CN114196624B - 促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂，属于生物医学技术领域。所述促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂为lnc‑AC005307.1的基因抑制剂，所述lnc‑AC005307.1的序列如SEQ ID NO.11所示，所述lnc‑AC005307.1的基因抑制剂为lnc‑AC005307.1的ShRNA，所述ShRNA的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。本发明的有益效果在于，使用本发明的基因抑制剂能够有效的促进脐带血间充质干细胞的增殖。

Description

促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂。
背景技术
干细胞是一种具备一定的增殖和分化潜能的细胞，其能够实现自我复制更新和高度分化。根据来源的不同，干细胞被分为胚胎干细胞，造血干细胞，神经干细胞，骨髓间充质干细胞，脂肪干细胞等。脐带血间充质干细胞是来源于脐带血的一种干细胞，作为组织工程中使用的一种种子细胞，其不仅来源广泛，而且取材也十分的方便。但是随着培养时间的延长，脐带血间充质干细胞会逐渐衰老且增殖能力下降，从而影响脐带血间充质干细胞的应用。
随着高通量测序技术的发展，过去被认为是转录噪音的长链非编码RNA引起了越来越多的科学家关注。长链非编码RNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其通常无蛋白质编码能力。现有的研究显示，长链非编码RNA在细胞增殖，细胞周期，细胞分化，细胞凋亡等多种生物学功能中具有重要的作用。然而，关于长链非编码RNA在脐血间充质干细胞衰老和增殖中的研究还较少，因此，研究长链非编码RNA在脐血间充质干细胞衰老和增殖中的功能对于有效的延缓脐带血间充质干细胞衰老，增加脐带血间充质干细胞增殖能力具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂。
为实现上述目的，本发明提供了一种促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂，所述基因抑制剂为lnc-AC005307.1的基因抑制剂。
优选地，所述lnc-AC005307.1的基因序列如SEQ ID NO.11所示。
优选地，所述基因抑制剂为特异性靶向抑制lnc-AC005307.1的ShRNA。
优选地，所述ShRNA的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
其次，本发明提供了一种基因抑制剂在制备脐带血间充质干细胞增殖药物中的用途，所述基因抑制剂为lnc-AC005307.1的基因抑制剂。
优选地，所述lnc-AC005307.1的基因序列如SEQ ID NO.11所示。
优选地，所述基因抑制剂为特异性靶向抑制lnc-AC005307.1的ShRNA，所述ShRNA的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
除此之外，本发明提供了一种促进脐带血间充质干细胞增殖的药物组合物，所述药物组合物包括特异性抑制lnc-AC005307.1表达的ShRNA，所述lnc-AC005307.1的序列如SEQ ID NO.11所示；所述ShRNA的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。
优选地，所述药物组合物还包括与所述ShRNA相配伍的药学上可接受的药物载体和辅料。
本发明的有益效果是：
本发明发现通过利用lnc-AC005307.1的ShRNA来特异性抑制脐带血间充质干细胞中的lnc-AC005307.1的表达能够有效的促进脐带血间充质干细胞的增殖，并且能够调控P21，P16，Cyclin-D1和Cyclin-E1的蛋白表达，因此可将lnc-AC005307.1的基因抑制剂用于制备促进脐带血间充质干细胞增殖的药物。
附图说明
图1脐带血间充质干细胞复制性衰老过程中lnc-RP11-266K4.9的表达量差异；
图2脐带血间充质干细胞复制性衰老过程中lnc-HOTAIR的表达差异；
图3脐带血间充质干细胞复制性衰老过程中lnc-RP11-272B17.1的表达差异；
图4脐带血间充质干细胞复制性衰老过程中lnc-AC005307.1的表达差异；
图5 脐带血间充质干细胞复制性衰老过程中lnc-AC091814.2的表达差异；
图6 本发明设计的Sh-lnc-AC005307.1的抑制剂效果检测结果；
图7 敲减Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1对于脐带血间充质干细胞增殖的调控；
图8 敲减Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1对于脐带血间充质干细胞复制性衰老的调控；
图9 敲减Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1对于脐带血间充质干细胞中P21，P16，CyclinD1和CyclinE1蛋白表达的调控；
图10 敲减 Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1对于脐带血间充质干细胞氧化应激衰老的调控。
具体实施方式
为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。
实施例1 分离和培养脐带血间充质干细胞
（1）采集30岁以下健康剖宫产妇的脐血，使用1:1的PBS稀释混匀；
（2）在离心管中倒入等体积的Percoll液，混匀后，置于离心机中，2000rpm/min离心20min；
（3）离心结束后，吸出中间絮状的白膜单核细胞层，使用PBS重悬；
（4）将离心管置于离心机中，1000rpm/min离心10min，收集离心管管底的细胞；
（5）加入含10%的胎牛血清，0.1%青霉素和链霉素双抗的DMEM/F12培养基悬浮细胞；
（6）使用DMEM/F12培养基离心清洗细胞2次，进行细胞计数，调整细胞密度为1×106/ml；
（7）将细胞接种于细胞培养皿中，加入DMEM/F12培养基进行培养，即得脐带血间充质干细胞。
实施例2 脐带血间充质干细胞复制性衰老时基因lnc-RP11-266K4.9，lnc-HOTAIR， lnc-RP11-272B17.1，lnc-AC005307.1和lnc-AC091814.2的表达差异
（1）分别收集P3，P6,P9和P12代（每组有3个重复）的脐带血间充质干细胞至EP管中，加入1ml Trizol充分裂解细胞；
（2）裂解10min之后，加入200μL氯仿，震荡混匀之后，在室温下静置10min；
（3）将EP管放入到高速离心机中，4℃下12000rpm离心10min，小心的吸取上层的水相，并将水相转移至新的EP管中；
（4）根据吸取水相的体积，加入等体积的预冷异丙醇，混匀后，在冰上静置10min；
（5）将EP管放入到高速离心机中，4℃下12000rpm离心10min，倒掉上清，得到RNA沉淀；
（6）加入1ml 75%的乙醇重悬沉淀后，将EP管放入到高速离心机中，4℃下8000rpm离心5min，取出后，去掉乙醇，室温下晾干，即得RNA；
（7）参照Takara逆转录试剂盒说明书配置如下反应体系去除基因组DNA：
试剂 添加量
5×gDNA Eraser Buffer 2μl
gDNA Eraser 1μl
Total RNA 1μg
RNase Free dH2O up to 10μl
设定PCR反应条件为：42℃ 2min，4℃ ∞进行反应；
（8）参考Takara逆转录试剂盒说明书配置如下反应体系进行逆转录反应：
试剂 添加量
步骤（7）反应液 10μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μl
RT Primer Mix 1μl
5×PrimeScript Buffer 4μl
RNase Free dH2O 4μl
设定PCR反应条件为37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ ∞进行反应；
（9）设计和合成lnc-RP11-266K4.9，lnc-HOTAIR， lnc-RP11-272B17.1，lnc-AC005307.1和lnc-AC091814.2的引物，具体引物序列如下：
（10）参考Takara定量PCR试剂盒说明书配置如下反应体系进行定量PCR反应：
试剂 添加量
SYBR Green Premix Ex Taq（2×） 10μl
上游引物 0.4μl
下游引物 0.4μl
cDNA template 2μl
ddH2O 4μl
设定实时荧光定量PCR仪的反应条件为：95℃ 5min预变性；95℃ 10变形，60℃30s 退火，72℃ 45s 延伸，38个循环；72℃ 10min 终末延伸；
按照2-△△Ct的方法处理得到的数据，计算lnc-RP11-266K4.9，lnc-HOTAIR， lnc-RP11-272B17.1，lnc-AC005307.1和lnc-AC091814.2的相对表达水平。
实验结果参照图1-图5，从图中可以看出，在脐带血间充质干细胞复制性衰老时，基因lnc-RP11-266K4.9，lnc-HOTAIR和lnc-AC091814.2的相对表达水平没有显著变化；lnc-RP11-272B17.1在P12的相对表达量相对于P1的表达量有一定程度的下降，但下降水平较低；lnc-AC005307.1的相对表达量随着传代次数的增加显著的升高，其中，P6代的相对表达量为1.635±0.109，P12代的相对表达量为2.992±0.169，相对于P1代，差异具有统计学意义。上述结果说明，在脐带血间充质干细胞复制性衰老的过程中，lnc-AC005307.1的相对表达量会随复制次数的增加而增加，因此，可以通过检测lnc-AC005307.1的表达水平来检测脐带血间充质干细胞的衰老情况。
实施例3
设计lnc-AC005307.1的ShRNA并使用荧光定量PCR进行验证
（1）根据lnc-AC005307.1的序列（SEQ ID NO.11）设计ShRNA，载体为pENTR™/H1/TO，具体序列为：
Top Strand：
5'-CACCGGACGATGAAGCTAGAATTTGAACGCAAATTCTAGCTTCATCGTCC-3'，SEQ IDNO.12；
Bottom Strand：
5'-AAAAGGACGATGAAGCTAGAATTTGCGTTCAAATTCTAGCTTCATCGTCC-3'，SEQ IDNO.13；
（2）将脐带血间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度达到90%时，转染Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1，转染48h后，提取RNA检测lnc-AC005307.1的相对表达量。
实验所得结果参照图6，其中，转染Sh-lnc-AC005307.1后细胞中lnc-AC005307.1的相对表达量为0.224±0.057，该结果说明本发明所设计的Sh-lnc-AC005307.1能够有效的抑制lnc-AC005307.1的表达。
实施例4 lnc-AC005307.1的基因抑制剂在脐带血间充质干细胞增殖中的作用
（1）将转染Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1的P12代脐带血间充质干细胞制成细胞悬液，接种于96孔板中；
（2）分别在1d，2d，3d，4d和5d时每孔加入10μLCCK-8用酶标仪测定450n处的吸光度。
实验结果如表1和图7所示：
表1不同时间的脐血间充质干细胞的450nm吸光度
Sh-NC Sh-lnc-AC005307.1
1d 0.240±0.006 0.234±0.012
2d 0.291±0.024 0.368±0.029
3d 0.363±0.027 0.586±0.036
4d 0.429±0.025 0.706±0.040
5d 0.467±0.035 0.790±0.039
从表1和图7可以看出，敲除AC005307.1后，能够有效地促进脐带血间充质干细胞的增殖能力，因此可以将AC005307.1的基因抑制剂用于制备促进脐带血间充质干细胞增殖的促进剂。
实施例4 lnc-AC005307.1的基因抑制剂对于脐带血间充质干细胞复制性衰老中的β-半乳糖苷酶的作用
（1）将P12代的脐血间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，sh-NC组和Sh-lnc-AC005307.1组分别转染Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1，对照组空转脂质体，每组设置有3个重复；
（2）配置β-半乳糖苷酶染色液，每1mlβ-半乳糖苷酶染色液为：10μLβ-半乳糖苷酶染色液A，10μLβ-半乳糖苷酶染色液B，930μLβ-半乳糖苷酶染色液C，50μL X-Gal溶液；
（3）吸除细胞培养液，使用PBS洗涤1次，每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶固定液，室温固定15ml；
（4）吸除细胞固定液，使用PBS洗涤细胞3次，每次3min；
（5）吸除PBS，每孔加入1ml染色液，37℃孵育过夜，显微镜下观察计数。
实验结果如图8所示，相较于对照组，转染Sh-NC的细胞对于β-半乳糖苷酶阳性细胞数没有显著影响，而转染Sh-lnc-AC005307.1后β-半乳糖苷酶阳性细胞数显著下降，说明lnc-AC005307.1的基因抑制剂能够有效的降低脐带血间充质干细胞的复制性衰老，因此可以将lnc-AC005307.1的基因抑制剂用于制备脐血间充质干细胞复制性衰老抑制剂。
实施例5 lnc-AC005307.1的基因抑制剂对于增殖和衰老相关基因P21，Cyclin-D1,P16和Cyclin-E1蛋白表达的影响
（1）将P12代的脐血间充质干细胞接种于6孔细胞培养板中，sh-NC组和Sh-lnc-AC005307.1组分别转染Sh-NC和Sh-lnc-AC005307.1，每组设置3个重复；
（2）转染48h后，去除培养基，每孔加入100ul蛋白裂解液，冰上充分裂解；
（3）裂解30min后，使用细胞刮刀将细胞刮下并转移至2ml离心管中，置于离心机中，在4℃条件下，12000rpn离心18min，吸取上清至新的EP管中；
（4）根据BCA检测试剂盒说明书的步骤检测样品蛋白的浓度，加入上样缓冲液；
（5）配置电泳胶，组装电泳装置，90V恒压电泳20min后，调整为120V恒压至溴酚蓝条带到达分离胶底部；
（6）按照电转夹，调整为230mA恒流，电转90min后结束电转，将PVDF膜取出置于封闭液中，封闭1h；
（7）孵育相应的P21，Cyclin-D1,P16和Cyclin-E1抗体，置于4℃冰箱中，孵育过夜；
（8）充分洗膜后，孵育相应的二抗，室温孵育1h；
（9）充分洗膜后，进行显影曝光。
实验结果如图9所示，从图中可以看出，转染Sh-lnc-AC005307.1能够降低促衰老和抑增殖相关的基因P21和P16蛋白的表达，而能够促进抑衰老和促增殖相关的基因Cyclin-D1和Cyclin-E1蛋白的表达，因此可将lnc-AC005307.1的基因抑制剂用于制备抑制P21和P16蛋白表达的抑制剂，同时，可将lnc-AC005307.1的基因抑制剂用于制备促进Cyclin-D1和Cyclin-E1蛋白表达的促进剂。
实施例6 lnc-AC005307.1的基因抑制剂对于脐带血间充质干细胞氧化应激衰老中的β-半乳糖苷酶的作用
（1）进行实验分组：对照组：空转脂质体，实验组1：空转脂质体+H2O2处理2h,实验组2：转染Sh-NC+H2O2处理2h，实验组3：转染lnc-AC005307.1+H2O2处理2h，每组设置有3个重复；
（2）配置β-半乳糖苷酶染色液，每1mlβ-半乳糖苷酶染色液为：10μLβ-半乳糖苷酶染色液A，10μLβ-半乳糖苷酶染色液B，930μLβ-半乳糖苷酶染色液C，50μL X-Gal溶液；
（3）吸除细胞培养液，使用PBS洗涤1次，每孔加入1mlβ-半乳糖苷酶固定液，室温固定15ml；
（4）吸除细胞固定液，使用PBS洗涤细胞3次，每次3min；
（5）吸除PBS，每孔加入1ml染色液，37℃孵育过夜，显微镜下观察计数。
实验结果如图10所示，从图中可以看出，从对照组和实验组1的结果可以看出，H2O2诱导衰老能够显著的增加β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例，说明衰老诱导成功；从实验组1，实验组2，和实验组3的结果可以看出，转染Sh-NC能够对于降低细胞衰老无显著效果，而转染Sh-lnc-AC005307.1则能够显著的降低β-半乳糖苷酶阳性细胞的比例，即，降低脐带血间充质干细胞衰老。因此，从上述结果可以看出，AC005307.1的基因抑制剂能够有效的抑制脐带血间充质干细胞的氧化应激衰老。
本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述，当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东大学齐鲁医院
<120> 促进脐带血间充质干细胞增殖的基因抑制剂
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggcaaagga cagaacgttg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagaacgct gtgtccatct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcacattgg cgagagaagt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttccctcct ctggctctct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaggaatcca agctggctgg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accgaaactg caacgaaatc t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgcactcagc ctccttaagc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
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<400> 8
gagatgggcg agaatccctg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
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<400> 9
ggaagccctg gtgacttgaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccttgccctc tgtccttctg 20
<210> 11
<211> 960
<212> DNA
<213> 人源(Human)
<400> 11
ctgggaggca gagaccctgt cttcaggtgt tggctgaaag aaatggtaac ttattttagc 60
agccttgagc tttctcatgc gggcacatga agaggactag tgtcatctta gggaatgcgg 120
cctcgcacca ttggaaacaa tgattctaaa gaccatttcc acatggagaa gctgccagaa 180
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agagcatggg aaaaatattt gctgtgattt cccaattccc cattttttct gattctttgt 540
tgcagtttcc acaactttgt tatcaggctg tgacagaggt ttgtgaactg atgaaagctc 600
cagagcctcc caggccctct gagtctgatg cctgcactcc acaatcaggc ctcaagctca 660
gggcgcctgc caccaaccca cgctgggctt caggggcagg cagcacttga atggggtttg 720
gttattgtct ttctttattt tctcttattt taagccttaa aaaaaaaaag ataaggtctt 780
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ctgggttcaa ccgatcctcc cacctaagcc tcccgagtaa ccaggactgc aagtatgcac 900
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tgttgcccag gctggtcttg aactcttgag ttcagacaat cctgccacct caacctcaca 1020
aagtgctgga attacaggcg tgagccactg cactcagcct ccttaagcca tttgcttaag 1080
tggctttatt gcaaaacaat atcagaataa caaagaaata taaggtcaaa ctttccctgt 1140
tcccatctag tccaataagc attgctgctc ttgccaggga ttctcgccca tctccatgtg 1200
ccagtgcaat ccatactggt tgttctcctt ggctacccca catctgagtc tctgccttgt 1260
ctgcattctt ccccacttta tgaagagatg agtcagtgcc tgattttttc tgcctctctt 1320
gtcactaggg cacagccatg tgcatgggcc ctgtcactca gaagccccca tccaccaaca 1380
acatggctct gggggcctcc tctctctgga agaattggca gttttagcaa gaaaggtttt 1440
cagaggcagc aatgatggtg gagatgtcca gggccagtgg caggtcaaac cattctctgt 1500
gtcatttggg gcagtgttta tgctgtccct cattttggtt ccctaagcct ccgaacatgt 1560
acgtgaattt 1570
<210> 12
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgttgcccag gctggtcttg aactcttgag ttcagacaat cctgccacct caacctcaca 1020
aagtgctgga attacaggcg tgagccactg cactcagcct ccttaagcca tttgcttaag 1080
tggctttatt gcaaaacaat atcagaataa caaagaaata taaggtcaaa ctttccctgt 1140
tcccatctag tccaataagc attgctgctc ttgccaggga ttctcgccca tctccatgtg 1200
ccagtgcaat ccatactggt tgttctcctt ggctacccca catctgagtc tctgccttgt 1260
ctgcattctt ccccacttta tgaagagatg agtcagtgcc tgattttttc tgcctctctt 1320
gtcactaggg cacagccatg tgcatgggcc ctgtcactca gaagccccca tccaccaaca 1380
acatggctct gggggcctcc tctctctgga agaattggca gttttagcaa gaaaggtttt 1440
cagaggcagc aatgatggtg gagatgtcca gggccagtgg caggtcaaac cattctctgt 1500
gtcatttggg gcagtgttta tgctgtccct cattttggtt ccctaagcct ccgaacatgt 1560
acgtgaattt 1570
caccggacga tgaagctaga atttgaacgc aaattctagc ttcatcgtcc 50
<210> 13
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aaaaggacga tgaagctaga atttgcgttc aaattctagc ttcatcgtcc 50

Claims (1)

1.一种基因抑制剂在制备脐带血间充质干细胞增殖药物中的用途，其特征在于，所述基因抑制剂为lnc-AC005307.1的基因抑制剂， 所述lnc-AC005307.1的基因序列如SEQ IDNO.11所示，所述lnc-AC005307.1的基因抑制剂为特异性靶向抑制lnc-AC005307.1的ShRNA，制备所述ShRNA的Top Strand序列如SEQ ID NO.12所示，制备所述ShRNA的BottomStrand 的序列如SEQ ID NO.13所示。
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