CN109942685A

CN109942685A - 应用细菌展示文库筛选特异结合ddx24解旋酶的多肽

Info

Publication number: CN109942685A
Application number: CN201910187312.0A
Authority: CN
Inventors: 单鸿; 金红军; 李志军; 杨帅; 陈守登; 陈秋樾
Original assignee: Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Current assignee: Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat Sen University
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2019-06-28

Abstract

本发明公开了一系列应用细菌展示文库筛选鉴定特异结合DDX24解旋酶的多肽，具体涉及八条多肽，分别具有下列氨基酸序列：1：STFVKSCYQCVMYAL；2：EWWEGLW；3：TMDDIWDSLSMGRSA；4：SWYEWAHDFWGTGMG；5：LWSAWEAGVLPPGDW；6：DAGWWMSGCGTAGCR；7：MWMENAWDTMGGRQT；8：IWDDWESGRMSRVSA。这些多肽是利用细菌展示文库通过特定步骤筛选出多肽，具有与血管畸形致病基因DDX24解旋酶特异性结合的能力。因此本发明及其衍生物可以作为血管畸形疾病或者其他与DDX24相关疾病的前体或先导物。

Description

应用细菌展示文库筛选特异结合DDX24解旋酶的多肽

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及应用细菌展示文库筛选鉴定特异结合DDX24解旋酶的一系列多肽。

背景技术

目前血管畸形发病率高，绝大部分的发病机制尚不明确，诊断和治疗均存在极大的困难；尤其是内脏血管畸形，由于发病部位隐匿，主要依赖MRI、CT等影像检查才能发现，大多数病人就诊时已发生严重并发症。血管畸形致病基因DDX24（DEAD‐box helicase 24）[Pengfei Pang et al. DDX24 Mutations Associated With Malformations of MajorVessels to the Viscera. Hepatology 2019; 69: 803-816]的发现为临床研究提供了新方向，有望成为血管畸形新的诊断依据和治疗靶点。

现有细菌展示文库，通常是对纯化了的蛋白进行筛选，得到与该蛋白特异结合的寡肽或抗体，在此基础上我们运用了细菌展示技术对细胞表面抗原进行筛选，通过这种方法可以得到对细胞表面特异结合的多肽分子。我们的方案克服了以往细胞筛选中的一些问题，主要是细胞表面成分复杂而且未知，细胞筛选的非特异性较大，背景值高。相比于噬菌体文库筛选，其可避免许多缺点。比如，外源蛋白的插入可能影响噬菌体的装配，使其失去感染力；多肽或蛋白质与噬菌体外壳蛋白融合表达时存在不可预测的偏差性等。

发明内容

本发明的目在于：提供一系列利用细菌展示文库通过特定步骤筛选鉴定出特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，该系列多肽能特异性识别DDX24解旋酶。

特异性识别DDX24解旋酶的多肽，所述多肽包括如下所示的特征序列部分：

多肽1：Ser-Thr-Phe-Val-Lys-Ser-Cys-Tyr-Gln-Cys-Val-Met-Tyr-Ala-Leu ;

多肽2：Glu-Trp-Trp-Glu-Gly-Leu-Trp ;

多肽3：Thr-Met-Asp-Asp-Ile-Trp-Asp-Ser-Leu-Ser-Met-Gly-Arg-Ser-Ala;

多肽 4：Ser-Trp-Tyr-Glu-Trp-Ala-His-Asp-Phe-Trp-Gly-Thr-Gly-Met-Gly;

多肽 5：Leu-Trp-Ser-Ala-Trp-Glu-Ala-Gly-Val-Leu-Pro-Pro-Gly-Asp-Trp;

多肽 6：Asp-Ala-Gly-Trp-Trp-Met-Ser-Gly-Cys-Gly-Thr-Ala-Gly-Cys-Arg;

多肽 7：Met-Trp-Met-Glu-Asn-Ala-Trp-Asp-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Gln-Thr;

多肽 8：Ile-Trp-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Arg-Val-Ser-Ala。

进一步的，利用细菌展示文库通过特定步骤筛选出多肽；特定步骤如下：（1）经过1-2轮的磁珠筛选技术（Magnetic cell sorting，MACS），运用包被了Dynabeads® MyOne™Streptavidin C1（以下简称SA-beads）的磁珠结合biotin-DDX24解旋酶，孵育细菌多肽库（X15 多肽库），获得富集了结合多肽的细菌库；（2）经过7-8轮的荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activated cell sorting，FACS）分选，减少蛋白的剂量，同时加入血清等物质以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选；（3）单克隆确定，选出20个克隆做细菌表面多肽的亲和力、特异性初筛，送克隆测序。

所述多肽可以结合、封闭、拮抗DDX24解旋酶。

本发明的有益效果在于：本发明的系列多肽可作为血管畸形疾病或者其它与DDX24解旋酶相关的疾病的诊断标志物，并应用于开发抑制血管畸形疾病或者其它与DDX24相关疾病靶向治疗药物的前体或先导物。

本发明还包括将上述系列多肽应用于荧光、化学发光、核素等标记，用于设计、制备预防和/或治疗内脏血管畸形或者其它与DDX24相关疾病药物中的应用。

附图说明

图1：将细菌文库与生物素标记的特异结合DDX24解旋酶的多肽共孵育，获得富集了该结合多肽的细菌库。接着进行MACS和多轮的FACS分选，以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选。

图2：对F2、F3、F4、F5的细菌表面多肽结合率检测图（DDX24蛋白浓度为5nmol/L，SAPE染色。

图3：与DDX24解旋酶特异结合的多肽列表。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式详细予以说明，这并不限制本发明的范围。

本发明实施例为：提供一系列利用细菌展示文库通过特定步骤筛选鉴定出特异结合DDX24解旋酶的多肽及其应用，该系列多肽的序列包括：

多肽1：Ser-Thr-Phe-Val-Lys-Ser-Cys-Tyr-Gln-Cys-Val-Met-Tyr-Ala-Leu ;

多肽2：Glu-Trp-Trp-Glu-Gly-Leu-Trp ;

多肽3：Thr-Met-Asp-Asp-Ile-Trp-Asp-Ser-Leu-Ser-Met-Gly-Arg-Ser-Ala;

多肽 4：Ser-Trp-Tyr-Glu-Trp-Ala-His-Asp-Phe-Trp-Gly-Thr-Gly-Met-Gly;

多肽 5：Leu-Trp-Ser-Ala-Trp-Glu-Ala-Gly-Val-Leu-Pro-Pro-Gly-Asp-Trp;

多肽 6：Asp-Ala-Gly-Trp-Trp-Met-Ser-Gly-Cys-Gly-Thr-Ala-Gly-Cys-Arg;

多肽 7：Met-Trp-Met-Glu-Asn-Ala-Trp-Asp-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Gln-Thr;

多肽 8：Ile-Trp-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Arg-Val-Ser-Ala。

其中用细菌展示文库筛选出多肽的特定步骤如下：（1）经过1-2轮的磁珠筛选技术（Magnetic cell sorting，MACS），运用包被了Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1（以下简称SA-beads）的磁珠结合biotin-DDX24解旋酶，孵育细菌多肽库（X15 多肽库），获得富集了结合多肽的细菌库；（2）经过7-8轮的荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activatedcell sorting，FACS）分选，减少蛋白的剂量，同时加入血清等物质以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选；（3）单克隆确定，选出20个克隆做细菌表面多肽的亲和力、特异性初筛，送克隆测序。

具体实施方式1：DDX24解旋酶的纯化：为了体外获得重组的DDX24蛋白，装有DDX24基因（28-859aa，基于57062 Pubmed 序列文库号）经Bamh I和Hind III酶切位点连接到pSUMO载体，在DH5α菌获得重组质粒，经测序验证无误，转入表达菌： BL21 （DE3）进行蛋白纯化。将质粒转化至BL21(DE3)，37度200转摇至吸光度0.6-0.8，加入终浓度0.1mMIPTG（索莱宝，SBJ-F2160），16度诱导表达，4度/5000g/15分钟收菌，每升培养基用30毫升A液重悬。高压低温破碎仪（JNBIO，JN-mini）破菌，14000g/35分钟/4度收菌，取上清液用镍柱（南京森贝伽生物科技有限公司，SBJ-FL2160）纯化，B液洗脱。洗脱蛋白加ulp1酶切16小时/4度，C液透析（索莱宝，ya1043）过夜。透析蛋白反挂镍柱（公司名称南京森贝伽生物科技有限公司，货号SBJ-FL2160），收集流穿，流穿液超滤浓缩（公司名称Millipore，货号UFC903096）后过HiLoad 16/600 superdex 200 prep grade柱子（公司名称GE，货号28-9920-17AC），D液洗脱，收集目的蛋白，浓缩后冻干（冻干设备厂家：广州智祥生物科技有限公司，型号：TF-LFD-1）。其中溶液A: 50 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl, 20 mMImidazole；B: 50 mM Tris-HCl pH8.0, 500mM NaCl, 300 mM Imidazole；C: 50 mMTris-HCl pH8.0, 150mM NaCl；D: PBS。最后，通常情况下抽提蛋白的产率为10升表达菌液可以获得90%纯度DDX24蛋白0.1mg。

磁珠筛选技术（Magnetic cell sorting，MACS）

1. 本实验中使用的细菌（细菌采用大肠杆菌菌株DH5α；质粒构建体利用pSUMO）展示多肽库的库容大约为5×10⁸，检测菌液在600nm下的光吸收值（OD 600），可以推测细菌浓度。可以认为1 OD的菌含有1×10⁹个克隆，接种10倍库容的菌于150 mL，含有34 μg/mL的氯霉素（chloramphenicol，CM）和终浓度为0.2 %（m/v）葡萄糖的LB（Luria-Bertani）培养基中，37 ℃，200 rpm过夜振荡培养。次日，测定OD 600，按照5.0 OD/管冻存，冻存液中加入不低于15 %（v/v）的甘油，-80℃保存。

2. 次日取出培养物，从过夜培养物中取出10倍完整库容的菌液（5 OD），接入150mL 含有34 μg/mL的氯霉素的LB培养基中。

3.接种物在37 ℃下，200 rpm恒温摇床下震荡培养2-2.5 h，测定菌液的OD 600，当OD值达到0.6时，将三角瓶置于4 ℃冰箱中静置10 min，以使培养基降温到25℃左右。随后加入1.5 ml浓度为2 %（m/v）的阿拉伯糖（公司名称macklin，货号D800971-25g）溶液作为诱导剂。

4.室温下，200 rpm震荡诱导培养1.2 h。诱导结束后，检测培养液的OD 600。取出含有约5 OD菌液，加入10 ml PBS溶液，3000 g，4℃条件下离心10 min。离心结束后，去除上清液，再次用PBS重悬后离心。洗涤完成后，0.9 ml PBS重悬细菌，放置于冰上备用。

5.振荡器充分振荡Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1（以下简称SA-beads，北京思尔成生物技术有限公司，货号650-01/650-02），使磁珠混匀，根据细菌和磁珠的数目20：1的比例，取原液20 μl（10 mg/mL，约10×10⁹ beads/mL），加入PBS 1 ml，充分振荡使其均匀分散，然后磁性分离1min，用枪头移除上清。重复洗涤操作1次，最后用100 μl PBS重悬SA-Beads。

6.把PBS重悬的菌液与SA-beads悬液混合。将混合物于4 ℃下在静音混合器中旋转孵育45 min，去除能够和SA-beads结合的细菌，防止后续筛选过程中非特异的吸附。

7.磁性分离SA-beads，收集上清，上清用3000 g，4℃下离心5 min收集细菌，0.9ml PBS重悬沉淀，并加入终浓度为100 nM生物素化的DDX24解旋酶。混合物在4 ℃下旋转孵育45 min。

8.孵育结束后，孵育物离心5 min收集沉淀。1 ml PBS重悬，加入按照上述方法洗涤的SA-beads，根据细菌和磁珠的数目20：1的比例加入磁珠。混合物在4℃下旋转孵育45min。

9.磁性分离磁珠，加入1mL PBS重悬，并反复颠倒EP管，使磁珠充分混匀后旋转孵育2 min，重复该洗涤步骤三次。收集洗涤过程中分离的上清液，分别命名为W1，W2，W3。洗涤三次后的磁珠用LB培养基重悬，命名为MACS（Magnetic cell sorting，磁珠筛选技术）。

10. W1，W2，W3和MACS分别取10 μl加入到990 μl LB培养基中，充分混匀后取100μl涂布在LB平板中，置于37℃中恒温培养箱中培养过夜，次日计算每个平板上单克隆的数目，根据涂布的体积和菌液的稀释倍数，换算出经过磁珠分选后细菌多肽库的库容。余下的W1，W2，W3和MACS加入到LB液体培养基中，加入终浓度为0.2 %的葡萄糖，37℃，200 rpm培养过夜。

具体实施方式2：荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activated cell sorting，FACS）

1. 从MACS分选的过夜培养物中取100 μl，接入5 ml含有34 μg/ml CM抗性的 LB培养基中，37℃，200 rpm震荡培养2-2.5 h。

2.待培养物OD 600在0.5-0.6之间时，将试管置于4℃冰箱中10 min。然后加入终浓度为0.02 %（m/v）的阿拉伯糖进行诱导，在室温下，200 rpm震荡培养1.2 h。

3.诱导结束后，测量每个试管的OD 600，实验设置对照组和实验组，每个组分别加入恰好0.05 OD的培养物，加入1 mL 预冷的PBS，3000 g，离心5 min。PBS重复洗涤一次。最后将细菌浓缩在大约100 μl的体系中。第一次进行流式分选时加入终浓度为40 nM生物素标记的DDX24解旋酶。4℃，旋转孵育45 min。孵育结束后加入1 ml的PBS溶液，3000 g，离心5min，并重复该洗涤步骤一次。最后加入终浓度为4 nM的SAPE溶液。4℃，旋转孵育30 min，PBS洗涤两次后，用0.5 ml PBS重悬菌液，置于冰上保存，等待流式上样分析。

4.流式细胞分选得到的细菌，加入到4 ml（索莱宝，货号C8050-10g）含有CM抗性的LB培养基中，加入终浓度为0.2 %的葡萄糖，37℃，200 rpm震荡培养过夜。次日取出细菌培养物，测定其OD 600并根据分选后细菌库容量接入至少是10倍于前一代菌库容量的菌液，作为下一轮分选的细菌库。从剩余的菌液中取出900 μl菌液加入400 μl 50 %的甘油，均匀混合后，冻存于-80℃作为备份。

5.每一轮分选均需要同时比较分选的前一代和后一代的荧光强度和结合率。随着分选代数的增加，细菌与蛋白的结合效率越来越高，当结合率到达40%以上时，前后两代之间荧光强度增加不明显，这时需要降低DDX24蛋白浓度，蛋白浓度按照梯度减半的方法进行。当细菌库在增加筛选压力并经历多轮筛选，菌库与蛋白结合率不再增加后，把最后一代筛选富集的细菌库涂布于含34 μg/ml CM的LB培养平板上，在37℃下过夜培养。次日观察平板，并随机挑取菌落单克隆，接入5ml含CM的LB培养基中，37℃，200 rpm振荡培养约10h后，取约500μl菌液送交苏州金唯智生物科技有限公司进行DNA测序工作。测序质粒为pBAD33质粒，抗性为氯霉素（CM），使用的测序引物为通用引物pBAD-Forward，要求测序片段长度为800 bp。根据DNA序列，得到多肽序列，剩余单克隆菌液按照细菌冻存步骤冻存。

Claims

1.一种特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽的序列中包括特征序列部分。

2.根据权利要求1所述的特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，所述特征序列部分包括:

多肽1：Ser-Thr-Phe-Val-Lys-Ser-Cys-Tyr-Gln-Cys-Val-Met-Tyr-Ala-Leu;

多肽2：Glu-Trp-Trp-Glu-Gly-Leu-Trp ;

多肽3：Thr-Met-Asp-Asp-Ile-Trp-Asp-Ser-Leu-Ser-Met-Gly-Arg-Ser-Ala;

多肽 4：Ser-Trp-Tyr-Glu-Trp-Ala-His-Asp-Phe-Trp-Gly-Thr-Gly-Met-Gly;

多肽 5：Leu-Trp-Ser-Ala-Trp-Glu-Ala-Gly-Val-Leu-Pro-Pro-Gly-Asp-Trp;

多肽 6：Asp-Ala-Gly-Trp-Trp-Met-Ser-Gly-Cys-Gly-Thr-Ala-Gly-Cys-Arg;

多肽 7：Met-Trp-Met-Glu-Asn-Ala-Trp-Asp-Thr-Met-Gly-Gly-Arg-Gln-Thr;

多肽 8：Ile-Trp-Asp-Asp-Trp-Glu-Ser-Gly-Arg-Met-Ser-Arg-Val-Ser-Ala。

3.根据权利要求1所述的特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于利用细菌展示文库通过特定步骤筛选出多肽；特定步骤如下：（1）经过1-2轮的磁珠筛选技术（Magnetic cell sorting，MACS），运用包被了Dynabeads® MyOne™ Streptavidin C1（以下简称SA-beads）的磁珠结合biotin-DDX24解旋酶，孵育细菌多肽库（X15 多肽库），获得富集了结合多肽的细菌库；（2）经过7-8轮的荧光激活细胞分选术（Fluorescence-activatedcell sorting，FACS）分选，减少蛋白的剂量，同时加入血清等物质以增加结合多肽的亲和力筛选，直到阳性比例不再增加后停止分选；（3）单克隆确定，选出20个克隆做细菌表面多肽的亲和力、特异性初筛，送克隆测序。

4.根据权利要求1所述的特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽可以结合、封闭、拮抗DDX24解旋酶。

5.根据权利要求1所述的特异性识别并结合DDX24解旋酶的多肽，其特征在于：所述多肽可作为血管畸形疾病或者其它与DDX24相关的疾病的诊断标志物。

6.根据权利要求2和6中任一项所述的多肽在制备预防和/或治疗内脏血管畸形疾病或者其它与DDX24相关的疾病药物的前体或先导物。