KR20080082893A

KR20080082893A - 면역 질환의 예방 또는 치료제 및 방법

Info

Publication number: KR20080082893A
Application number: KR1020077021021A
Authority: KR
Inventors: 야스유끼 이시이; 리사 노자와; 유끼꼬 마쯔이
Original assignee: 도꾸리쯔교세이호징 리가가쿠 겐큐소
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2008-09-12
Also published as: AU2007205489A1; US20120121688A1; JPWO2007080977A1; CA2601803A1; EP1974750A4; WO2007080977A1; CN101309705A; JP5191234B2; EP1974750A1

Abstract

본 발명은 NKT 세포의 다채로운 기능 중에서 선택적으로 면역 억제 기능을 증강시키는 방법, 및 생체내에서 항원 특이적 면역 억제를 양호한 효율로 유도하는 방법, 및 이들을 응용한 의약을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 CD1d 리간드 및 표적 항원(예를 들면, 알레르겐, 자기 항원)을 포함하는 의약(예를 들면, 알레르기 질환, 자기 면역 질환 등의 면역 질환의 예방ㆍ치료제)을 제공한다. 바람직하게는, 본 의약은 CD1d 리간드 및 표적 항원을 포함하며, 내강을 갖는 약물 송달 매체를 함유하여 이루어진다.

NKT 세포, CD1d 리간드, 표적 항원, 자기 면역

Description

면역 질환의 예방 또는 치료제 및 방법{PREVENTIVE OR THERAPEUTIC AGENT AND METHOD FOR IMMUNE DISEASE}

본 발명은 알레르기 질환 또는 자기 면역 질환 등의 면역 질환의 예방 내지 치료제, 면역 질환의 예방 내지 치료 방법, 삼나무 화분 항원 융합 단백질 등에 관한 것이다.

면역 응답의 이상을 원인으로 하는, 자기 면역 질환, 알레르기 질환을 비롯한 면역 질환에 대한 현행 치료의 대부분은 대증(對症) 요법이기 때문에, 이러한 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 면역 제어 기구를 이용한 방법에 대한 개발이 갈망되었다. 면역 제어 기구에 관련되는 주요한 세포 집단으로서는, NKT 세포, 면역 관용 유도성 수상 세포, 제어성 T 세포 등이 이미 보고되어 있다. 따라서, 면역 질환을 근본적으로 치료할 수 있는 방법으로서는, 이들 면역 세포를 통한 면역 제어 기구를 이용하는 방법을 생각할 수 있다.

면역 질환의 치료에 관련될 수 있는 면역 제어 기구를 이용하는 방법으로서는, 지금까지 이하의 보고가 있다.

특허 문헌 1에는 α-GalCer(α-갈락토실 세라미드)를 포함하는 리포솜 내강(內腔)에 OVA(난백 알부민) 단백질을 봉입하는 방법과 상기 리포솜에 의한 마우스 의 항체 생산 억제 작용이 기재되어 있다.

비특허 문헌 1에는 마우스 골수 세포를 IL-10 존재하에 시험관내에서 배양하는 경우 CD45RB^highCD11c^low 세포가 증식하는 것, 또한 비장 중에는 CD45RB^highCD11c^low 세포가 존재하고 시험관내와 생체내(마우스)에서 나이브 CD4⁺T 세포로부터 제어성 T 세포를 분화ㆍ증식시킬 수 있는 것이 기재되어 있다.

비특허 문헌 2에는 마우스 골수 세포로부터 제어성 수상 세포를 인공적으로 제조하는 방법이 기재되어 있다.

비특허 문헌 3에는, 마우스 비장 중의 저비중 B220 양성 B 세포가 박테리아 자극으로 IL-10을 생산하는 능력이 있는 것이 기재되어 있다.

비특허 문헌 4에는, α-GalCer을 투여한 마우스 비장 중의 저비중 B 세포는 NKT 세포의 IL-4 생산능을 높일 수 없는 것과, DC에서 활성화되는 NKT 세포의 IFN-γ와 IL-4 생산 기능을 억제하는 것이 기재되어 있다.

그러나, NKT 세포의 다채로운 기능 중에서 선택적으로 면역 억제 기능을 증강시키는 방법, 및 생체내에서 항원 특이적 면역 억제를 효율적으로 유도하는 방법은 아직 개발되지 않았다.

특허 문헌 1: 국제 공개 WO2005/120574호 공보

비특허 문헌 1: Wakkach et al., Immunity 18: 605-617(2003)

비특허 문헌 2: Sato et al., Immunity 18: 367-379(2003)

비특허 문헌 3: Burke et al., The Journal of Immunology 173: 2362- 2372(2004)

비특허 문헌 4: Bezbradica et al., The Journal of Immunology 174: 4696-4705(2005)

<발명의 개시>

<발명이 해결하고자 하는 과제>

따라서, 본 발명의 목적은 NKT 세포의 다채로운 기능 중에서 선택적으로 면역 억제 기능을 증강시키는 방법, 및 생체내에서 항원 특이적 면역 억제를 효율적으로 유도하는 방법, 및 이들을 응용한 의약을 제공하는 것이다.

<과제를 해결하기 위한 수단>

본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, CD1d 리간드 및 천연 또는 재조합 알레르겐을 포함하는 약물 송달 매체가 상기 알레르겐에서 기인하는 IgE 생산을 특이적으로 억제하는 것으로부터, 상기 알레르겐에서 기인하는 알레르기 질환이 이러한 약물 송달 매체에 의해 특이적으로 치료될 수 있는 것을 발견하고, 또한 이러한 발견으로부터 알레르겐 대신에 자기 항원을 포함하는 약물 송달 매체를 이용함으로써, 상기 자기 항원에서 기인하는 자기 면역 질환에 대해서도 동일하게 특이적으로 치료할 수 있는 것을 착상하여, 이로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명 등을 제공한다:

[1] CD1d 리간드 및 표적 항원을 포함하며, 내강을 갖는 약물 송달 매체를 함유하여 이루어지는, 상기 표적 항원에서 기인하는 면역 질환의 예방 또는 치료제.

[2] 상기 [1]에 있어서, 표적 항원이 알레르겐이고, 면역 질환이 상기 알레르겐에서 기인하는 알레르기 질환인 제제.

[3] 상기 [1]에 있어서, 약물 송달 매체가 리포솜인 제제.

[4] 상기 [1]에 있어서, CD1d 리간드가 α-GalCer인 제제.

[5] 상기 [2]에 있어서, 알레르겐이 삼나무 화분 항원인 제제.

[6] 상기 [2]에 있어서, 알레르겐이 Cryj1 성숙 단백질 및 Cryj2 성숙 단백질의 융합 단백질인 제제.

[7] 상기 [5]에 있어서, 융합 단백질에서 Cryj1 성숙 단백질이 Cryj2 성숙 단백질보다 N 말단측에 존재하는 제제.

[8] 상기 [2]에 있어서, CD1d 리간드가 리포솜 막내에 매입되고, 알레르겐이 리포솜 내강에 봉입되어 있는 제제.

[9] 상기 [1]에 있어서, 표적 항원이 자기 항원인 제제.

[10] 삼나무 화분 항원 Cryj1 단백질과 Cryj2 단백질을 포함하는 융합 단백질.

[11] 상기 [10]에 있어서, 상기 Cryj1 단백질이 Cryj1 성숙 단백질이고, Cryj2 단백질이 Cryj2 성숙 단백질인 융합 단백질.

[12] 상기 [10]에 있어서, Cryj1 단백질과 Cryj2 단백질이 직접 또는 펩티드 링커를 통해 연결되어 있는 융합 단백질.

[13] 상기 [10]에 있어서, Cryj1 단백질이 N 말단측에, Cryj2 성숙 단백질이 C 말단측에 존재하는 융합 단백질.

[14] 상기 [1] 내지 [9] 중 어느 한 항에 기재된 면역 질환의 예방 또는 치료제의 약학적 유효량을 그의 치료를 필요로 하는 피검체에 투여하는 공정을 포함하는, 면역 질환의 예방 또는 치료 방법.

[15] 상기 [14]에 있어서, 상기 피검체가 인간 면역 질환 환자인 면역 질환의 예방 또는 치료 방법.

도 1은 α-GalCer 또는 αGC(α-GalCer)-리포솜 투여 마우스 비장 유래의 수상 세포(DC) 및 B 세포에 있어서의 IFN-γ, IL-4, IL-10 생산을 나타내는 도면이다. ("ND": 검출되지 않음)

도 2A는 플로우 사이토미터에 의한 저밀도(LD)-B 세포 및 고밀도(HD)-B 세포의 해석을 나타내는 도면이다.

도 2B는 저밀도(LD)-B 세포 또는 고밀도(HD)-B 세포와, 전체 비장 세포와의 공배양에 의해 배양 배지에 분비된 IL-10의 양을 나타내는 도면이다.

도 3은 αGC 리포솜을 펄스시킨 변연대(邊緣帶) B 세포에 의한 IL-10 생산을 나타내는 도면이다. ("ND": 검출되지 않음)

도 4는 천연형 Cryj1 감작 마우스에 있어서, αGC-천연형 Cryj1-리포솜, αGC-리포솜 또는 리포솜 단체가 투여된 혈중 항 Cryj1 특이적 IgE 농도를 나타내는 도면이다.

도 5는 Cryj1/2 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열 8)을 나타내는 도면이다. 서열 8로 표시되는 뉴클레오티드 서열 중, 1 내지 57번째의 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 뉴클레오티드 서열(하선을 그음)은 pET47b 백터 유래 His 태그 영역의 뉴클레오티드 서열이고, 58 내지 1119번째의 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 Cryj1 성숙 단백질의 아미노산 서열(유전자 은행 등록 번호 BAA07020으로서 등록되어 있는 아미노산 서열 중, 21 내지 374번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열: 서열 10)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이고, 1120 내지 2283번째의 뉴클레오티드 잔기로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 Cryj2 성숙 단백질의 아미노산 서열(유전자 은행 등록 번호 P43212로서 등록되어 있는 아미노산 서열 중, 46 내지 433번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열: 서열 11)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다.

도 6은 Cryj1/2 단백질의 아미노산 서열(서열 9)을 나타내는 도면이다. 서열 9로 표시되는 아미노산 서열 중, 1 내지 19번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열(하선을 그음)은, pET47b 백터 유래 His 태그 영역의 아미노산 서열이고, 20 내지 373번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 Cryj1 성숙 단백질의 아미노산 서열예(유전자 은행 등록 번호 BAA07020으로서 등록되어 있는 아미노산 서열 중, 21 내지 374번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열예: 서열 10)이고, 374 내지 761번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 Cryj2 성숙 단백질의 아미노산 서열예(유전자 은행 등록 번호 P43212로서 등록되어 있는 아미노산 서열 중, 46 내지 433번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열예: 서열 11)이다.

도 7은 천연형 Cryj1 또는 recCryj1/2 단백질로 면역시킨 마우스 혈청 중의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가를 나타내는 도면이다. (* 검출 한계 이하)

도 8은 천연형 Cryj1 또는 recCryj1/2 단백질로 면역시킨 마우스 혈청 중의 recCryj1/2 특이적 IgE 항체가를 나타내는 도면이다.

도 9는 천연형 Cryj1 또는 recCryj1/2 단백질로 면역시킨 마우스 혈청 중의 천연형 Cryj1 특이적 IgG 항체가를 나타내는 도면이다.

도 10은 천연형 Cryj1 면역 마우스 혈청 중의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가의 상승을 recCryj1/2 단백질에 의해 억제하는 것을 나타내는 도면이다.

도 11은 천연형 Cryj1 감작 마우스에 있어서, αGC-재조합 Cryj1/2 융합 단백질-리포솜, αGC-리포솜 또는 생리 식염수가 투여된 혈중 항 Cryj1 IgE 농도를 나타내는 도면이다.

<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>

하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명은 CD1d 리간드 및 표적 항원을 포함하며, 내강을 갖는 약물 송달 매체(이하, 필요에 따라서 약물 송달 매체, 내강을 갖는 약물 송달 매체, CD1d 리간드를 포함하는 약물 송달 매체, 또는 표적 항원을 포함하는 약물 송달 매체 등이라고 약칭함)를 함유하여 이루어지는 면역 질환의 예방 또는 치료제를 제공한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 약물 송달 매체로서는, 동물에 대하여 약물 송달을 가능하게 하면서 내강을 갖는 것인 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 리포솜, 마이크로스페어를 들 수 있다.

리포솜이란, 마이셀(친수성 영역과 소수성 영역을 포함하는 양친매성 분자의 응집에 의해서 얻어지는 수용성 입자)이 폐쇄된 소포 구조를 말한다. 본 발명의 의약이 약물 송달 매체로서 리포솜을 포함하는 경우, CD1d 리간드가 리포솜 막내에 매입될 수 있으면서, 또한 알레르겐이 리포솜 내강에 봉입될 수 있다. 약물 송달 매체로서 리포솜이 이용되는 경우, 이러한 리포솜은 국제 공개 WO2005/120574호 공보에 기재된 방법에 의해 제조할 수 있다. 상세하게는 α-GalCer 등의 CD1d 리간드를 포함하는 리포솜은 PCT/JP2005/10254에 기재된 것과 같은 통상법에 따라서, 리포솜을 구성하는 지질과 CD1d 리간드를 포함하는 유기 용매 용액을 혼합 후에 건조시키고, 여기에 물을 첨가하여 초음파 처리함으로써 얻을 수 있다. 또한, 표적 항원을 봉입한 리포솜은, 리포솜을 구성하는 지질과 CD1d 리간드를 포함하는 유기 용매 용액을 혼합 후에 건조시키고, 여기에 표적 항원의 수용액을 첨가하여 초음파 처리함으로써 얻을 수 있다.

마이크로스페어란, 기제로서 생체내에서 분해되는 중합체를 사용한 미소 구형 물질을 말한다. 마이크로스페어로서는, 예를 들면 다공형 마이크로스페어, 캡슐형 마이크로스페어를 들 수 있다.

CD1d 리간드란, CD1d 발현 항원 제시 세포(APC) 상에 제시되고, 이로써 NKT 세포를 활성화할 수 있는 물질을 말한다. CD1d 리간드로서는, 예를 들면 α-GalCer 및 그의 유연체, 및 생체내에 존재하는 IGb3(이소글로보-글리코스핀고리피드)을 들 수 있지만, α-GalCer이 보다 바람직하다.

표적 항원은 생체에 있어서 상기 항원에 대한 면역 응답의 억제를 목적하는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 표적 항원은 천연체, 재조합 단백질, 화학 합성물일 수도 있고, 예를 들면 알레르겐, 자기 항원, 이식편 알로 항원을 들 수 있다. 이하, 본 발명의 의약을 알레르기성 질환 및 자기 면역 질환 등에 적용하는 경우에 대하여 상세하게 설명한다.

(알레르기성 질환에 대한 적용)

알레르겐은 생체가 노출되거나, 생체가 섭취하거나, 또는 생체에 적용되고, 알레르기의 원인이 될 수 있는 인자인 한 특별히 한정되지 않는다. 이러한 알레르겐으로서는, 예를 들면 화분(예, 삼나무, 노송나무, 돼지풀, 벼, 자작나무, 오리새, 쑥국화), 식품(예, 우유, 메밀 국수, 알, 땅콩, 밀, 대두, 어폐류, 과일 또는 이들의 가공품), 인간 이외의 생물 또는 그의 유래물(예, 진드기, 곰팡이, 동물ㆍ조류의 체모, 벌독), 약물(예, 페니실린계 항생 물질, 술파제, 바르비투르산 유도체), 의료용품(예, 천연 고무 장갑), 생활용품(예, 장식 용구의 금속), 그 밖의 물질 또는 조성물(예, 라텍스) 등에 포함되는, 알레르기의 원인이 될 수 있는 인자를 들 수 있다.

본 발명의 의약은 표적 항원으로서 알레르겐을 포함하는 약물 송달 매체를 포함하는 경우, 상기 알레르겐에서 기인하는 알레르기 질환의 특이적 치료제로서 유용하다. 본 발명자들은 CD1d 리간드 및 알레르겐을 포함하는 약물 송달 매체가 상기 알레르겐에서 기인하는 IgE 생산을 특이적으로 억제하기 때문에, 상기 알레르겐에서 기인하는 알레르기 질환이 이러한 약물 송달 매체에 의해 특이적으로 치료될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 의약에 의해 특이적으로 치료될 수 있는 알레르기 질환으로서는, 예를 들면 아토피형 기관지 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염(예, 화분증), 알레르기성 결막염, 음식물 알레르기, 약물 알레르기를 들 수 있다.

알레르겐으로서 바람직한 예는, 삼나무 화분 항원(예, Cryj1, Cryj2 등의 단백질)일 수 있다. 알레르겐으로서는 또한 삼나무 화분 항원의 재조합 융합 단백질도 또한 바람직하다. 이러한 융합 단백질로서는, 예를 들면 Cryj1 단백질 및 Cryj2 단백질의 융합 단백질(이하, 필요에 따라서 「융합 단백질」이라 약칭함)을 들 수 있다.

Cryj1 성숙 단백질은 Cryj1 유전자로부터 발현된 폴리펩티드 중, N 말단측에 존재하는 시그널 영역이 적어도 부분적으로 제거된 폴리펩티드이다. 예를 들면, 유전자 은행 등록 번호: BAA07020을 참조하면, Cryj1 단백질로서, 374개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드가 등록되어 있지만, Cryj1 성숙 단백질은 BAA07020에 등록된 374개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 중, 22 내지 374번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드에 대응한다. BAA07020에 등록된 374개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 중, 1 내지 21번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역은 시그날 영역이다.

Cryj1 성숙 단백질은 천연 Cryj1 성숙 단백질 또는 천연 Cryj1 성숙 단백질에 있어서의 1개 이상(예를 들면, 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1, 2 또는 3개)의 아미노산이 개변(예, 치환, 부가, 삽입, 결실)되거나, 또는 천연 Cryj1 성숙 단백질의 아미노산 서열과 약 95 ％ 이상, 바람직하게는 약 97 ％, 보다 바람직하게는 약 98 ％, 가장 바람직하게는 약 99 ％의 아미노산 서열 동일성(％)을 나타내는 아미노산 서열을 가지면서 Cryj1 성숙 단백질 중의 에피토프를 유지하는 변이 단백질일 수 있다. 천연 Cryj1 성숙 단백질로서는, 유전자 은행 등록 번호: BAA07020에 등록된 374개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 중, 22 내지 374번째의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩티드, 및 천연에 존재하는 그의 아이소타입(예를 들면, 유전자 은행 등록 번호 D34639, D26544, D26545, AB081309, AB081310 참조)을 들 수 있다. 변이 단백질은 Cryj1 성숙 단백질에 있어서의 1 또는 2 이상, 바람직하게는 모든 에피토프(예, T 세포 또는 B 세포 에피토프)를 유지하도록 개변된 단백질일 수 있다.

Cryj2 성숙 단백질은 Cryj2 유전자로부터 발현된 폴리펩티드 중, N 말단측에 존재하는 시그날 영역, 및 성숙 단백질의 코딩 부분의 N 말단 및 C 말단측에 각각 존재하는 2개의 프로 영역이 제거된 폴리펩티드이다. 예를 들면, 유전자 은행 등록 번호: P43212를 참조하면, Cryj2 단백질로서, 514개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드가 등록되어 있지만, Cryj2 성숙 단백질은 P43212에 등록된 514개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 중, 46 내지 433번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드에 대응한다. P43212에 등록된 514개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 중, 1 내지 22번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역은 시그날 영역이고, 23 내지 45번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역 및 434 내지 514번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 영역은 각각 프로 영역이다.

Cryj2 성숙 단백질은 천연 Cryj2 성숙 단백질 또는 천연 Cryj2 성숙 단백질에 있어서의 1개 이상(예를 들면 1 내지 10개, 바람직하게는 1 내지 7개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 가장 바람직하게는 1, 2 또는 3개)의 아미노산이 개변(예, 치환, 부가, 삽입, 결실)되거나, 또는 천연 Cryj2 성숙 단백질의 아미노산 서열과 약 95 ％ 이상, 바람직하게는 약 97 ％, 보다 바람직하게는 약 98 ％, 가장 바람직하게는 약 99 ％의 아미노산 서열 동일성(％)을 나타내는 아미노산 서열을 가지면서 Cryj2 성숙 단백질 중의 에피토프를 유지하는 변이 단백질일 수 있다. 천연 Cryj2 성숙 단백질로서는, 유전자 은행 등록 번호: P43212에 등록된 514개의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드 중, 46 내지 433번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드, 및 천연에 존재하는 그의 아이소타입(예를 들면, 유전자 은행 등록 번호 D37765, D29772, E10716, AB081403, AB081404, AB081405 참조)을 들 수 있다. 변이 단백질은 Cryj2 성숙 단백질에 있어서의 1 또는 2 이상, 바람직하게는 모든 에피토프(예, T 세포 또는 B 세포 에피토프)를 유지하도록 개변된 단백질일 수 있다.

아미노산 서열 동일성(％)은 상기 분야에서 관용 프로그램(예를 들면, BLAST, FASTA 등)을 초기 설정으로 이용하여 결정할 수 있다. 동일성(％)은 또한, 상기 분야에서 공지된 임의의 알고리즘, 예를 들면 니들맨(Needleman) 등의 문헌[J. Mol. Biol., 1970, 48: 444-453], 마이어스(Myers) 및 밀러(Miller)의 문헌[CABIOS, 1988, 4: 11-17]의 알고리즘 등을 사용하여 결정할 수 있다. 니들맨 등의 알고리즘은 GCG 소프트웨어 패키지(www.gcg.com에서 입수 가능)의 GAP 프로그램에 조립되어 있고, 동일성(％)은 예를 들면 BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 갭 웨이트(gap weight): 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4, 및 렝쓰 웨이트(length weight: 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 것을 사용함으로써 결정할 수 있다. 또한, 마이어스 및 밀러의 알고리즘은 GCG 서열 얼라인먼트 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램에 조립되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해서 ALIGN 프로그램을 이용하는 경우, 예를 들면 PAM120 웨이트 레지듀 테이블(weight residue table), 갭 렝쓰 패널티 12, 갭 패널티 4를 사용할 수 있다. 아미노산 서열 동일성은 상기 임의의 방법으로 결정된 것이면 상관없고, 예를 들면 계산시에 상기 방법 중에서 가장 낮은 값을 나타내는 방법이 채용될 수 있다.

융합 단백질은 Cryj1 성숙 단백질이 N 말단측에, Cryj2 성숙 단백질이 C 말단측에 존재하는 것일 수도 있거나, 또는 Cryj1 성숙 단백질이 C 말단측에, Cryj2 성숙 단백질이 N 말단측에 존재하는 것일 수도 있다. 융합 단백질은 또한 Cryj1 성숙 단백질과 Cryj2 성숙 단백질 사이에 펩티드 링커를 포함하지 않을 수도 있거나, 또는 포함할 수도 있다. 당업자는 상기 기술 분야에서의 기술 상식으로부터 이러한 펩티드 링커를 적절하게 설계할 수 있다. 예를 들면, 펩티드 링커는 약 30 이하, 바람직하게는 약 25 이하, 보다 바람직하게는 약 20 이하, 보다 더 바람직하게는 약 15 이하, 가장 바람직하게는 약 10 또는 5 이하의 아미노산 잔기의 길이일 수 있다.

융합 단백질은 또한 N 말단 또는 C 말단 중 어느 것, 또는 쌍방에 펩티드 부분이 더 부가된 것일 수도 있다. 이러한 펩티드 부분은, 융합 단백질에 부가된 경우에, 융합 단백질의 특성을 유지할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 이러한 펩티드 부분으로서는, 정제용 태그(예, 히스티딘(His) 태그, FLAG 태그, Myc 태그)를 들 수 있다. 또한, 이러한 펩티드 부분은, 예를 들면 약 30 이하, 바람직하게는 약 25 이하, 보다 바람직하게는 약 20 이하의 아미노산 잔기의 길이일 수 있다.

융합 단백질은 가용성 단백질일 수 있다. 융합 단백질이 가용성 분획 중에 얻어지는 가용성 단백질인 경우, 예를 들면 칼럼 크로마토그래피 등의 일반적인 정제법에 의해 고순도로 정제 가능함, 단백질의 수식이 용이함 등의 장점이 있다. 융합 단백질은 또한 불용성 분획 중에 얻어진 경우에도, 가용화 처리에 의해 가용화 단백질로서 얻을 수 있고, 따라서 상기 장점도 또한 갖는다.

아나필락시스 반응은 비만 세포 표면에 결합되어 있는 IgE 항체에 대한 알레르겐의 결합에 의해 생기는 시그날이 세포내로 도입됨으로써 야기된다. 융합 단백질은 삼나무 화분 항원(예, 천연형 Cryj1)에 특이적인 IgE 항체의 생산을 유도할 수 할 수 없을 뿐 아니라, 삼나무 화분 항원에 의한 삼나무 화분 항원 특이적 IgE 항체의 생산도 억제할 수 있다. 한편, 융합 단백질은 Cryj1 성숙 단백질 및 Cryj2 성숙 단백질에 있어서 1 이상(바람직하게는 전부)의 T 세포 에피토프를 유지할 수 있다. 따라서, 융합 단백질은 천연형 Cryj1 또는 Cryj2 특이적 IgE 항체에 결합할 수 없으므로, 아나필락시스 반응을 일으킬 수 없는 안전한 알레르겐일 수 있고, 삼나무 화분에서 기인하는 아나필락시스 반응의 정도를 억제할 수 있으며, 삼나무 화분 항원에 특이적인 면역(예, 세포성 면역, IgG 등의 액성 면역)을 충분히 유도할 수 있고, 모든 삼나무 화분증 환자에 있어서의 T 세포 에피토프를 커버할 수 있다는 등의 이점을 갖는다.

(자기 면역 질환 등에 대한 적용)

자기 항원은 자기 면역 질환에 있어서 면역 세포의 표적이 될 수 있는 항원인 한 특별히 한정되지 않는다. 자기 항원으로서는, 예를 들면 콜라겐, 핵산(관절성 류마티스, 전신성 에리테마토서스), 미엘린 염기성 단백질(MBP)(다발성 경화증), 사일로글로불린(갑상선 자기 면역 질환), 이식편 알로 항원(이식편 대 숙주병)을 들 수 있다.

본 발명의 의약은 표적 항원으로서 자기 항원을 포함하는 약물 송달 매체를 포함하는 경우, 자기 면역 질환의 치료제로서 유용하다. 본 발명자들은 CD1d 리간드 및 알레르겐을 포함하는 약물 송달 매체가 상기 알레르겐에서 기인하는 알레르기 질환을 특이적으로 치료할 수 있는 것을 발견한 것으로부터, 알레르겐 대신에 자기 항원을 포함하는 약물 송달 매체를 이용함으로써, 상기 자기 항원에서 기인하는 자기 면역 질환에 대해서도 동일하게 특이적으로 치료할 수 있는 것을 착상하였다. 이러한 자기 면역 질환으로서는, 예를 들면 상술한 것을 들 수 있다.

본 발명의 약물 송달 매체가 투여되는 개체는 임의의 동물종일 수 있다. 이러한 동물종으로서는, 예를 들면 영장류, 설치 동물 등의 포유 동물, 조류를 들 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명이 적용될 수 있는 동물로서는, 예를 들면 인간, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 마우스, 래트, 몰모트, 햄스터, 토끼, 닭을 들 수 있다. 임상 응용이라는 관점에서는 인간, 및 /또는 개, 고양이가 바람직하다.

본 발명의 의약은 약물 송달 매체에 부가적으로 임의의 담체, 예를 들면 의약상 허용될 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 의약상 허용될 수 있는 담체로서는, 예를 들면 수크로스, 전분, 만니트, 소르비트, 젖당, 글루코오스, 셀룰로오스, 탈크, 인산칼슘, 탄산칼슘 등의 부형제, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴, 아라비아 고무, 폴리에틸렌글리콜, 수크로스, 전분 등의 결합제, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 스타치, 나트륨-글리콜-스타치, 탄산수소나트륨, 인산칼슘, 시트르산칼슘 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 에어로질, 탈크, 라우릴황산나트륨 등의 윤활제, 시트르산, 멘톨, 글리실 리신ㆍ암모늄염, 글리신, 오렌지 분말 등의 방향제, 벤조산나트륨, 아황산수소나트륨, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등의 보존제, 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산 등의 안정제, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 스테아르산알루미늄 등의 현탁제, 계면 활성제 등의 분산제, 물, 생리 식염수, 오렌지 쥬스 등의 희석제, 카카오 지방, 폴리에틸렌글리콜, 백등유 등의 베이스 왁스를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.

경구 투여에 바람직한 제제는 물, 생리 식염수와 같은 희석액에 유효량의 물질을 용해시킨 액제, 유효량의 물질을 고체나 과립으로서 포함하고 있는 캡슐제, 새쉐이(sachet)제 또는 정제, 적당한 분산매 중에 유효량의 물질을 현탁시킨 현탁액제, 유효량의 물질을 용해시킨 용액을 적당한 분산매 중에 분산시켜 유화시킨 유제, 또는 산제, 과립제 등이다.

비경구적인 투여(예, 정맥내 주사, 피하 주사, 근육 주사, 국소 주입 등)에 바람직한 제제로서는, 수성 및 비수성의 등장인 무균 주사 액제가 있고, 이것에는 항산화제, 완충액, 제균제, 등장화제 등이 포함될 수도 있다. 또한, 수성 및 비수성의 무균 현탁액제를 들 수 있고, 이것에는 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제, 방부제 등이 포함될 수도 있다. 상기 제제는 앰플이나 바이알과 같이 단위 투여량 또는 복수회 투여량씩 용기에 봉입할 수 있다. 또한, 유효 성분 및 의약상 허용될 수 있는 담체를 동결 건조시켜, 사용 직전에 적당한 무균의 비히클에 용해 또는 현탁시킬 수 있는 상태로 보존할 수도 있다.

본 발명의 제의 약학적 유효량은 유효 성분의 활성이나 종류, 투여 양식(예, 경구, 비경구), 병의 중등도, 투여 대상이 되는 동물종, 투여 대상의 약물 수용성, 체중, 연령 등에 따라서 다르므로 일률적으로 말할 수는 없지만, 통상적인 성인 1일당 유효 성분량으로서 체중 1 kg당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg이다.

본 발명의 제제는 면역 질환을 갖는 피검체(특히 인간 환자)에 1일 또는 수일간 연속 투여할 수도 있고, 1일 내지 수일간의 간격을 두고 투여할 수도 있다. 예를 들면, 면역 질환이 화분증인 경우에는, 대상이 되는 화분(예를 들면 삼나무, 돼지풀 등)의 비산 시기 전, 또는 화분의 비산 시기에 화분증 피검체에 투여될 수 있다. 또한, 다른 알레르기 질환의 경우에는, 피검체가 상기 알레르겐에 접촉하기 전, 또는 상기 알레르겐에 접촉 후 알레르기 증상이 나타난 시점에서 투여하는 것이 바람직하다.

이하에 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들은 단순 한 예시이며, 본 발명의 범위를 조금도 한정하는 것은 아니다.

제조예 1: α-갈락토실 세라미드와 천연형 Cryj1 단백질을 함유하는 리포솜의 제조

L-α-포스파티딜글리세롤, 디팔미토일(DPPG; 와코 준야꾸) 1.12 mg과 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000] (암모늄염)(PEG-PE; 아반티 폴라 리피즈) 0.029 mg을 클로로포름/메탄올(1:1) 용매 250 μl에 용해시켰다. 또한, α-갈락토실 세라미드(독립 행정 법인 이화학 연구소 면역ㆍ알레르기 과학 종합 연구 센터에서 제조) 0.16 mg은 별도로 클로로포름/메탄올(1:1) 용매 250 μl에 용해시켰다. 다음에, 양자를 혼합하여 증발기에서 건고(乾固)시킨 후, 진공하의 데시케이터내에서 밤새 건조시켰다. 다음에 천연 삼나무 화분으로부터 정제된 Cryj1 단백질(세이까가꾸 고교) 농도가 0.4 mg/ml인 수용액을 200 μl 첨가하고, 초음파 파쇄 장치에서 10 분간 처리한 후, 포아 사이즈 0.22 ㎛의 멸균용 멤브레인을 통과시켰다. 다음에, 포아 사이즈 100 nm의 폴리카르보네이트막을 장착한 리포소 패스트-베이직(Liposo Fast-Basic) 압출기(아베스틴 인크.)를 25회 통과시킴으로써 정립((整粒)하였다. 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-4 원심 필터(PL-100)(밀리포아)를 이용하여 Cryj1을 봉입한 리포솜의 농축과 정제수에 의한 세정에 의해 리포솜 미봉입 Cryj1 단백질의 제거를 행하고, 최종적으로 정제수로 800 μl 수용액으로 조정하였다. 이 천연형 Cryj1 봉입 리포솜(αGC-천연형 Cryj1 리포솜을 포함하는 수용액을 SDS 전기 영동으로 해석한 결과, Cryj1 단백질 농도는 50 μg/ml인 것이 확인되었다. 또한, α-GalCer이 전부 리포솜 막에 삽입되었다고 상정하고, Lipo-αGC+Cryj1 용액 중의 α-GalCer 최종 농도를 200 μg/ml로 하였다.

실시예 1: α- 갈락토실 세라미드 함유 리포솜에 의한 B220 ⁺ 세포로부터의 IL-10 생산 유도

BDF1 마우스에게 수성 α-GalCer 또는 αGC-리포솜(국제 공개 WO2005/120574호 공보)을 2 μg α-GalCer/마우스로 복강내에 투여하고, 24 시간 후에 비장을 적출하였다. 슬라이드 유리로 비장을 짓이겨 세포를 제조한 후, 항 CD11c 항체 자성 마이크로비드(밀테니이)를 첨가하고, 마그네트를 이용하여 CD11c⁺ 세포(DC)를 제조하였다. 마그네트에 결합되지 않은 남은 세포로부터 항 B220 mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)로 B220⁺ 세포(B 세포)를 제조하였다. 96 웰 U 바닥 배양 플레이트의 1 웰내에, 200 μl의 배양액에 현탁시킨 2.5 x 10⁵개의 정상 BDF1 마우스의 전체 비장 세포와 수성 α-GalCer 또는 αGC-리포솜 투여 BDF1 마우스 비장 세포 유래의 1 x 10⁵개의 DC 또는 3 x 10⁵개의 B 세포를 첨가하여, 37 ℃의 5 ％ CO₂ 함유 인큐베이터내에서 배양하였다. 24, 48, 72 시간 후의 배양 상청 중의 사이토카인, IFN-γ, IL-4, IL-10을 ELISA로 측정하였다(도 1).

그 결과, αGC-리포솜 투여 BDF1 마우스 비장 유래의 CD11c⁺ 세포의 첨가군은 수성 α-GalCer 투여 BDF1 마우스 비장 유래의 CD11c⁺ 세포의 첨가군에 비해 IFN-γ 생산량이 크지만, IL-4와 IL-10 생산량은 동등하였다. αGC-리포솜 투여 BDF1 마우스 비장 유래의 B220⁺ 세포를 전체 비장 세포에 첨가하면, IL-10은 생산되지만, IL-4와 IFN-γ는 생산되지 않았다. 수성 α-GalCer 투여 BDF1 마우스 비장 유래의 B220⁺ 세포를 전체 비장 세포에 첨가한 경우에는, IL-4, IL-10, IFN-γ 생산은 검출되지 않았다.

실시예 2: α-갈락토실 세라미드 함유 리포솜에 의한 변연대 B 세포로부터의 IL-10 생산 유도

BDF1 마우스에게 αGC-리포솜을 2 μg α-GalCer/마우스로 복강내에 투여하여 24 시간 후에 비장을 적출하였다. 비장 중에 1 mg/ml의 콜라게나제 D(로쉐)를 주입하여 CO₂ 인큐베이터내에서 45 분간 인큐베이팅하였다. 다음에, 비장으로부터 세포를 추출하여 3 ml의 히스토덴즈(HistoDenz)(14.1 ％, 시그마-알드리치)에 현탁시킨 후, 50 μM의 2-머캅토에탄올(2 ME) 함유 X-VIVO 15 배지(캄브렉스 바이오 사이언스 워커스빌, 인크.)를 중층시켰다. 1500 rpm으로 5 분간 원심한 후, 중간층의 저밀도(LD) 세포와 침전 고밀도(HD) 세포를 회수하였다. 50 μM 2ME, 10 ％ FCS를 함유하는 X-VIVO 15 배지로 세포를 세정한 후, 0.5 ％ FCS 함유 인산 완충액(PBS)에 현탁시켰다. LD 세포에 항 CD11c mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)를 첨가하고, 마그네트를 이용하여 CD11c⁺ 수상 세포를 제조한 후, 나머지 세포로부터 항 B220 mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)로 LD-B 세포를 제조하였다. 또한, HD 세포로부터 항 B220 mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)로 HD-B 세포를 제조하였다. LD-B 세포와 HD-B 세포를 각각 FITC 표지 항 IgM 항체와 PE 표지 항 CD21 항체로 염색 후, 플로우 사이토미터로 해석하였다(도 2A). 96 웰 U 바닥 배양 플레이트의 1웰내에, 200 μl의 배양액에 현탁시킨 2.5 x 10⁵개의 정상 BDF1 마우스의 전체 비장 세포와 1 x 10⁵개의 LD-B 세포 또는 HD-B 세포를 넣어 37 ℃의 5 ％ CO₂ 함유 인큐베이터내에서 배양하였다.

그 결과, LD-B 세포를 전체 비장 세포에 첨가한 군만, 배양 상청 중에 IL-10 생산이 검출되었다(도 2B). LD-B 세포는 변연대 B 세포이기 때문에, αGC-리포솜의 생체내 투여에 의해 얻어지는 변연대 B 세포가, 전체 비장 세포와의 상호 작용에 의해 IL-10 생산을 유도하는 것이 개시되었다.

실시예 3: α-갈락토실 세라미드 함유 리포솜 펄스 변연대 B 세포에 의한 IL-10 생산 유도

BDF1 마우스로부터 적출한 비장 중에 1 mg/ml의 콜라게나제 D(로쉐)를 주입하여 CO₂ 인큐베이터내에서 45 분간 인큐베이팅하였다. 다음에, 비장으로부터 세포를 추출하여 3 ml의 히스토덴즈(14.1 ％, 시그마-알드리치)에 현탁시킨 후, 50 μM의 2-머캅토에탄올(2 ME) 함유 X-VIVO 15 배지(캄브렉스 바이오 사이언스 워커스빌 인크.)를 중층하였다. 1500 rpm으로 5 분간 원심 후, 중간층의 저밀도(LD) 세포를 회수하였다. 50 μM 2ME, 10 ％ FCS를 함유하는 X-VIVO 15 배지로 세포를 세정 후, 0.5 ％ FCS 함유 인산 완충액(PBS)에 현탁시켰다. LD 세포에 항 CD11c mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)를 첨가하고, 마그네트를 이용하여 CD11c⁺ 수상 세포를 제조한 후, 나머지 세포로부터 항 B220 mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)로 LD-B 세포를 제조하였다. 3 x 10⁶개의 LD-B 세포를 3 ml의 배양액이 들어간 6웰 배양 플레이트에 첨가하고, 또한 αGC-리포솜을 배양액에 최종 농도 100 ng/ml로 첨가한 웰과 첨가하지 않는 웰을 준비하였다. 18 시간, 37 ℃의 5 ％ CO₂ 함유 인큐베이터내에서 배양한 후, 각각의 웰로부터 세포를 회수하였다. BDF1 마우스로부터 적출한 전체 비장 세포에 항 B220 mAb 자성 마이크로비드(밀테니이)를 첨가하고, 마그네트를 이용하여 B220⁺ 세포를 제거한 전체 비장 세포(-B220 양성 세포)를 제조하였다. 96 웰 U 바닥 배양 플레이트의 1웰내에, 200 μl의 배양액에 현탁시킨 2.5 x 10⁵개의 정상 BDF1 마우스의 전체 비장 세포(-B220 양성 세포)와 1 x 10⁵개의 LD-B 세포를 넣어 37 ℃의 5 ％ CO₂ 함유 인큐베이터내에서 2일 또는 3일간 배양하였다.

그 결과, αGC-리포솜을 첨가하여 배양한 LD-B 세포를 전체 비장 세포(-B220 양성 세포)에 첨가한 군만, 배양 상청 중에 IL-10 생산이 검출되었다(도 3). LD-B 세포는 변연대 B 세포이기 때문에, αGC-리포솜으로 펄스된 변연대 B 세포(생체내)가 전체 비장 세포와의 상호 작용에 의해 IL-10 생산을 유도하는 것이 개시되었다.

실시예 4: α-갈락토실 세라미드와 천연형 Cryj1 단백질을 함유하는 리포솜 투여에 의한 생체내 이차적 IgE 항체 생산의 억제 작용

천연형 Cryj1(5 μg/마우스, 세이까가꾸 고교)과 수산화알루미늄 겔(2 mg/마우스)로 2회 감작시킨 BDF1 마우스에게, αGC-천연형 Cryj1-리포솜(αGC: 2 μg, Cryj1: 0.5 μg/마우스), αGC-리포솜(αGC: 2 μg/마우스) 또는 리포솜 단체를 감작으로부터 28일, 35일, 42일째의 3회 정맥내에 투여하고, 49일째에 천연형 Cryj1(1 μg/마우스)로 추가 면역시켰다. 추가 면역 전후에 채혈하여 혈청 중의 항 Cryj1-IgE 항체를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, αGC-천연형 Cryj1-리포솜을 투여한 군에서는, 추가 면역 후의 이차적 IgE 항체 생산이 유의하게 억제되었다(도 4).

실시예 5: Cryj1/2 융합 유전자의 합성

Cryj1/2 융합 유전자는 Cryj1 유전자(유전자 은행 등록 번호: BAA07020)의 N 말단 시그날 영역을 포함하지 않는 63 위치(Ser)로부터 1122 위치(Cys)까지의 뉴클레오티드(성숙 Cryj1)와 Cryj2 유전자(유전자 은행 등록 번호: P43212)의 N 말단 시그날 및 프로 영역을 포함하지 않는 138 위치(Arg)로부터 1299 위치(Ser)까지의 뉴클레오티드(성숙 Cryj2)를 이하의 방법으로 결합시킴으로써 제조하였다. 성숙 Cryj2 유전자 영역에는, XbaI 절단 서열이 868-874 위치(Ser-Arg)의 뉴클레오티드 서열(TCTAGA)로서 존재하고, 다양한 벡터와의 재조합 조작에 부적합하기 때문에, TCTAGA->TCAAGA의 코돈 치환에 의해 XbaI 절단 서열을 상실시키는 것으로 하였다. 우선, Cryj2 유전자 전장이 삽입된 플라스미드 DNA((독)삼림 종합 연구소)를 템플릿으로 하고, 프라이머 1, 2 또는 프라이머 3, 4에 의한 PCR을 DNA 합성의 정확도가 높은 DNA 폴리머라제(예, 다까라 슈조의 프라임스타(PrimeStar), 도요보의 코 드(KOD)) 존재하에서 20 사이클 행하였다. 그 결과, 성숙 Cryj2의 N 말단 영역 단편과 C 말단 영역 단편을 각각 증폭시킬 수 있었다. 다음에, 이들 2개의 DNA 단편을 혼합하고, 프라이머 1, 4를 이용한 PCR을 20 사이클 행함으로써 성숙 Cryj2 유전자 전장을 증폭시켰다. 이 DNA 단편을 벡터 pMAT324의 XbaI-EcoRI 부위에 서브클로닝한 후, DNA 시퀀싱을 행하고, 성숙 Cryj2 유전자의 XbaI 절단 서열의 상실과 기타 전체 서열에 PCR에 의한 변이가 생기지 않은 것을 확인하였다(pMAT324-Cryj2 ΔXbaI). Cryj1/2 융합 유전자를 제조하기 위해서, pMAT324-Cryj2 ΔXbaI를 템플릿으로 프라이머 4, 5를 이용한 PCR을 행하여 성숙 Cryj2 유전자 단편을 증폭시켰다. 다음에, Cryj1 유전자 전장이 삽입된 플라스미드 DNA((독)삼림 종합 연구소)를 템플릿으로 하여 프라이머 6, 7을 이용한 PCR을 행하여 성숙 Cryj1 유전자 단편을 증폭시켰다. 마지막으로, 성숙 Cryj1 유전자 영역 DNA 단편과 성숙 Cryj2 유전자 영역 DNA 단편을 혼합하고, 프라이머 4, 6를 이용한 PCR을 20 사이클 행함으로써, Cryj1/2 융합 유전자 DNA 단편을 증폭시켰다. Cryj1/2 융합 유전자를 EcoRI 소화 후, SmaI와 EcoRI로 절단된 pET47b(노바젠) 벡터와 라이게이션을 행하여 대장균 DH10B주에 형질 전환시였다(pET47b-Cryj1/2). DNA 시퀀싱에 의해 Cryj1/2 융합 유전자의 전체 서열과, 히스티딘(His) 태그 서열이 Cryj1/2 유전자의 5' 말단에 부가된 것을 확인하였다(도 5, 6).

이하, 필요에 따라서 본 실시예에서 제조된 구축물을 recCryj1/2라 약칭한다.

프라이머 1(센스): CCGGTCTAGAAAAGTTGAGCATTC(서열 1)

프라이머 2(안티센스): CCTCTGCTCTTGAGTTTTCCC(서열 2)

프라이머 3(센스): GGGAAAACTCAAGAGCAGAGG(서열 3)

프라이머 4(안티센스): CCGGAATTCCTATCAACTTGGACTTAAATTC(서열 4)

프라이머 5(센스): AGAAAAGTTGAGCATTC(서열 5)

프라이머 6(센스): TCTGATAATCCCATAGAC(서열 6)

프라이머 7(안티센스): GAATGCTCAACTTTTCTACAACGTTTAGAGAGAGAGC(서열 7)

실시예 6: recCryj1/2 단백질의 발현 확인

pET47b-Cryj1/2 플라스미드 DNA를 대장균 BL21주(인비트로젠)에 형질 전환시켰다. 가나마이신(최종 농도 20 μg/ml)을 첨가한 LB 배지 100 ml에 형질 전환주를 접종하였다. 37 ℃에서 하루 동안 배양한 후, 100 ml의 균체 배양액 전부를 1 L의 가나마이신 함유 LB 배지에 옮기고, 37 ℃에서 2 시간 더 배양하였다. 다음에, IPTG를 최종 농도 0.1 mM이 되도록 첨가한 후, 30 ℃에서 3 시간 배양하였다. 균체를 회수하여 초음파 파쇄한 후, 고속 원심기로 침전을 분리하였다. 침전을 물에 현탁 후, 원심 후의 상청과 함께 SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동과 HRP 표지 항 Cryj2 모노클로날 항체(하야시바라 겡뀨쇼)를 이용한 웨스턴 블로팅으로 해석하였다. 그 결과, 균체 파쇄 후의 침전 분획에서, 쿠마신 브릴리언트 블루(CBB) 단백질 염색에서 양성이면서 항 Cryj2 모노클로날 항체에 양성이며, 분자량 약 70 kDa의 단백질이 recCryj1/2 단백질인 것이 예상되었다. 다음에, 웨스턴 블로팅으로 PVDF막에 트랜스퍼시킨 상기 75 kDa 부근의 밴드를 CBB 염색 후에 잘라내어, 엔도프로테아제 Asp-N(다카라 바이오) 효소 소화 후, 질량 분석한 결과, Cryj1과 Cryj2내의 펩티드 서열을 다수 검출할 수 있었다.

이상의 결과로부터, 균체 파쇄 침전에 있는 약 75 kDa의 단백질은 recCryj1/2 단백질인 것이 확인되었다.

실시예 7: recCryj2 단백질의 가용화와 정제

pET47b-Cryj1/2 발현 균체 1 g(습중량)을 버그부스터(Bugbuster)(노바젠) 5 ml와 벤조나제(Benzonase)(노바젠) 1 μl로 용해 후, 16000 g, 20 분간 원심하여 불용성 분획을 회수하였다. 다음에 버그부스터(노바젠) 5 ml를 첨가하여 볼텍스로 충분히 교반한 후, 리조나제(Lysonase)(노바젠) 2 μl를 첨가하고, 볼텍스로 더 교반하였다. 실온에 5 분간 정치 후, 10배 희석한 버그부스터(노바젠) 용액 30 ml를 첨가하고, 16000 g, 15 분간 원심하여 불용성 분획을 회수하였다. 다음에 35 ml의 10 mM 이미다졸/8 M 요소/ 인산 완충액(PBS)에 현탁시킨 후, 자기 교반기로 교반시켜 불용성 단백질을 용해시켰다. 고속 원심기로 18000 rpm, 15 분간 원심한 후, 상청을 회수하였다. 다음에, 0.1 M NiSO₄를 충전시키고, 50 mM 이미다졸/8 M 요소/PBS로 평형화시킨 킬레이팅 세파로스(Chelating Sepharose) FF(GL 헬스 케어 바이오사이언스) 칼럼에, 원심 상청을 고속액체 크로마토그래피로 적용하였다. 50 mM 이미다졸/8 M 요소/PBS로 세정 후, 500 mM 이미다졸/8 M 요소/PBS로 recCryj1/2 융합 단백질을 용출시켰다. 용출액에 아르기닌을 최종 농도 0.4 M이 되도록 첨가 후, 투석 튜브에 넣고, 0.4 M 아르기닌/PBS 용액내에서 24 시간 투석시킴으로써 가용화 recCryj1/2 단백질을 회수하였다. SDS 폴리아크릴아미드 전기 영동과 항 히 스티딘 태그 모노클로날 항체(GE 헬스 케어 바이오사이언스), 또는 HRP 표지 항 Cryj2 모노클로날 항체(하야시바라 겡뀨쇼)를 이용한 웨스턴 블로팅으로 recCryj1/2 단백질인 것을 확인하였다.

실시예 8: recCryj2 단백질 면역에 의한 생체내 항체 생산능

BALB/c x DBA 2F1(BDF1) 마우스 1군 5마리(암컷, 8주령, 찰즈리버)에, 수산화알루미늄 겔ㆍ어쥬번트(리까가꾸 겡뀨쇼) 2 mg에 혼합한 삼나무 화분 유래 정제 Cryj1(천연형 Cryj1; 하야시바라 겡뀨쇼) 10 μg 또는 recCryj1/2 단백질 5 또는 10 μg을 실험 개시시(0일째)와 14일째에 복강내 면역시키고, 41일째에 각각의 마우스에게 천연형 Cryj1을 1 μg 또는 recCryj1/2 단백질을 5 또는 10 μg 추가 면역시켰다. 또한, 81일째에는, 모든 마우스에게 수산화알루미늄 겔 2 mg에 혼합한 천연형 Cryj1 1 μg을 추가 면역시켰다. 안와 채혈을 13, 28, 55, 76, 95일째에 실시하고, 혈청 중의 천연형 Cryj1 특이적 항체가와 recCryj1/2 특이적 IgE 항체가를 측정하였다. 그 결과, 28, 55, 76일째의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가는 천연형 Cryj1 면역 마우스에서는 상승하였지만, recCrj1/2 단백질을 면역시킨 마우스에서는 전혀 상승하지 않고, 또한 81일째의 수산화알루미늄 겔ㆍ어쥬번트와 천연형 Cryj1의 면역에 대해서도, 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체의 상승은 94일째에서는 거의 확인되지 않았다(도 7). 그러나, 76일째의 recCryj1/2 특이적 IgE 항체가는 recCryj1/2 융합 단백질을 면역시킨 마우스에서 상승하였다(도 8). 한편, 28, 55일째의 천연형 Cryj1 특이적 IgG1이나 IgG2a 항체가의 상승은, 천연형 Cryj1 면역 마우스와 recCryj1/2 면역 마우스 둘다에서 확인되었다(도 9).

이상의 결과로부터, recCryj1/2 단백질은 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체의 생산을 유도하지 않는, 안전한 저감작 항원이 될 수 있는 것이 시사되었다.

실시예 9: recCryj1/2 단백질의 생체내 IgE 항체 생산 억제능

BDF1 마우스(암컷, 8주령, 찰즈리버)에 수산화알루미늄 겔ㆍ어쥬번트(리까가꾸 겡뀨쇼) 2 mg에 혼합한 삼나무 화분 유래 정제 Cryj1(천연형 Cryj1; 하야시바라 겡뀨쇼) 5 μg을 실험 개시시(0일째)와 14일째에 복강내 면역시킨 후, 50일째에 천연형 Cryj1을 1 μg 추가 면역시켰다. 그 사이, 안와 채혈을 14, 29, 57일째에 실시하고, 혈청 중의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체를 측정하였다. 그 후, 99일째에 전체 마우스의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체를 측정하고, 항체가의 평균값이 동일해지도록 마우스를 3군(1군내 5마리)으로 나누었다. 106, 113, 120일째에는 각 군의 마우스의 복강내에 recCryj1/2 단백질(0.2 μg), recCryj1/2 단백질(2 μg) 또는 생리 식염수를 3회 투여하고, 또한 133일째에 천연형 Cryj1을 1 μg 추가 면역시켰다. 안와 채혈을 14O, 16O일째에 실시하여 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가를 측정하였다. 그 결과, recCryj1/2 투여군에서는, 투여 후의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가(127일째)는 생리 식염수 투여군보다 상승하였지만, 그 후의 천연형 Cryj1의 추가 면역(133일째) 후의 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가(160일째)는 생리 식염수 투여군에서 상승하였지만 recCryj1/2 투여군에서는 반대로 저하되었다(도 10).

이상의 결과로부터, recCryj1/2 단백질은 천연형 Cryj1 특이적 IgE 항체가의 상승을 억제할 수 있는 저감작 항원으로서 이용할 수 있는 것이 시사되었다.

제조예 2: α-갈락토실 세라미드와 recCryj1/2(재조합 융합 단백질)을 함유하는 리포솜의 제조

L-α-포스파티딜콜린, 디올레오일(DOPC; 와코 준야꾸) 0.77 mg과 콜레스테릴 3β-N-(디메틸아미노에틸)카르보네이트 히드로클로라이드(DC-콜; 시그마 알드리치) 0.83 mg과 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000](암모늄염)(PEG-PE; 아반티 폴라 리피즈) 0.029 mg을 클로로포름/메탄올(1:1) 용매 250 μl에 용해시켰다. 또한, α-갈락토실 세라미드(독립 행정 법인 리까가꾸 겡뀨쇼 면역ㆍ알레르기 과학 종합 연구 센터에서 제조) 0.16 mg은 별도로 클로로포름/메탄올(1:1) 용매 250 μl에 용해시켰다. 다음에, 양자를 혼합하여 증발기에서 건고시킨 후, 진공하의 데시케이터내에서 밤새 건조시켰다. 다음에 recCryj1/2 단백질(실시예 7) 농도가 0.4 mg/ml인 수용액을 200 μl 첨가하고, 초음파 파쇄 장치에서 10 분간 처리한 후, 포아 사이즈 0.22 ㎛의 멸균용 멤브레인을 통과시켰다. 다음에, 포아 사이즈 100 nm의 폴리카르보네이트막을 장착한 리포소 패스트-베이직 압출기(아베스틴 인크.)를 25회 통과시킴으로써 정립하였다. 아미콘 울트라-4 원심 필터(PL-100)(밀리포아)를 이용하여 recCryj1/2를 봉입한 리포솜의 농축과 정제수에 의한 세정에 의해 리포솜 미봉입 recCryj1/2 단백질의 제거를 행하고, 최종적으로 정제수로 800 μl 수용액으로 조정하였다. 이 recCryj1/2 봉입 리포솜(αGC-recCryj1/2 리포솜)을 포함하는 수용액을 SDS 전기 영동으로 해석한 결과, recCrj1/2 단백질 농도는 25 μg/ml인 것이 확인되었다. 또한, α-GalCer이 전부 리포솜 막에 삽입되었다고 상정하여, Lipo-αGC+Cryj1 용액 중의 α -GalCer 최종 농도를 200 μg/ml로 하였다.

실시예 10: α- 갈락토실 세라미드와 recCryj2 (재조합 융합 단백질)을 함유하는 리포솜 투여에 의한 생체내 삼차적 IgE 항체 생산의 억제 작용

천연형 Cryj1(5 μg/마우스, 세이까가꾸 고교)과 수산화알루미늄 겔(2 mg/마우스)로 2회 감작시킨 BDF1 마우스에게, 천연형 Cryj1(1 μg/마우스, 세이까가꾸 고교)을 추가 면역시킨 후, αGC-recCryj1/2-리포솜(αGC: 2 μg, recCryj1/2: 0.5 μg/마우스), αGC-리포솜(αGC: 2 μg/마우스) 또는 리포솜 단체를, 감작으로부터 105일, 112일, 119일째의 3회 복강내에 투여하고, 126일째에 천연형 Cryj1(1 μg/마우스)로 2회째 추가 면역을 행하였다. 감작 전, 감작 후 14일, 28일, 56일, 98일, 126일, 140일, 160일째에 채혈하여 혈청 중의 항 Cryj1-IgE 항체를 ELISA로 측정하였다. 그 결과, αGC-리포솜 또는 αGC-recCryj1/2-리포솜을 투여한 군에서는, 리포솜 단체를 투여한 음성 대조에 비해 투여 후의 혈중 IgE 항체가의 감소가 현저하면서 또한 2회째 추가 면역 후의 삼차적 IgE 항체 생산의 상승도 억제되었다(αGC-recCryj1/2-리포솜 투여군의 억제 효과는 통계학적으로 유의함)(도 11). 이상의 결과로부터, αGC-리포솜에는 알레르기 발증 후의 고 IgE 항체가를 내리는 치료 효과를 기대할 수 있고, 또한 리포솜내에 알레르겐성이 없는 항원을 봉입함으로써, 그 효과를 더욱 증강시킬 수 있는 것이 시사되었다.

CD1d 리간드 및 표적 항원(예, 알레르겐, 자기 항원)을 포함하며, 내강을 갖는 약물 송달 매체를 함유하여 이루어지는 본 발명의 제제는 표적 항원에서 기인하 는 질환의 특이적인 치료에 유용하다.

본 발명의 제제는 또한 삼나무 화분 항원의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 제제에 포함될 수 있는 융합 단백질은 아나필락시스 반응을 일으킬 수 없는 안전한 알레르겐이 될 수 있고, 삼나무 화분에서 기인하는 아나필락시스 반응의 정도를 억제할 수 있으며, 삼나무 화분 항원에 특이적인 면역을 충분히 유도할 수 있고, 모든 삼나무 화분증 환자에 있어서 T 세포 에피토프를 커버할 수 있다고 하는 우수한 효과를 발휘한다. 따라서, 본 발명의 제제는 삼나무 화분증의 신규 저감작 요법에 있어서 및/또는 치료용 백신 등의 의약으로서 유용할 수 있다.

본 출원은 2006년 1월 13일에 일본에서 제출된 특허 출원 2006-005658을 기초로 하며, 그의 내용은 본 참조에 의해 본 명세서 중에 원용된다.

SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Prophylactic or therapeutic agents for immune diseases and methods using the same <130> 091013 <150> JP 2006-5658 <151> 2006-1-13 <160> 11 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 1 ccggtctaga aaagttgagc attc 24 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 2 cctctgctct tgagttttcc c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 3 gggaaaactc aagagcagag g 21 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 4 ccggaattcc tatcaacttg gacttaaatt c 31 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 5 agaaaagttg agcattc 17 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 6 tctgataatc ccatagac 18 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 7 gaatgctcaa cttttctaca acgtttagag agagagc 37 <210> 8 <211> 2283 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (1)..(2283) <400> 8 atg gca cat cac cac cac cat cac tcc gcg gct ctt gaa gtc ctc ttt 48 Met Ala His His His His His His Ser Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe 1 5 10 15 cag gga ccc tct gat aat ccc ata gat agc tgc tgg aga gga gac tca 96 Gln Gly Pro Ser Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ser 20 25 30 aac tgg gca caa aac aga atg aag ctc gca gat tgt gca gtg ggc ttc 144 Asn Trp Ala Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe 35 40 45 gga agc tcc acc atg gga ggc aag gga gga gat ctt tat aca gtc aca 192 Gly Ser Ser Thr Met Gly Gly Lys Gly Gly Asp Leu Tyr Thr Val Thr 50 55 60 aac tca gat gac gat cct gtg aat cct gca cca gga act ctg cgc tat 240 Asn Ser Asp Asp Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr 65 70 75 80 gga gca acc cga gat agg ccc ctg tgg ata att ttc agt ggg aat atg 288 Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Ser Gly Asn Met 85 90 95 aat ata aag ctc aaa atg cct atg tac att gct ggg tat aag act ttt 336 Asn Ile Lys Leu Lys Met Pro Met Tyr Ile Ala Gly Tyr Lys Thr Phe 100 105 110 gat ggc agg gga gca caa gtt tat att ggc aat ggc ggt ccc tgt gtg 384 Asp Gly Arg Gly Ala Gln Val Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys Val 115 120 125 ttt atc aag aga gtg agc aat gtt atc ata cac ggt ttg cat ctg tac 432 Phe Ile Lys Arg Val Ser Asn Val Ile Ile His Gly Leu His Leu Tyr 130 135 140 ggc tgt agt act agt gtt ttg ggg aat gtt ttg ata aac gag agt ttt 480 Gly Cys Ser Thr Ser Val Leu Gly Asn Val Leu Ile Asn Glu Ser Phe 145 150 155 160 ggg gtg gag cct gtt cat cct cag gat ggc gat gct ctt act ctg cgc 528 Gly Val Glu Pro Val His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu Thr Leu Arg 165 170 175 act gct aca aat att tgg att gat cat aat tct ttc tcc aat tct tct 576 Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn Ser Phe Ser Asn Ser Ser 180 185 190 gat ggt ctg gtc gat gtc act ctt tct tcg act gga gtt act att tcc 624 Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Ser Ser Thr Gly Val Thr Ile Ser 195 200 205 aac aat ctt ttt ttc aac cat cat aaa gtg atg ttg tta ggg cat gat 672 Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Asp 210 215 220 gat gca tat agt gat gac aaa tcc atg aag gtg aca gtg gcg ttc aat 720 Asp Ala Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn 225 230 235 240 caa ttt gga cct aac tgt gga caa aga atg ccc agg gca cga tat gga 768 Gln Phe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly 245 250 255 ctt gta cat gtt gca aac aat aat tat gac cca tgg act ata tat gca 816 Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Thr Ile Tyr Ala 260 265 270 att ggt ggg agt tca aat cca acc att cta agt gaa ggg aat agt ttc 864 Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe 275 280 285 act gca cca aat gag agc tac aag aag caa gta acc ata cgt att gga 912 Thr Ala Pro Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr Ile Arg Ile Gly 290 295 300 tgc aaa aca tca tca tct tgt tca aat tgg gtg tgg caa tct aca caa 960 Cys Lys Thr Ser Ser Ser Cys Ser Asn Trp Val Trp Gln Ser Thr Gln 305 310 315 320 gat gtt ttt tat aat gga gct tat ttt gta tca tca ggg aaa tat gaa 1008 Asp Val Phe Tyr Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Tyr Glu 325 330 335 ggg ggt aat ata tac aca aag aaa gaa gct ttc aat gtt gag aat ggg 1056 Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu Asn Gly 340 345 350 aat gca act cct caa ttg aca aaa aat gct ggg gtt tta aca tgc tct 1104 Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ser 355 360 365 ctc tct aaa cgt tgt aga aaa gtt gag cat tct cgt cat gat gct atc 1152 Leu Ser Lys Arg Cys Arg Lys Val Glu His Ser Arg His Asp Ala Ile 370 375 380 aac atc ttc aat gtg gaa aaa tat ggc gca gta ggc gat gga aag cat 1200 Asn Ile Phe Asn Val Glu Lys Tyr Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His 385 390 395 400 gat tgc act gag gca ttt tca aca gca tgg caa gct gca tgc aaa aag 1248 Asp Cys Thr Glu Ala Phe Ser Thr Ala Trp Gln Ala Ala Cys Lys Lys 405 410 415 cca tca gca atg ttg ctt gtg cca ggc aac aag aaa ttt gtt gta aac 1296 Pro Ser Ala Met Leu Leu Val Pro Gly Asn Lys Lys Phe Val Val Asn 420 425 430 aat ttg ttc ttc aat ggg cca tgt caa cct cac ttt act ttt aag gta 1344 Asn Leu Phe Phe Asn Gly Pro Cys Gln Pro His Phe Thr Phe Lys Val 435 440 445 gat ggg ata ata gct gcg tac caa aat cca gct agc tgg aag aat aat 1392 Asp Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Lys Asn Asn 450 455 460 aga ata tgg ttg cag ttt gct aaa ctt aca ggt ttt act cta atg ggt 1440 Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly 465 470 475 480 aaa ggt gta att gat ggg caa gga aaa caa tgg tgg gct ggc caa tgt 1488 Lys Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly Lys Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys 485 490 495 aaa tgg gtc aat gga cga gaa att tgc aac gat cgt gat aga cca aca 1536 Lys Trp Val Asn Gly Arg Glu Ile Cys Asn Asp Arg Asp Arg Pro Thr 500 505 510 gcc att aaa ttc gat ttt tcc acg ggt ctg ata atc caa gga ctg aaa 1584 Ala Ile Lys Phe Asp Phe Ser Thr Gly Leu Ile Ile Gln Gly Leu Lys 515 520 525 cta atg aac agc ccc gaa ttt cat tta gtt ttt ggg aat tgt gag gga 1632 Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe His Leu Val Phe Gly Asn Cys Glu Gly 530 535 540 gta aaa atc atc ggc att agt att acg gca ccg aga gac agt cct aac 1680 Val Lys Ile Ile Gly Ile Ser Ile Thr Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn 545 550 555 560 act gat gga att gat atc ttt gca tct aaa aac ttt cac tta caa aag 1728 Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys 565 570 575 aac acg ata gga aca ggg gat gac tgc gtc gct ata ggc aca ggg tct 1776 Asn Thr Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Val Ala Ile Gly Thr Gly Ser 580 585 590 tct aat att gtg att gag gat ctg att tgc ggt cca ggc cat gga ata 1824 Ser Asn Ile Val Ile Glu Asp Leu Ile Cys Gly Pro Gly His Gly Ile 595 600 605 agt ata gga agt ctt ggg agg gaa aac tct aga gca gag gtt tca tac 1872 Ser Ile Gly Ser Leu Gly Arg Glu Asn Ser Arg Ala Glu Val Ser Tyr 610 615 620 gtg cac gta aat ggg gct aaa ttc ata gac aca caa aat gga tta aga 1920 Val His Val Asn Gly Ala Lys Phe Ile Asp Thr Gln Asn Gly Leu Arg 625 630 635 640 atc aaa aca tgg cag ggt ggt tca ggc atg gca agc cat ata att tat 1968 Ile Lys Thr Trp Gln Gly Gly Ser Gly Met Ala Ser His Ile Ile Tyr 645 650 655 gag aat gtt gaa atg ata aat tcg gag aac ccc ata tta ata aat caa 2016 Glu Asn Val Glu Met Ile Asn Ser Glu Asn Pro Ile Leu Ile Asn Gln 660 665 670 ttc tac tgc act tcg gct tct gct tgc caa aac cag agg tct gcg gtt 2064 Phe Tyr Cys Thr Ser Ala Ser Ala Cys Gln Asn Gln Arg Ser Ala Val 675 680 685 caa atc caa gat gtg aca tac aag aac ata cgt ggg aca tca gca aca 2112 Gln Ile Gln Asp Val Thr Tyr Lys Asn Ile Arg Gly Thr Ser Ala Thr 690 695 700 gca gca gca att caa ctt aag tgc agt gac agt atg ccc tgc aaa gat 2160 Ala Ala Ala Ile Gln Leu Lys Cys Ser Asp Ser Met Pro Cys Lys Asp 705 710 715 720 ata aag cta agt gat ata tct ttg aag ctt acc tca ggg aaa att gct 2208 Ile Lys Leu Ser Asp Ile Ser Leu Lys Leu Thr Ser Gly Lys Ile Ala 725 730 735 tcc tgc ctt aat gat aat gca aat gga tat ttc agt gga cac gtc atc 2256 Ser Cys Leu Asn Asp Asn Ala Asn Gly Tyr Phe Ser Gly His Val Ile 740 745 750 cct gca tgc aag aat tta agt cca agt 2283 Pro Ala Cys Lys Asn Leu Ser Pro Ser 755 760 <210> 9 <211> 761 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <400> 9 Met Ala His His His His His His Ser Ala Ala Leu Glu Val Leu Phe 1 5 10 15 Gln Gly Pro Ser Asp Asn Pro Ile Asp Ser Cys Trp Arg Gly Asp Ser 20 25 30 Asn Trp Ala Gln Asn Arg Met Lys Leu Ala Asp Cys Ala Val Gly Phe 35 40 45 Gly Ser Ser Thr Met Gly Gly Lys Gly Gly Asp Leu Tyr Thr Val Thr 50 55 60 Asn Ser Asp Asp Asp Pro Val Asn Pro Ala Pro Gly Thr Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Gly Ala Thr Arg Asp Arg Pro Leu Trp Ile Ile Phe Ser Gly Asn Met 85 90 95 Asn Ile Lys Leu Lys Met Pro Met Tyr Ile Ala Gly Tyr Lys Thr Phe 100 105 110 Asp Gly Arg Gly Ala Gln Val Tyr Ile Gly Asn Gly Gly Pro Cys Val 115 120 125 Phe Ile Lys Arg Val Ser Asn Val Ile Ile His Gly Leu His Leu Tyr 130 135 140 Gly Cys Ser Thr Ser Val Leu Gly Asn Val Leu Ile Asn Glu Ser Phe 145 150 155 160 Gly Val Glu Pro Val His Pro Gln Asp Gly Asp Ala Leu Thr Leu Arg 165 170 175 Thr Ala Thr Asn Ile Trp Ile Asp His Asn Ser Phe Ser Asn Ser Ser 180 185 190 Asp Gly Leu Val Asp Val Thr Leu Ser Ser Thr Gly Val Thr Ile Ser 195 200 205 Asn Asn Leu Phe Phe Asn His His Lys Val Met Leu Leu Gly His Asp 210 215 220 Asp Ala Tyr Ser Asp Asp Lys Ser Met Lys Val Thr Val Ala Phe Asn 225 230 235 240 Gln Phe Gly Pro Asn Cys Gly Gln Arg Met Pro Arg Ala Arg Tyr Gly 245 250 255 Leu Val His Val Ala Asn Asn Asn Tyr Asp Pro Trp Thr Ile Tyr Ala 260 265 270 Ile Gly Gly Ser Ser Asn Pro Thr Ile Leu Ser Glu Gly Asn Ser Phe 275 280 285 Thr Ala Pro Asn Glu Ser Tyr Lys Lys Gln Val Thr Ile Arg Ile Gly 290 295 300 Cys Lys Thr Ser Ser Ser Cys Ser Asn Trp Val Trp Gln Ser Thr Gln 305 310 315 320 Asp Val Phe Tyr Asn Gly Ala Tyr Phe Val Ser Ser Gly Lys Tyr Glu 325 330 335 Gly Gly Asn Ile Tyr Thr Lys Lys Glu Ala Phe Asn Val Glu Asn Gly 340 345 350 Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala Gly Val Leu Thr Cys Ser 355 360 365 Leu Ser Lys Arg Cys Arg Lys Val Glu His Ser Arg His Asp Ala Ile 370 375 380 Asn Ile Phe Asn Val Glu Lys Tyr Gly Ala Val Gly Asp Gly Lys His 385 390 395 400 Asp Cys Thr Glu Ala Phe Ser Thr Ala Trp Gln Ala Ala Cys Lys Lys 405 410 415 Pro Ser Ala Met Leu Leu Val Pro Gly Asn Lys Lys Phe Val Val Asn 420 425 430 Asn Leu Phe Phe Asn Gly Pro Cys Gln Pro His Phe Thr Phe Lys Val 435 440 445 Asp Gly Ile Ile Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Ala Ser Trp Lys Asn Asn 450 455 460 Arg Ile Trp Leu Gln Phe Ala Lys Leu Thr Gly Phe Thr Leu Met Gly 465 470 475 480 Lys Gly Val Ile Asp Gly Gln Gly Lys Gln Trp Trp Ala Gly Gln Cys 485 490 495 Lys Trp Val Asn Gly Arg Glu Ile Cys Asn Asp Arg Asp Arg Pro Thr 500 505 510 Ala Ile Lys Phe Asp Phe Ser Thr Gly Leu Ile Ile Gln Gly Leu Lys 515 520 525 Leu Met Asn Ser Pro Glu Phe His Leu Val Phe Gly Asn Cys Glu Gly 530 535 540 Val Lys Ile Ile Gly Ile Ser Ile Thr Ala Pro Arg Asp Ser Pro Asn 545 550 555 560 Thr Asp Gly Ile Asp Ile Phe Ala Ser Lys Asn Phe His Leu Gln Lys 565 570 575 Asn Thr Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Val Ala Ile Gly Thr Gly Ser 580 585 590 Ser Asn Ile Val Ile Glu Asp Leu Ile Cys Gly Pro Gly His Gly Ile 595 600 605 Ser Ile Gly Ser Leu Gly Arg Glu Asn Ser Arg Ala Glu Val Ser Tyr 610 615 620 Val His 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Claims

CD1d 리간드 및 표적 항원을 포함하며, 내강을 갖는 약물 송달 매체를 함유하여 이루어지는, 상기 표적 항원에서 기인하는 면역 질환의 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서, 표적 항원이 알레르겐이고, 면역 질환이 상기 알레르겐에서 기인하는 알레르기 질환인 제제.
제1항에 있어서, 약물 송달 매체가 리포솜인 제제.
제1항에 있어서, CD1d 리간드가 α-GalCer인 제제.
제2항에 있어서, 알레르겐이 삼나무 화분 항원인 제제.
제2항에 있어서, 알레르겐이 Cryj1 성숙 단백질 및 Cryj2 성숙 단백질의 융합 단백질인 제제.
제5항에 있어서, 융합 단백질에서 Cryj1 성숙 단백질이 Cryj2 성숙 단백질보다 N 말단측에 존재하는 제제.
제2항에 있어서, CD1d 리간드가 리포솜 막내에 매입되고 알레르겐이 리포솜 내강에 봉입되어 있는 제제.
제1항에 있어서, 표적 항원이 자기 항원인 제제.
삼나무 화분 항원 Cryj1 단백질과 Cryj2 단백질을 포함하는 융합 단백질.
제10항에 있어서, 상기 Cryj1 단백질이 Cryj1 성숙 단백질이고, Cryj2 단백질이 Cryj2 성숙 단백질인 융합 단백질.
제10항에 있어서, Cryj1 단백질과 Cryj2 단백질이 직접 또는 펩티드 링커를 통해 연결되어 있는 융합 단백질.
제10항에 있어서, Cryj1 단백질이 N 말단측에, Cryj2 성숙 단백질이 C 말단측에 존재하는 융합 단백질.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 면역 질환의 예방 또는 치료제의 약학적 유효량을 그의 치료를 필요로 하는 피검체에 투여하는 공정을 포함하는, 면역 질환의 예방 또는 치료 방법.
제14항에 있어서, 상기 피검체가 인간 면역 질환 환자인 면역 질환의 예방 또는 치료 방법.