CN112553208A - 一个长链非编码rna新基因及其在制备检测或诊断早期黑变病试剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明还提供了一种长链非编码RNA基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。并提供了所述长链非编码RNA基因在制备检测或诊断早期黑变病的试剂中的应用，还提供了这个新基因的组织表达特性、促黑素生成效果以及其作用机制，为下一步治疗黑变病临床药物的开发提供了理论依据。本发明提供的长链非编码RNA能够用于多种黑变病的早期临床检测，以利于疾病的早期干预，并且不局限于黑色素瘤，还可用于其他表现为组织黑色素增生的多种黑变病的早期临床检测和预防，其适用范围更加广泛。

Description

一个长链非编码RNA新基因及其在制备检测或诊断早期黑变 病试剂中的应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种长链非编码RNA及其应用。

背景技术

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸且不能编码蛋白质的转录本，主要参与基因的表达调控。研究表明，它可以通过参与X染色体失活和转录、染色质修饰、基因组印记、干扰基因启动子、诱导组蛋白修饰、蛋白活性调控及核内运输等多种重要的调控过程，在表观遗传学调控、信号通路、转录及转录后调节编码蛋白基因的表达等途径参与基因的表达与调控。目前，已经证实多种疾病的发生和发展、不同肿瘤细胞类型的转换、侵袭和转移等都与lncRNA的异常表达有关。

黑色素病变是指因黑色素分泌和代谢异常而引起的一类色素丢失(白化)或增生(黑变)的疾病。黑变病又称黑色素沉着症，是一类引起组织弥漫性色素沉着为特点的疾病，根据组织分类可分为皮肤黑变病(包括Riehl黑变病、职业性黑变病、摩擦性黑变病、civatte异色性黑变病等)和内脏器官黑变病(包括直肠黑变病、结肠黑变病、口腔粘膜黑变病等)。目前，对于人类黑变病的发病机制尚不明确。酉州乌羊是迄今为止人们发现的唯一一种全身乌皮，眼、鼻、嘴、肛门、阴门等处可视黏膜也为乌色表型的哺乳动物。已经证实，酉州乌羊的乌皮、乌黏膜是一类罕见的色素增生现象，是研究人类皮肤、黏膜黑变病的一个理想的医学模型。因此，研究酉州乌羊皮肤黑色素沉积有助于人们理解多种人类黑变病的发病机制。

发明内容

本发明的发明目的在于提供了可以用于早期检测黑变病的一个长链非编码RNA新基因及其应用方法。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一个长链非编码RNA新基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。本发明能够用于多种黑变病的早期临床检测，以利于疾病的早期干预并防止恶化。

一种载体，包含上述的长链非编码RNA基因；所述载体结构如图7所示。

本发明还提供了上述长链非编码RNA基因在检测或诊断早期黑变病的试剂中的应用，还提供了这个新基因的组织表达特性、促黑素生成效果以及其作用机制，为下一步治疗黑变病临床药物的开发提供了理论依据。本发明提供的长链非编码RNA不局限应用于黑色素瘤的检测或诊断，还可用于其他表现为组织黑色素增生的多种黑变病的早期临床检测和预防，其适用范围更加广泛。

上述黑变病包括黑色素瘤、Riehl黑变病、职业性黑变病、摩擦性黑变病、civatte异色性黑变病、直肠黑变病、结肠黑变病、口腔粘膜黑变病等。

上述应用，包括采用上述的长链非编码RNA基因的引物进行PCR检测的步骤。优选的，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种用于检测黑变病的试剂盒，包括：每20μL反应体系包括聚合酶液10.0μL，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，染料0.4μL，cDNA 2.0μL，RNase ddH2O 6.8μL。进一步采用定量PCR进行检测，反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火34s，共40个循环。本试剂盒可用于临床上快速检测组织中TCONS_00153149基因的表达。

有益效果

1、本发明所提供的长链非编码RNATCONS_00153149，相对于已报道的其他lncRNA具有以下优势：

(1)检测时机更早：其他lncRNA的分离和鉴定多来自于肿瘤组织，其异常表达只有在形成肿瘤后才能被发现。而本专利lncRNATCONS_00153149在正常组织黑色素增生早期就能被检测到其异常表达，这在酉州乌羊(具黑色素增生表型，但不发生癌变)上得到了验证，酉州乌羊遗传资源群体给研究人类黑色素疾病提供了一个良好的动物模型。因此，通过检测正常组织lncRNATCONS_00153149的表达量并测定黑色素含量可为临床提供更早诊断信息，给预防和治疗黑色素肿瘤疾病提供更多的机会。

(2)适用范围更广：鉴于lncRNATCONS_00153149新基因的多组织表达特性(详见具体实施方式)以及黑色素细胞在体组织的广泛分布特性，奠定了其适用范围的广谱性。说明本发明专利的新基因lncRNATCONS_00153149可用于多种组织的黑色素增生(黑变病)的早期诊断和预测，并不仅仅局限于某一种黑色素肿瘤的预测和诊断。

(3)灵敏度更高：本发明用于黑变病的检测灵敏度高，尤其是用于正常组织黑色素增生早期检测时，检测对象含量微小，检测难度大，而本发明提供的检测试剂盒和方法灵敏度可以达到pg(10^-12克)级，甚至达fg(10^-15克)级。

2、发明人团队前期应用转录组测序(transcriptome sequencing,RNA-Seq)法从酉州乌羊(乌皮)和渝东白山羊(白皮)皮肤中鉴定出1336个特定的lncRNAs，其中lncRNATCONS_00153149为一个新基因，且在羚羊、绵羊、家牛、水牛、牦牛、瘤牛等反刍动物中显示出极高的保守性。此外，研究还发现lncRNA TCONS_00153149的表达量与组织黑色素含量呈显著正相关，这说明lncRNA TCONS_00153149参与了酉州乌羊皮肤组织黑色素沉积的调控，其极有可能作为一个人类黑变病的临床诊断指标。

3、本发明提供了一个全新的调控皮肤黑色素增生的标志物-新基因lncRNATCONS_00153149，阐明了该新基因促进皮肤黑色素增生的作用机制。该长链非编码RNA新基因有望作为一个预测黑色素增生类疾病(黑变病)的有效诊断指标，为人类黑变病的预防和早期临床诊断提供依据。

附图说明

图1LncRNA TCONS_00153149在酉州乌羊各组织中的相对表达(GAPDH为内参基因)

图2LncRNA TCONS_00153149在酉州乌羊与渝东白山羊各组织中的相对表达图3黑色素含量

图4LncRNA TCONS_00153149在B16-F10黑色素细胞分化阶段的动态表达

图5转染B16-F10黑色素细胞后00153149基因的表达情况

图6转染B16-F10黑色素细胞后黑色素候选基因的表达情况

图7 lncRNA TCONS_00153149的慢病毒表达载体结构图，A-穿梭质粒结构图，B-包装质粒结构图

图8不同毛色山羊100日龄胎儿皮肤TCONS_00153149及黑色素基因表达

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方法进行详细描述，下面的描述是为了进一步说明本发明，而不构成对本发明的限定。

实施例1

一种长链非编码RNA，其序列如SEQ ID NO.1所示。

1 LncRNATCONS_00153149的组织表达特性

1.1 LncRNATCONS_00153149在酉州乌羊各组织中的表达特性

实时定量PCR(qPCR)分析结果显示，lncRNA TCONS_00153149基因在脾中的相对表达量最高，极显著高于皮肤、肾、肺、肝和心脏组织(P﹤0.01)，lncRNA TCONS_00153149基因在皮肤中的相对表达量与肌肉、大脑、皮肤、肾、肺、肝、心脏组织的相对表达量差异不显著(P>0.05)(图1)。

1.2 LncRNA TCONS_00153149在不同肤色山羊品种间的表达差异

应用qPCR检测了lncRNA TCONS_00153149在酉州乌羊(乌皮)和渝东白山羊(白皮)各组织中的表达情况，结果显示，lncRNA TCONS_00153149在不同品种山羊的体组织中均有表达，且相对表达量存在差异(如图2所示)。特别是lncRNA TCONS_00153149在酉州乌羊皮肤和肌肉组织中的相对表达量极显著高于渝东白山羊(P﹤0.01)；lncRNA TCONS_00153149在酉州乌羊心、肝、肺、大脑组织中的相对表达量显著高于渝东白山羊(P﹤0.05)；lncRNATCONS_00153149在酉州乌羊脾组织中的相对表达量显著低于渝东白山羊(P﹤0.05)；lncRNATCONS_00153149在酉州乌羊肾组织中的相对表达量和渝东白山羊的差异不显著(P＞0.05)。以上结果暗示，lncRNA TCONS_00153149的表达与皮肤组织黑色素含量呈明显的正相关关系。

2 LncRNA TCONS_00153149促黑色素生成的效果

为了进一步确证lncRNA TCONS_00153149对黑色素生成的促进作用，我们构建了lncRNA TCONS_00153149的慢病毒表达载体，将其转染B16黑色素细胞，转染后分化培养第3天，应用NaOH裂解法测定黑色素含量，发现转染lncRNA TCONS_00153149基因的B16细胞中黑色素含量显著高于对照组(NC)(p＜0.05)(图3)。这说明lncRNA TCONS_00153149具有显著的促进黑色素增生的作用。

3 LncRNA TCONS_00153149在小鼠B16-F10黑色素细胞分化阶段的动态表达

LncRNA TCONS_00153149在黑色素细胞不同分化时间都有表达，且在分化培养第3天的相对表达量最高，其次第5天，两者之间差异不显著(P＞0.05)；分化第3﹑5天细胞中lncRNATCONS_00153149的相对表达量极显著高于分化第-1﹑0﹑1、7天的相对表达量(P﹤0.01)(图4)。因此，在后续的转染实验及黑色素测定实验中，研究选取了转染后分化培养第3天进行测定。

4 LncRNA TCONS_00153149促进黑色素生成的作用机制

4.1 LncRNA TCONS_00153149在转染小鼠B16-F10黑色素细胞后的表达情况

用含有lncRNA TCONS_00153149基因和NC的慢病毒载体对B16-F10细胞进行转染，转染后分化培养第3天qPCR法检测lncRNA TCONS_00153149的表达情况，以小鼠GAPDH为内参基因进行校正。结果显示，lncRNA TCONS_00153149基因相对表达量极显著提高(P﹤0.01)(图5)。

4.2 TCONS_00153149对黑色素生成关键基因表达的影响

为进一步阐明此lncRNA的促黑素生成作用机制，我们构建了lncRNA TCONS_00153149的特异性慢病毒表达载体，并分析了此lncRNA对B16-F10细胞黑色素生成关键基因表达的影响，以小鼠GAPDH为内参基因进行校正。qPCR分析结果显示，与NC组相比，转染lncRNA TCONS_00153149基因后，TYRP的相对表达量显著提高(P﹤0.05)，MITF、DCT的相对表达量极显著提高(P﹤0.01)，TYR的相对表达量差异不显著(P>0.05)；而ASIP基因的相对表达量极显著降低(P﹤0.01)(图6)。由于ASIP是黑色素生成过程中的关键负调控基因，而MITF、DCT、TYRP、TYR是关键正调控基因。这些色素关键基因的差异表达进一步从分子层面验证了lncRNA TCONS_00153149显著的促黑素生成作用。

实施例2胎儿早期皮肤组织黑色素增生检测

不同毛色的山羊胎儿发育至100日龄时，其毛发还未生成。检测黑山羊与白山羊100日龄胎儿皮肤黑色素生成关键基因的表达，可明确此时皮肤组织的黑色素增生状况。而所有人类黑变病的早期症状均为黑色素增异常增生。因此，研究早期山羊胎儿黑色素增生与TCONS_00153149的关系，也可为人类黑色素增生的临床诊断提供重要参考。

试剂：一种检测早期黑色素增生的试剂盒，包括：lncRNA TCONS_00153149扩增的特异性引物一对(18OD)，聚合酶液(10ml)，染料(1ml)，RNase ddH2O(50ml)；

引物序列为：F:CTGCACCTTGGACCTGTGAC

R:CCTATTCTCTGCGTCCTCCTG

反应体系为20μL：其中聚合酶液10.0μL，上下游引物(10μmol/L)各0.4μL，染料0.4μL，cDNA 2.0μL，RNase ddH₂O 6.8μL。

定量PCR检测：定量PCR仪上采用的反应程序为95℃预变性30s；95℃变性5s；60℃退火34s，共40个循环。

样本：重庆本地黑山羊与白山羊100日龄胎儿皮肤。不同毛色的山羊胎儿发育至100日龄时，其毛发还未生成。黑变病的早期症状均为黑色素增异常增生，检测黑山羊与白山羊100日龄胎儿皮肤黑色素生成关键基因的表达，可明确其早期黑色素增生情况。

结果：应用本专利的检测试剂盒通过qPCR法对黑山羊与白山羊100日龄胎儿皮肤组织中TCONS_00153149及黑色素生成关键调控基因ASIP、DCT、TYRP1的表达进行了检测分析。结果表明，TCONS_00153149及黑色素生成关键正调控基因(DCT、TYRP1)在黑山羊中显著上调，而黑色素负调控基因ASIP显著下调，这说明长链非编码RNA TCONS_00153149可作为一个有效的检测早期组织黑色素增生(黑变病)的临床指标。见图8。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆市畜牧科学院

<120> 一个调控皮肤黑色素增生的长链非编码RNA新基因及其应用

<160>

<210> 1

<211> 1300

<212> LncRNA TCONS_00153149

<213> RNA

<400> 1

nctccactca ccaggtctct gatgagtgcc tctcctctgg cctgggggca gcagccagca 60

ccccatgaga tcagatgggt ggccggggcc cccatgtcct aggagacctc ctgtcccttc 120

cctgacctgc ttgacctgcc agcctccctc gggggtcagt gttgacccat ccccgggacc 180

ttccccggga cttggggctg agtggccagt gcgatgctcc ctatgtggct cagagggccc 240

gggctccctg tgtccttccg cgcgggctgc tccgtgagcc gcagggcatc tcctggaccc 300

cagcccgctg caccttggac ctgtgacagc atggatgggc ctggagtgcg tcgtgctggg 360

ataaatgtga tttcacacac gtggaatctg cgacacgagc aggcaaacag gaggacgcag 420

agaatagggt ggtggttaca gagaggggag gcaggggcgg gcgtgagagg gccgaccccc 480

ggggacaggg aagccagagg gttggtggtg agtggttccc aggcggcact ggtggtggag 540

aaccgacctg cccgtgtgtg agtccctggg tcaggaggat ctcctggagg agggcatggc 600

aaactactcc attactcttg cccagagaac cccgtggaca gaggagcctg gtgcacgcag 660

gccatagggt tgcagagtcg agacacggcc gaagcagcgt agggtcctca gaagcaggag 720

ctcgtgatgg tgcgagccag tgttactcca gcaaagaata tgctgtttta aaaatctgat 780

tctattcctt gtcagcagga gtctggccgt gactggtgtt ggtcttttag gcacgggtgt 840

gattcttaaa gtgcgcacgc acccggggca gccaggttgg gaccctgctg tcctgtcctc 900

tggctgttct ggaacctgcc cccaccccag ggaaggcgcc tcctgtgcgg gtgggcggcg 960

tgtctcacgg cagggctgcc gggagtcctg gggtgcagcc ctgaagctcc acgcaggcgg 1020

gtaaacccca gctggttcca ggagaaggcg gaagcagctg tggagagcat ctctcttgtt 1080

ttagaagatt ccggaaggag gggtgtggcg tgggagcaga aagggtgtca cgggctggca 1140

tctaggagga gtctgcctgc cagaggcccc actgtgcctc accctggggt gcgggggcag 1200

cgcccagggc tcccggcctg cactccactg aagtcgccgt gttctgggga ggtccggcgg 1260

ggcggggcag ggcgggttgc atcacagccc tagcgccccc 1300

<210> 2

<211>

<212> LncRNA TCONS_00153149上游引物

<213> RNA

<400> 2

ctgcaccttg gacctgtgac 20

<210> 3

<211>

<212> LncRNA TCONS_00153149下游引物

<213> RNA

<400> 3

cctattctct gcgtcctcct g 21

Claims (9)

1.一种长链非编码RNA基因，其序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种载体，包含权利要求1所述的长链非编码RNA基因。

3.如权利要求2所述载体，结构如图7所示。

4.如权利要求1所述的长链非编码RNA基因在制备检测或诊断早期黑变病试剂中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，所述黑变病包括黑色素瘤、黑色素增生、Riehl黑变病、职业性黑变病、摩擦性黑变病、civatte异色性黑变病、直肠黑变病、结肠黑变病、口腔粘膜黑变病等。

6.如权利要求4或5所述的应用，包括步骤：采用权利要求1所述的长链非编码RNA基因的引物进行定量PCR。

7.如权利要求6所述的应用，所述引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

8.一种用于检测黑变病的试剂盒，每20 µL反应体系包括：SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3(10 µmol/L)各0.4 µL、染料0.4 µL、cDNA 2.0 µL、RNase ddH₂O 6.8 µL、聚合酶液10.0µL。

9.如权利要求8所述试剂盒的使用方法，采用定量PCR法，反应条件为：95℃预变性30s、95℃变性5 s、60℃退火34 s，共40个循环。

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