JP2010095541A - 標的化部位特異的薬物送達組成物および使用方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、治療剤の送達のための薬学的組成物および方法に関する。本発明の方法および組成物は、治療物質の部位特異的送達を達成し得、特に必要な治療レベルでの標的化部位に到達する際の問題を提示したオリゴヌクレオチドのような薬剤のためのより低い用量および改善された効力を可能にする。超音波の標的化導入を用いて、治療剤の放出を促進し得る。送達系としては、N2枯渇またはN2を含まない環境下で形成されるタンパク質でカプセル化されたガス充填微小泡が挙げられる。これらの微小泡は、空気の存在下で超音波処理された微小泡よりも小さくかつ安定している。
【選択図】なし
Description
本発明は、生物活性物質の送達のための薬学的組成物および方法に関する。本発明の方法および組成物を使用して、生物学的に活性な物質の部位特異的送達を達成し得る。この特異性は、より低い薬物用量かつ改善された効力を可能にし、標的化された器官における治療濃度の達成の問題に代表的に悩まされるオリゴヌクレオチドのような薬剤について特により低い薬物用量かつ改善された効力を可能にする。
薬物送達技術は、薬物利用可能性を増大するために、薬物用量を減少させるために、および結果的に薬物が誘導する副作用を減少させるために薬物治療において用いられる。これらの技術は、身体中の薬物の放出を制御、調節、および標的するように働く。目下の薬物送達の目標は、より少ない頻度の薬物投与、全身性循環もしくは特定の標的器官部位における薬物の一定かつ継続した治療レベルの維持、望ましくない副作用の減少、ならびに所望の治療利益を実現するのに必要な量および用量濃度の減少を含んでいた。最終的には、所望の薬物の標的器官への送達を非侵襲的に標的とした方法が所望される。
1つの局面において、本発明は、生物学的薬剤を特定の組織部位へ送達するための方法を提供する。この方法は、(a)タンパク質でカプセル化され、不溶性ガスを含有する複数の微小泡(microbubble)の水性懸濁液を形成する工程であって、ここで、この生物学的薬剤が、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のN2分圧よりも低いこの微小泡内のN2分圧を生じる条件下で、そのタンパク質と結合体化される、工程;および(b)この懸濁液を動物に投与し、その結果このタンパク質が、タンパク質のバイオプロセシングの部位へとこの微小泡結合体化剤を指向し、そしてこの微小泡の消散の際、この生物学的薬剤を放出する工程、を包含する。好ましくは、この微小泡は、N2枯渇環境、およびより好ましくはN2を含まない環境(例えば、酸素)で形成される。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
(項目1)
生物学的薬剤を特定の組織部位に送達するための方法であって、以下:
(a)タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、該生物学的薬剤が、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のN 2 分圧よりも低い該微小泡内のN 2 分圧を生じる条件下で、該タンパク質に結合体化される、工程;ならびに、
(b)該懸濁液を動物に投与し、その結果該タンパク質が、該微小泡が結合体化した薬剤を該タンパク質のバイオプロセシング部位に指向させ、そして該微小泡の消散の際に該薬剤を放出する、工程、
を包含する、方法。
(項目2)
前記微小泡がN 2 枯渇環境で形成される、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記微小泡がN 2 を含まない環境で形成される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記環境が酸素からなる、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記タンパク質が、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目6)
前記タンパク質がアルブミンである、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記不溶性ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目8)
前記組織部位が前記動物の肝臓または腎臓である、項目1に記載の方法。
(項目9)
前記生物学的薬剤が、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボザイム、ナプロキセン、ピロキシカム、ワルファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソンおよびミコナゾールからなる群より選択される、項目1に記載の方法。
(項目10)
前記生物学的薬剤が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチジーンオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブ、ベクター、ウイルスベクター、およびプラスミドからなる群より選択されるポリヌクレオチドである、項目9に記載の方法。
(項目11)
生物学的薬剤を特定の組織部位へ送達するための方法であって、以下:
(a)タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、該生物学的薬剤が、該タンパク質に結合体化される、工程;
(b)該懸濁液を動物に投与する工程、および
(c)該組織部位を超音波に曝露する工程、
を包含する、方法。
(項目12)
前記微小泡が、空気中での超音波処理を介して得られる微小泡内のN 2 分圧よりも低い該微小泡内のN 2 分圧を生じる条件下で形成される、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記微小泡がN 2 枯渇環境で形成される、項目12に記載の方法。
(項目14)
前記微小泡がN 2 を含まない環境で形成される、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記微小泡が以下:
(a)5重量%〜50重量%のデキストロースを含むデキストロース水溶液を用いて、約2重量%〜約10重量%のヒト血清アルブミンを含むアルブミン水溶液を、約2倍〜約8倍に希釈する工程;
(b)該溶液を前記不溶性ガスで攪拌する工程;および
(c)N 2 枯渇環境において、該溶液を超音波処理ホーンに曝露し、該溶液中で微粒子部位に空洞を作製し、それによって直径約0.1〜10ミクロンの安定した微小泡を生成する工程、
によって形成される、項目1に記載の方法。
(項目16)
工程(b)における前記N 2 枯渇環境がN 2 を含まない、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記環境が酸素からなる、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記酸素が、前記超音波処理ホーンと前記溶液との間の界面に吹き込まれる、項目17に記載の方法。
(項目19)
超音波画像化に有用な微小泡組成物であって、タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する微小泡の水性懸濁液を含み、該微小泡内のN 2 分圧が、空気中で超音波処理された微小泡内のN 2 分圧よりも低い、微小泡組成物。
(項目20)
生物学的薬剤の標的部位への送達に有用な組成物であって、タンパク質でカプセル化され不溶性ガスを含有する微小泡と、該タンパク質に結合体化された生物学的薬剤とを含む水性懸濁液を含み、該微小泡内のN 2 分圧が、空気中で超音波処理された微小泡内のN 2 分圧よりも低い、組成物。
(項目21)
前記微小泡が実質的にN 2 を含まない、項目20に記載の組成物。
(項目22)
前記タンパク質が、アルブミン、ヒトγグロブリン、ヒトアポトランスフェリン、β−ラクトースおよびウレアーゼからなる群より選択される、項目20に記載の組成物。
(項目23)
前記タンパク質がアルブミンである、項目20に記載の組成物。
(項目24)
前記ガスがペルフルオロカーボンである、項目20に記載の組成物。
(項目25)
前記ガスが、ペルフルオロメタン、ペルフルオロエタン、ペルフルオロプロパン、ペルフルオロブタン、およびペルフルオロペンタンからなる群より選択される、項目24に記載の組成物。
(項目26)
前記生物学的薬剤が、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、リボザイム、ナプロキセン、ピロキシカム、ワルファリン、フロセミド、フェニルブタゾン、バルプロ酸、スルフイソキサゾール、セフトリアキソンおよびミコナゾールからなる群より選択される、項目20に記載の組成物。
(項目27)
前記生物学的薬剤がオリゴヌクレオチドである、項目26に記載の組成物。
(項目28)
前記微小泡が直径0.1〜10ミクロンである、項目20に記載の組成物。
(項目29)
血管の外傷を受けた動物における頸動脈狭窄形成を防ぐための方法であって、該方法は:
アルブミンでカプセル化され不溶性ガスを含有する複数の微小泡の水性懸濁液を形成する工程であって、ここで該微小泡を満たすガスがN 2 枯渇状態であり、該微小泡が、平滑筋の増殖を媒介する調節酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドに結合体化される、工程;
該懸濁液を該動物に投与する工程;および
該外傷部位を超音波に曝露する工程
を包含する、方法。
(項目30)
前記微小泡が実質的にN 2 を含まない、項目29に記載の方法。
(項目31)
前記遺伝子がc−mycである、項目29に記載の方法。
(項目32)
前記遺伝子がc−mybである、項目29に記載の方法。
これらおよび他の本発明の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を添付の図面とともに読むと、より完全に明らかになる。
(I.超音波の治療用途)
超音波画像化は、治療手順を補助するための診断ツールとして長く使用されている。これは、音波エネルギーが目的の領域に集束され得、そして反射して画像が生じるという原理に基づく。一般的に、超音波変換器は、画像化される領域の上に横たわる身体の表面上に配置され、そして音波を発生および受容することにより生じる超音波エネルギーが伝達される。超音波エネルギーは、変換器に対して後方へ反射され、ここで超音波エネルギーは超音波画像へと翻訳される。反射されたエネルギーの量および特徴は、組織の音響特性に依存する。好ましくは、エコー源性である造影剤を使用して、目的の領域における超音波エネルギーを生じ、そして受容される画像化を改善する。超音波造影心臓図検査計測器の考察については、DeJong、「Acoustic Properties of Ultrasound Contrast Agents」、Cip−Gegevens Koninklijke Bibliotheek、Denhag(1993)、120頁(以下参照)を参照のこと。
本発明の薬学的組成物は、血液不溶性ガスを含み、好ましくは0.1〜10ミクロンの直径を有する微小泡の液体懸濁物、好ましくは水性懸濁物を含む。この微小泡は、そのようなガスの微小泡を液体へ包括することによって形成される。この微小泡は、フッ化炭素または六フッ化硫黄ガスのような様々な血液不溶性ガスを含み得る。一般には、体温で非毒性でありかつガス状である任意の不溶性ガスが使用され得る。このガスはまた、この薬学的組成物が、微小泡を形成するように超音波処理される場合、約0.1ミクロンと10ミクロンとの間の平均サイズの直径を有する、安定な微小泡を形成しなければならない。この範囲の平均直径を有する微小泡は、経肺通過に適切であり、そして静脈内注射後および標的部位への移行の間に、微小泡内でガスの有意な拡散を防止するに十分安定である。
好ましい実施態様において、本発明の組成物は、市販のアルブミン(ヒト)、U.S.P.溶液(一般に、5重量%または20重量%の滅菌水溶液として供給される)、および市販のデキストロース(静脈内投与のためのU.S.P.)の混合物から処方される。最も好ましい実施態様において、この混合物は、ヒト血清アルブミンの2重量%〜10重量%の溶液の2倍から8倍の希釈物を、デキストロースの5重量%〜50重量%溶液とともに含む。
本発明に有用な治療用薬剤は、フィルム原性タンパク質と結合するそれらの能力を介して選択され、そして逆もまた同様である。例えば、このフィルム原性タンパク質がアルブミンである場合、この治療薬は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはリボザイムを含み得、これらの全てはアルブミンに結合し得、そしてそれ自体、微小泡との結合体を形成し得る。部位1(これは、本発明の組成物および方法においてインタクトなままであることが確認されている)でアルブミンに結合に結合する薬物の一覧表は、以下の通りである:
本発明の送達療法を実施するための好ましい方法において、本発明の薬学的液体薬剤は、静脈内注射、静脈内的(i.v.注入)、経皮的、または筋肉内的に、好ましくはこの薬剤の活性の標的部位付近で、哺乳動物宿主に導入される。治療部位は、特定の腫瘍の位置、特定の感染の位置、差次的な遺伝子活性化に起因して特定の遺伝子産物を発現する器官、損傷または血栓の部位、治療薬のさらなる進行および分布のための部位のような部位を含み得る。
本発明の実施態様に従って、タンパク質(例えば、アルブミン)でコートされた、不溶性(例えば、過フッ化炭素)ガスの微小泡は、オリゴヌクレオチドとの安定な結合体を形成することが示された(実施例4〜6を参照のこと)。ODN結合体化泡は、動物に導入され、それにより、このタンパク質コーティングは、結合体化薬剤を相互作用部位に指向させ得る。最終的には、泡散逸として、この薬剤は、組織部位で放出される。本発明者らは、超音波の適用が、タンパク質コーティングのバイオプロセシングの部位への生物製剤の標的化送達には必要ではないことを示した。このことは、実施例9に示され、ここでは、ODN結合体化微小泡は、肝臓および腎臓に指向され、そしてヘキソバルビタールの代謝を変更するに有効であった。このタンパク質は、微小泡および結合体を、プロセシング部位に通過させ、そして泡散逸として、オリゴヌクレオチドまたは他の生物製剤が放出されてその部位で相互作用し、生物学的薬剤の画分が、従来の投与と比較して、同じ生物学的効果を達成することを可能にする。
本発明の1つの実施態様において、診断用超音波フィールドは、注射されたボーラスが標的部位に到達するときに導入される。実施例8に実証されるように、PS−ODN標識した過フッ化炭素含有微小泡の診断用超音波への曝露は、PS−ODNの強度を変更しないが、そのアルブミン結合からはODNを放出する。
(A.背景)
何人かの研究者が、平滑筋細胞の移動および増殖の結果としての血管バルーン損傷後に新内膜(neointimal)過形成が生じることを示した(Austin,G.E.ら、「Intimal Proliferation of Smooth Muscle Cells as on Explanation for Recurrent Coronary Artery Stenosis After Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty」、J Am.Coll.Cardiol.6:369−75,1985;Libby,P.ら、「A Cascade Model for Restenosis:A Special Case of Atherosclerosis Progression」、Circulation 86:III47−III52,1992;Clowes,A.W.ら、「Regulation of Smooth Muscle Cell Growth in Injured Artery」、J.Cardiovasc.Pharmacol.14:S12−S15,1989)。この新内膜形成は、バルーン損傷および血管内ステント挿入(stenting)の両方の後の再狭窄の血管造影観察において、役割を果たす(Mintz,G.S.ら、「Intravascular Ultrasound Insights into Mechanisms of Stenosis Formation And Restenosis」、Cardiol.−Clin.15:1:17−29,1997)。血管平滑筋の増殖を担うプロトオンコジーンの合成を阻害する合成アンチセンスオリゴヌクレオチド(ODN)は、冠状動静脈または頸動脈の損傷後の狭窄形成を首尾良く阻害した(Shi,Y.ら、「Transcatheter Delivery of C−Myc Antisense Oligomers Reduces Neointimal Formation in a Porcine Model of Coronary Artery Balloon Injury」、Circulation 90:944−51,1994;Morishita,R.ら、「Intimal Hyperplasia After Vascular Injury is Inhibited by Antisense CDK2 Kinase Oligonucleotides」、J.Clin.Invest.93:1458−64,1994)。この時点まで、このような処置は、血管内または外膜周囲(periadventitial)への直接送達を必要とした。本発明者らは、ODN(詳細には、c−mycおよびc−mybへ)が過フッ化炭素を曝露されて超音波処理されたデキストロース/アルブミン(PESDA)微小泡に結合することを実証した(Porter,T.R.ら、「Interaction of Diagnostic Ultrasound with Synthetic Oligonucleotide−Labeled Perfluorocarbon−Exposed Sonicated Dextrose Microbubbles」、J.Ultrasound.Med.15:577−584,1996)。続く研究は、経皮的低周波数超音波は、音波を作り出さない(insonification)フィールド内に含まれる血管へのODNの堆積を増加させることを示した(Porter,T.R.ら、「The Effect of Microbubble Gas Composition and External Ultrasound Frequency on the Non−Invasive Enhancement of Antisense Oligonucleotide Delivery to the Vascular Wall in Pigs」、Circulation Suppl.2249,1997)。実施例14に記載される研究は、低周波数の超音波およびPESDA微小泡に結合したc−mycに静脈内注射されたODNに伴うこの増強された血管堆積は、頸動脈のバルーン損傷後の新内膜形成を阻害し得るか否かを決定するために行われた。
実施例14は、本明細書中に記載される経皮的超音波および静脈内微小泡送達系(c−mycプロトオンコジーンに対するアンチセンスを含む)を使用するブタにおける頸動脈新内膜形成の阻害を記載する。右頸動脈にわたる領域は、バルーン拡張直後および3日後の両方に、合計6分間、各注射の前後に音波を作り出さなかった。実施例に実証されるように、PESDA微小泡に結合した、静脈投与されたODNの超音波標的化堆積は、内膜過形成を阻害すること、ならびに管腔直径に対して有意に小さな内膜厚の比を作製することにより、狭窄形成を阻害した。
Migration」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:654−58,1993)。ODNが血管サイズを変更し得る別の機構は、エンドセリン−1の産生(強力な血管収縮薬およびマイトジェン物質)を刺激するc−mycの能力を阻害することによる(Shichiri.M.ら、「Biphasic Regulation of the Preproendothelin−1 Gene by c−myc」、Endocrinology
138(11):4584−90、1997)。
Enhances Gene Expression of Liposomal Transfection」、Invest.Radiol.32:723−27、1997)。超音波の存在下でのこの増強された細胞取り込みの機構は、細胞膜の空洞化誘導性二重層障害であると仮定されている(Mitragotri,S.ら、「Transdermal Drug Delivery Using Low−Frequency Sonophoresis」、Pharmaceutical Research 13:411−20、1996)。それゆえ、微小泡は、この空洞化の閾値をより低くするその能力のために、他のキャリア系を超える固有の利点を有し得る(Holland,C.K.ら、「Thresholds for Transient Cavitation Produced by Pulsed Ultrasound in a Controlled Nuclei Environment」、J.Acoust.Soc.Am.88:2059−69,1990)。空洞化がODNの増強された取り込みのための機構である場合、微小泡の存在およびこの研究で使用されるより低周波数の超音波(20kHz)の両方は、改善された取り込みを有し得る。
アルブミン殻を含む微小泡は、それらの膜を通過する可溶性ガスの迅速な拡散を可能にする。過フッ化炭素含有微小泡は、より高分子量のガスの拡散の低速度および血中におけるその不溶性に起因して、同じ膜を有する空気含有微小泡よりも長く残存する。
この改変は、実質的により小さな微小泡を作ることが見出された。この微小泡は、血流中でより安定であり、コントラストおよび薬物送達の改善を生じた。このような効果は、実施例11において記載される非開胸研究において一貫して観察され、空気の存在下で超音波処理されたPCMBよりもより大きな心筋のコントラストを生じた。100ミリ秒までの短いパルス間隔を使用する間欠性の画像化(10ヘルツ画像化)を用いてでさえ、視覚的に明白な心筋のコントラストは、N2を含まない環境中で超音波処理した微小泡を用いてもなお達成された。
以下の実施例は、例示目的のみのためであって、いかなる場合においても本発明を限定することを意図しない。多数の他のタンパク質生物活性薬剤の組合せが本発明において使用され得、そして本明細書中で意図されることが当業者によって理解される。例えば、フィルモーゲンタンパク質(filmogenic protein)が、α1酸 糖タンパク質である場合、生物活性薬剤は、リドカイン、インデラル、またはヘパリンであり得る。
鎖伸長合成を、ABI Model391 DNAシンセサイザー(Perkin Elmer,Foster City,CA)の1μmolカラム支持体上で実行するか、または、これは、Lynx Therapeutics,Inc.(Hayward CA)によって提供された。1μmol合成は、ABIユーザーブレティン58により、シアノエチルホスホルアミダイトおよび二硫化テトラエチルチウラムを用いるイオウ処理を使用した。放射性標識されたオリゴヌクレオチドを、Glen Research(Bethesda,MD)による亜リン酸水素原料として合成した。
5%ヒト血清アルブミンおよび5%デキストロースを、商業的な供給源より入手した。5%デキストロース溶液の3部および5%ヒト血清アルブミン溶液の1部(総計16ml)を、35ml Monojet(登録商標)シリンジに引き上げた。各々のデキストロース/アルブミンサンプルを、デカフルオロブタンまたは空気のいずれかの8±2mlで、手で攪拌し、次いで、そのサンプルを20キロヘルツでの80±5秒間の電気機械的超音波処理に曝した。この様式によって作製された4つの連続した、過フルオロカーボンに曝され超音波処理したデキストロース/アルブミン(PESDA)微小泡のサンプルの平均サイズは、血球計数によって測定されるように、4.6±0.4ミクロンであった。そして平均濃度は、Coulter計数器によって測定されるように、1.4×109泡/mLであった。
配列5’−TAT GCT GTG CCG GGG TCT TCG GGC3’(c−mybに相補的な24mer)(配列番号2)および5’TTAGGG(配列番号3)を有する、均一に35S標識されたPS−ODN(ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド)を、過フルオロカーボンに曝された、超音波処理したデキストロース/アルブミン(PESDA)微小泡サンプル溶液と、0.5mlの最終容量中で、37℃で30分間インキュベートした。その溶液を、微小泡が上端に生じ得るように立てた;次いで、サンプルを、底の清澄な溶液または微小泡を含む上端層のいずれかから、取り除き得た。
洗浄した微小泡を作製するために、実施例1において調製したような微小泡の溶液を、5%デキストロースの1000倍過剰容量で洗浄して、微小泡と結合していないアルブミンを除去した。微小泡を4時間発生させた。次いで、低位の溶液を除去し、洗浄した泡を残し、次いで0.9%塩化ナトリウムと共に混合した。洗浄した微小泡中のアルブミンタンパク質濃度は、Bradfordアッセイ(Bradford,M.ら、「A Rapid and Sensitive Method for the Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein−Dye Binding」、Anal.Biochem.72:248,1976)によって決定されるように、0.28±0.04mg/mlであった。
実施例4の洗浄した微小泡に対するPS−ODNの接合親和性を評価するために、結合部位に対する競合リガンドとして過剰の非放射性PS−ODNの増加した量を含む混合物を調製した。配列5’−d(CCC TGC TCC CCC CTG GCT CC)−3’(配列番号4)を有する非放射性のPS−ODN 20merを、一連の増加する濃度(0、3.3、10、32.7、94.5、167、および626μM)の放射性24merを含むチューブに添加した。各々の泡の懸濁物を、反転することによって混合し、そして37℃で60分間インキュベートした。
サンプルの3つのグループを以下のように三連で調製し、そして各々のサンプルを室温で20分間インキュベートした。
グループB:100μlの微小泡/900μLの生理食塩水+2μLのFITC標識20mer(最終20mer濃度=151nM)
グループC:100μlの微小泡/800μLの生理食塩水+2μLのFITC標識20mer+100μLの非標識20mer。
空気を含む超音波処理されたデキストロース/アルブミン微小泡へのPS−ODNの結合の均一性対過フルオロカーボンを含む超音波処理されたデキストロース/アルブミン微小泡へのPS−ODNの結合の均一性を、フローサイトメトリーによって測定した。洗浄したPESDA微小泡に対するPS−ODNのガウス分布(データは示さず)は、これらの微小泡のアルブミンが、オリゴヌクレオチドについてのその結合部位を保持したことを示した。洗浄したRA−SDA微小泡についてのガウス分布の非存在は、これらの微小泡の超音波処理の間に、このオリゴヌクレオチドについてのアルブミン結合部位1の損失が生じたことを示した。(アルブミン結合特性、特にそれらがオリゴヌクレオチドに関する場合については、Kumarら、「Characterization of Binding Sites,Extent of Binding,and Drug Interactions of Oligonucleotides with Albumin」Antisense Res.Dev.5:131−139(1995)を参照のこと)。
以前に記載されたもの(Mor−Avi,V.ら、「Stability of Albunex(登録商標) Microspheres under Ultrasonic Irradiation;an in vitro Study」J.Am.Soc.Echocardiology 7:S29,1994)と同様の、可変流ミクロスフェアスキャニングチャンバーを使用した。このシステムは、Masterflex(登録商標)フローシステム(Microgon,Inc.,Laguna Hills,CA)に連結された環状のスキャニングチャンバーを含む。このスキャニングチャンバーは、各側を水で満たしたチャンバーで囲まれ、そして各側で音響学的に透明な物質で束縛されている。PS−ODN標識されたPESDA微小泡(0.1ml)を、スキャニングチャンバーに対して近位にボーラスとして1秒間にわたって注入し、次いで、水道水を満たしたスキャニングチャンバーに、100ml/分の制御された流速でプラスチックチュービングを通して流した。泡がスキャニングチャンバーを通過したときに、スキャナー(2.0MHz周波数、1.2MPaピーク陰圧)を、従来的な30ヘルツフレームレートで超音波を送達するために設定した。超音波が送達されないコントロールランもまた行った。
超音波に対する曝露後の頂部の層において微小泡の有意な損失が存在する(超音波なしで219±54微小泡に対し、診断的な超音波に曝露した場合、溶出液の上部の層において53±21微小泡)。この微小泡計数の損失は、上部の泡含有層における初期PS−ODN濃度に関わらず明白であった。泡を含まないより低い層におけるPS−ODN濃度は、ゲル電気泳動によって測定され、有意に増加した。このデータは、診断的超音波に対するPS−ODN標識PESDA微小泡の曝露がPS−ODNの完全性を変化させないが、そのアルブミン結合から遊離させることを示す。
チトクロームP450 IIB1遺伝子配列に対するアンチセンスホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを設計し、ヘキソバルビタールの代謝を変化させた(PBはCYP IIB1 mRNAを刺激し、そして結果として、ヘキソバルビタール(これはCYP IIB1によって水酸化される)は、より迅速に代謝され、そしてその鎮静的効果が減少する。このアンチセンスオリゴは、この効果と反作用することが期待される)。
動脈血を、4匹のイヌおよび3匹の健常なブタから、屠殺する直前に空気吸入条件下で採取した。動物のうちの4匹において、さらなる動脈血を、動物が100%酸素を最低10分間にわたって吸入した後に得た。この血液を、60mlヘパリン処理注射器に収集し、そしてスキャニングチャンバ中に注射するまで温水浴中で37℃にて保持した。スキャニングチャンバ中への血液の注射の直前に、0.2mlのペルフルオロカーボン含有微小泡(PCMB)を、止め栓を通して60ml注射器中の血液に注射し、そしてこの注射器を手で穏やかに反転および回転させることによって混合した。
Packard Co.,Andover,MA)によって測定し、全ての試行を通じて平均7±3mmHgであった。
ペルフルオロカーボン含有微小泡(PCMB)を、実施例1に記載の通りに調製した。1部の5%ヒト血清アルブミンおよび3部の5%デキストロース(計16ml)を、8mlのデカフルオロブタンを用いて手動で攪拌した。攪拌後、サンプルに、電気機械的超音波処理を80±2秒間行った。80秒間の超音波処理プロセスを、2つの異なる環境で行った:空気(RA)または100%酸素(N2を含まない環境)のいずれかを、超音波処理ホーンとペルフルオロカーボンデキストロース/アルブミン溶液との間の界面に超音波処理の間に吹き込んだ。
PS−ODN結合体化微小泡の腎臓取り込みに対する超音波処理の効果のインビボでの研究を、3匹のイヌにおいて行った。蛍光標識したPS−ODN PESDA微小泡(0.2ml)の静脈内注射を、大腿静脈において与えた。同時に、左腎臓を、外部に配置した2.0MHz〜2.5MHzの診断超音波変換器(ピークの負の圧力は1.1MPa)によってインソニファイ(insonify)した。この腎臓を、注射後、およびこの腎臓における視覚的に明らかなコントラスト出現の間、最低2分間にわたって30Hzフレームレートを用いてインソニファイした。各イヌでは、左心室動脈圧および肺動脈圧を、左心室および胚動脈にそれぞれ配置した生理食塩水を充填したカテーテルを用いた腎臓注射の前および後でモニタリングした。注射の約4時間後、このイヌを屠殺し、そして両方の腎臓を取り出した。切断切片を、腎皮質から得て、そしてPS−ODNについてのサンプルとし、上記の遺伝子スキャニング方法(実施例8)を用いて計数した。組織学的切片をまた、糸球体およびネフロンにおいて、蛍光の分析のために得た。
静脈内ヘパリンを、3つの異なる設定で、1500単位のボーラス用量でイヌ被験体に投与した。設定1では、ヘパリンを、遊離の薬物として与えた。設定2では、1500単位のヘパリンを、オロソムコイドPESDAに結合させて与えたが、超音波は血液プールに適用しなかった。設定3では、オロソムコイドPESDAに結合させた同じ用量のヘパリン(1500単位)を与え、そして超音波を血液プールに適用した。活性化部分トロンボプラスチン時間(PTT)のベースライン測定を測定し、次いで各注射後に5分間の間隔で、最低15分間にわたって繰り返した。
全ての手順は、Institutional Animal Care and Use Committeeによって承認され、そしてPosition of the American Heart Association on Research Animal Useに従った。28匹の家畜ブタに、アスピリン(325mg PO)を前投薬した。次いで、ケタミン(20mg/kg)、キシラジン(4mg/kg)および補助的なペントバルビタールを用いて全身麻酔を投与した。このブタに挿管し、そして呼吸器の呼吸空気に置いた。Swan Ganzカテーテルを、肺動脈中へ前進させて肺の圧力をモニタリングした。静脈内ヘパリン(4,000〜5,000単位)、アトロピン(0.5〜1.0mg)、および舌下ニフェジピン(10〜30mg)を与えた。8Fガイドカテーテルを、右頚動脈の近位部分に配置した。大きすぎるバルーン(6.0mm〜10.5mm)で血管を平均107±34秒間(90〜240秒間の範囲)拡張することによってこの動脈を傷付けた。この介入を、ブタがその後どの処置を受けるかを知らない実験的介入心臓病専門医(U.D.)によって行った。損傷後の血管開存性を、HexabrixまたはRenographin−76の頚動脈内注射を用いる血管造影によって確認した。
(a)PESDAに結合したc−mycに対する静脈内ホスホロチオエートODN(0.5ミリグラム;Lynx Therapeutics;Hayward,California)(ODN−PESDA);
(b)c−myc単独に対する同じ用量の静脈内アンチセンス(ODN単独);または
(c)注射なし(コントロール)。
Claims (1)
- 本明細書中に記載の方法。
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