CN117064931A - 金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒的制药用途，具体涉及金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用。本发明创造性地提取纯化中药金银花衍生的细胞外囊泡，并对其生理功效进行了研究，发现其能够充分被人支气管上皮细胞和巨噬细胞内化吸收，显著促进巨噬细胞的增殖，而对支气管上皮细胞的生长无明显影响，还能够抑制巨噬细胞中LPS刺激引起的激活和炎症反应，具有体内肺靶向性，在小鼠流感病毒模型中显示出显著的保护效果，将其用于制备抗流感病毒的药物具有潜力，为预防或治疗流感的方法提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒的制药用途，尤其涉及金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用。
背景技术
流感是由流感病毒引起的呼吸道传染病，是全球最大的公共卫生挑战之一。甲型流感病毒(Influenza A virus，IAV)是导致不可预测的流感大流行和致命人畜共患的原因。IAV有不同的亚型，其中感染人类的主要亚型为H1N1、H2N2和H3N2。
金银花为忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初开的花，以“金银花”为正名入药始载于明代《滇南本草》。金银花性甘、寒，入肺、心、胃、大肠经，能清热解毒、宣散风热。细胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)含有多种蛋白质、脂质和核酸，可通过介导细胞与细胞之间的通讯发挥重要的生理功能，几乎所有类型的真核和原核细胞都分泌EVs。植物EVs在形态方面与哺乳动物EVs相似，但其组成和功能等方面研究较少。有研究发现植物EVs是植物先天免疫系统的组成成分，具有抗真菌作用。此外，植物EVs具有跨物种调节功能，不仅可以调节哺乳动物细胞的生理功能，还可以干预和预防疾病进程，对疾病起到治疗作用。这些研究结论证明植物EVs作为一种新型的天然产物有可能成为新药开发的良好候选来源。中药多为植物，成本低，副作用小，但中药源性的EVs却很少有人研究。
从中药金银花中提取细胞外囊泡是否可行，提取出的金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒是否具有生物活性还未可知。
因此，如何提供一种从中药金银花中提取细胞外囊泡的方法，并深入研究提取到的金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒的功能，以发掘其在防治流感方面的应用潜力，是具有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒的制药用途，尤其提供金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用。
中医药因其临床疗效可靠、副作用少和低耐药性，已成为抗病毒研究的主要焦点。中医药具有多种有效成分协同作用以及多靶标的特点，可防止耐药性的产生，在呼吸道病毒相关疾病的治疗中具有独特优势。
本发明创造性地提取纯化中药金银花衍生的细胞外囊泡，并对其生理功效进行了研究，发现其能够充分被人支气管上皮细胞和巨噬细胞内化吸收，显著促进巨噬细胞的增殖，而对支气管上皮细胞的生长无明显影响，还能够抑制巨噬细胞中LPS刺激引起的激活和炎症反应，具有体内肺靶向性，在小鼠流感病毒模型中显示出显著的保护效果，将其用于制备抗流感病毒的药物具有潜力，为预防或治疗流感的方法提供了新的策略。
本发明所涉及的金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒可以通过本领域技术人员公知的任何方法制备得到，更优选下述提取方法，该方法得到的金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒纯度更高，具有更优异的体内肺靶向性和抗流感病毒效果。
优选地，所述金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒由包括如下步骤的制备方法制得：
将金银花原料浸泡后进行破壁粉碎，汁液离心过滤，滤液进行切向流浓缩富集，得到浓缩液；浓缩液离心，上清液过滤，滤液超速离心，收集沉淀，沉淀重悬，过滤，即得。
优选地，所述金银花原料包括金银花饮片。
优选地，所述汁液离心在1000-4000g(例如1000g、2000g、3000g、4000g等)下进行，离心时间为20-40min(例如20min、25min、30min、35min、40min等)。
优选地，所述浓缩液离心在0-8℃(例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等)下以8000-15000g(例如8000g、9000g、10000g、11000g、12000g、13000g、14000g、15000g等)进行40-100min(例如40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min等)。
优选地，所述超速离心在0-8℃(例如0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等)下以80000-150000g(例如80000g、90000g、100000g、110000g、120000g、130000g、140000g、150000g等)进行40-100min(例如40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min等)。
优选地，所述浓缩液为浓缩前滤液体积的10-40％，例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％等。
优选地，所述沉淀重悬后过滤使用0.22μm滤膜过滤。
在本发明中，所述流感病毒包括甲型流感病毒。
优选地，所述甲型流感病毒包括H1N1病毒、H2N2病毒或H3N2病毒。
在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、粉剂、溶液剂、气雾剂或喷雾剂中的任意一种。
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料，例如稀释剂、调味剂、粘合剂、填充剂、增稠剂、润滑剂或pH调节剂等。
第二方面，本发明提供金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备肺靶向制剂中的应用。
本发明还研究发现金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒具有显著的肺部靶向性，这一发现可进一步应用于肺靶向制剂的制备中，以进行肺部疾病发病机制的研究和相关病症的治疗。
优选地，所述肺靶向制剂还包括负载于所述金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒中的其他抗流感病毒的药物。
第三方面，本发明提供金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备巨噬细胞增殖促进剂中的应用。
第四方面，本发明提供金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备巨噬细胞炎症反应抑制剂中的应用。
根据本发明的研究结果，金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒能够在细胞水平(体外水平)促进巨噬细胞的增殖或抑制巨噬细胞炎症反应，即金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒能被制成一种单纯的试验用制剂，用于探究巨噬细胞的生理代谢过程，本发明所要求保护的细胞增殖促进剂或细胞炎症反应抑制剂并不是用于消除病因或病灶，即是一种以非治疗为目的地在制备巨噬细胞增殖促进剂或巨噬细胞炎症反应抑制剂中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明创造性地提取纯化中药金银花衍生的细胞外囊泡，并对其生理功效进行了研究，发现其能够充分被人支气管上皮细胞和巨噬细胞内化吸收，显著促进巨噬细胞的增殖，而对支气管上皮细胞的生长无明显影响，还能够抑制巨噬细胞中LPS刺激引起的激活和炎症反应，具有体内肺靶向性，在小鼠流感病毒模型中显示出显著的保护效果，将其用于制备抗流感病毒的药物具有潜力，为预防或治疗流感的方法提供了新的策略。
目前还未见文献报道有关高纯度金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒的提取方法和功能研究，本发明首次对高纯度金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒进行提取并进行深入研究，为植物源性细胞外囊泡的研究与开发以及流感的研究与治疗提供了新的策略。
附图说明
图1是金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的粒径分布图；
图2是金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的纯度检测结果图；
图3是金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的透射电子显微镜图；
图4是采用琼脂糖凝胶电泳、银染以及薄层色谱法分别对HDNPs内DNA、RNA、蛋白质和脂质的检测结果图；
图5是BEAS-2B细胞内化结果图(其中A为流式细胞仪检测结果图，B为摄取率统计结果图，C为平均荧光强度统计结果图)；
图6是RAW264.7细胞内化结果图(其中A为流式细胞仪检测结果图，B为摄取率统计结果图，C为平均荧光强度统计结果图)；
图7是CCK-8法检测HDNPs对RAW264.7细胞的增殖情况结果图；
图8是CCK-8法检测HDNPs对BEAS-2B细胞的增殖情况结果图；
图9是RAW264.7细胞中炎症因子的RNA水平结果图(C为IL-1β、D为IL-6，E为COX-2)；
图10是小鼠器官(心、肝、脾、肺、肾和股骨)的成像图；
图11是各组小鼠的生存曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例所涉及的金银花饮片购自佛山冯了性中药材饮片公司。
实施例1
金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的提取：
(1)取金银花饮片100g用预冷的PBS溶液浸泡后进行榨汁，将榨取的汁液于4℃，3000g离心30min，取上清液；
(2)将上清液进行切向流浓缩富集，浓缩至原体积的20％，得到浓缩液；
(3)浓缩液10000g离心60min，收集上清液，于超速离心机4℃，100000g离心70min；
(4)弃去上清，每个离心管中用1mL预冷的PBS重悬沉淀，得到重悬液，使用0.22μm一次性针头过滤器进行过滤，冻存于-80℃冰箱备用。
实施例2
金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的表征：
对实施例1提取到的HDNPs的粒径、纯度、形态、化学组成进行表征。
(1)利用纳米流式检测仪对HDNPs的粒径分布进行分析，如图1所示：粒径平均值大小为65.73nm，符合文献报道的细胞外囊泡粒径范围。
(2)利用Triton X-100破膜实验检测HDNPs纯度：使用不同浓度的Triton X-100对HDNPs进行膜溶解后，用纳米流式检测仪测试粒子数变化，如图2所示，研究结果显示所提取的HDNPs纯度高达75％。
(3)在透射电子显微镜下观察HDNPs的形态，如图3所示：表面凹陷，呈现典型的球形茶杯托状的囊泡结构，胞膜结构清晰可见，膜边界清楚锐利，染色背景干净，反差明显。
(4)采用琼脂糖凝胶电泳、银染以及薄层色谱(thin layer chromatography,TLC)的方法分别对HDNPs内蛋白质、RNA和脂质进行检测。结果如图4所示(其中D为蛋白质结果，E为RNA结果，F为脂质结果)，显示HDNPs含有丰富的核酸、蛋白质和脂质。
以上结果证明实施例1所提取的HDNPs不但具有典型的EVs形态、粒径、膜结构，化学组成，还具有纯度高的特点。
实施例3
金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的内化吸收试验：
HDNPs被支气管上皮细胞和巨噬细胞充分内化吸收是后续HDNPs用于呼吸系统疾病的前提基础，因此在做后续实验之前我们先验证HDNPs是否能被BEAS-2B细胞和RAW264.7细胞内化吸收。
(1)DiI-HDNPs溶液制备：500μL HDNPs(1×1012粒子/mL)与500μL PBS放入无菌EP管中混匀，然后加入10μL DiI，混合均匀，37℃避光孵育30min。30min后，在4℃条件下以100000×g离心70分钟，弃上清，用PBS缓冲液重悬沉淀后，再重复超速离心3次以洗涤多余的染液，最后一次离心后，使用500μL PBS缓冲液重悬沉淀，即得DiI-HDNPs溶液，保存于-80℃冰箱内备用。
(2)流式细胞仪检测HDNPs内化吸收情况：将已标记的HDNPs(1×109粒子/mL)分别与BEAS-2B细胞、RAW264.7细胞进行共培养2h、4h和8h。然后用流式细胞仪检测摄取率和平均荧光强度。
BEAS-2B细胞内化结果如图5所示(其中A为流式细胞仪检测结果图，B为摄取率统计结果图，C为平均荧光强度统计结果图)，由图可知，DiI-HDNPs可被BEAS-2B内化吸收且内化程度随共孵育时间的延长而增加。
RAW264.7细胞内化结果如图6所示(其中D为流式细胞仪检测结果图，E为摄取率统计结果图，F为平均荧光强度统计结果图)，由图可知，DiI-HDNPs可被RAW264.7细胞内化吸收且内化程度随共孵育时间的延长而增加。
实施例4
金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的生物活性研究：
为了验证HDNPs的生物活性，首先进行了体外细胞水平的研究，探讨了HDNPs对BEAS-2B细胞和RAW264.7细胞的作用效果及机制。
(1)CCK-8法检测HDNPs对BEAS-2B细胞和RAW264.7细胞的影响：按合适细胞密度接种于96孔板中，取不同浓度的HDNPs(0.1μg/mL、1μg/mL、5μg/mL和10μg/mL)与BEAS-2B细胞或RAW264.7细胞共培养，分别于培养12h、24h和48h后在450nm处测定各组细胞的吸光度值。
结果如图7(RAW264.7细胞)和图8(BEAS-2B细胞)所示，结果显示，加入HDNPs在48h显著促进RAW264.7细胞的增殖，而对BEAS-2B细胞的生长无明显影响。
(2)探讨HDNPs细胞水平的抗炎活性：研究其是否能够抑制RAW264.7巨噬细胞中LPS刺激引起的激活和炎症反应，使用qPCR法检测了LPS刺激之后RAW264.7细胞中炎症因子的RNA水平。
结果如图9所示(C为IL-1β、D为IL-6，E为COX-2)，结果显示，与单独的LPS处理相比，加入一定浓度的HDNPs后，IL-1β、IL-6、COX-2的mRNA的水平降低，结果表明，一定浓度的HDNPs能抑制LPS诱导的炎性细胞因子的释放。
实施例5
金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的肺靶向性试验：
体内靶向性研究是后续研究HDNPs体内生物活性的前提，因此在验证HDNPs体内作用效果及机制之前检测了HDNPs在体内的靶向分布。
(1)DiI-HDNPs溶液制备：方法同实施例3。
(2)动物活体成像：
尾静脉注射100μL DiI-HDNPs溶液到雌性C57BL/6J小鼠体内，同时设空白对照(给予100μL PBS)和阳性对照(给予100μL DiI染液(DiI:PBS＝1:50))。给药后12h、24h、48h、72h进行荧光成像。
器官(心、肝、脾、肺、肾和股骨)的成像如图10所示，由图可知，PBS组小鼠器官无论在任何时间点均未能检测到荧光信号，DiI组小鼠荧光信号主要分布于肝和骨，DiI-HDNPs组小鼠荧光信号除分布于DiI组分布的器官以外，肺组织中也出现了较强的荧光信号，并且随时间的延长有加强的趋势。
实施例6
金银花源性细胞外囊泡(HDNPs)的体内水平抗感染试验：
(1)甲型流感感染小鼠模型的建立：
选择18-22g SPF级BALB/c雌性小鼠，以2倍半数致死量(LD50)甲型流感病毒毒株(H1N1/PR8)滴鼻感染，每只0.05mL，建立甲型流感病毒(IAV)感染小鼠模型；
(2)将小鼠随机分为5组：(2.1)MOCK组(空白对照组)(n＝8)：给予生理盐水；(2.2)Virus组(病毒模型组)(n＝8)：给予小鼠生理盐水；(2.3)IGH组(n＝8)：小鼠高剂量HDNPs灌胃(粒子数为1×1012))；(2.4)IGL组(n＝8)：小鼠低剂量HDNPs灌胃(粒子数为1×1011)；(2.5)OSE组(阳性对照组)(n＝8)：以磷酸奥司他韦胶囊为阳性对照药，按动物体表面积剂量换算法，给药剂量为21.63mg/(kg·d)。各给药组在感染当天2小时后开始灌胃给药，0.2mL/20g体质量，1次/d，连续给药7d。
各组小鼠的生存曲线图如图11所示，由图可知，HDNPs在小鼠H1N1流感病毒模型中显示出显著的保护效果，显著增加小鼠的生存率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备抗流感病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒由包括如下步骤的制备方法制得：
将金银花原料浸泡后进行破壁粉碎，汁液离心过滤，滤液进行切向流浓缩富集，得到浓缩液；浓缩液离心，上清液过滤，滤液超速离心，收集沉淀，沉淀重悬，过滤，即得。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述金银花原料包括金银花饮片；
优选地，所述汁液离心在1000-4000g下进行，离心时间为20-40min。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述浓缩液离心在0-8℃下以8000-15000g进行40-100min；
优选地，所述超速离心在0-8℃下以80000-150000g进行40-100min。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述浓缩液为浓缩前滤液体积的10-40％；
优选地，所述沉淀重悬后过滤使用0.22μm滤膜过滤。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒；
优选地，所述甲型流感病毒包括H1N1病毒、H2N2病毒或H3N2病毒。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、滴丸剂、粉剂、溶液剂、气雾剂或喷雾剂中的任意一种；
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
8.金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备肺靶向制剂中的应用；
优选地，所述肺靶向制剂还包括负载于所述金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒中的其他抗流感病毒的药物。
9.金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备巨噬细胞增殖促进剂中的应用。
10.金银花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备巨噬细胞炎症反应抑制剂中的应用。
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| CN117752564A (zh) * | 2023-12-15 | 2024-03-26 | 广州中医药大学第三附属医院(广州中医药大学第三临床医学院、广州中医药大学附属骨伤科医院、广东省中医骨伤研究院) | 玫瑰花源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备美白抗氧化功效的产品中的应用 |
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| CN115414397A (zh) * | 2022-09-14 | 2022-12-02 | 广州中医药大学第三附属医院 | 续断源性细胞外囊泡样纳米颗粒在制备预防或治疗骨科疾病药物中的应用 |
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