CN111254130A - Ddx24解旋酶点突变抑制肿瘤生长的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了DDX24解旋酶新发现的促癌作用以及通过点突变实现抑癌效果的方法及其应用，所述包括以下：1.野生型DDX24高表达与肿瘤生长有着显著相关性，通过高表达野生型DDX24，可促进肿瘤的生长；2.与家族性脉管畸形的致病基因DDX24机理不同，包括K11E或者E271K的DDX24点突变，明显抑制肿瘤的生长；3.通过本专利提供的DDX24的新功能以及诱导点突变，可对隐匿性、难治性肿瘤的治疗提供新的靶向治疗方法，也可为肿瘤相关疫苗的制备提供新思路；4.上述1‑3所述的应用，可针对头颈部鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤黑色素瘤、淋巴瘤、腺皮瘤、胸腺瘤、肺癌、结直肠癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、鼻咽癌、骨癌、恶性肌肉瘤等实体肿瘤，但不限于这里所列肿瘤。

Description

DDX24解旋酶点突变抑制肿瘤生长的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及野生型DDX24促癌以及点突变后抑癌的方法及其应用。
背景技术
DDX24基因定位于14号染色体长臂32区，广泛分布于人体各组织中。既往认为DDX24是非环形超家族2解旋酶中最大成员DEAD-box家族中的一员 (Fairman-Williams,Guenther et al, 2010, Curr Opin Struct Biol. 20(3): 313-324)，具有ATP依赖的RNA解旋酶活性以及RNA依赖的ATP酶活性，参与翻译起始与翻译后修饰来调控细胞生理活动(Jarmoskaite, Russell, 2011, 2010 John Wiley&Sons, Ltd. 2: 135-152)。 另有文章指出DDX24可能参与内脏血管畸形的形成 (Pang, Hu et al, 2019, Hepatology 69(2):803-816)。此外，DDX24可能通过结合泛素特异性蛋白酶USP7 (Georges, Marcon et al,2018, Scientific Reports 8: 1-12)、负调控抑癌基因p53 (Shi, Dai et al，2016,Oncogene 35(4): 528-536)等多途径参与癌症的发生，在人类多种癌细胞中过表达。
目前TCGA临床数据库显示在头颈部鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤黑色素瘤、淋巴瘤、腺皮瘤、胸腺瘤等肿瘤中DDX24过表达，提示DDX24有促癌功能，但是缺乏系统细胞或者活体动物的研究。为了弥补这个不足，开展DDX24本身癌基因特性细胞和活体动物模型研究，寻找DDX24关键位点抑制成瘤，可为隐匿性、难治性肿瘤的的早期检测、诊断及治疗提供新方法，对于减少肿瘤的发生发展具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于针对在多种肿瘤中过表达的癌基因DDX24，提供2种点突变以及其在制备肿瘤检测、诊断、治疗或预后中的应用。
所述点突变位点由前期多器官静脉淋巴管畸形综合征的基因筛查中得到（Pang,Hu et al, 2019, Hepatology 69(2): 803-816）。通过不同物种的关键位点序列比对，认为该突变位点位于保守序列，一旦发生突变，会产生结构、功能的改变，但尚不知这些突变能否抑制肿瘤生长。
所述点突变位点包括K11E或者E271K。癌基因DDX24各点突变模型仅有一处碱基点突变：K11E中第31nt由腺嘌呤脱氧核糖核苷酸A突变为鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸G，第11位密码子由赖氨酸（简写K）突变为谷氨酸（简写E）；E271K中第811nt由鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸G突变为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸A，第271位密码子由谷氨酸（简写E）突变为赖氨酸（简写K）。
通过NCBI数据库在线引物设计软件设计引物对，扩增所述点突变位点，如SEQ IDNO.1-4所示。本发明选用的引物对特异性强，扩增效果好，扩增的序列可作为肿瘤预测、治疗、评估等分子手段的生物标记物。
进一步地，选择pmCherry-N1载体构建目标质粒WT-DDX24、MT-K11E-DDX24、MT-E271K-DDX24，再选择中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞作为目的质粒的载体，筛选出过表达野生型DDX24以及2种点突变的单克隆细胞株及动物模型。
本发明设计的引物对可构建癌基因DDX24的点突变模型，其单克隆细胞株可在活体细胞层面直接探究DDX24的生物物理学及功能学研究，相应的动物模型可了解癌基因DDX24在疾病发生发展过程中的作用，进而应用于疾病的早期检测、分子成像、药物的靶向输送具有重要意义。
本发明还包括将上述点突变模型应用于设计、制备与肿瘤相关的检测、诊断、治疗或预后试剂中。
附图说明
图1是野生型DDX24构建2种点突变的引物序列。
图2：A、B图是多种肿瘤中DDX24高表达；C图是多种肿瘤中DDX24表达量及相关预后；ACC: Adrenocortical carcinoma; CHOL: Cholangio carcinoma; DLBC: LymphoidNeoplasm Diffuse Large B-cell Lymphoma; ESCA: Esophageal carcinoma; HNSC:Head and Neck squamous cell carcinoma; KICH: Kidney Chromophobe; LIHC: Liverhepatocellular carcinoma; PAAD: Pancreatic adenocarcinoma; PCPG:Pheochromocytoma and Paraganglioma; SKCM: Skin Cutaneous Melanoma; STAD:Stomach adenocarcinoma; THCA: Thyroid carcinoma; THYM: Thymoma；数据来源TCGA数据库。
图3：A图是以pmCherry-N1为载体构建的目的质粒示意图；B图为DDX24点突变示意图；C图为pmCherry-N1-WT-DDX24质粒分别在密码子11与271位点的检测情况；D图分别表示2种突变型质粒在相应位点的检测情况。
图4：A图是DEAD-box RNA Helicase家族的结构域模拟情况；B图是人源与鼠源DDX24在2个突变位点的比对情况；C图是人源DDX24与进化树上最接近的种属的DDX24在2个突变位点的比对情况。
图5：A图是G418抑制CHO细胞生长的浓度曲线；B图是各单克隆细胞株本身的mCherry表达情况；C图为各单克隆细胞株蛋白印迹实验；D、E图为各单克隆细胞株在细胞层面的荧光分布。
图6：A图是CHO过表达WT-DDX24在2个突变位点的检测情况；B图是CHO过表达MT-K11E-DDX24在2个突变位点的检测情况；C图是CHO过表达MT-E271K-DDX24在2个突变位点的检测情况；大写字母表示突变。
图7是转染细胞株的细胞增殖实验。
图8是荷瘤小鼠皮下瘤生长曲线。
图9是各转染细胞成瘤情况示意图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详细予以说明。需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例中所使用的试剂主要包括分子生物学实验试剂和试剂盒等，均可通过商业途径获得。本发明实施例中所提供的方法，如果没有特殊说明均为常规方法。
实施例一
一、一种扩增DDX24的野生与点突变基因，并筛选单克隆细胞株、构建点突变模型的方法，所述DDX24突变位点包括K11E或者E271K，包括以下步骤：
查找基因文库，获取人源DDX24野生型核苷酸与氨基酸序列；在NCBI数据库在线引物设计中设计并筛选引物对，扩增人源野生型与点突变型DDX24目的基因。引物对如图1所示。
继而分别构建含目的基因的质粒。为了实现细胞层面的动态观察研究，选取Clontech公司的目的载体pmCherry-N1， mCherry在目的基因DDX24的羧基末端后，是一种红色荧光蛋白，其最大吸收/发射峰分别位于587 nm和610nm。因而转染后可通过荧光显微镜下红色荧光情况直观判断目的基因DDX24的表达。出于研究DDX24的酶活性的考虑，在DDX24羧基末端与mCherry氨基末端之间加一个TEV位点以及6xHis标签。 组氨酸可以特异性的结合镍离子，因而带有His标签的重组蛋白可以被镍柱吸附，达到纯化蛋白的目的。TEV位点可被TEV蛋白水解酶，便于后期去除His标签。
质粒大小为7337bp，基本结构为：DDX24-TEV-6xHis-mCherry；插入位点：BglⅡ、HindⅢ；原核抗性为卡那霉素Kanamycin、真核抗性为新霉素Neomycin；正向测序引物为CMV-f，反向测序引物为mCherry-r。
经测序：野生型WT质粒所有位点无突变，K11E质粒仅目标基因31nt点突变（A变G），E271K质粒仅目的基因811nt点突变（G变A）。
扩增目的质粒：制备DH5-α感受态大肠杆菌，分别转化4种目的质粒pmCherry-N1-WT-DDX24、pmCherry-N1、pmCherry-N1-MT-K11E-DDX24、pmCherry-N1-MT-E271K-DDX24后涂布，挑取单克隆分别小摇、大摇后收菌大量抽提质粒。所提质粒经测序后序列正确，测序结果见图3。
在核苷酸与氨基酸层面比对人源与鼠源DDX24的相似性：Mouse、Rat、CHOK1GS与人源性DDX24核苷酸层面均达到75%以上的相似性，在氨基酸层面均有80%以上的相似性。故以中国仓鼠卵巢细胞CHO细胞为细胞载体转染目标质粒。
筛选遗传霉素G418杀伤CHO细胞的最低浓度：96孔板中铺板CHO细胞，102/well，贴壁24h后，分别加用0μg/ml、375μg/ml、500μg/ml、750μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml、3000μg/ml、4000μg/ml的G418，每三天换液（含G418），作用10天后，1500μg/ml及其以上浓度孔的细胞基本全部死亡，确认G418杀伤CHO的最小浓度为1500μg/ml。
脂质体法瞬时转染质粒，再以遗传霉素G418筛选稳定转染的单克隆细胞株：12孔板中铺板CHO细胞（105/well），贴壁24小时后，汇合度80%，进行五种质粒的转染加样。5种质粒各准备2个200μl灭菌EP管，分别标记为A、B；首先在A、B管中均加入50μl Opti-MEM减血清培养基，在A管中加入3μl Lipofectamine轻轻混匀，在B管中先加入1μg质粒再加入2μlP3000，再将B管中液体转移至A管，室温孵育15min，最后12孔板中每孔加入100μl混合物。
转染48小时后，消化计数，分别接种100个细胞于15cm*20mm的培养皿中，并加入含有1500μg/ml G418的DMEM/F12培养基；每三天换液（含G418），两周后可见“单克隆”形成。挑取上述“单克隆”于48孔板中扩大培养，为保证挑取的克隆为单克隆，待一定汇合度时重新消化计数，在96孔板中铺板，每孔平均1个细胞。3天后可见部分孔中仅有一个单克隆长出，继续培养1周后扩大至12孔板。最终，筛选出过表达CHO-Vector、CHO-WT-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24、CHO-MT-E271K-DDX24的单克隆细胞株。荧光显微镜下可见各细胞中有红色荧光，且收集细胞沉淀并用PBS缓冲液清洗后上流式细胞仪检测，检测到转染的五株细胞有mCherry荧光。
二、野生型DDX24与点突变DDX24的单克隆细胞株的鉴定
将CHO-WT-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24、CHO-MT-E271K-DDX24各单克隆株送往北京阅微基因技术有限公司、广州艾基生物技术有限公司行扩增测序：均测得DDX24的完整片段，CHO-WT-DDX24细胞所有位点无突变，CHO-MT-K11E-DDX24细胞仅31nt点突变（A变G），CHO-MT-E271K-DDX24细胞仅811nt点突变（G变A）。
行蛋白质免疫印迹Western Blot实验：分别收集CHO、CHO-Vector、CHO-WT-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24、CHO-MT-E271K-DDX24细胞沉淀，冰冷PBS缓冲液润洗后离心，向沉淀加入裂解液（含1%蛋白酶抑制剂），吹匀后裂解30min，再14000g离心15min，取上清，行BCA检测蛋白浓度，再加入相应5X的loading混匀，沸水煮10min后，按蛋白浓度配平上样，依次电泳、转膜、封闭、孵育一抗二抗及化学发光显影。结果显示：在140kDa处，CHO-WT-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24以及CHO-MT-E271K-DDX24细胞有DDX24条带，而CHO细胞以及CHO-Vector细胞未见DDX24有条带。
爬片分析：在24孔板中滴入一滴培养基后，放入爬片；再分别消化计数并铺板CHO细胞、CHO-Vector细胞、CHO-WT-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24以及CHO-MT-E271K-DDX24细胞，104/well，500 ml/well；待48h贴壁后，加热PBS缓冲液、4%多聚甲醛至37℃，先用PBS润洗3遍，3min/次，再加入4%多聚甲醛固定20min，再用PBS润洗3遍，3min/次，最后用即用型DAPI试剂直接封片固定，使用高分辨数字病理扫描机进行扫片。
实施例二
一、DDX24的野生与突变型单克隆细胞的增殖实验：
在96孔板中接种的细胞悬液（100μL/孔），细胞数为800。将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2的条件下）。向培养板每孔加入10μL的CCK-8溶液，放置培养箱内孵育2小时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
结果显示，CHO-WT-DDX24细胞增殖较快，其次为CHO-Vector细胞，而DDX24点突变后的细胞则表现增殖较慢。
二、裸鼠荷瘤实验
本实施例所用动物品系为Balb/cnu裸鼠，将5-6周龄的雌性裸鼠随机分为四组，包括CHO-Vector对照组，CHO-WT-DDX24、CHO-MT-E271K-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24实验组，每组10只。
野生型与点突变的单克隆细胞株分别皮下接种：CHO-Vector、CHO-WT-DDX24、CHO-MT-K11E-DDX24、CHO-MT-E271K-DDX24细胞常规胰酶消化，调整细胞数为 5×107/mL，于右后腿皮下注射细胞悬液 0. 1 mL。隔天观察裸鼠状态，用游标卡尺测量肿瘤结节的大小，按公式计算肿瘤近似体积V = 长径×短径2/2。
皮下瘤形成：细胞皮下接种后裸鼠状态稳定，不影响动物存活率。与对照组相比，CHO-WT-DDX24组成瘤较快，接种第6天起肉眼可见皮下小结节，生长迅速。而CHO-MT-E271K-DDX24组与对照组CHO-Vector生长情况相仿。CHO-MT-K11E-DDX24组10只裸鼠，其中2只于第22天出现肿瘤生长，其余8只观察60天无肿瘤生长。

Claims (8)

1.促进或者抑制肿瘤生长的DDX24解旋酶，其特征在于：野生型表现为促进肿瘤生长而所述点突变位点可以抑制肿瘤生长。
2.根据权利要求1所述的抑制肿瘤生长速度的DDX24点突变，所述特征在于： DDX24解旋酶点突变为K11E或者E271K。
3.根据权利要求1-2所述的应用，其肿瘤为头颈部鳞状细胞癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、甲状腺癌、皮肤黑色素瘤、淋巴瘤、腺皮瘤、胸腺瘤、肺癌、结直肠癌、胆囊癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、鼻咽癌、骨癌、恶性肌肉瘤等实体肿瘤，但不限于这里所列肿瘤。
4.野生型DDX24及其点突变的试剂在制备肿瘤检测、诊断、治疗或预后产品中的应用，其特征在于： DDX24解旋酶点突变为K11E、E271K。
5.根据权利要求1-4所述的应用，其特征在于：所述产品为生物制剂，包括用于扩增野生型DDX24以及点突变位点的引物对，或是用于扩增野生型DDX24及其点突变位点的引物对和限制性核酸内切酶。
6.根据权利要求1-5所述的应用，其特征在于：扩增野生型DDX24点突变位点的引物对的核酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。
7.根据权利要求1-6所述的应用，其特征在于：所述产品为试剂盒，其包括定点突变试剂、基因扩增试剂、基因测序试剂、蛋白分析试剂。
8.根据权利要求1-7所述的应用，其特征在于：所示试剂盒还包括dNTPs、Taq酶、Mg2+和PCR反应缓冲液。
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