎒ 진단상의 초음파 변환기(최대치 음성적 압력 1.1㎫)에 의하여 고주파발사되었다. 신장은 주사 후, 그리고 신장에서 조영의 시각적으로 명백한 출현동안에, 최소 2분동안 30 Hz 화면율을 사용하여 고주파발사되었다. 각 개에서, 좌심실과 폐동맥 압력은 가가 폐동맥과 좌심실에 배치된 카테테르가 채워진 함염물을 사용하면서 신장주입 전과 후에 관측된다. 대략 주입후 4시간 후에, 개는 희생되었고 양쪽 신장은 제거되었다. 절단면은 신장외피에에서 얻어졌고 PS-ODN을 위한 견본이 만들어졌고 상기(실시예 8)에서 기술한 유전자 스캐닝법을 사용하면서 계산되었다. 조직학상의 단면은 또한 신사구체와 신원(네프론)에서 형광분석을 위해 얻어졌다.

한마리 개에서, 표시된 PESDA에서 PS-ODN 정맥내의주입후에 고주파발사되지 않은 신장에 비교되는 고주파발사된 신장내에서 PS-ODN의 10배이상 흡수가 많아졌다. 첫번째 개에서, 고주파발사되지 않은 신장에 대비해 고주파발사된 신장에서 PS-ODN의 3배 더 높은 흡수가 있었다. 두 번째 개에서, 고주파발사된 신장에서 PS-ODN의 9배이상의 더 높은 흡수가 있었다. 한편, 세 번째개에서 그 두신장 사이에 PS-ODN의 흡수에서 차이가 없었다. PS-ODN 표시가 된 PESDA 미세기포의 정맥내 주사 후에 혈역학적 변화는 없었다. 신장 시체의 조직학상의 시험은 또한 진단상의 초음파에 의해서 어떤 신사구체나 관계조직 세포의 파괴가 없다는 것을 나타냈다.

실시예 13. 미세기포로부터 헤파린의 흡수에 미치는 초음파처리의 효과

정맥내의 헤파린은 bolus안에 1500유닛으로, 3개의 다른 셋팅으로 개의 시체에 투여되었다. 셋팅 1에서 헤파린은 약물이 없는 것으로 주어졌다. 셋팅 2에서 1500 유닛 헤파린은 오로소뮤코이드(orosrmucoid) PESDA에 결합되도록 주어졌으나, 초음파는 혈액푸울에 적용되지 않았다. 셋팅 3에서 에 결합된 헤파린의 같은 용량(1500유닛)은 주어졌고 초음파는 혈액풀에 적용되었다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴(PTT)의 측정은 측정되었고, 그리고나서 최소한 15분동안 각각 주입후에 5분 간격으로 반복되었다.

셋팅 1에서 PTT는 5분에 106초이상 증가하였으나, 15분에 30-60초로 되돌아갔다. 셋팅 2에서 PTT는 10분후에 106초 이상에 달했고 최소한 15분에 60-80초로 되돌아갔다. 셋팅 3에서 PTT는 15분후에 106초 이상으로 남았다; 더 이상의 측정은 만들어지지 않았다.

실시예 14. 경피초음파 및 c-myc 프로토온코진에 대한 안티센스를 함유하는 정맥내 미세기포 송달체계를 사용한 경동맥 신생내막 형성의 저해

모든 절차는 국제동물보호와 사용협회에 의해 승인되고 연구동물 사용에서 미국심장협회의 태도에 따른다. 28마리의 사육된 돼지는 아스피린 325mg PO로 예비마취되었다. 전신마취제는 그리고나서 케타민 20mg/kg, 살라진 4mg/kg과 보충적으로 펜토바비탈이 투여되었다. 돼지는 사육되었고 실내공기를 호흡하는 호흡기에 놓여졌다. 백조 갠즈 카테테르는 폐의 압력을 관찰하기 위해 폐동맥내로 전진되었다.정맥내로 헤파린 4000 내지 5000유닛, 아트로핀 0.5 내지 1.0mg와, 그리고 설하에 니페디핀 10 내지 30mg이 주어졌다. 8F 가이드 카테테르는 우측 경동맥의 가까운 부분내로 배치되었다. 동맥은 평균 107±34초로(90-240초 범위) 특대의 풍선(6.0mm에서 10.5mm)과 함께 혈관을 확장함에 의해 손상되었다. 이 발명은 돼지가 순차적으로 받은 처치의 정보를 갖지 않았고 경험있는 발명적 심장학자(U.D.)에 의해 성취되었다. 손상에 의한 혈관개방은 헥사브릭스 또는 레노그래핀-76의 경동맥내 주입으로써 혈관조영술적으로 확인되었다.

첫번째 20마리 동물은 풍선손상에 의한 3개의 처치를 받기 위해 임의 추출되었다.

(a) PESDA (ODN-PESDA)에 결합된 c-myc에 포스포로티오에이트 ODN의 정맥내 주사(0.5밀리그램;)

(b) c-myc 단독(ODN 단독)에 정맥내 안티센스의 동일 복용량

(c) 주입 없음(대조군)

주입은 ODN 단독의 돼지와 ODN-PESDA에서 풍선손상에 의해 하루에 3번 반복된다. 모든 동물은 미세기포를 수용하기 위해 임의추출된 돼지에서 폐의 고혈압 반응을 억제하도록 케토롤락 60mg과 솔루멘데롤 40mg을 정맥내로 받았다.

마지막 8마리 돼지는 c-myc에 다른 ODN을 받았다(Morpholino, AVI Biopharma, Inc; Corvallis, Oregon). 이들 돼지에서 처음 4마리는 PESDA에 결합된 ODN을 받았고, 나머지 4마리는 ODN 단독(n=2) 또는 풍선손상에 의한 처치 없음( n=2)을 경험했다.

ODN-PESDA에 임의 추출된 이들 동물에서, 풍선확장후 즉시와 하루 3회 총 6분동안 각각 주입전과 후에 경피성 20㎐ 초음파탐침(Model XL202; Heat System; Framingdale, New York)은 고출력 50watts/㎠로 우측경동맥 위의 범위를 고주파발사했다. 탐침가열로 인한 피부자극을 피하기 위하여, 1.5 내지 2.0센티미터 커플링 겔은 역으로 잠근 12밀리리터 주사기를 사용하는 탐침 끝과 피부경계면 사이에 놓여졌다. 우측경동맥 자리잡음은 진단상의 변환기에 의해 확인되었다(HD13000; Advanced Technology Laborator; Bothell, Washington).

풍선손상에 따르는 30일간에의 측정: 풍선손상에 따르는 30일에 정맥내 초음파(IVUS) 측정은 돼지를 스캐닝하는 것에 앞서서 이루어졌다. 2.9 또는 3.1F 30㎒ IVUS 카테테르(CVIS; Sunnyvale, CA)는 말초의 경동맥내로 불소검사법하에서 진전되었고, 관측된 카테테르의 철수가 행해졌다. 루멘영역, 전체 혈관영역(루멘 더하기 구상화된 플라크), 그리고 혈관직경의 오프라인 면적측정법은 이전에 손상된 영역에서 가장 큰 플라크(Plaque)와 가장 작은 루멘의 부위에서 수행되었다. 그리고나서 돼지는 희생되었고 고정후에 경동맥의 일련의 단면들이 측정되었다. 최대의 내막두께의 부위는 디지탈 면적측정에 의해 측정되었다(NHI Image 1.61; Bethesda, Maryland). 혈관이 살포 고정을 경험하지 않았기 때문에 최대의 내막두께에 대한 값은 IVUS에 의해 측정된 풍선손상부위에서 혈관 직경으로 지수화되었다. IVUS와 해부학적 측량은 돼지가 받은 처치 섭생의 정보를 갖지 않은 검열자(W. H. and S. R, respectively)에 의해 이루어졌다.

통계 분석: 세 그룹에서의, 풍선손상부위에서의 전체혈관영역, 루멘영역, 루멘직경의 IVUS 측정에 있어서의 차이 및 최대 내막두께의 조직학적 측정은 분산분석( Student- Newmann- Keuls multiple comparison procedures)을 사용하여 비교된다. IVUS가 ODN을 단독으로 받는 세마리의 돼지에서 행해질 수 없기 때문에 ODN 단독과 대조군로부터의 데이터는 또한 조합되고 학생등의 t-테스트 또는 Mann- Whitney Rank Sum 테스트에 의한 ODN-PESDA와 비교되었다. IVUS 및 조직학적 측정에 있어서의 관찰자간의 변동은 동일 검염자가 다른시간에 측량을 반복하고, 측량들간의 퍼센티지 차이를 계산하게 함에 의해 산출되었다.

결과: 두마리 돼지가 풍선손상절차동안 죽었다. 5마리의 돼지에서(세마리 ODN-PESDA, 한마리 IV ODN 단독, 한마리 대조군), 손상에 의한 30일에서 손상이나 내막 이상형성의 조직학적 증거는 없었다. ODN-PESDA을 받은 8마리, 정맥내로 ODN 단독투여된 7마리, 아무것도 받지 않은 6마리, 즉 21마리의 돼지가 남았다. 이 돼지들은 20㎐ 초음파로 처치된 30일의 추적검사에서 더 길어지지 않은 응용된 초음파의 부위에서 표면상의 염증이 생겼다.

표 1은 세개의 그룹에서의 혈관내 초음파와 조직학적 데이터를 함유한다.

혈관내 초음파는 돼지의 16에서 가능했다.손상에 의한 30일에서 트롬보틱폐색때문에 ODN 단독을 받는 3마리의 돼지들과 기술적 이유로 ODN-PESDA과 ODN 단독이 주입된 각각 하나의 돼지들에서 수행될 수 없었다.

IVUS로 측량된 손상 부위의 전체 혈관영역과 루멘영역은 ODN-PESDA 그룹에서 현저히 커졌다. 이 커진 혈관 크기는 조직학적으로 같은 그룹에서 더 작은 최대내막두께에도 불구하고 현저하게 보여졌다. 최대내막두께의 조직학적 측량을 IVUS 혈관 직경에 지수화하였을때, 세 그룹간에 명백히 구별되는 상이함이 있었다(표 1).

초음파와 ODN-PESDA으로 처치한 돼지에 비교할때 대조군 돼지는 더 작은 혈관을 가졌으나 30일에서 더 큰 내막두께를 가졌다. 내부관측자 변수는 IVUS 측정에서 3%(n=12)였고 반복된 조직학적 측정에 대해 14%(n=25)였다.

경피 초음파로의 ODN-PESDA, ODN 단독 또는 무처치(대조군)를 받는 돼지들에서 경동맥의 풍선손상 30일후의 혈관내 초음파(IVUS)와 조직학적 결과

처치	MIT(mm)	MIT 지수	LA(㎟)	TVA(㎟)
ODN-PESDA	0.14±0.04^a	0.58±0.22^b	21±3^c	24±4^c
ODN단독	0.41±0.34	1.26±0.45	13±5	15±4
대조군	0.22±0.09	1.66±0.86	13±6	15±5
MIT=최대내막두께(조직학) MIT Index=혈관 직경에 지수화된 MIT LA= 루멘 영역 (IVUS); TVA=전체 혈관영역 (IVUS) ODN 단독에 비교하여^aP＜0.05 ODN 단독에 비교하여^bP=0.01 다른 모든그룹에 비교하여^cP＜0.05

Claims

특정 조직 부위에 생물학적 약물을 송달하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 다수의 단백질 캡슐화된 불용성기체-함유 미세기포의 수성 현탁액을 포함하며, 상기 생물학적 약물은 상기 단백질에 결합되어 있고, 상기 현탁액은 투여후에 상기 단백질이 미세기포-결합된 약물을 상기 특정 조직 부위로 향하게 하는 것을 특징으로 하는 조성물에 있어서, 상기 미세기포를 캡슐화하는 단백질은 알부민, 인간 감마 글로불린, 인간 아포트란스페린, 베타 락토오스 및 우레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 불용성 기체는 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 및 퍼플루오로펜탄으로 이루어지는 퍼플루오로카본으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 조직부위를 초음파에 노출함으로써 미세기포의 분산이 행해지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 미세기포의 현탁액은 실내공기 초음파처리에 의해서 얻어진 것보다 미세기포내에서의 증가된 산소 함유량 및 더욱 낮은 N₂ 부분압을 생성하는 조건하에서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물로서, 상기 '미세기포내에서의 증가된 산소함유량 및 더욱 낮은 N₂ 부분압을 생성하는 조건'은 초음파 처리 혼과 용액사이의 경계면으로 질소 고갈 (또는 질소가 없는) 기체를 도입함으로서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
동물에서 표적 부위로 생물학적 약물을 송달하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 다수의 단백질 캡슐화된 불용성기체-함유 미세기포의 수성 현탁액을 포함하고, 상기 생물학적 약물은 상기 단백질에 결합되어 있으며, 상기 현탁액이 투여된 후 표적부위에 초음파장이 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물에 있어서, 상기 미세기포를 캡슐화하는 단백질은 알부민, 인간 감마 글로불린, 인간 아포트란스페린, 베타 락토오스 및 우레아제로 이루어지는 군으로부터 선택되고, 상기 불용성 기체는 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 및 퍼플루오로펜탄으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 미세기포의 현탁액은 실내공기 초음파처리에 의해서 얻어진 것보다 미세기포내에서의 증가된 산소 함유량 및 더욱 낮은 N₂ 부분압을 생성하는 조건하에서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물로서 상기 '미세기포내에서의 증가된 산소함유량 및 더욱 낮은 N₂ 부분압을 생성하는 조건'은 초음파 처리 혼과 용액사이의 경계면으로 질소 고갈 (또는 질소가 없는) 기체를 도입함으로서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3항 또는 제 5항에 있어서, 상기 미세기포는 N₂가 없는 환경에서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 환경이 산소로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
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제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 약물이 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항원 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 프로브, 벡터, 바이러스 벡터 및 플라스미드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 미세기포는 (a) 인간 혈청 알부민 2중량% 내지 10중량%를 포함하는 알부민 수용액을 덱스트로스 5중량% 내지 50중량%를 포함하는 덱스트로스 수용액으로 2배 내지 8배 희석하는 단계,

(b) 상기 불용성 기체로 상기 용액을 교반하는 단계, 그리고

(c) 상기 용액안의 입자 부위에 공동화를 생성시키기 위하여 N₂-고갈 환경에서 초음파 혼(sonication horn)에 상기 용액을 노출시켜 지름이 0.1 내지 10미크로미터인 안정한 미세기포를 발생시키는 단계에 의해 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 12 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 N₂-고갈 환경은 산소로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
제 13 항에 있어서, 산소는 초음파 혼(sonication horn)과 용액사이의 계면으로 불어넣어지는 것을 특징으로 조성물.
혈관 외상을 앓는 동물에서 경동맥 협착 형성을 예방하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 조성물은 다수의 단백질 캡슐화된 불용성기체-함유 미세기포의 수성 현탁액을 포함하고, 상기 단백질은 평활근의 증식을 조정하는 조절효소를 암호화하는 유전자의 발현을 저해하는 올리고뉴클레오티드에 결합되어 있고, 상기 현탁액이 동물에 투여된 후 상기 동맥부위에 초음파장이 적용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 미세기포는 실내 공기 초음파처리에 의해서 얻어진 것보다 미세기포내에서의 증가된 산소 함유량 및 더욱 낮은 N₂ 부분압을 생성하는 조건하에서 형성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 15 항에 있어서, 상기 유전자는 c-myc 또는 c-myb 인 것을 특징으로 하는 조성물.
실내공기 초음파 처리된 미세기포보다 미세기포내에서의 증가된 산소 함유량 및 더욱 낮은 N₂ 부분압을 갖는, 단백질-캡슐화된 불용성기체 함유 미세기포의 수성 현탁액을 포함하는 미세기포 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 단백질에 결합된 생물학적 약물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 단백질이 알부민, 인간 감마 글로불린, 인간 아포트랜스페린, β-락토오스 및 우레아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 20 항에 있어서, 상기 단백질이 알부민인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 18 항에 있어서, 상기 불용성기체는 퍼플루오로카본인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 22 항에 있어서, 상기 기체가 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄, 퍼플루오로펜탄으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 19 항에 있어서, 상기 생물학적 약물은 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 조성물.
단백질-캡슐화된 불용성기체-함유 미세기포의 수성 현탁액을 포함하고, 상기 단백질에 올리고뉴클레오티드가 결합된 것을 특징으로 하는 미세기포 조성물.
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