CN102757482B - 一种多肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽及其应用。该多肽具有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。该多肽可以靶向肿瘤血管内皮生长因子受体2，因此，该多肽可以有效地抑制肿瘤血管的生长，并且可以应用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中。

Description

一种多肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其应用，具体地讲，本发明涉及一种靶向肿瘤血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）的多肽以及该多肽的应用。

背景技术

据世界卫生组织统计，每年有大约500万人死于癌症。癌症已成为摧毁人类健康、剥夺人类生命的最危险的疾病之一，因此癌症的预防、诊断及治疗任务十分艰巨。

传统的肿瘤治疗方法存在各种弊端，例如，手术治疗只适用于体积较大、影像技术可检测的良性实体瘤，对于体积较小的肿瘤或者转移性肿瘤无能为力；放射疗法对局部组织的损伤较大；化学疗法需要全身给药，针对性差，给患者造成巨大的毒副作用。

鉴于以上肿瘤治疗方法中的缺陷，研究人员一直努力开发可用于肿瘤早期定位诊断及有效治疗的药物或办法。肿瘤靶向分子的出现为解决这一难题提供了思路，肿瘤靶向治疗技术具有特异性强、效果显著、基本不损伤正常组织的特点。

单克隆抗体是目前已知的、最早应用于肿瘤靶向治疗的肿瘤靶向分子，目前已有8种抗体被FDA批准应用于肿瘤的临床治疗。但是，目前抗体治疗实体瘤仍存在以下问题：因实体肿瘤的细胞被致密的基质包裹，导致抗体难以穿透实体肿瘤的细胞；实体肿瘤内压力较高，阻碍了抗体进入肿瘤内部，致使抗体治疗大体积实体肿瘤的疗效不理想；由于治疗肿瘤的抗体需要量大，要求产品纯度高，所以抗体的生产成本高、价格昂贵，据Genentech报告，使用贝伐单抗治疗10个月将花费大约4.4万美元。虽然目前抗体肿瘤治疗取得一定成效，但科学家们仍然在努力寻找其他的生物分子对肿瘤进行靶向治疗。

多肽被认为具有至少相同于抗体的靶向引导治疗的作用，而且多肽具有分子量小、抗原性低、作用迅速、较易体外及生物合成等优点，并且可以具有普通蛋白质的功能，因此多肽可以直接用作抗肿瘤药物，也可以与其他方法合用而作为靶向引导分子使用。

肿瘤血管内皮生长因子（VEGF）的受体（VEGFR）是肿瘤部位所特有的，可作为血管靶向治疗的理想靶点。其中，在所有的VEGFR中，仅肿瘤血管内皮生长因子-2（VEGFR-2，又称FLK-1或KDR）既在细胞的生长和分化中起重要作用又与内皮细胞的增殖和血管的生成有关，请参见Shibuya M.Vascular endothelial growth factor receptor-2:its unique signaling and specificligand,VEGF-E.Cancer Sci2003;94(9):751-756，以及Pradeep CR,Sunila ES,Kuttan G.Expression of Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)and VEGFReceptors in Tumor Angiogenesis and Malignancies.Integrative Cancer Therapies2005;4(4):315。在肿瘤组织中，VEGFR-2主要表达于肿瘤血管内皮细胞，而在肿瘤上皮细胞中不表达或低表达。这说明VEGFR-2在促进血管发生及再生中起着非常重要的作用，所以开发针对VEGFR-2的抑制剂将有效抑制肿瘤的生长。目前，已经开发出针对VEGFR-2的单克隆抗体，请参见Prewett M,Huber J,Li Y，Santiago A,O'Connor W，King K,Overholser J,Hooper A,Pytowski B,Witte L.Antivascular Endothelial Growth Factor Receptor(FetalLiver Kinase1)Monoclonal Antibody Inhibits Tumor Angiogenesis and Growthof Several Mouse and Human Tumors.Cancer Research,Volume59:AACR;1999.p5209-5218。但该单克隆抗体的毒副作用及长期效应仍需进一步鉴定。

鉴于多肽在靶向药物治疗上与抗体相比具有一定的优势，因此，开发靶向VEGFR-2的多肽十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种靶向VEGFR-2的多肽及该多肽在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中的应用。

本发明的一方面提供了一种多肽，该多肽具有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了一种上述多肽在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中的应用。

根据本发明的多肽可以与VEGFR-2特异性地结合，从而可以有效地抑制肿瘤血管的生长。此外，由于根据本发明的多肽可以与VEGFR-2特异性地结合，所以根据本发明的多肽可以应用于用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中。

附图说明

通过结合附图进行的示例性实施例的以下描述，本发明的这些和/或其他方面和优点将变得清楚和更易于理解，其中：

图1示出了在筛选的第6轮和第7轮加入免疫球蛋白（IgG）后得到的流式细胞分选结果图；

图2示出了根据实施例得到的部分单克隆细菌所展示的多肽与VEGFR-2的结合情况；

图3示出了根据实施例得到的不同的单克隆细菌的表面上的多肽与VEGFR-2的解离常数的测定结果。

具体实施方式

根据本发明的具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽是通过细菌表面展示随机肽库和流式细胞分选技术筛选得到，得到的多肽可以与肿瘤血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）特异性地结合。因此，根据本发明的多肽可以有效地抑制肿瘤血管的生长，并可以应用于用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中，例如，根据本发明的多肽可以应用在肿瘤药物靶向运输体系中。

下面将参照示例性实施例来详细地描述通过细菌表面展示随机肽库和流式细胞分选技术筛选根据本发明的多肽的过程。下面的示例性实施例中未注明条件的实验方法可以按本领域内的常规实验方法进行，例如，可以参照Sambrook等人的《Molecular cloning:a laboratory manual》（New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989）。

本发明所使用的细菌表面展示随机肽库是从美国加州大学圣巴巴拉分校化学工程系的Patrick S.Daugherty实验室获得。该细菌表面展示随机肽库的构建过程如下。首先，对外膜蛋白（OmpX，outer membrane protein X）进行改造，在OmpX的C端和N端分别连接上GGSG连接分子，并在OmpX第2个环（loop）的s53和s54残基之间打开，形成游离于胞外的COOH端和NH2端，成为CPX（circularly permuted outer membrane protein OmpX）骨架（请参见Rice et al.(2006)protein Sci.15,825-836）。然后，将随机合成的多肽文库X₂CX₇CX₂连接到CPX骨架的N端，其中，X表示任意一个氨基酸，C表示半胱氨酸，将改造后的CPX片段插入pBAD33质粒（Guzman,L.et al.Tight Regulation,Modulation,and High-Level Expression by Vectors Containingthe Arabinose PBAD Promoter.(1995)J.Bacteriol.177,4121–4130）下游的alaj GFP1（Bessette,P.H.et al.Rapid isolation of high-affinity protein bindingpeptides using bacterial display.(2004)Protein Eng.Des.Sel.17,731-739）多克隆位点上。改造后的pBAD33质粒在araBAD（阿拉伯糖启动子）的控制下可以同时表达CPX表面展示多肽及alajGFP1绿色荧光蛋白。最后将改造过的pBAD33质粒转化入大肠杆菌MC1061[F-araD139D(ara-leu)7696galE15galK16D(lac)X74rpsL(StrR)hsdR2(rK-mKt)mcrA mcrB1]（Casadaban,M.Jand Cohen,S.N.Analysis of gene control signals by DNA fusion and cloning inEscherichia coli.(1980)J.Biol.Chem.,138,179-207），从而完成细菌随机展示肽库的构建。构建好的细菌表面展示随机肽库在阿拉伯糖（arabinose）诱导下同时表达CPX表面展示随机多肽及绿色荧光蛋白（Dane,K.Y.et al.Isolation ofcell specific peptide ligands using fluorescent bacterial display libraries(2006)J.Immunol Methods.309,120-129）。

1、利用磁珠分选技术降低细菌表面展示随机肽库的细菌容量

上述的从美国加州大学圣巴巴拉分校化学工程系的Patrick S.Daugherty实验室获得的细菌表面展示随机肽库可以表达大约1×10⁹种不同的多肽，按照流式细胞仪的分选效率，从上述肽库中筛选出展示目的多肽的细菌需要至少2个小时，在这段时间内细菌形态已经发生变化，所以需要在进行流式分选前对该细菌表面展示随机肽库进行预分选，以将该细菌表面展示随机肽库的容量降低至包含大约1×10⁶-1×10⁷种多肽。

（1）细菌表面展示随机肽库的复苏和诱导

从冻存的细菌表面展示随机肽库中取100μL接种到100mL SOC培养基中，在37℃、200转/分的条件下过夜培养，其中，SOC培养基加入有34μg/mL氯霉素和2mg/mL的葡萄糖。从过夜培养的细菌中取出100μL并加入5mL LB培养基中，在37℃、200转/分的条件下培养2小时至OD₆₀₀值在0.5-0.6之间，其中，LB培养基中加入有34μg/mL的氯霉素。以200μg/mL的量加入阿拉伯糖，在室温（约25℃）、200转/分的条件下诱导培养约1h，其OD₆₀₀值达到0.8-1.0，按照一个OD等于1×10⁹个细胞计算细菌总数。

（2）磁珠阴性分选

从上述经诱导的菌液中取出包含大约1×10¹⁰个细菌的量的菌液，离心后用PH值为4.7的PBS缓冲液重悬。按照细菌:磁珠等于大约100:1（个数比）的比例，将链霉亲和素包被的磁珠（Streptavidin-coated magnetic microbeads）与经PBS缓冲液重悬的细菌共同放入1.5mL离心管中，在静音旋转混合器中以4℃孵育45分钟后，取出离心管插入磁架中，其中，链霉亲和素包被的磁珠和磁架均从Invitrogen公司购得，链霉亲和素包被的磁珠的商品名为

MyOne^TM，商品号为656-01。经磁珠分选，那些表达能与链霉亲和素（Streptavidin）结合的多肽的细菌吸附到磁珠上，并且磁珠在磁力的作用下吸附在管壁中靠近磁架的地方。用枪头吸出上清进入下一轮的阳性分选。

（3）磁珠阳性分选

使用从Invitrogen公司购得的商品号为F6347的蛋白荧光生物素标记试剂盒（Fluoreporter mini-biotin-xx protein labeling Kit）对VEGFR-2蛋白进行生物素化（biotinylated），其中，VEGFR-2蛋白（编码核苷酸265bp-2493bp）是从PROSPEC公司购得，商品号为PKA-242。

按照蛋白:细菌等于大约500:1（个数比）的比例将生物素化的VEGFR-2蛋白与经阴性选择的细菌混合，使混合液中VEGFR-2蛋白的浓度为10nM，在静音旋转混合器上4℃共同孵育45分钟。孵育结束后在3800转/分、4℃的条件下离心，移除上清液，并将沉淀重新悬浮在1mL PBS缓冲溶液中。沉淀中部分细菌的表面具有特异性结合有生物素化的VEGFR-2蛋白的多肽。

接下来，利用链霉亲和素与生物素特异结合的原理，用包被有链霉亲和素的磁珠将这部分细菌吸附下来。按照磁珠:细菌为大约1:100（个数比）的比例将磁珠与重新悬浮在PBS缓冲液中的细菌混合，4℃共同孵育45分钟后放入磁架中，与磁珠结合的细菌在磁力作用下可以吸附到靠近磁架的管壁，弃除上清。用PBS缓冲液清洗沉淀3次后用1mL LB重悬，取出10μL稀释100倍，在测量其OD₆₀₀值之后，涂布在固体LB平板上，37℃过夜培养，第二天根据长成的细菌克隆数量计算磁珠分选后的细菌库容量。剩下的细菌重新悬浮在5mL的SOC培养基中，在37℃、200转/分的条件下过夜培养，以用于流式分选。

2、利用流式细胞仪分选表达靶向VEGFR-2的多肽

（1）准备细菌表面展示库

取100μL过夜培养的细菌接种到5mL的LB培养基中，在37℃、200转/分的条件下培养约2h至OD₆₀₀值在0.4-0.6之间，以200μg/mL的量加入阿拉伯糖，室温下诱导细菌表达，约1h后细菌的OD₆₀₀值为0.8-1.0，按照1个OD等于1×10⁹个细菌计算总体细菌的数量。

（2）细菌与目的蛋白VEGFR-2共同孵育

从经阿拉伯糖诱导表达的细菌中取10μL，在3000转/分、室温的条件下离心5分钟，弃除上清，将沉淀重新悬浮在1mL PBS缓冲液中。按照蛋白：细菌等于大约10:1（个数比）的比例将生物素化的VEGFR-2蛋白与重新悬浮在PBS缓冲液中的细菌混合，在4℃、温和旋转（例如，20转/分）的条件下共同孵育45分钟。然后，在4℃、3000转/分的条件下离心5分钟，弃除上清。将沉淀重新悬浮在100μL SAPE染液中，在4℃、温和旋转（例如，20转/分）的条件下孵育45分钟。孵育结束后，在4℃、3000转/分的条件下离心5分钟，弃除上清。根据流式细胞仪对细胞分选的每秒300-5000个的要求，将沉淀重新悬浮在PH值为7.4的600μL的PBS缓冲液中，使细菌在PBS缓冲液中的浓度为大约每毫升5×10⁶至1×10⁷个。

（3）利用流式细胞仪对细菌进行分选

利用流式细胞仪对重新悬浮在PBS缓冲液中的细菌进行分选。其中，表面结合有生物素化的VEGFR-2的细菌，即，表面展示有可以特异性结合VEGFR-2蛋白的多肽的细菌，在488nm光源激发下发出的荧光强度比没有结合VEGFR-2蛋白的细菌的荧光强度高。通过调节流式细胞仪的电压，利用流式细胞仪的分选功能将高荧光值的细菌分选出来，即，将表面结合有生物素化的VEGFR-2蛋白的细菌分选出来。将分选出来的细菌-蛋白复合体接种到5mL SOC培养基中过夜培养，培养期间蛋白降解，细菌得以富集，将富集的细菌再次进入流式分选流程。

当经过6轮上述流式分选的筛选，细菌与多肽的结合效率达到60%时，收集菌液并将收集的菌液接种到5mL LB培养基中，过夜培养。从过夜培养的细菌中取出10μL涂布在LB固体培养基上，在37℃过夜培养。从平板上随机挑选50个单克隆细菌，编号为clone1-clone50，分别接种到5mL LB液体培养基中，在37℃、200转/分的条件下过夜培养，并对过夜培养的细菌分别进行多肽的测序，这里，在上海生工生物工程有限公司对多肽进行测序。其中，编号为KG1的序列MAKGDFFERWGVKEM和编号为KG8的序列ENVVVNTFYEMWGVK出现的频率最高。

在流式分选过程中，为了模拟体内血液循环系统的环境，可以在筛选过程中加入20uM或者40uM的免疫球蛋白（IgG）以增大筛选压力。

图1示出了在筛选的第6轮和第7轮加入免疫球蛋白（IgG）后得到的流式细胞分选结果图。其中，F6-KDR和F7-KDR分别表示采用流式细胞仪进行筛选的第6轮和第7轮，P4代表可以与生物素化的VEGFR-2结合的细菌，P4门外的数字代表P4门内与VEGFR-2结合的细菌数量，图1中标记SAPElabeling的图片表示仅用SAPE染色的细菌，未加入任何蛋白的阴性试样。图1的流式细胞结果可以证明筛选得到的细菌所展示的多肽在生理环境下也可以与VEGFR-2蛋白很好地结合。

3、细菌表面展示多肽与VEGFR-2之间亲和力的测定

首先，用VEGFR-2与包含1×10⁷个细菌的单克隆菌液进行孵育，其中，VEGFR-2在菌液中的浓度为67nM，孵育结束后以3800转/分离心5分钟，经SAPE染色后用流式细胞仪分别检测上清和沉淀中的平均荧光值。上清（Diss）中的荧光值越低、沉淀（Ori）中的荧光值越高的细菌克隆与VEGFR-2的亲和力越高。用分别加入有血清（serum）和免疫球蛋白（IgG）的PBS缓冲液对沉淀进行洗涤，经SAPE染色后用流式细胞仪检测沉淀中的平均荧光值，其中，仍然有高荧光值的细菌与VEGFR-2亲和力较高，受阻断分子（血清和免疫球蛋白）的影响较小。图2示出了部分单克隆细菌所展示的多肽与VEGFR-2的结合强度，其中，Ori代表单克隆细菌与VEGFR-2共同孵育后经离心得到的沉淀；Diss代表单克隆细菌菌液与VEGFR-2共同孵育后经离心得到的上清液；serum代表经血清处理过的沉淀；IgG代表经免疫球蛋白处理过的沉淀；编号为clone1的细菌上表达有序列为KG1的多肽；编号为clone8的细菌上表达有序列为KG8的多肽；编号为clone45、clone46、clone 22、clone23和clone9的细菌上不具有序列为KG1和KG8的多肽；eCPX为初始的未经筛选的细菌表面展示随机肽库。从图2中可以看出，clone1和clone8的亲和力和特异性是最优的。

4、细菌表面展示多肽与VEGFR-2复合物的解离常数（Kd）的测定

这里，解离常数指细菌表面展示多肽与VEGFR-2蛋白形成的复合物解离的平衡常数，其反比于多肽与VEGFR-2之间的亲和力，也就是说，解离常数越低，亲和性越高。根据本发明的示例性实施例，取不同浓度的VEGFR-2蛋白（1nM-100nM）与1x10⁸个诱导表达的细菌4℃共孵育45min后，3800g离心5min，将沉淀重悬在1mLPBS中，通过流式细胞仪检测细菌的荧光值。将VEGFR-2蛋白的浓度及相应的细菌荧光值代入公式Fl-Fl_CPX＝Fl_max[P]/（K_D+[P]）就可以计算出细菌表面展示多肽与VEGFR-2蛋白复合物的解离常数。其中，Fl表示单个克隆细菌与VEGFR-2结合后的荧光值；Fl_CPX表示本底细菌展示库CPX的荧光值；Fl_max[P]表示细菌-蛋白复合物荧光值达到最高时VEGFR-2蛋白的浓度与此时荧光值的乘积；K_D解离常数。

图3示出了通过上述实施例得到的编号为clone1和clone8表面上的多肽与VEGFR-2的解离常数的测定结果。从图3中可以看出，随着VEGFR-2浓度的升高，与之结合的细菌表面展示的多肽在不断增加。经计算，clone1表面展示的多肽对VEGFR-2蛋白的亲和力是287.7±0.988nM，clone8表面展示的多肽对VEGFR-2蛋白的亲和力是312±0.994nM。

因此，前述实施例可以证明编号为clone1和clone8的单克隆细菌所展示的多肽与VEGFR-2蛋白具有优异的亲和性，即，具有SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列的多肽与VEGFR-2具有优异的亲和性，可以作为VEGFR-2的抑制剂。此外，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽不但具有抗体的特异性结合优势，同时还具有分子量小、免疫反应弱、更易穿透细胞膜等特点，因此，在肿瘤的早期诊断和靶向治疗的药物中具有巨大的潜在应用价值。此外，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽的制备方法操作简单，易于实施，利于进行大规模工业化生产。

序列表

<110>中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所

<120>一种多肽及其应用

<160>2

<210>1

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>靶向肿瘤血管内皮生长因子受体2的多肽

<400>1

Met Ala Lys Gly Asp Phe Phe Glu Arg Trp Gly Val Lys Glu Met

1                 5                     10                     15

<210>2

<211>15

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>靶向肿瘤血管内皮生长因子受体2的多肽

<400>2

Glu Asn Val Val Val Asn Thr Phe Tyr Glu Met Trp Gly Val Lys

1                 5                      10                    15

Claims (2)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的多肽在制备用于肿瘤诊断和/或治疗的药物中的应用。

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