CN108697771A

CN108697771A - 癌症治疗

Info

Publication number: CN108697771A
Application number: CN201780011674.3A
Authority: CN
Inventors: M·佩兰; J·凯尼恩; J·A·M·科拉莱斯; M·A·G·查维兹
Original assignee: Propanc Pty Ltd
Current assignee: Propanc Pty Ltd
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-27
Publication date: 2018-10-23
Also published as: JP7058604B2; JP2019507129A; NZ744845A; WO2017127892A1; EP3407909A1; IL260814A; EP3407909B1; CA3012398A1; HK1251794A1; ES2965358T3; AU2017212151B2; EP3407909A4; DK3407909T3; IL260814B; US20230089740A1; SG11201806318UA; IL260814B2; AU2017212151A1; US11376313B2; US20190038725A1

Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的组合物、方法、用途和试剂盒。本发明涉及用于在受试者中使癌症的进展最小化的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中使癌症的进展最小化。特别地，这些方法提供了通过在该受试者中减少癌症干细胞的数量来治疗癌症的方法。

Description

癌症治疗

技术领域

本发明涉及用于治疗癌症的组合物、方法、用途和试剂盒。

申请的交叉引用

本申请要求西班牙专利申请P 201630112和P 201631662的优先权，将其全部内容以其整体并入本文。

背景技术

尽管针对治疗癌症的疗法有所改进，但是全球癌症死亡率仍然很高，并且仍然需要预防癌症的复发的策略。目前针对癌症的治疗策略经常导致治疗失败，这通常是由于多种恶性肿瘤的发展和/或对化学疗法和放射疗法的抗性。

癌症干细胞(CSC)是永生的肿瘤起始细胞，其具有自我更新的能力并具有多能性能力(Reya等人，(2001).Nature[自然]414:105-111)。CSC存在于多种恶性肿瘤(包括白血病和许多实体瘤)中，并且鉴于其干细胞特性，被认为是肿瘤起始、发展、转移和复发的基础(Tang DG.Cell Res[细胞研究]2012；22:457-72)。

CSC仅代表肿瘤内的一小部分癌细胞，并且可以长时间保持静止，从而避过了靶向高度增殖细胞的常规疗法(例如，化学疗法和放射疗法)(Chikamatsu等人，(2011)HeadNeck.[头颈杂志]34(3):336-43)。因此，用于改进癌症治疗和减少癌症再发的风险的优先事项是开发选择性地靶向CSC根除同时保留正常干细胞的新策略。

在本说明书中对任何现有技术的提及并不是承认或暗示此现有技术形成任何管辖权的公知常识的一部分，或者此现有技术可合理地预期被理解为被认为与本领域技术人员已知的其他现有技术是相关的和/或与之组合。

发明内容

在第一方面，本发明涉及一种在已经接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中使癌症的进展最小化。

在另一方面，本发明涉及一种在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变(minimal residual disease)的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中治疗微小残留病变。

在另一方面，本发明涉及一种在正在接受癌症治疗的受试者中预防微小残留病变的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在受试者中预防微小残留病变。

在另一方面，本发明涉及一种在已经接受过癌症治疗的受试者中预防癌症的复发的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中预防癌症的复发。

在另一方面，本发明涉及一种在受试者中预防或抑制癌症的转移的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中预防癌症的转移。

在又另一方面，本发明涉及一种使受试者对随后的癌症治疗增敏的方法，该方法包括在受试者接受癌症治疗之前向受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而使该受试者对随后的癌症治疗增敏。

在又另一方面，本发明涉及一种在受试者中预防癌症的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，其中该受试者被认为有癌症发展的风险。

本发明还涉及一种在受试者中延迟癌症的发作的方法，该方法包括给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中延迟癌症的发作。

在本发明的任何方法或用途中，受试者中的癌症干细胞的数量可以在数量上减少或防止其增加。可替代地，可以区分癌症干细胞。癌症干细胞的鉴定或分化的程度可以通过本文所述的任何方法使用如本文(特别是表1)所述的标志物来确定。

进一步提供了用于在已经接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化的组合物，这些组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

在另一个方面，本发明提供了用于在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变的组合物，这些组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

在仍另一方面，本发明提供了用于在受试者中预防癌症的转移的组合物，这些组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

本发明还考虑了胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在受试者中使癌症的进展最小化，其中该受试者先前已经接受过癌症治疗。

此外，本发明考虑了胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变。

在本文所述的本发明的任何方法中，该方法可以进一步包括鉴定受试者中癌症干细胞的存在的步骤。

在本文所述的本发明的任何方法中，该方法可以进一步包括提供已经接受过癌症治疗的受试者的步骤。此外，在给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原时，受试者可能不具有可检测的癌症，例如，由于先前治疗(那时向受试者给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原)，癌症的大小、质量或其他物理量度可能大大减少。

本发明还涉及一种在受试者中治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：

-鉴定受试者中癌症干细胞的存在；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中治疗癌症。

本发明还涉及一种在受试者中预防癌症的方法，该方法包括以下步骤：

-鉴定未被诊断患有癌症的受试者中癌症干细胞的存在；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防癌症。

-提供被鉴定为有患癌症风险但是未被诊断为患有癌症的受试者；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防癌症。

本发明还涉及一种在受试者中延迟癌症的发作的方法，该方法包括以下步骤：

-提供有癌症风险但是未被诊断为患有癌症的受试者；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中延迟癌症的发作。

在本发明的任何实施例中，被认为有癌症风险的受试者或个体可以是具有癌症家族史的个体，其具有一种或多种与癌症相关的生物标志物，包括具有癌症干细胞。

因此，本发明还涉及一种在受试者中预防癌症的方法，该方法包括以下步骤：

-鉴定受试者中癌症干细胞的存在，其中该受试者未被诊断为患有癌症；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防癌症。

-鉴定有患癌症风险但是未被诊断为患有癌症的受试者中癌症干细胞的存在；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防癌症。

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中延迟癌症的发作。

在另一实施例中，本发明涉及一种在受试者中预防癌症的复发的方法，该方法包括以下步骤：

-提供已经接受过癌症治疗的个体；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防癌症的复发。

在另一实施例中，本发明涉及一种在受试者中预防癌症的转移的方法，该方法包括以下步骤：

-提供将要接受癌症治疗、正在接受癌症治疗或已经接受过癌症治疗的个体；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防癌症的转移。

此外，本发明涉及一种在受试者中延迟癌症的复发的方法，该方法包括以下步骤：

-提供已经接受过癌症治疗的个体；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中延迟癌症的复发。

此外，本发明涉及一种在受试者中延迟癌症的发作的方法，该方法包括以下步骤：

-提供有癌症发展的风险的个体；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中延迟癌症的发作。

优选地，在现有肿瘤的部位或治疗干预的部位鉴定是否发生癌症干细胞的存在。典型地，治疗干预是手术切除、化学疗法或放射疗法。

优选地，使用如本文(例如表1中)所述的任何一种或多种标志物鉴定癌症干细胞。例如，胰腺特异性CSC标志物包括CD326、CD44和CxCR4，且结肠特异性CSC标志物包括：CD326和CD44，并通过免疫荧光或流式细胞术分析。

-通过确定表1中细胞表面标志物中的任何一种或多种的存在来鉴定受试者中癌症干细胞的存在；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中治疗癌症。

本发明还涉及一种在受试者中治疗结肠癌的方法，该方法包括以下步骤：

-通过确定细胞表面标志物CD326和CD44中的任何一种或多种的存在来鉴定受试者中结肠癌干细胞的存在；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中治疗结肠癌。

本发明还涉及一种在受试者中预防结肠癌的方法，该方法包括以下步骤：

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防结肠癌。

本发明还涉及一种在受试者中延迟结肠癌的发作的方法，该方法包括以下步骤：

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中延迟结肠癌的发作。

本发明还涉及一种在受试者中预防结肠癌的复发的方法，该方法包括以下步骤：

-提供已经接受结肠癌治疗的受试者；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防结肠癌的复发。

本发明还涉及一种使受试者对结肠癌的治疗增敏的方法，该方法包括以下步骤：

-提供将要接受结肠癌治疗的受试者和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而使该受试者对结肠癌的治疗增敏。

本发明还涉及一种在受试者中治疗胰腺癌的方法，该方法包括以下步骤：

-通过确定细胞表面标志物CD326、CD44和CxCR4中的任何一种或多种的存在来鉴定受试者中胰腺癌干细胞的存在；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中治疗胰腺癌。

本发明还涉及一种在受试者中预防胰腺癌的方法，该方法包括以下步骤：

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防胰腺癌。

本发明还涉及一种在受试者中延迟胰腺癌的发作的方法，该方法包括以下步骤：

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中延迟胰腺癌的发作。

本发明还涉及一种在受试者中预防胰腺癌的复发的方法，该方法包括以下步骤：

-提供已经接受胰腺癌治疗的受试者；和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而在该受试者中预防胰腺癌的复发。

本发明还涉及一种使受试者对胰腺癌的治疗增敏的方法，该方法包括以下步骤：

-提供将要接受胰腺癌治疗的受试者和

-给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，

从而使该受试者对胰腺癌的治疗增敏。

本发明还涉及一种包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原或由其组成的组合物，在如下中使用：(a)在已经接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化，(b)在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变，或(c)使受试者对随后的癌症治疗增敏。典型地，该组合物进一步包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。

本发明还提供了一种包括至少一个剂量单位的试剂盒，该试剂盒在已经接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化，其中该剂量单位包括胰凝乳蛋白酶原、胰蛋白酶原和药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体。任选地，试剂盒还包括书面说明书，用于指导使用者根据本文所述的本发明方法给予剂量单位的胰凝乳蛋白酶原。

当用于本发明的方法时，本发明还提供了本发明的试剂盒。

在本发明的任何方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原以1:1或约1:1至10:1或约10:1、4:1或约4:1至8:1或约8:1、5:1或约5:1至7:1或约7:1、或以约6:1的范围的重量比给予。此外，上述的任一组合物具有1:1或约1:1至10:1或约10:1、4:1或约4:1至8:1或约8:1、5:1或约5:1至7:1或约7:1、或以约6:1的范围的重量比的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

在本发明的任何方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原是静脉内、肌肉内或皮下给予的。

在本发明的任何方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原可以同时或顺序给予。

在本发明的方法或用途的任何方面，该方法或用途进一步包括鉴定患有癌症或有发展癌症风险的受试者的步骤。优选地，该癌症是本文所描述的任何一个。

在本发明的任何方面中，该组合物不包含或者该方法或用途不给予淀粉酶。

在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰凝乳蛋白酶原的量可以是大于或等于1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、3.5mg/kg、5mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、135mg/kg、250mg/kg或500mg/kg。

在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰蛋白酶原的量可以是大于或等于0.2mg/kg、0.25mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、20mg/kg、40mg/kg或80mg/kg。

在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予人类的胰凝乳蛋白酶原的量可以是大于或等于0.1mg/kg、0.15mg/kg、0.25mg/kg、0.4mg/kg、1.2mg/kg、3.5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg或40mg/kg。

在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予人类的胰蛋白酶原的量可以是大于或等于0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.2mg/kg、0.6mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg或6mg/kg。

优选地，在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰凝乳蛋白酶原的量可以是1mg/kg至41mg/kg、1.5mg/kg至500mg/kg、2mg/kg至250mg/kg、3.5mg/kg至135mg/kg、5mg/kg或15mg/kg至45mg/kg的范围。

优选地，在本文所述本发明的任何方面、实施例或形式中，给予的胰蛋白酶原的量可以是大于0.2mg/kg至7mg/kg、0.25mg/kg至80mg/kg、0.4mg/kg至40mg/kg、0.6mg/kg至20mg/kg、0.8mg/kg至8mg/kg、或2.5mg/kg至8mg/kg。

在以上发明的任何组合物中，该组合物可以被调节用于给予受试者胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的相关的mg或mg/kg。

如本文所用的，除非上下文另有要求，术语“包含(comprise)”及该术语的变体如“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”并不旨在排除其他添加剂、组分、整体或步骤。

前述段落中所述的本发明其他方面和这些方面的其他实施例将从以举例方式给出的以下描述中并且参考附图而变得清楚。

附图说明

图1：MTT测定以确定胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的IC₅₀。显示了用不同浓度的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原(1:6)或干扰素α(IFN)处理的结肠HCT-116CSC和胰腺BxPC3CSC的细胞增殖速率与处理浓度。

图2：人胰腺癌细胞系BxPC3的细胞周期测定。小图a和b显示了胰腺非CSC的测定结果；小图c和d显示了胰腺CSC的测定结果。

图3：人结肠癌细胞系HCT-116的细胞周期测定。小图a和b显示了结肠非CSC的测定结果；小图c和d显示了结肠CSC的测定结果。

图4：人胰腺细胞系BxPC3的醛脱氢酶测定。显示在用对照、PRP、PRP+IFN或IFN处理细胞后，胰腺非CSC和CSC中ALDH阳性细胞的百分比。

图5：在用PRP、PRP+IFN或IFN处理细胞后，基于标志物CD326、CD44和CxCR4的细胞表面表达，胰腺CSC的流式细胞术分选的点图结果。

图6：针对用PRP、PRP+IFN或IFN处理的CSC和非CSC所显示的，显示胰腺CSC中CSC标志物表达：具有三种标志物CD326、CD44、CxCR4的细胞百分比的直方图。显示了两个单独测定的结果。

图7：描绘结肠CSC的流式细胞术分选结果的直方图。针对用PRP、IFN或PRP+IFN处理后的细胞所显示的，是ALDH阳性并表达CD44和CD326标志物的HCT-116CSC的百分比。

图8：描绘在用PRP处理后表达标志物CD44或CD326的ALDH阳性HCT-116CSC的百分比的直方图。

图9：显示在用PRP、INF或PRP+IFN处理后第2天和第5天，胰腺BxPC3CSC的球体形成的代表性的光学显微镜图像。

图10：在用PRP、INF或PRP+IFN处理后第2天和第5天，结肠HCT-166CSC的球体形成的代表性光学显微镜图像。

图11：当在CSC条件下培养SK-N-SH细胞时形成的神经母细胞瘤球体的代表性光学显微镜图像(小图A和C)。向培养基中添加PRP防止了神经母细胞瘤球体的形成(小图B和D)。原始放大倍数小图A和B为10x；小图C和D为20x。E和F：未处理的和用PRP处理的BxPC3和SK-N-SH细胞中的初级(E)和次级(F)球体的数量。

图12：用PRP(浅灰色)处理后用于表达EMT相关基因的qRT-PCR分析的结果。使用GAPDH作为内部对照，将未处理的CSC的数据归一化为1，并绘制为平均值±SEM(n＝3)。

图13：用PRP(浅灰色)处理后用于表达CSC相关基因的qRT-PCR分析的结果。使用GAPDH作为内部对照，将未处理的CSC的数据归一化为1，并绘制为平均值±SEM(n＝3)。

图14：A.用于评估PRP对CSC的抗肿瘤活性的体内研究设计。垂直条代表PRP推注注射。B.用于评估PRP抑制胰腺CSC肿瘤能力起始的能力的体内研究设计。C.用于评估体内CSC的转移潜力的体内研究设计。垂直条代表PRP推注注射。

图15：在用CSC接种后9.5周，从小鼠切除的肿瘤的图像。对照组，n＝10；预防组，n＝8；预防+处理组，n＝6。

图16：接种CSC后小鼠的肿瘤发生率百分比。接种后9.5周测量肿瘤发生率。预防组、和预防+处理组的发生率百分比显示为与对照小鼠(无预防或治疗)中观察到的发生率的比例。P＝0.039

图17：在治疗终止时(接种后9.5周)，小鼠的平均肿瘤体积(mm²)±SE。对照组和预防+处理组之间的肿瘤重量的差异具有统计学显著性，p<0.05。

图18：A.描绘在CSC接种后每2天测量的每个实验组(对照组、预防组、和预防+处理组)中肿瘤体积的图。X轴表示肿瘤发展的天数。第0天对应于CSC接种后30天。A.描绘在CSC接种后每2天(基于速率的T/C)测量的每个实验组(对照组、预防组、和预防+处理组)中肿瘤体积的图。X轴表示肿瘤发展的天数。第0天对应于CSC接种后30天。星号表示统计学显著性，p<0.05。

图19：在CSC接种后9.5周，对照组、预防组、和预防+处理组的肿瘤发生指数(TIn)±SE。TIn是肿瘤发生率和肿瘤重量的量度。对照组与预防组和预防+处理组两者之间的TIn差异具有统计学显著性，p<0.01。

图20：显示H&E染色的代表性图像。在皮下异种移植模型中，将来自对照组、预防组和预防+处理组中小鼠的肿瘤进行切除和固定。将BxPC3肿瘤组织包埋在石蜡中，切成5μm厚并用H&E染色(左：放大倍数，20x；中间：放大倍数，10x；右：放大倍数，x40)。

图21：显示皮下异种移植模型中BxPC3肿瘤的Masson-trichome染色的代表性图像。显示了来自对照组、预防组和预防+处理组中小鼠的肿瘤染色。

图22：在PRP处理后的CSC中EMT相关基因的表达水平。A：通常在EMT期间下调但在PRP处理后上调的基因的表达。B：通常在EMT期间上调但在PRP处理后下调的基因的表达。

图23：PRP处理对与CSC细胞分化相关的基因的表达水平的影响。

图24：PRP处理对CSC中肿瘤抑制基因的表达水平的影响。

图25：PRP处理对与转移和侵袭(A)和细胞黏附(B)相关的基因的CSC表达水平的影响。

图26：PRP处理对编码细胞因子的基因的CSC的表达水平的影响。

图27：PRP处理对CSC标志物基因的表达的影响。

图28：PRP处理对CSC中MAPK相关基因的表达的影响。

具体实施方式

应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。这些不同组合的全部构成本发明的多个替代性方面。

现在将详细地参照本发明的某些实施例。虽然本发明将结合实施例来进行描述，但是应当理解的是，不意图将本发明限于那些实施例。相反，本发明意图涵盖可以包括在如权利要求书所限定的本发明的范围内的所有替代方案、修改方案以及等效方案。

本领域技术人员应认识到类似于或等同于本文所述的那些的可以在本发明的实践中使用的许多方法和材料。本发明绝不限于所述的方法和材料。应当理解的是，在本说明书中披露和限定的本发明可扩展至所提及的或者从文本部分和附图部分显而易见的单个特征的两个或更多个的所有可替换组合。这些不同组合的全部构成本发明的多个替代性方面。

在此提及的所有专利和公开物均通过引用以其全文结合在此。

出于解释本说明书的目的，以单数形式使用的术语也包括复数并且反之亦然。

目前针对癌症的治疗策略具有严重的局限性，这经常导致治疗失败。累积的证据表明，这些失败的基础是由于目前的疗法无法消除CSC，这意味着患者有复发和转移的风险。此外，有证据表明CSC群体比非CSC群体对常规癌症疗法更具抗性。因此，消除CSC对于治疗恶性疾病至关重要。

本发明基于以下出人意料的发现：通过提供胰腺(前)酶胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的组合，可能减少CSC的增殖、减少癌细胞群体中CSC的群体、抑制球体形成、和减少与上皮向间充质表型转变相关的CSC中的基因的表达。因此，本发明的诸位发明人已经鉴定了用于靶向癌细胞群体中的CSC的新颖方法。这一发现对于先前已经接受过癌症治疗的个体的治疗具有重要的应用，特别是考虑到常规癌症疗法通常不能根除靶CSC，并且尽管癌症治疗显然是成功的，但癌症复发的可能性很高。

因此，在第一方面，本发明提供了用于在接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

胰凝乳蛋白酶原(在本文中其可缩写为“C”)是酶胰凝乳蛋白酶的一种酶原形式，其优先地在以下氨基酸处切割蛋白：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和亮氨酸。胰凝乳蛋白酶可以被称为或包括胰凝乳蛋白酶A、胰凝乳蛋白酶B(包括B1和B2形式)、胰凝乳蛋白酶C、a-糜蛋白酶、糜蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、α-胰凝乳酶、蛋白质溶解酶、α-胰凝乳酶(quimar)、糜蛋白酶(quimotrase)、α-胰凝乳蛋白酶(α-chymar)、α-胰凝乳蛋白酶A、α-胰凝乳蛋白酶。胰凝乳蛋白酶C可以从猪胰凝乳蛋白酶原C或从羧肽酶原A的牛亚基II形成，并且优先地在以下氨基酸处切割蛋白：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺。胰凝乳蛋白酶原包括胰凝乳蛋白酶原A、胰凝乳蛋白酶原B1和胰凝乳蛋白酶原B2。

胰蛋白酶原(在本文中其可被缩写为“T”)是胰蛋白酶的酶原形式，其优先地在精氨酸和赖氨酸处切割蛋白。胰蛋白酶可以被称为或包括α-胰蛋白酶、β-胰蛋白酶、茧酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶(parenzymol)、胰蛋白酶(tryptar)、胰蛋白酶(trypure)、胰蛋白酶(pseudotrypsin)、类胰蛋白酶、胰蛋白酶(tripcellim)、精子受体水解酶β-胰蛋白酶，可以从胰蛋白酶原通过切割一个肽键形成。进一步的肽键切割产生α和其他的同种型。多种阳离子和阴离子胰蛋白酶可以从许多脊椎动物的胰腺中和更低等的物种(包括小龙虾、昆虫(茧酶)和微生物(灰色链霉菌))中分离出来。在消化的正常过程中，无活性胰蛋白酶原被存在于肠黏膜中的肠肽酶活化以形成酶胰蛋白酶，其然后作为丝氨酸蛋白酶起作用在碱性氨基酸/蛋白质的羧基侧切割肽键。

如上所述，该酶原形式主要地提供原位(例如，通过体内或体外活化)活化的酶的无活性形式。例如，酶原的活化(酶原向活性酶的转化)可以在与CSC接触时发生。据信，该酶原胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原在与癌症细胞接触并且不与健康细胞接触时被选择性地活化为酶胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。酶原的使用减少了与原位提供活性酶相关的问题，例如在到达癌症细胞的预期的靶之前或酶的不期望的反应或失活。

不希望受理论束缚，诸位发明人认为酶原胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的组合起到抑制生长因子和血管生成刺激因子的产生的作用，这促成肿瘤龛(tumour niche)并因此降低肿瘤移植的潜力。此外，蛋白酶原酶诱导CSC分化，从而减少CSC的总群体，并降低肿瘤的复发或转移的可能性。例如，诸位发明人已经表明，当在适当条件下向CSC提供胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原时，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原减少CSC的增殖、减少癌细胞群体中CSC的群体、抑制球体形成并降低与上皮向间充质表型转变相关的CSC中的基因的表达。鉴于此，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原的用途在已经接受过癌症治疗的受试者中在使癌症的进展、复发或转移最小化的方面具有特别的用途，尤其是考虑到常规癌症治疗典型地不靶向或不最小化CSC。

如本文所用的，“使癌症的进展最小化”意指治疗受试者以预防或延迟肿瘤的复发或转移。使癌症的进展最小化包括在癌症治疗后预防或延迟癌症的复发。正在被预防的复发包括例如在手术切除后在肿瘤床中的复发。可替代地，复发包括在身体的另一部分中的癌症的转移。本文所用的术语“预防复发(preventing recurrence)”和“预防再发(preventing relapse)”是可互换的。

本发明还包括在个体中预防癌症的发展的方法。例如，需要预防癌症的个体可能被认为有患癌症的风险、但尚未具有可检测的癌症。有癌症发展风险的个体可以是具有癌症家族史的个体、和/或基因测试或其他测试表明有癌症发展的高风险或高可能性的个体。个体可能具有癌症干细胞，但尚未发现具有任何可检测的肿瘤。应当理解的是，预防癌症的发展的方法包括在受试者中延迟癌症的发作的方法。

受试者先前已经接受过的治疗可以是任何常规的癌症治疗，包括化学疗法、放射疗法、免疫疗法和/或手术切除肿瘤。在一个实施例中，受试者接受的治疗是手术切除肿瘤。在另一个实施例中，例如在非实体瘤的治疗中，受试者已经接受化学疗法、放射疗法或免疫疗法、或其组合。在又另一实施例中，受试者在根据本发明的方法给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原之前已经接受过外科手术、化学治疗和放射治疗干预。任何减少肿瘤体积或质量的方法都被认为是受试者先前已经接受过的治疗。

已经接受过癌症治疗的受试者可能部分或完全缓解。换句话说，如上所述，已经接受过癌症治疗的受试者可以在肿瘤生长的可测量参数上减少50％或更多，这可以在体格检查、放射学研究中发现或通过来自血液或尿液检查的生物标志物水平发现。可替代地，在受试者完全缓解的情况下，所有可检测的疾病表现完全消失，使得该受试者不具有任何可检测的癌症体征。受试者可能具有基本上不可检测的癌症体征。“基本上不可检测的”癌症通常是指如下情况：治疗已经耗尽癌症的大小、体积或其他物理量度，使得作为治疗的结果，使用相关标准检测技术(例如体内成像)不能明显地检测到癌症。

常规癌症疗法的关键限制是即使在手术切除肿瘤和辅助疗法(例如化学疗法)之后，也可能存在微小残留病变。微小残留病变(MRD)是指治疗后留在患者体内的少量癌细胞。典型地，这些细胞难以检测或根本检测不到，因此认为患者没有任何可检测的癌症。然而，MRD是癌症再发的主要原因，并且即使在广泛治疗后CSC的存在也被认为是MRD的关键因素。

因此，本发明提供了一种在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗或预防微小残留病变的方法，该方法包括给予该受试者治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

用胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原治疗的目的或结果可以是减少癌细胞的数量；减少原发肿瘤的大小；抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即，在一定程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与障碍相关的一种或多种症状。

治疗的功效可以通过评估存活持续时间、疾病进展时间、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。

在一个实施例中，该方法对于延迟疾病进展特别有用。

在一个实施例中，该方法对于延长受试者的存活(包括总体存活以及无进展存活)特别有用。

在一个实施例中，该方法对于提供对治疗的完全响应特别有用，由此响应于治疗，所有癌症体征都消失了。这并不总是意味着癌症已经治愈。

在一个实施例中，该方法对于提供对治疗的部分响应特别有用，由此响应于治疗，一个或多个肿瘤或病变的大小或体内癌症的程度已经减小。

本发明的方法还包括在受试者接受常规癌症治疗之前进行CSC的靶向治疗。技术人员将理解的是，该方法特别适用于其中不可能通过手术切除肿瘤的血液癌症。因此，本发明提供了一种在治疗癌症之前使受试者增敏的方法，该方法包括在受试者接受癌症治疗之前向受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

此外，本发明的方法还包括在受试者接受常规癌症治疗的同时靶向治疗CSC。因此，本发明提供了一种进一步治疗受试者的癌症的方法，该方法包括在治疗完成时预防微小残留病变的可能性、或延迟或预防癌症的复发，该方法包括与常规癌症治疗同时向受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

癌症干细胞的鉴定可以通过一种或多种标志物的检测来进行。示例性标志物显示在下表1中。

可以使用本文所述的任何方法从组织或样品中分离癌症干细胞。来自肿瘤或肿瘤基质的样品的癌症干细胞可以通过切割样品的至少一部分来鉴定、针对任何一种或多种癌症干细胞标志物进行标记(优选免疫标记)、和通过免疫荧光进行分析。

该“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物可以是人类，或者可以是家养动物、动物园动物或宠物。虽然特别考虑到本发明的方法适用于人类的医学治疗，但它们也适用于兽医治疗，包括治疗宠物如狗和猫以及家养动物如马、牛和绵羊，或者动物园动物如猫科动物、犬科动物、牛科动物和有蹄类动物。受试者可能患有癌症或其他障碍，或者可能不患有癌症或其他障碍(即，没有可检测到的疾病)。

人类受试者的典型体重可以是大于或等于60kg、65kg、70kg、75kg、80kg、85kg、90kg、95kg、100kg、105kg或110kg。

术语“治疗有效量”是指组合物的量、或组合物中药剂或化合物的量能够使癌症的进展最小化、治疗癌症、预防癌症的复发、或减轻癌症或其扩散(转移)。治疗有效量可以凭经验并且以与治疗癌症有关的常规方式确定，并且会导致增加的预期寿命。

如本文所述，本发明的方法包括使使癌症的进展最小化，预防微小残留病变(该微小残留病变与赘生物和相关病症、癌症、肿瘤、恶性和转移病症相关)的复发或对其进行治疗。与可以用本发明的方法或药物组合物治疗的与实体瘤和转移瘤相关的组织和器官包括但不限于：胆道、膀胱、血液、脑、乳房、子宫颈、结肠、子宫内膜、食道、头、颈、肾、喉、肝、肺、髓质、黑色素、卵巢、胰腺、前列腺、直肠、肾脏、视网膜、皮肤、胃、睾丸、甲状腺、尿路和子宫。

本发明的方法和药物组合物对于使进展最小化(包括预防以下类型的癌症和转移癌的复发)是有用的：胰腺癌、食道癌、结肠癌、肠癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤或肺癌。优选地，该癌症是胰腺癌、结肠癌或卵巢癌。更优选地，该癌症是胰腺癌。

本发明的方法和药物组合物可以提供治疗癌症的多效方法，例如通过增加肿瘤细胞凋亡、增加细胞与细胞的黏附、分化和免疫原性(通过免疫系统靶向和去除)。因此，在不存在可能抑制或损害免疫系统的任何其他治疗的情况下进行治疗是有益的。

除了提供治疗方法之外，应当理解的是，本发明包括治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在已经接受过癌症治疗的受试者使癌症的进展最小化。

在另一实施例中，该用途包括胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在受试者中治疗微小残留病变、或用于在受试者接受癌症治疗之前使该受试者增敏。

本发明的方法涉及向对其有需要的受试者给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

用于本发明的任何方面的胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原可以是经分离的、纯化的、基本上纯的、重组的或合成的。

酶原胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原可以是选自胰凝乳蛋白酶类别3.4.21.1或3.4.21.2的酶、或来自类别3.4.21.4、或选自任何其他适合的来源(根据国际生物化学与分子生物学联合会的命名委员会的分类分组的类别)的胰蛋白酶的前体。这些酶是可商购的并且可以是人类、牛或猪来源的。

在本发明的某些方面中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原可以同时或顺序给予。当同时给予时，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原可以包含在相同的药物组合物中。当在相同的药物配制品中组合时，胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比可以在1:1至10:1或约10:1之间、在4:1或约4:1至8:1或约8:1之间、在5:1或约5:1至7:1或约7:1之间、或在约6:1的范围内。在一个实施例中，胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间，优选6:1的范围内。

在一个方面，本发明的药物配制品仅包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原作为活性剂。在可替代的实施例中，组合物中包含另外的活性剂。例如，除了胰腺酶原胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原之外，这些组合物还可包括用于癌症治疗的其他已知疗法。

本发明的药物组合物可以例如通过采用常规的固体或液体载体或稀释剂连同适合于所需给予方式的类型的药物添加剂(例如赋形剂、黏合剂、防腐剂、稳定剂、调味剂等)，根据例如药物配制品领域中熟知的技术进行配制。

本发明的药物组合物、和其制剂或配制品可以通过使组合物的组分(包括胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原)混合在一起来制备。该混合可以顺序地或同时进行。

本发明的药物组合物可以常规地以剂量单位形式存在，并且可以通过制药领域中熟知的任何方法来制备。所有方法包括使活性剂和/或蛋白酶酶原与构成一种或多种辅助成分的载体相关联的步骤。通常，该药物组合物通过以下步骤来制备：使活性剂和/或蛋白酶酶原均匀地并密切地与液体载体或精细分散的固体载体或两者相关联，以及然后视需要将产品成型为所希望的配制品。该活性剂和/或蛋白酶酶原以剂量单位形式提供，其量足以在单次或重复给予后对疾病的病程或状况产生所希望的作用。

本发明的药物组合物可以处于适合口服使用形式，例如，片剂、糖锭剂、锭剂、水性的或油性的悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳液、硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。旨在用于口服使用的组合物可以根据本领域已知的用于制造药物组合物的任何方法来制备，并且为了提供药学上精致的并且适口的制剂，此类组合物可以包含一种或多种选自下组的试剂，该组由以下各项组成：甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。片剂包含与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂，这些赋形剂适合片剂的制造。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂，如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒剂和崩解剂，例如玉米淀粉或海藻酸；黏合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。这些片剂可以是未包衣的，或者它们可以通过已知的技术来包衣以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，并且由此在一个更长时期提供持久的作用。例如，可以采用延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。它们也可被包衣以形成用于控制释放的渗透性治疗片剂。

口服使用的配制品还能以硬明胶胶囊的形式呈现，其中第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂与惰性固体稀释剂(例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合，或者以软明胶胶囊的形式呈现，其中第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂与水或油介质(例如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合。

水性悬浮液包含与适于制造水性悬浮液的赋形剂相混合的活性剂和蛋白酶酶原。此类赋形剂是助悬剂，例如，羧甲纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯基吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂可以是天然磷脂，例如卵磷脂，或烯烃氧化物与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯、或环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物，例如，十七亚乙基氧基鲸蜡醇，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，比如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯，或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇脱水物的偏酯的缩合产物，例如聚乙烯脱水山梨醇单油酸酯。水性悬浮液还可以包含一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂、以及一种或多种甜味剂如蔗糖或糖精。

含油悬浮液可以这样配制：将活性剂和蛋白酶酶原悬浮于植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油中，或于矿物质油例如液状石蜡中。所述油悬浮液可以包含增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或十六烷醇。可以添加如上文所述的甜味剂、以及调味剂来提供美味的口服制品。这些可以通过添加抗氧化剂，如抗坏血酸来保存。

通过添加水，适合制备水性悬浮液的可分散粉末以及颗粒提供了与分散剂或湿润剂、悬浮剂以及一种或多种防腐剂混合的第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂。适合的分散剂或润湿剂和助悬剂例如上文已经提及的那些。也可以存在另外的赋形剂，例如甜味剂、调味剂和着色剂。

本发明的药物组合物还可以处于水包油乳液的形式。所述油相可以是植物油，例如橄榄油或花生油；或矿物油，例如液态石蜡或这些物质的混合物。适合的乳化剂可以是天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶；天然存在的磷脂，例如大豆、卵磷脂，和衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如单油酸山梨聚糖，和所述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯单油酸山梨聚糖。所述乳剂还可以包含甜味剂和调味剂。

糖浆剂和酏剂可以用甜味剂例如甘油、丙二醇、山梨醇或蔗糖进行配制。它们还可以包含润药剂(demulcent)、防腐剂和调味剂和着色剂。

本发明的这些药物组合物可以处于无菌的可注射水性或油性悬浮液形式。这种悬浮液可以根据本领域已知的使用上面已经提及的那些适合的分散剂或润湿剂以及助悬剂来配制。第一和第二方面的药物组合物还可以是在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的一种无菌可注射的溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的一种溶液。可采用的可接受的载体以及溶剂有水、林格氏溶液、以及等渗氯化钠溶液。此外，常规采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可采用任何温和的非挥发油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，发现脂肪酸(如油酸)可用于注射剂的制品中。

在一个具体的实施例中，本发明的药物组合物被配制成用于直肠给予药物的栓剂。可以通过将第一和第二方面的蛋白酶酶原和活性剂与一种适合的非刺激性赋形剂混合来制备这些配制品，该赋形剂在室温下是固体并且在直肠温度下是液体并且因此将在直肠中熔化从而释放药物。这类物质包括可可脂以及聚乙二醇。直肠给予可以用于消除与口服给予酶相关的胃肠道中的肠-肝首过效应。

本发明的药物组合物也可以配制成脂质体。如本领域中所已知，脂质体通常源自磷脂或其他脂质物质。脂质体由分散在一种水性介质中的单层或多层水合液体晶体形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的、生理学上可接受的和可代谢的脂质。脂质体配制品可以包含稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂质是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱。形成脂质体的方法是本领域中已知的。

本发明的药物组合物可以与给予说明书一起包括在容器、包装、或分配器中。该药物组合物的蛋白酶酶原和活性剂和任选的另外的活性剂可以在容器、包装或分配器中作为分离的组分提供，以分别或一起在相同或不同的时间用于本文所述的发明的用途或方法。

本发明药物组合物的适当剂量水平通常为每天每千克患者体重约0.01mg至500mg，其能以单剂量或多剂量给予。可以是从每天约0.1mg/kg至约250mg/kg；或每天约0.5mg/kg至约100mg/kg。适合的剂量水平可以是每天约0.01mg/kg至250mg/kg、每天约0.05mg/kg至100mg/kg、或每天约0.1mg/kg至50mg/kg。在此范围内，剂量可以是每天0.05mg/kg-0.5mg/kg、0.5mg/kg-5mg/kg或5mg/kg-50mg/kg。

对于口服给予，药物组合物可以以含有1.0毫克-4000毫克蛋白酶酶原(特别是1.0毫克、5.0毫克、10.0毫克、15.0.20.0毫克、25.0毫克、50.0毫克、75.0毫克、100.0毫克、150.0毫克、200.0毫克、250.0毫克、300.0毫克、400.0毫克、500.0毫克、750.0毫克、1000毫克、1500毫克、2000毫克、2500毫克、3000毫克、3500毫克、和4000毫克的蛋白酶原酶)的片剂的形式提供，用于对待治疗的患者的剂量进行对症调整。如本文所述的药物组合物可以以如下方案给予：每天1至4次、每天一次或两次、或每天一次，其中减少的给予要求通常导致更高的依从性。

剂量可以根据是否给予单次给予形式的组合物而广泛变化。对于如本文所述的药物组合物的实施例的合适的单次给予可以包括：

●胰蛋白酶原的量在1mg-100mg之间，特别是在2mg-50mg之间，更特别地(以mg计)是1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0；和

●胰凝乳蛋白酶原的量在1mg-100mg之间，特别是在2mg-50mg之间，更特别地(以mg计)是1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、40.0、50.0。

然而，应当理解的是，任何具体患者的特定剂量水平和剂量频率可以是不同的，并且取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、代谢稳定性和该化合物的作用时长，年龄，体重，总体健康，性别，饮食，给予模式和时间，排泄速率，药物组合，具体病症的严重程度，以及接受治疗的宿主。

如本文所述的药物组合物的实施例的各种组分(如果存在)的合适剂量水平可以包括：

●胰凝乳蛋白酶原的量为至少0.2mg/kg，或在0.2mg/kg-5mg/kg的范围内、或在0.5mg/kg-2.0mg/kg的范围内，或为约0.8mg/kg；

●胰蛋白酶原的量小于0.5mg/kg，或在0.01mg/kg-0.4mg/kg的范围内、或在0.05mg/kg-0.20mg/kg的范围内，或为约0.1mg/kg；

如本文所述的药物组合物(如果存在于肿瘤细胞表面或其附近则可能是特别有效的)的各种组分(如果存在)的合适浓度可以包括：

●胰凝乳蛋白酶原浓度为至少0.5mg/ml，或在1mg/ml-2mg/ml的范围内；

●胰蛋白酶原浓度小于0.25mg/ml，或在0.1mg/ml-0.2mg/ml的范围内；

本发明的药物组合物可以通过任何适合的方式给予，例如口服，例如以片剂、胶囊、颗粒或粉末的形式；舌下；经颊；肠胃外的，例如通过皮下、静脉内、肌内或脑池内注射或输注技术(例如，作为无菌注射水溶液或非水溶液或悬浮液)；经鼻，如吸入喷雾；局部，例如以霜或软膏的形式；或直肠，例如以栓剂的形式；在包含无毒的药学上可接受的载体或稀释剂的剂量单位配制品中给予。它们可以例如以适合立即释放或延长释放的形式给予，例如通过使用例如皮下植入剂、封装的球状体或渗透泵的装置。

在某些实施例中，可以优选地将胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原(例如在切除肿瘤块后)直接给予至肿瘤床或周围组织。在可替代的实施例中，胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原以全身剂量提供，这可能更适合于血液癌症。

以上披露内容总体上描述了本发明。通过参考以下具体实施例可以获得更完整的理解，这些实施例仅出于说明的目的而提供，并不旨在限制本发明的范围。

实例

实例1

进行了一系列体外研究以对胰腺酶原对CSC增殖和分化的影响进行研究。

A.材料和方法

处理方案和对照

将6mg/ml的胰凝乳蛋白酶原A和1mg/ml的胰蛋白酶原的储备溶液在PBS中制备，并储存在-20℃直至需要。对于每个实验，将储备溶液在培养基中进一步稀释以获得所希望的浓度(参见表2)。

将抗增殖剂干扰素α(IFN)以浓度10000UI/ml(A干扰素α-2b)用作阳性对照。

包含胰凝乳蛋白酶原A/胰蛋白酶原和IFN的溶液还用于评估这些试剂的组合效果。

细胞系

人胰腺癌细胞系BxPC3和人结肠癌细胞系HCT-116获得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并维持在补充有10％FBS的RPMI 1640培养基(针对BxPC3)和杜氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(针对HCT-116)(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。

神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH(HTB-11^TM，源自转移部位骨髓的神经母细胞瘤)获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并维持在补充有10％FBS的伊格尔极限必需培养基(Eagle's Minimum Essential Medium)中。

使用胰蛋白酶替代试剂TrypLE^TM(生命科技公司(Life Technologies))进行细胞传代。

CSC的分离

BxPC3胰腺癌细胞系和HCT-116结肠癌细胞系在超低附着板中的球体形成培养基中生长。1周后，使用ALDEFLUOR测定(干细胞技术公司(StemCell Technologies))和以下标志物分离细胞形成的球体和癌症干细胞样细胞：CD326、CD44和CxCR4(BxPC3)，以及通过荧光激活细胞分选(FACS)的CD326和CD44(针对HCT-116)。如Charafe-Jauffret等人(2010)Clin Cancer Res.[临床癌症研究]16(1):45-55先前所述，在超低附着板(科宁公司(Corning))中用特定的球体形成培养基生长CSC的富集亚群。Ramírez等人(2014)Oncotarget[肿瘤靶标]，5(11):3590-3606描述了类似的方法。

用于下游测定的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的最佳浓度的确定

使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)测定(西格玛公司(Sigma))来评估细胞活力和增殖。简而言之，将细胞(2×10³个细胞/孔)接种到96孔板上并孵育24h，然后用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原(参见表2)、IFN(对照)、和胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原+IFN的不同溶液进行处理。

三天后，重复处理并将细胞再维持3天。将细胞处理维持6天。此后，如下处理细胞，向每个孔中添加10μL的2mM MTT试剂，并将细胞在37℃孵育4小时。然后添加100μL洗涤剂试剂，并将细胞在室温下在黑暗中放置2小时。在570nm下记录吸光度。

使用Sigma Plot软件通过线性内插从四参数逻辑曲线计算IC₅₀值。将所有实验铺板在一式三份的孔中并进行至少两次。

使用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)测定(西格玛公司(Sigma))来评估抗癌药物对细胞活力和增殖的影响。

表2.处理溶液的组成和浓度

细胞周期测定

在对照和经处理的细胞中测量细胞周期分布。处理后，将细胞收集在15ml管中并在冷的5ml PBS中洗涤一次。为了固定细胞，将细胞轻轻涡旋，同时逐滴添加200μl的70％乙醇，并在4℃在黑暗中孵育至少20min。固定后，通过离心弃去乙醇，并将细胞通过添加含有PI和RNA酶的溶液进行染色、并在黑暗中孵育45分钟。将样品使用来自科学仪器中心(Scientific Instrumental Center)(格拉纳达大学(University of Granada))的FACSAria III流式细胞仪(BD公司(Becton Dickinson)，BD生物科技公司(BDBiosciences)，富兰克林湖，新泽西州，美国)立即进行处理。在每个最终选通直方图(gatedhistogram)中收集至少10,000个事件。使用Dean和Jett算法(多周期(Multicycle)，凤凰流动系统公司(Phoenix Flow Systems)，圣地亚哥，加利福尼亚州)进行细胞周期分析。

通过流式细胞术进行CSC标志物分析

将ALDEFLUOR分选的BxPC3胰腺癌细胞和HCT-116结肠癌细胞在培养基中维持6天，并用胰凝乳蛋白酶原0.42mg/ml-胰蛋白酶原0.07mg/ml处理两次(第2天和第5天)。

将经处理的和未处理的CSC使用Tryple进行解离，并在补充有1％牛血清白蛋白(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，圣路易斯，密苏里州)的PBS中洗涤两次。使用IgG(圣克鲁兹生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology,Inc.)，圣克鲁兹，加利福尼亚州)在冰上封闭细胞表面Fc受体15min。将细胞在4℃用抗CD44-PE和抗CD326FITC和CxCR4-APC单克隆抗体(BD生物科技公司(BD Biosciences)，富兰克林湖，新泽西州)染色30min。洗涤后，将细胞使用来自科学仪器中心(Scientific Instrumental Center)(格拉纳达大学(University of Granada))的FACSAria III流式细胞仪(BD公司(Becton Dickinson)，BD生物科技公司(BD Biosciences)，富兰克林湖，新泽西州，美国)进行分析。

在胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的存在下的CSC球体形成

将SK-N-SH细胞从培养瓶中分离，并在胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原(0.07:0.42mg/ml)的存在下在富含CSC的条件培养基中进行培养。在光学显微镜下每天监测球体形成，在第6天拍摄照片。

将BxPC3胰腺癌细胞系和HCT-116结肠癌细胞系从培养瓶中分离并在以下之一的存在下在富含CSC的条件培养基中培养：

1.胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原(0.07mg/ml：0.42mg/ml)

2.胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原(0.07mg/ml：0.42mg/ml)加IFN(10000UI/ml)；或

3.IFN(10000UI/ml)

在光学显微镜下每天监测球体形成，在第2天和第5天拍摄照片。

对于次级球体形成测定，将来自初级球体的细胞通过离心收集、然后用Tryple解离并用移液管机械破碎。将10³个单细胞铺板并重悬于超低黏附24孔板中的球体培养基中。通过光学显微镜在6天后计数>75μM直径的球体。

定量实时RT-PCR

根据制造商(生命科技公司(Life Technologies))的说明书，使用TRIZOL试剂从一式两份的80％融合培养物中提取来自不同细胞系的总RNA。使用逆转录系统(普洛麦格公司(Promega))通过总RNA的逆转录来合成cDNA，并使用SYBR绿色PCR预混合液(Green PCRMaster Mix)(普洛麦格公司(Promega))和随机引物进行qRT-PCR测定。从两个cDNA稀释液中一式三份进行每个反应。比较阈值周期(Ct)方法用于计算制造商规定的放大因子。将人GADPH用作内部标准，以归一化输入cDNA的定量的RNA质量变化。用于确定与上皮-间充质转变(EMT)相关的基因的表达的引物序列列于表3中。

表3：用于确定与上皮-间充质转变(EMT)相关的基因的表达水平的引物序列

表4：用于确定与多能性相关的基因的表达水平的引物序列

微阵列研究

按照制造商的说明书处理，使用RT²Profiler^TM PCR阵列(凯杰公司(Qiagen))分析参与上皮向间充质转变(EMT)或与CSC表达相关的基因的表达。

存在于阵列上的一组对照使用相对定量的ΔΔCT方法和逆转录性能、基因组DNA污染和PCR性能的评估来实现数据分析。

使用的RT²Profiler^TM PCR阵列是：

1.人上皮向间充质转变(EMT)RT²Profiler^TM PCR阵列，其描述84个关键基因的表达，这些基因在EMT期间改变其表达或在EMT期间调节基因表达变化。该阵列包括细胞表面受体，细胞外基质，和介导细胞黏附、迁移、运动和形态发生的细胞骨架基因；控制细胞分化、发育、生长和增殖的基因；以及导致EMT及其所有相关过程的信号转导和转录因子基因。

2.人癌症干细胞RT² Profiler PCR阵列描述了与癌症干细胞(CSC)相关的84个基因的表达。用该阵列描述的基因包括CSC分子标志物和调节CSC增殖、自我更新和多能性的基因，以帮助确保培养物中CSC分离物的稳定性。还包括了参与CSC不对称细胞分裂、迁移和转移的基因，以及相关的信号转导途径。

B.结果

通过MTT测定来确定IC₅₀

MTT测定是基于通过代谢活性细胞减少的MTT(3-(4,5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物)进行。所得细胞内紫色甲臜可以通过分光光度手段进行溶解和定量。

图1显示了不同浓度的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原、和胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原+IFN的响应曲线。

数据显示胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A的最佳浓度是胰蛋白酶原0.07mg/ml和胰凝乳蛋白酶原A0.42mg/ml(1:6比例)，然而，在1:1至约1:10之间的胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的比率还预期会减少细胞代谢活性并抑制细胞增殖。将这些浓度的胰蛋白酶原(0.07mg/ml)和胰凝乳蛋白酶原A(0.42mg/ml)用于随后的实验，并且在随后的实验中称为“PRP”。数据还显示IFN和胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的组合显著增强了胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的抗增殖作用。

细胞周期测定

对在球体形成条件(CSC)和在黏附细胞(非CSC)下生长的细胞进行细胞周期测定。将细胞用IFN(10000UI/ml)、PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原0.07mg/ml:0.42mg/ml)和PRP+IFN(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原0.07mg/ml:0.42mg/ml加IFN10000UI/ml)处理一次，并在处理4天后进行细胞周期测定。

G1/G0阶段细胞数量在胰腺CSC和非CSC(72.8％与82.4％)以及结肠CSC和非CSC(77.1％与79.9％)中相似。用PRP处理似乎没有改变胰腺CSC(82.4％与89.4％)或结肠CSC(79.9％与78.8％)中G1/G0中细胞的数量(图2a-c；图3a-c)。

与对照相比，PRP处理导致阶段S的细胞数量略微减少(3.25％与7.95％)，这是通过添加IFN(2.25％)而增强的效果(图2d)。用PRP处理后结肠CSC的细胞周期没有显著差异(图3d)。

这些结果表明胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原减少胰腺CSC增殖的能力并减少胰腺CSC中的阶段S。

ALDEFLUOR测定

CSC存活机制包括通过醛脱氢酶(ALDH)增加代谢活性。因此，ALDH被描述为鉴定癌症干细胞的标志物(Huang等人(2009).Cancer Res[癌症研究]第69卷(第8期):3382-3389)。使用流式细胞仪可以用ALDEFLUOR试剂检测ALDH阳性细胞。Aldefluor测定是基于ALDH底物的荧光无毒底物向荧光反应产物的转化。ALDH的无毒底物可以自由地扩散到完整的活细胞中。通过ALDH活性将BODIPY氨基乙醛转化为荧光产物BODIPY氨基乙酸酯。ALDH阳性细胞已经发现于多种癌组织(包括乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌和急性髓细胞性白血病)中，并与癌症化疗抗性有关(Siclari和Qin(2010)J Orthop SurgRes[外科研究杂志]5(78))。

图4显示了胰腺CSC和非CSC的ALDH测定的结果。

非CSC样品中ALDH阳性细胞的百分比大约为12％。对于在球体形成条件下培养的细胞，大约50％的细胞是ALDH阳性的。用PRP处理细胞显著减少了(从47.2％到17.5％)胰腺CSC中ALDH阳性细胞的群体。IFN的添加进一步增加了(13.8％)PRP的作用。这些结果表明胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原减少了胰腺癌中的CSC群体。

在胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原处理的细胞中CSC标志物的表达

在球体形成条件下培养胰腺癌细胞以富集CSC亚群。然后用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原0.07mg/ml:0.42mg/ml)、PRP+IFN和IFN处理胰腺CSC，并通过流式细胞术测量胰腺特异性CSC标志物CD326、CD44和CxCR4。

流式细胞术结果表明，用PRP处理后，表达三种CSC标志物的细胞的百分比显著降低(从56.6％降至8.8％)。用PRP+IFN进行处理使表达这些标志物的细胞群体减少到4.3％(图5和6)。这些结果表明，用PRP处理减少胰腺癌中的CSC群体。

在球体形成条件下培养结肠癌细胞以富集CSC亚群。然后用PRP、PRP+IFN和IFN处理结肠CSC。将细胞用ALDH和结肠特异性CSC标志物：CD326和CD44进行标记，并通过流式细胞术进行分析。

流式细胞术结果(图7和8)表明，PRP处理后，ALDH阳性的和表达两种结肠特异性CSC标志物的细胞的百分比显著降低(从64.8％降至31.05％)。用PRP+INF处理使表达这些标志物的细胞群体减少到40.8％(图7)。在PRP处理后，ALDH+的且表达CD44或CD326标志物的细胞的百分比显著降低(对于ALDH+CD44+细胞，从35.5％降至8.1％，并且对于ALDH+CD326+细胞，从43.9％降至7.1％，图8)。

在胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原的存在下的CSC球体形成

测试了PRP抑制球体形成的能力。当在球体条件(条件培养基和低附着培养基)下培养癌细胞时，在第0天将PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原0.07mg/ml:0.42mg/ml)、IFN(10000UI/ml)和PRP+IFN添加培养基中。

图9显示了第2天和第6天的胰腺细胞培养物的图像。第2天图像显示向培养基中添加PRP显著减少了胰腺CSC球体的数量和大小。此外，形成的球体的形态显著不同(在未处理的对照细胞中是规则的，而在经PRP处理的细胞中是不规则的)。

第5天图像显示了经胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A处理的细胞和对照细胞之间的关键差异。PRP和PRP+IFN处理的细胞不形成球体。细胞显示解离并破裂。

结肠癌细胞的结果不同。图10显示了即使在第2天，PRP的添加也抑制了球体的形成。细胞显示分散但未死亡。在第5天，球体尚未形成，并且细胞未聚集。

这些结果表明，胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原显著地抑制CSC的球状体形成。

在PRP的存在下的神经母细胞瘤CSC球体形成

在第2天和第4天，当在球体条件(条件培养基和低附着培养孔)下培养癌细胞时，将PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原0.07mg/ml:0.42mg/ml)添加到细胞培养基中。

图11显示了第6天的细胞培养物的图像。用PRP处理的神经母细胞瘤不形成CSC球体：细胞在悬浮液中生长但不形成细胞簇(图11B和11D)。当细胞在不存在PRP的情况下维持在对照条件下时，神经母细胞瘤球体CSC示于小图A和C中。

次级球体形成

通过解离由PRP处理的细胞形成的初级球体并与未处理的对照细胞比较来进行次级球体形成测定。图11E显示了对于癌细胞系BxPC3和SK-N-SH，次级球体在PRP处理后不能算入计数。相反，未处理的对照细胞能够恢复形成细胞簇的能力。

PRP破坏初级球体并且还抑制CSC形成次级球体的能力。由于肿瘤球体被定义为源自单个肿瘤干细胞的克隆衍生的非黏附细胞集落，所获得的结果表明PRP处理对癌症干细胞群体具有直接影响。

EMT和多能性相关的基因表达

将与EMT方法和/或多能性相关的基因的表达在用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A0.07mg/ml:0.42mg/ml)处理的胰腺CSC中进行分析，并与未处理的CSC进行比较。qRT-PCR结果显示，与EMT(例如SNAIL、SLUG、波形蛋白和神经钙黏着蛋白)相关的基因的表达在处理后已经降低(图12)。处理后上皮钙黏着蛋白表达增加。这些结果表明PRP处理可以减少从上皮向间充质表型的转变。

为了确定PRP处理是否改变CSC标志物的表达，通过qRT-PCR分析若干个多能性基因(使用的引物描述于表4)。结果显示，与未处理的CSC相比，用胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A处理后，OCT4、CMYC和KLF4基因表达略微降低。相反，NANOG和CD133的表达在处理后增加，这表明PRP的作用不是通过这两个基因介导的(图13)。

微阵列研究

以下结果涉及在PRP处理后CSC中基因表达的变化。

a)与EMT相关的表达基因

为了研究PRP对EMT过程的影响，将参与EMT的若干个关键基因的表达在经处理的CSC中进行了分析，并与未处理的对照CSC的基因表达谱进行了比较。结果显示为相比于对照细胞的倍数调节(上调或下调)。

图22A显示了在EMT过程中通常下调的选择基因的基因表达的变化。图22A显示了在PRP处理后，上皮钙黏着蛋白的表达增加4.28倍，这表明PRP处理诱导该基因的表达。此外，Kruppel样因子17(KLF17)也被PRP处理上调，达到5.9的倍数上调。据先前报道，KLF17直接抑制EMT、血管生成、侵袭和转移。在PRP处理后，其他基因的表达也增加(例如，MST1R:1.6928倍；TFPI2:4.4272倍，和NUDT13:2.3692倍)，这表明PRP具有抗EMT作用。

对在EMT期间通常上调的基因进行分析，结果总结在图22B中。在用PRP处理后，已经描述的诱导EMT的13种基因被下调。例如，转录因子Snail(其典型地在经历EMT的转移细胞中上调)在PRP处理后下调(SNAI1:-1.9678和SNAI2:-1.8604)。在PRP处理后，丝氨酸蛋白酶抑制剂SERPINE1显著下调(4.6倍下调)。整联蛋白ITGA5和ITGAV的表达也被下调(分别下调2.5697和1.0193)。据报道，ITGA5促进肿瘤侵袭，且先前已发现此基因的较高表达与癌症患者的生存时间缩短相关。ITGAV还涉及血管生成和癌症进展的调节。

总之，通过诱导在EMT期间通常下调的基因的表达，并且减少在EMT期间通常上调的基因的表达，PRP处理对参与EMT过程的基因的表达具有显著影响。结果表明PRP在除抑制CSC群体外减少肿瘤进展和转移方面具有治疗潜力。

b)参与干细胞分化的基因的表达

在胰腺CSC中分析了参与胰腺分化的关键基因的表达。将用PRP处理的CSC中的基因的表达与在未处理的对照CSC中的基因的表达进行比较。结果显示为相比于对照细胞的倍数调节(上调或下调)。

获得的结果总结在图23中，并且与研究一致，这表明PRP处理诱导细胞分化。在PRP处理后，与分化相关的7个基因上调，包括表皮生长因子(EGF)的表达，其与对照细胞相比增加8.9倍。

c)肿瘤抑制基因的表达

图24显示了在PRP处理后具有先前报道的肿瘤抑制作用的11种基因的上调。

PRP处理后转录因子FOXP1的表达增加了6.04倍。此外，在PRP处理后，TWIST2的表达上调(5.2737倍)。由于PRP处理而上调的另一种肿瘤抑制基因是THY1(增加3.622倍)。

发现SPARC(一种参与细胞外基质的沉积和模制的细胞外蛋白，其在许多肿瘤类型中被下调)在PRP处理后上调(3.611倍)。在经处理的细胞中SIRT1表达也增加了2倍。SIRT1编码去乙酰化酶蛋白家族的成员，并且被报道为抑制表达胰腺癌上调因子(PAUF)的胰腺癌细胞的增殖。

d)与转移和侵袭相关的基因的表达

在PRP处理后，确定涉及转移和细胞侵袭的9种基因的表达水平(图25A)。结果表明，PRP处理导致这些基因的显著下调。例如，骨桥蛋白(SPP1)的表达减少了10倍。SPP1是一种趋化因子样钙化ECM相关蛋白，据报道，该蛋白在确定各种癌症的转移潜力中起着至关重要的作用。

通过血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)的信号传导参与多种肿瘤相关过程。PDGFR的表达在许多肿瘤中上调，例如在显示出PDGFR的高表达的原位生长的胰腺癌模型中转移肿瘤的内皮细胞中。在PRP处理后，PDGFRB的表达减少了3.1093倍，这表明PRP具有抗转移作用。此外，在PRP处理后，编码纤连蛋白的基因FN1的表达也显著减少(3.2倍下调)。纤连蛋白参与细胞黏附和迁移过程，包括转移。

e)与细胞黏附相关的基因的表达

图25B显示了参与细胞黏附的基因的上调。与先前的研究一致，在PRP处理后，上皮钙黏着蛋白和β-连环蛋白的表达增加(分别增加4.3倍和4倍)。上皮钙黏着蛋白和β-连环蛋白在EMT中具有已知的作用。结果表明，PRP通过直接增强CSC中上皮钙黏着蛋白和β-连环蛋白的表达来抑制EMT。

f)编码细胞因子的基因的表达

研究了PRP处理对胰腺CSC中编码细胞因子的基因的表达的影响。图26显示了编码与癌症中细胞增殖、迁移和侵袭相关的细胞因子的基因的下调。

已经显示IL-8和IL-8受体在胰腺癌中过表达但在正常胰腺组织中被抑制，这表明IL-8在人胰腺癌的侵袭性中起重要作用。此外，还报道了IL-8通过调节肿瘤微环境来促进EMT。此处显示的结果表明在PRP处理后IL-8的表达下调(4.5倍)。在PRP处理后检测到的IL-8基因表达的降低进一步支持了PRP发挥抗CSC作用的观察结果。

用PRP处理CSC显著降低了分泌的磷蛋白-1的表达(SPP1，10倍下调)。据报道，SPP1促进癌细胞存活并调节肿瘤相关的血管生成和炎症。此外，PRP处理诱导膜糖蛋白CD31/PECAM-1的下调，该蛋白已经发现于许多肿瘤细胞，例如人脑神经胶质瘤、子宫颈癌，肺癌和乳腺癌中。

g)CSC标志物基因的表达

胰腺CSC的PRP处理诱导6种被认为是CSC标志物(包括CD38、CD45、Oct-04和KLF4)的基因的下调(图27)。

h)与MAPK/ERK途径相关的基因的表达

PRP处理胰腺CSC诱导了若干种MAPK相关基因的下调。结果示于图28中。

结论

上述体外研究结果表明：

1.PRP处理破坏了初级球体并抑制了CSC形成次级球体的能力，从而对癌症干细胞群体产生直接影响；

2.PRP在CSC中具有有效的抗EMT作用；

3.PRP具有抗转移作用，其增强促进细胞黏附的因子的表达并减少与CSC迁移过程相关的因子的表达；

4.PRP增强CSC中相关肿瘤抑制基因的表达；

5.PRP调节CSC标志物基因的表达；

6.PRP可以诱导CSC的分化；和

7.PRP下调与癌症中细胞增殖、迁移和侵袭相关的细胞因子的表达。

这些结果增强了PRP作为抗CSC药物、抗EMT药物、抗转移药物和抗肿瘤药物的治疗潜力。

实例2

阶段1-PRP对CSC的抗肿瘤活性的体内研究

A.实验设计：

1-对照组(n＝10)：未处理的小鼠(接种生理盐水溶液)

2-预防组：在用CSC接种之前，用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)处理小鼠(n＝10)。将溶于生理盐水溶液中的PRP每隔一天以单次静脉内(i.v.)推注注射来给予，持续3周。

3-预防+处理组：在CSC接种之前和之后，用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)处理小鼠(n＝10)。将溶于生理盐水溶液中的PRP每隔一天以单次静脉内推注注射来给予，持续3周。将处理维持3-4个月。

4-处理组：仅在CSC接种后用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)处理小鼠。将溶于生理盐水溶液中的PRP每隔一天以单次静脉内推注注射来给予，持续3-4个月。

阶段2-PRP抑制胰腺CSC的肿瘤能力的能力的研究

为了确定PRP处理是否可以减少胰腺CSC的肿瘤起始能力，进行以下一组实验。进行异种移植实验，其中通过注射先前用PRP体外处理的胰腺CSC来诱导肿瘤形成。进行肿瘤形成的评估和肿瘤特征的研究。

A.实验设计：

1-对照组(n＝8)。向NSG小鼠注射未处理的胰腺CSC。

2-IC50PRP组(n＝8)。向小鼠注射用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)的IC50处理3-6天的胰腺CSC。

3-2x IC50PRP组(n＝8)。向小鼠注射用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)的2xIC50处理3-6天的胰腺CSC。

4-5x IC50PRP组(n＝8)。向小鼠注射用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)的5xIC50处理3-6天的胰腺CSC。

阶段3-实验转移体内测定

为了确定PRP是否可以用作抗转移剂，使用免疫缺陷小鼠进行实验转移测定。体内转移模型利用CSC-L2T(从用萤光素酶体外转染的BxPC3获得的富集亚群和红色荧光蛋白td-Tomato)，将其通过NSG小鼠(NOD scidγ小鼠)的尾静脉直接注射到NSG小鼠的循环中。通过IVIS(光谱临床前体内成像系统)监测转移进展。根据以下实验设计，在注射CSC-L2T之前和之后用PRP处理小鼠：

A.实验设计：

1-对照组(n＝8)：接种生理盐水溶液的未处理的小鼠。

2-预防组：在接种CSC-L2T之前，用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)处理小鼠。将溶于生理盐水溶液中的PRP每隔一天以单次静脉内推注注射来给予，持续3周。

3-预防+处理组：在CSC-L2T接种之前和之后，用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)处理的小鼠。将溶于生理盐水溶液中的PRP每隔一天以单次静脉内推注注射来给予，持续3周。将处理维持3-4个月。

4-处理组：仅在用CSC-L2T接种后，用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)处理小鼠。将溶于生理盐水溶液中的PRP每隔一天以单次静脉内推注注射来给予，持续3-4个月。

材料和方法

阶段1和阶段2

CSC的分离

通过荧光激活细胞分选(FACS)使用ALDEFLUOR测定(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))来分离来自BxPC3胰腺癌(腺癌)细胞系的癌干细胞样细胞，并且CSC的富集亚群将在超低附着板(科宁公司(Corning))中用我们特定的球体形成培养基(PCT/ES2015/070606)进行生长。

体内抗肿瘤异种移植研究

为了建立异种移植肿瘤，使用六至八周龄的NSG免疫缺陷小鼠。所有程序均由格拉纳达大学(University of Granada)的动物护理和使用委员会机构(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准。将小鼠圈养并维持在20℃至24℃、50％RH、14h至10h光照黑暗周期，并随意进食和饮水。

对于阶段2，将胰腺CSC用PRP的IC₅₀、2x IC₅₀和5x IC₅₀处理3天和6天。在将PRP处理的CSC接种到NSG小鼠模型之前确定细胞活力。

通过使用26号针头皮下注射100-500个活细胞/小鼠*来产生BxPC3胰腺癌细胞系肿瘤。然后将动物(n＝10/组)随机分配为对照组和处理组(组1-4)，并根据先前描述的实验程序进行处理(图14A和B)。

根据公式计算肿瘤重量：TW(mg)＝肿瘤体积(mm³)＝d2×D/2，其中d和D分别是最短和最长直径。所有肿瘤的石蜡包埋块以5μm切片。每个样品用苏木精和曙红(H&E)染色，用于组织病理学分析。

体内PRP处理

在处理期间，将溶于生理盐水溶液中的PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)每隔一天以单次静脉内推注注射来给予。给予组2和组3的剂量是83.3mg/kg胰蛋白酶原和500mg/kg胰凝乳蛋白酶原A。胰蛋白酶原和胰凝乳蛋白酶原A以组合提供并以单次注射给予。给药体积是10mL/kg。计算给予每只动物的给药溶液的体积并基于即将给药前测量的个体体重进行调整。

在肿瘤诱导前给予处理3周(预防组)或在肿瘤诱导前给予处理3周且在诱导后给予处理至少4周(优选长达9.5周)(预防+处理组)。

初步转移测定

用致死剂量的戊巴比妥钠(100mg/kg体重)杀死小鼠。取出胸腔器官，将肺在冷PBS中洗涤并称重。将其他内脏器官移除并检查是否存在转移。将肺固定在福尔马林中并包埋在石蜡中。针对转移结节的存在，对苏木精和曙红(H&E)染色的肺切片进行分析。

PRP对肿瘤生长影响的测量

通过计算肿瘤生长抑制率T/C来确定PRP对肿瘤生长的影响。使用两种不同的方法确定T/C：在处理结束时第一次测量肿瘤体积，并且在处理过程中第二次测量肿瘤生长速率。

在第一种方法中，计算对照肿瘤(C)的平均体积与处理最后一天的处理肿瘤(T)的平均体积的比率。T/C≤0.45是指示给定处理功效的共有截止值，

在第二种方法中，使用Hather等人，(2014)描述的基于速率的T/C。该方法是基于将每个肿瘤的生长曲线拟合为指数模型。基于速率的T/C使用所有可用数据，因此能够解释初始体积中的随机差。此外，拟合所有数据减少测量噪声的影响，并允许基于速率的T/C估计更精确。还使用双侧t检验计算p值，其中对估计的肿瘤生长速率应用不等方差。p值计算假设估计的肿瘤生长速率正常分布在每个处理组内。选择0.4的阈值是因为常见的截止值是确定抗肿瘤活性是否足以具有实际意义。因此，通过在36天内每2天测量肿瘤体积来评估肿瘤生长的进展，并使用计算基于速率的T/C的Excel电子表格来分析数据(图18)。预处理组的基于速率的T/C为0.54(p＝0.17)，并且预处理组和处理组的基于速率的T/C为0.13(p＝0.001)。表明PRP的后续处理显著抑制了肿瘤生长。

PRP对肿瘤发生率和体重的影响

肿瘤发生指数(TIn)是反映受试者中相对肿瘤发生率和肿瘤重量的指数。TIn可以用于测量恶性肿瘤或肿瘤侵袭性。

阶段3

慢病毒转染

使用脂质体转染试剂(生命科技公司(Life Technologies))，用编码萤火虫萤光素酶的慢病毒载体和红色荧光蛋白td-Tomato(L2T)26(包装载体(psPAX2)和包膜载体(pCMV-VSVG))共转染293T细胞。收集由293T细胞产生的病毒颗粒并用于感染BxPC3细胞。简而言之，将上清液在48h后从293T转染的细胞回收、并用0.45μm孔隙膜过滤、并添加到补充有4μg/mL聚凝胺的BxPC3铺板细胞(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))中。在病毒感染后，选择td-Tomato+细胞以通过FACS稳定整合转染。

实验肺转移体内测定

将BxPC3CSC-L2T注射到4-6周龄雌性NSG小鼠的尾静脉中(n＝8/组)。通过腹膜内注射150mg/kg的D-萤光素(D-Luciferine，赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))，在第0天和每周通过IVIS监测生物发光。4周后，对小鼠实施安乐死，并将肺切除、针对td-Tomato表达进行拍摄并测定萤光素酶活性，用在PBS中稀释的150μg/mL D-萤光素来洗涤肺。切除的肺也用于苏木精和伊红染色和共聚焦显微镜分析。

体内PRP处理

将溶于生理盐水溶液中的PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)每隔一天以单次静脉内推注注射来给予，持续3-4个月。

组织学分析

将肺在4℃在0.1M PBS中的4％多聚甲醛中浸渍4h，在0.1M PBS中洗涤、并在自动组织处理器(TP1020，莱卡公司(Leica)，德国)中包埋在石蜡中。将石蜡块切成4mm切片，用于染色。将切片用二甲苯脱石蜡并在降低的醇浓度(无水至70％)下水合，并用苏木精-伊红进行染色。然后将切片用增加的醇浓度(95％至无水)脱水、并用二甲苯澄清并用封固剂进行固定。使用倒置显微镜(Nikon H550s)在光学显微镜和数字图像采集下进行观察。

免疫组织化学分析

将肺在室温下浸入10％福尔马林中过夜、在0.1M PBS中洗涤、并在PBS中的30％蔗糖中保存24h。然后将该材料浸泡在OCT化合物(欧洲樱花检验仪器株式会社(SakuraFinitek Europe B.V.)，荷兰)中，在液氮中冷冻并在-40℃储存直至使用。将OCT块切成8mm的切片并收集在SuperFrost载玻片(Menzel-Glasser公司，德国)上。将切片用PBS水合并用封固剂与DAPI一起固定。荧光显微镜和数字图像采集的观察将用共聚焦显微镜(Nikon A1)进行。

结果

在CSC接种后4周和9.5周获得阶段1实验的初步结果。结果证明了PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)对人胰腺CSC中通过BxPC3诱导的肿瘤的抗肿瘤功效。

图15至19显示了试验开始后9.5周(即CSC接种后67天)的阶段1研究的结果。

图15提供了来自组1、2和3的小鼠的切除的肿瘤的图像。

图16显示了组1、2和3中％肿瘤发生率：10只对照小鼠中的9只在皮下注射富含CSC的胰腺BxPC3群体后形成肿瘤(该值被解释为100％肿瘤发生率)。在组2和组3(即预防和预防+处理)中，不到50％的小鼠发展了肿瘤(组2中为41％；组3中为50％)。这些结果表明，在CSC接种之前用PRP(胰蛋白酶原/胰凝乳蛋白酶原A)进行预防性处理对胰腺CSC肿瘤移植具有明显的抑制作用。

评估PRP处理在减少肿瘤生长中的影响，结果示于图17和图18中。图17显示了处理最后一天的每个肿瘤的体积以及组2和组3两者的小鼠的T/C值(使用方法1计算)。这些结果表明与未处理的对照动物相比，用PRP的预防性处理(组2)和预防+处理(组3)降低肿瘤摄取并损害肿瘤生长(组2中T/C＝0.64，并且组3中T/C＝0.40)。

两个实验组的基于速率的T/C示于图18中。对于预防组(组2)，基于速率的T/C为0.54(p＝0.17)，对于预防+处理组(组3)，基于速率的T/C为0.13(p＝0.001)。这些结果表明，PRP的后续处理显著抑制肿瘤生长，这可以通过该处理组中肿瘤体积减少得到证实。具体地，对于组2小鼠，肿瘤体积仅为对照小鼠肿瘤中所见体积的54％。在组3小鼠中，肿瘤体积仅为对照小鼠肿瘤体积的13％。

总之，图17和18中显示的结果显示肿瘤发展的发生率显著减少、并且在接受PRP作为预防的小鼠中和在接受预防和CSC后接种(处理)PRP两者的小鼠中发展的任何肿瘤的体积减少。

图19显示了当小鼠接受了预防性PRP或当小鼠同时接受预防性PRP和CSC接种后接受PRP时，观察到TIn的显著差异(p<0.01)，这表明PRP的抗肿瘤作用。

图20和21分别显示从来自对照组、预防组、和预防+处理组中的小鼠切除的肿瘤切片的H&E染色和Masson-trichome染色。代表性图像显示肿瘤密度的显著差异，其中在预防组和预防+处理组的肿瘤中观察到的细胞之间密度显著减少且间隙增加。此外，与对照小鼠相比，接受PRP的小鼠(预防组和预防+处理组)的肿瘤中纤维化组织的存在显著减少。

总之，数据证明了PRP作为预防和处理的抗肿瘤作用。PRP损害了小鼠中CSC肿瘤的移植，并显著降低了CSC接种后起始的那些肿瘤的进展。

实例3

使用本发明来治疗癌症可以根据以下实施。

被诊断患有结肠癌的个体可以通过手术(腹腔镜或常规)去除大部分肿瘤块。切除肿瘤块后，向个体给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，任选地与化学疗法或放射疗法组合。在给予之前，可以通过鉴定个体中或切除部位附近(其表达结肠癌干细胞的标志物特征)的细胞来确定结肠癌干细胞的存在。示例性标志物可以是CD326和CD44或本文所述的任何其他标志物(参见表1)。然后监测个体在原始肿瘤部位的复发和在结肠癌转移的已知部位的转移出现。结果是预防或延迟复发或转移。

被诊断患有胰腺癌的个体可以通过手术(腹腔镜或常规)去除大部分肿瘤块。切除肿瘤块后，向个体给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，任选地与化学疗法或放射疗法组合。在给予之前，可以通过鉴定个体中或切除部位附近(其表达胰腺癌干细胞的标志物特征)的细胞来确定胰腺癌干细胞的存在。示例性标志物可以是CD326、CD44和CxCR4或本文所述的任何其他标志物(参见表1)。然后监测个体在原始肿瘤部位的复发和在胰腺癌转移的已知部位的转移出现。结果是预防或延迟复发或转移。

类似的方法可以应用于其他癌症，优选实体瘤，例如前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或本文所述的任何其他癌症。

序列表

<110> 普罗潘克股份有限公司（Propanc Pty Ltd）

<120> 癌症治疗

<130> 50158602AZD

<150> ES P201630112

<151> 2016-01-29

<150> ES P201631662

<151> 2016-12-22

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNAIL 正向引物

<400> 1

accccacatc cttctcactg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SNAIL 反向引物

<400> 2

tacaaaaacc cacgcagaca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SLUG 正向引物

<400> 3

tgcgatgccc agtctagaaa 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SLUG 反向引物

<400> 4

ttctcccccg tgtgagttc 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上皮钙黏着蛋白正向引物

<400> 5

aattcctgcc attctgggga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上皮钙黏着蛋白反向引物

<400> 6

tcttctccgc ctccttcttc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 神经钙黏着蛋白正向引物

<400> 7

tgagcctgaa gccaacctta 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 神经钙黏着蛋白反向引物

<400> 8

aggtcccctg gagttttctg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 波形蛋白正向引物

<400> 9

agctaaccaa cgacaaagcc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 波形蛋白反向引物

<400> 10

tccactttgc gttcaaggtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OCT4 正向引物

<400> 11

caccatctgt cgcttcgagg 20

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> OCT4 反向引物

<400> 12

agggtctccg atttgcatat ct 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KLF4 正向引物

<400> 13

cgaacccaca caggtgagaa 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> KLF4 反向引物

<400> 14

tacggtagtg cctggtcagt tc 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOX 2 正向引物

<400> 15

caagatgcac aactcgcaga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> SOX2 反向引物

<400> 16

catgagcgtc ttggttttcc 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NANOG 正向引物

<400> 17

tcctgaacct cagctacaaa c 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NANOG 反向引物

<400> 18

gcgtcacacc attgctattc 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C-MYC 正向引物

<400> 19

gagtctggat caccttctgc tg 22

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> C-MYC 反向引物

<400> 20

aggatagtcc ttccgagtgg ag 22

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD133 正向引物

<400> 21

cagaataata aacagcagcc c 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CD133 反向引物

<400> 22

gattatgaca agccagaaac t 21

Claims

1.一种在已经接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中使该癌症的进展最小化。

2.根据权利要求1所述的方法，其中该受试者部分或完全缓解。

3.一种在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中治疗微小残留病变。

4.一种在已经接受过癌症治疗的受试者中预防癌症的复发的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中预防癌症的复发。

5.一种在将要接受癌症治疗、正在接受癌症治疗或已经接受过癌症治疗的受试者中预防或抑制癌症的转移的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中预防或抑制癌症的转移。

6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该癌症治疗选自由手术切除肿瘤、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合组成的组。

7.一种在受试者中预防癌症的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中预防癌症。

8.一种在受试者中延迟癌症的发作的方法，该方法包括向该受试者给予治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原，从而在该受试者中延迟癌症的发作。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中该受试者是被鉴定为有患癌症的风险的受试者。

10.根据权利要求9所述的方法，其中该癌症的风险是基于家族病史或与癌症风险相关的生物标志物或其组合来确定的。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中该受试者未被诊断为患有癌症。

12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该个体在给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原时不具有可检测的癌症。

13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原被调节为以大于1:1但小于或等于10:1之间的胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比来给予。

14.根据权利要求13所述的方法，其中该胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在4:1至8:1之间的范围内。

15.根据权利要求13所述的方法，其中该胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比在5:1至7:1之间的范围内。

16.根据权利要求15所述的方法，其中该胰凝乳蛋白酶原:胰蛋白酶原的重量比是约6:1。

17.根据任一前述权利要求所述的方法，其中同时给予该胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该方法进一步包括确定该受试者中癌症干细胞的存在。

19.根据权利要求18所述的方法，其中该受试者中癌症干细胞的存在是通过鉴定表达一种或多种癌症干细胞标志物的细胞来确定的。

20.根据权利要求19所述的方法，其中这些癌症干细胞标志物选自以下一种或多种：

(a)CD34⁺、CD38^-、HLA-DR、CD71^-、CD90^-、CD117^-、和CD123⁺；

(b)ESA⁺CD44⁺CD24^-/低谱系^-、和ALDH-1^高；

(c)CD133⁺、CD49f⁺、和CD90⁺；

(d)CD133⁺、BCRP1⁺、A2B5⁺、和SSEA-1⁺；

(e)CD133⁺、和ABCG2^高；

(f)CD133⁺、CD44⁺、CD166⁺、EpCAM⁺、CD24⁺或CD326⁺、和CD44⁺；

(g)CD138^-；

(h)CD44⁺、α2β1^高、和CD133⁺；和

(i)CD133⁺、CD44⁺、EpCAM⁺、CD24⁺或CD326⁺、CD44⁺、和CxCR4⁺。

21.根据任一前述权利要求所述的方法，其中该受试者中癌症干细胞的数量在给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原后在数量上减少或防止其增加。

22.根据任一前述权利要求所述的方法，其中这些癌症干细胞在给予胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原后被分化。

23.一种用于在已经接受过癌症治疗的受试者中使癌症的进展最小化的组合物，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

24.一种用于在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变的组合物，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

25.一种用于使受试者对随后的针对癌症的癌症治疗增敏的组合物，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

26.一种用于在已经接受过癌症治疗的受试者中预防癌症的复发的组合物，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

27.一种用于在受试者中预防癌症的组合物，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

28.一种用于在受试者中延迟癌症的发作的组合物，该组合物包含胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

29.根据权利要求23至28中任一项所述的组合物，其中该组合物被调节为以大于1:1但小于或等于10:1之间的重量比来递送胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原。

30.胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在受试者中使癌症的进展最小化，其中该受试者先前已经接受过癌症治疗。

31.胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在已经接受过癌症治疗的受试者中治疗微小残留病变。

32.治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在已经接受过癌症治疗的受试者中预防癌症的复发。

33.根据权利要求30至32中任一项所述的用途，其中该癌症治疗选自由手术切除肿瘤、放射疗法、化学疗法、免疫疗法或其组合组成的组。

34.治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在受试者中预防癌症，其中该受试者被认为有癌症发展的风险。

35.治疗有效量的胰凝乳蛋白酶原和胰蛋白酶原在制备如下药物中的用途，该药物用于在受试者中延迟癌症的发作。

36.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中该癌症选自由胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、皮肤癌、食道癌、肺癌和乳腺癌组成的组。

37.根据权利要求23至29中任一项所述的组合物，其中该癌症选自由胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、皮肤癌、食道癌、肺癌和乳腺癌组成的组。

38.根据权利要求30至35中任一项所述的用途，其中该癌症选自由胰腺癌、结肠癌、神经母细胞瘤、卵巢癌、非小细胞肺癌、皮肤癌、食道癌、肺癌和乳腺癌组成的组。