CN101619312A - 人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码rna序列及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA(lncRNA-UN)及其RNA干扰靶点,以及RNA干扰靶点的短发夹RNA(shRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、编码短发夹RNA的正义链DNA和反义链DNA、转录短发夹RNA的重组质粒。实验表明,lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达,在癌旁组织中不表达,可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中应用。实验表明,转录短发夹RNA的重组质粒在黑色素瘤细胞中表达shRNA和siRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-UN并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长,因而本发明所述lncRNA-UN的RNA干扰靶点的shRNA及siRNA,以及转录shRNA的重组质粒可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域,特别涉及一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA(long non-coding RNA,简称lncRNA,下文中“lncRNA”的含义为长非编码RNA)及其用途。
背景技术
人体中编码蛋白质的基因大约有2~3万个,仅占人类基因组的2%,其余98%不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的,是生物体中的垃圾,通常被称为“垃圾DNA”(junk DNA)。但目前的研究表明,这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA,简称ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同,ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA、miRNA、piRNA等),中等长度ncRNA(70-200nt)和lncRNA(long≥200nt)。目前,ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA,而对lncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子,lncRNA不能被翻译成蛋白质,通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能,如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等,越来越多的证据表明lncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现,lncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系,例如与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等疾病有关,研究结果表明lncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用(见Tarantul V.,Nilolaev A.,Hanning H.,et al.,Detection of abundantly transcribed genes and gene translocation inhuman immunodeficiency virus-associated non-Hodgkin’slymphoma.Neoplasia,2001,3:132-142.)。因此,通过大范围分析肿瘤和正常组织的lncRNA,可以鉴定与肿瘤特异相关的lncRNA,使其成为潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的lncRNA的短发夹RNA(short-hairpin RNA,简称shRNA,下文中“shRNA”的含义为短发夹RNA)可以有效地表达特异性的小分子干扰RNA(small interference RNA,简称siRNA,下文中“siRNA”含义为小分子干扰RNA)并抑制lncRNA作用的发挥,比其他的治疗手段的毒副作用会更低。相反,通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的lncRNA,进而抑制其调控的特定靶基因的表达,也可以达到抑制肿瘤生长的效果。为了人类的健康,开发更多的肿瘤特异性表达的lncRNA对基于lncRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种人黑色素瘤细胞特异表达的lncRNA及其RNA干扰靶点(RNA interference,简称“RNAi”,下文中“RNAi”的含义为RNA干扰),以及RNA干扰靶点shRNA、siRNA、编码shRNA的正义链DNA和反义链DNA及转录shRNA的重组质粒;本发明的再一目的是提供所述人黑色素瘤细胞特异表达的lncRNA及shRNA、siRNA和转录shRNA的重组质粒的用途。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的lncRNA克隆自人恶性黑色素瘤细胞yusac,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示(长239nt),或与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列,命名为“lncRNA-UN’。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点(RNAi靶点),来自lncRNA-UN,含有序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的短发夹RNA(shRNA),含有序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:3所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干扰RNA(siRNA),含有序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQID NO:4所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:4所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
本发明所述编码人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA,根据lncRNA-UN的RNAi靶点序列设计;所述正义链DNA含有序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:5所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列;所述反义链DNA含有序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:6所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列。
本发明所述转录短发夹RNA的真核重组质粒,由编码人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段与真核表达载体构建而成。
实验表明,本发明所述lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达,在癌旁组织中不表达,因而lncRNA-UN可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。
实验表明,在黑色素瘤细胞中表达lncRNA-UN对应的shRNA和siRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-UN并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长,因而本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA及siRNA,以及编码shRNA的重组质粒可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
本发明所述lncRNA-UN序列、lncRNA-UN的RNAi靶点序列,lncRNA-UN干扰靶点的shRNA序列,siRNA序列,及编码shRNA的DNA序列既可通过生物学方法获得,又可通过化学合成方法获得,若通过化学合成方法制备,只要将其核苷酸序列提供给有关专业公司,委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征,可对其进行硫代修饰或/和甲氧基修饰。
本发明具有以下有益效果:
1、本发明为黑色素瘤疾病的诊断提供了新的方法和试剂,有利于黑色素瘤疾病的确诊与治疗。
2、本发明为黑色素瘤疾病的治疗提供了新的方法和药物,对于挽救黑色素瘤疾病患者的生命具有重要意义。
附图说明
图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中表达的结果图。
图2是对单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1进行软琼脂集落生长检测的结果图。
图3是将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1注入裸鼠后的实验结果图,图中,1-1和1-2为第1只裸鼠的移植瘤,2-1、2-2为第2只裸鼠的移植瘤,3-1、3-2为为第3只裸鼠的移植瘤。
图4是本发明所述lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC和稳定低表达细胞株yusac-shUN中的表达情况图,图中,1泳道为lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC中的表达,2泳道为lncRNA-UN在稳定细胞株yusac-shUN中的表达。
图5是对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测的结果图。
图6是将稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC注入裸鼠后的实验结果图,图中,1-1和1-2为各实验组中第1只裸鼠的移植瘤,2-1、2-2为各实验组中第2只裸鼠的移植瘤,3-1、3-2为各实验组中第3只裸鼠的移植瘤。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中,凡未注明具体实验条件的,均为按照本领域技术人员熟知的常规条件,例如Sambrook等著的分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989),Freshney著的动物细胞培养:基本技术指南第五版(John Wiley&Sons,Inc,2005)中所述的条件及实验步骤,或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。
实施例1:lncRNA-UN的克隆与分析
1、试剂
Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;MMLV逆转录酶、DNA聚合酶、pfu酶、Nde I酶、Xho I酶、RNase抑制剂均购自立陶宛Fermentas公司;T7RNA聚合酶购自美国NEB公司;随机引物购自美国Promega公司;TALON金属离子树脂购自美国BDClontech公司;PCR引物由Invitrogen公司合成。
2、菌株、细胞株和载体
人恶性黑色素瘤细胞yusac购自美国标准菌种收藏所(ATCC);E.coli BL2菌株购自天津天有利科技有限公司;PCR-blunt-TOPO载体购自美国Invitrogen公司;pET-28a(+)载体购自德国Novagen公司。
3、实验方法
3.1人恶性黑色素瘤细胞yusac总cDNA文库的构建
3.1.1yusac细胞总RNA的提取
1)人恶性黑色素瘤细胞yusac培养至75%汇合度,加入1mL Trizol试剂,用枪头吹打混匀;
2)用5mL带7号针头的1次性注射器吹打10次进行匀浆,将匀浆样品在室温孵育5min;
3)加0.2mL氯仿,盖紧Ep管盖,用手剧烈振荡15s并于室温孵育2~3min;
4)4℃,12,000×g离心15min;
5)将水相层转移到1干净的1.5mLEp管中,加入0.5mL异丙醇及20μg糖原,颠倒混匀,将混匀后的样品于室温孵育10min;
6)4℃,12,000×g离心10min。倒掉上清液,用75%的乙醇1mL洗涤RNA沉淀1-2次,旋涡振荡混合样品后,4℃,7,500×g离心5min;
7)倒掉乙醇,常温干燥RNA沉淀10min,加入50μL无RNA酶的H2O,并于55℃孵育5min,以使RNA充分溶解,于260nm测定RNA浓度。
3.1.2逆转录(RT)
在500μL EP管中加入以下组分:
yusac细胞RNA 10μL
随机引物(10μmol/L)1μL
H2O 18μL
混匀后70℃温育5min,迅速置冰浴中,静置3min后加样如下:
RNase抑制剂1μL
dNTP(10mmol/L)1μL
5×buffer 8μL
MMLV逆转录酶1μL
混匀后42℃温育1h,70℃10min灭活逆转录酶,-20℃保存样品。
3.1.3yusac细胞总cDNA文库的构建
将本实施例3.1.2所得单链cDNA经DNA聚合酶及pfu酶处理得到平末端双链cDNA(操作步骤见DNA聚合酶、pfu酶操作手册)。所得平末端双链cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体上,构建yusac细胞总cDNA文库。
3.2带组氨酸标签His-PSF融合蛋白的原核表达及亲和纯化
3.2.1多聚酶链式反应(PCR)扩增PSF基因的编码序列(Coding Sequence,CDS)
反应体系为:
PCR缓冲液(10×)5μL
MgCl2(2.5mmol/L)2.5μL
dNTP(2.5mmol/L)1.0μL
上游引物(10μmol/L)0.5μL
下游引物(10μmol/L)0.5μL
pcDNA3.1-PSF(连接位点为EcoR I和EcoRV)0.1μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.1μL
Pfu DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL
ddH2O 40μL
矿物油30μL
反应参数为:94℃1min(预变性);94℃30sec(变性),65℃30sec(复性),72℃2min(延伸),所述变性-复性-延伸23个循环;72℃10min(终延伸)。
引物序列如下:
上游引物(FP):5’-ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3’(下划线标示Nde I酶切位点)
下游引物(RP):5’-GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3’(下划线标示Xho I酶切位点)
3.2.2His-PSF融合蛋白的原核表达载体的构建
将PSF的编码序列通过Nde I和Xho I酶切位点克隆到原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点区,得到重组质粒pET-28a(+)-PSF(载体多克隆位点区末端自带组氨酸His标签)。
3.2.3His-PSF融合蛋白的表达
1)将本实施例3.2.2所得重组质粒pET-28a(+)-PSF转化到E.coli BL21菌株中;
2)接种转化了重组质粒pET-28a(+)-PSF的E.coli BL21单菌落于LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中,37℃震荡培养;
3)检测菌液OD600至0.6-0.7时加入1.0mmol/L IPTG,并将温度调至25℃,诱导培养过夜。
3.2.4His-PSF融合蛋白的亲和纯化
1)离心收集菌体,菌体经PBS缓冲液(140mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,
5mmol/L Na2HPO4,1.8mmol/L KH2PO4及5mmol/L EDTA,pH7.2)洗涤后重新悬浮于20mL PBS(含0.5mol/L NaCl,1mmol/L PMSF及1mmol/L DTT);
2)冰浴超声破壁,13,000×g离心30min收集上清;
3)沉淀以相同步骤重复处理一次,合并两次上清收集液,得到蛋白粗提液;
4)将TALON金属离子亲和树脂(BD Clontech)用平衡-洗涤缓冲液(250mmol/LNa3PO4,1.5mol/LNaCl,pH7.0)预平衡;
5)加适量蛋白粗提液于预平衡后的TALON金属离子亲和树脂,轻柔摇晃1.5hrs;
6)加入平衡-洗涤缓冲液(含有10mmol/L咪唑)洗涤树脂两次;
7)用平衡-洗涤缓冲液(含有250mmol/L咪唑)洗脱树脂上结合的His-PSF重组蛋白;
8)洗脱得到的重组蛋白用50倍体积的透析缓冲液(20mM Hepes,20%glycerol,100mM KCl,0.2mM EDTA,0.2mM PMSF,0.5mM DTT,pH7.9)在4℃透析过夜,中途更换透析缓冲液一次;
9)得到的透析产物用液氮速冻,1h后长期冻存于-80℃;
3.3PSF蛋白结合RNA的筛选及编码PSF结合RNA的cDNA子文库的构建
利用组氨酸标签将原核重组质粒表达的His-PSF融合蛋白结合于TALON金属离子树脂上;用T7RNA聚合酶将yusac细胞总cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混合体,RNA混合体通过5次反复过柱,使能够与PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上;将RNA从树脂上洗脱,逆转录合成cDNA,将cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体上构建cDNA子文库,文库中富集了编码与PSF蛋白结合的RNA的克隆,挑取阳性克隆测序。
3.4所获克隆序列的分析
所获克隆序列测序,对人基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST分析,并找到它们在人染色体上的精确定位(http://genome.ucsc.edu/)。挑选出≥200bp且位于基因组非蛋白质编码区的序列。其中获得一条239nt的lncRNA,其序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,定位于6号染色体的165453538-165453778位核苷酸,其为一未知序列编码,命名为lncRNA-UN。
3.5lncRNA-UN的RT-PCR鉴定
使用Trizol试剂从人恶性黑色素瘤组织提取总RNA(方法同本实施例3.1.1),按照常规RT-PCR方法检测lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织中的表达。
3.5.1RT(方法同本实施例3.1.2)获得黑色素瘤组织cDNA
3.5.2PCR
PCR缓冲液(10×)2.5μL
dNTP(2.5mmol/L)1.0μL
上游引物(10μmol/L)1.0μL
下游引物(10μmol/L)1.0μL
黑色素瘤组织cDNA 0.3μL
DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL
ddH2O 19μL
反应参数均为:94℃3min(预变性);94℃30sec(变性),64℃30sec(复性),72℃60sec(延伸),所述变性-复性-延伸30次循环。
引物序列如下:
5’-tttgacacgagtgactgtattttgaa-3’
5’-atttatgaattgtcacaggacctct-3’
测序检测RT-PCR扩增获得的序列,并与序列表中SEQ ID NO:1比对,结果显示吻合。
实施例2:定量PCR检测lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中的表达
1、试剂、菌株、细胞株和载体
常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例一相同。
QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司。
2、实验方法
2.1.1合成的总cDNA
以人黑色素瘤组织及对应癌旁组织为材料,用Trizol试剂分别提取黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总RNA(方法同实施1中的3.1.1)。将黑色素瘤组织总RNA和对应癌旁组织总RNA各取1μg,用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例1中的3.1.2)获黑色素瘤组织总cDNA和对应癌旁组织的总cDNA,合成的黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总cDNA即为定量PCR反应的模板。
2.1.2黑色素瘤组织及癌旁组织的lncRNA-UN表达
以本实施例2.1.1所得黑色素瘤组织总cDNA和对应癌旁组织的总cDNA为PCR反应的模板,以特异于lncRNA-UN序列的RT-PCR引物(同实施例1的3.5.2中引物)为引物,用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应,即获黑色素瘤组织及癌旁组织的lncRNA-UN表达。
2.1.3实验结果
黑色素瘤组织及癌旁组织lncRNA-UN的表达情况见图1,图1中1,3,5,7对应的为黑色素瘤癌旁组织;2,4,6,8对应的为黑色素瘤组织。从图1可以看出,lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达,而在癌旁组织中不表达。实验结果表明,lncRNA-UN在黑色素瘤组织和癌旁组织中的表达水平存在明显差异,因而lncRNA-UN可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。
实施例3:lncRNA-UN的过量表达对黑色素瘤细胞生长的影响
1、试剂、菌株、细胞株和载体
常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例1相同。
pcDNA-3.1真核表达载体、lipofectamine 2000转染试剂、G418抗生素均购自美国Invitrogen公司;DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibico公司;硝基蓝四唑(nitro bluetetrazolium,NBT)购自美国Sigma公司。
Perfection 4990平板式扫描仪购自日本Epson公司。
BALB/c裸鼠,SPF(Specific Pathogen-free,无特定病原体)级,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司
2、实验方法
2.1稳定高表达lncRNA-UN的单克隆细胞株的构建
2.1.1构建lncRNA-UN的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN
将原本克隆于PCR-blunt-TOPO载体上的编码lncRNA-UN的DNA序列(由实施例1的3.3和3.4获得)重新连接到真核表达载体pcDNA-3.1的Nhe I和Apa I酶切位点,构建lncRNA-UN的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN。
2.1.2构建单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN
用含10%胎牛血清的DMEM培养基将人黑色素瘤细胞yusac培养于5%CO2的37℃培养箱中。转染前一天于6孔板中接入1×106个细胞/孔,用lipofectamine 2000进行转染,每孔转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN 3μg。细胞转染24小时后用浓度为700mg/L的G418连续筛选1-2周,得到稳定转染的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN。同时以空载体pcDNA-3.1稳定转染yusac细胞(见lipofectamine 2000说明书),得到对照细胞株yusac-pcDNA3.1。
2.1.3单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-UN的表达量检测
以常规半定量RT-PCR检测各单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-UN的表达量,挑选得到lncRNA-UN表达量最高的稳定黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN。并以转入空真核表达载体pcDNA-3.1的黑色素瘤细胞株yusac-pcDNA3.1作为对照。
50μL半定量PCR反应体系,其组分为
PCR缓冲液(10×)5μL
MgCl2(25mM)5μL
dNTP(2.5mmol/L)1.0μL
上游引物(10μmol/L)0.5μL
下游引物(10μmol/L)0.5μL
模板(yusac-lncRNA-UN或yusac-pcDNA3.1的cDNA)2μL
DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL
ddH2O 35.6μL
所有PCR的反应参数为:94℃3min(预变性);94℃30ec(变性),64℃30s ec(复性),72℃60sec(延伸),所述变性-复性-延伸×n cycles。循环次数根据PCR反应的起跳点确定,一般情况下,每次具体的PCR反应较起跳点多1-2个循环。
2.2软琼脂集落生长检测
在6孔板中用1mL含0.6%琼脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培养基铺设下层琼脂;待下层琼脂凝固后,将本实施例2.1.2构建的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体的对照细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5×103个细胞/孔的数量接入1mL含0.3%琼脂糖、700mg/LG418及10%胎牛血清的DMEM培养基,混匀后铺设上层琼脂;待上层琼脂凝固后,培养于5%CO2的37℃培养箱中培养。2周后,加入400μL 1.25g/L的硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium,NBT)染色液,置于5%CO2的37℃培养箱中孵育过夜,透射扫描仪扫描的图像见图2。
图2表明,与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1相比,转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN稳定过量表达lncRNA-UN,可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的集落性生长,增强了yusac细胞的体外恶性生长特性。
2.3裸鼠移植瘤生长检测
实验裸鼠为5周龄裸鼠,分成两组,每组3只,一组用于注射本实施例2.1.2构建的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN,一组用于注射本实施例2.1.2构建的转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1。
将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5×105个细胞/注射点的剂量对裸鼠进行颈部皮下注射(每只裸鼠2个注射点),待移植瘤长出后,每3天检测一次大小,移植瘤长出后约一个月,将裸鼠脱颈椎处死,取出肿瘤,两组裸鼠的实验结果见图3,从图3可以看出,注射单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN的裸鼠长有移植瘤,注射对照细胞株yusac-pcDNA3.1的裸鼠未长有移植瘤。
图3表明,与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1相比,转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN稳定过量表达lncRNA-UN可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的体内成瘤性,增强了yusac细胞的体内恶性生长特性。
实施例4:lncRNA-UN特异性shRNA抑制黑色素瘤细胞的恶性生长特性
1、试剂、菌株、细胞株和载体
常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例1相同。
正义链DNA和反义链DNA模板由美国Invitrogen公司合成;限制性内切酶BamH1和HindIII均购自立陶宛Fermentas公司;真核表达载体pGenesil-1购自武汉赛晶公司。
2、实验方法
2.1lncRNA-UN特异性RNA干扰载体的构建
将lncRNA-UN的序列信息提交siRNA互联网设计工具(www.dharmacon.com),获得可信度最高的RNAi靶点序列(如序列表中SEQ ID NO:2所示)。根据lncRNA-UN的RNAi靶点序列设计编码特异性shRNA分子的正义链DNA和反义链DNA模板,将所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体pGenesil-1,构建lncRNA-UN干扰重组质粒。将构建好的lncRNA-UN干扰重组质粒导入哺乳动物细胞后,能在其中转录出shRNA(如序列表中SEQ ID NO:3所示),shRNA在动物细胞内被动物细胞固有的Dicer酶进一步切割形成具有RNA干扰功能的siRNA(如序列表中SEQ ID NO:4所示),从而诱导RNA干扰程序的启动。正义链DNA和反义链DNA模板序列如下:
1)编码lncRNA-UN RNAi靶点shRNA的正义链DNA:
2)编码lncRNA-UN RNAi靶点shRNA的反义链DNA:
序列中下划线部分为靶基因的RNAi靶点序列及相应互补序列;方框部分为限制性内切酶BamH1和HindIII的识别位点,用于退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体;中间未标示部分编码shRNA的茎环(loop)。
2.1.1正义链DNA和反义链DNA的退火
将编码lncRNA-UN RNAi靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA片段浓度分别调整为250μM,退火形成互补双链DNA分子(经退火处理后5’及3’端分别带有BamH1/HindIII酶切位点)。退火反应条件如下:
shRNA-S模板(250μM)5μL
shRNA-A模板(250μM)5μL
10×退火缓冲液(100mM Tris-HCl,pH7.5,10mM EDTA,1MNaCl)1.25μL
H2O 1.25μL
混匀,石蜡油覆盖后离心10s,95℃温育5min,经1-2小时缓慢降温至室温,此时两条寡核苷酸精确退火为寡核苷酸双链(浓度为100μM);退火后的双链DNA用灭菌水稀释100倍,浓度为1μM。
2.1.2构建lncRNA-UN干扰重组质粒
将退火形成的双链DNA片段连接到RNA干扰载体pGenesil-1的BamH1/HindIII酶切位点,构建lncRNA-UN特异性shRNA的真核重组质粒pGenesil-shUN。连接反应条件如下:
pGenesil-1载体(约0.005μM)10μL
双链DNA(1μM)0.5μL
10×连接酶缓冲液2μL
H2O 5.5μL
连接酶2μL
混匀,离心5sec,16℃连接过夜,70℃10min灭活连接酶,-20℃保存样。
2.1.3构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC
构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC的方法同本实施例2.1.1和2.1.2。将负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC导入哺乳动物细胞后转录出萤火虫荧光素酶基因luciferase特异的shRNA-shLUC,其编码DNA序列的正义及反义链分别为:
2.2稳定低表达lncRNA-UN的单克隆细胞株的构建
同实施例3中的2.1.2所述方法将获得的真核重组质粒pGenesil-shUN稳定转染人黑色素瘤细胞yusac,经G418筛选、半定量RT-PCR检测后,获得lncRNA-UC表达量最低、RNAi效果最好的稳定细胞株yusac-shUN。同时,以负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC转染yusac细胞,得到对照细胞株yusac-shLUC。lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC和稳定细胞株yusac-shUN中的表达情况见图4。图4表明,稳定细胞株yusac-shUN中,lncRNA-UN的表达量较对照细胞株yusac-shLUC明显降低,说明选用的RNAi靶点序列正确无误,shRNA诱导的RNAi效果明显,稳定低表达lncRNA-UN的单克隆细胞株构建成功。
2.3软琼脂集落生长检测
同实施例3中2.2所述方法分别对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测(细胞接种量为1×104个细胞/孔),检测结果见图5。由图5可知,转染真核重组质粒pGenesil-shUN降解yusac细胞内源性lncRNA-UN后,yusac细胞的集落性生长受到了一定程度的抑制,其体外恶性生长特性减弱,而转染对照重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体外恶性生长特性没有影响。这表明lncRNA-UN特异性的shRNA对黑色素瘤细胞的生长具有抑制作用,并具有治疗黑色素瘤疾病的作用,可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
2.4裸鼠移植瘤生长检测
同实施例3中的2.3所述方法分别对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行裸鼠移植瘤生长检测(细胞注射剂量为2×106个细胞/注射点),检测结果见图6。由图6可知,转染真核重组质粒pGenesil-shUN降解yusac细胞内源性lncRNA-UN后,yusac细胞的体内成瘤性受到了一定程度的抑制,其体内恶性生长特性减弱,而转染对照真核重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体内恶性生长特性没有影响。这进一步表明lncRNA-UN特异性的shRNA对黑色素瘤的发生发展具有抑制作用,具有治疗黑色素瘤相关疾病的用途,可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
序列表
<110>四川大学
<120>人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA序列及其用途
<160>6
<170>PatenInVersion 3.2
<210>1
<211>239
<212>RNA
<213>人
<400>1
ugugugugug uaugugagag agagagagag agagcccucu cuucaugguc uuccucagcu 60
ccauuugcca gaguuugaca cgagugacug uauuuugaau cuuacaacuu ucacagauua 120
cauauauuuu aagaaaauuc cuacuuaagc uagaugagcu uucucuuuca gagguccugu 180
gacaauucau aaauuuaaug uuugcauuua aaucuuacuu gcuuauuaug agcauuguu 239
<210>2
<211>19
<212>RNA
<213>人
<400>2
uggucuuccu cagcuccau 19
<210>3
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
uggucuuccu cagcuccauu ucaagagaau ggagcugagg aagacca 47
<210>4
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>4
uggucuuccu cagcuccau 19
accagaagga gucgaggua 19
<210>5
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gatcctggtc ttcctcagct ccatttcaag agaatggagc tgaggaagac catttttta 59
<210>6
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
agcttaaaaa atggtcttcc tcagctccat tctcttgaaa tggagctgag gaagaccag 59
Claims (9)
1、一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA,其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,或与序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
2、一种权利要求1所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点,其特征在于它含有序列表中SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQID NO:2所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:2所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
3、一种权利要求2所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的短发夹RNA,其特征在于它含有序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQID NO:3所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
4、一种权利要求2所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干扰RNA,其特征在于它含有序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:4所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。
5、一种编码权利要求3所述短发夹RNA的正义链DNA和反义链DNA,其特征在于所述正义链DNA含有序列表中SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQID NO:5所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:5所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列;所述反义链DNA含有序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列,或与序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性,或为序列表中SEQ ID NO:6所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列。
6、一种转录权利要求3所述短发夹RNA的真核重组质粒,含有权利要求5所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段。
7、权利要求1所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。
8、权利要求3所述短发夹RNA在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
9、权利要求4所述小分子干扰RNA在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。
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