CN106749656B - 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法 - Google Patents
一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106749656B CN106749656B CN201610993601.6A CN201610993601A CN106749656B CN 106749656 B CN106749656 B CN 106749656B CN 201610993601 A CN201610993601 A CN 201610993601A CN 106749656 B CN106749656 B CN 106749656B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rcn3
- antibody
- mouse
- seq
- scfv antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
- C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体及抗体的开发和生产，具体涉及一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体噬菌体文库及其淘选方法。所述单克隆ScFv抗体的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。本发明公开了一种对小鼠RCN3蛋白有很高的亲和力，在噬菌体表面展示的，可用于高效筛选的抗体噬菌体文库的构建及其淘选方法和抗体的序列及真核表达与抗原检测的方法；本发明的淘选方法可以淘选得到特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子的ScFv抗体，所述抗体文库构建及其淘选方法对筛选出来的抗体对RCN3蛋白相关的检测与疾病防治具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗体及抗体药物的开发和生产，具体涉及一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法，抗小鼠RCN3蛋白抗体的序列及真核表达与抗原检测的方法。
背景技术
小鼠RCN3是一个单拷贝基因，基因序列号为BC055903，位于小鼠的7号染色体上，含有7个外显子，编码328个氨基酸。研究表明，RCN3蛋白位于小鼠内质网分泌途径，含有6个EF-hand结构域的内质网钙离子结合蛋白，与肺I型和II型蛋白增值相关。人工敲除该基因的基因缺失纯合体小鼠在生产后会呼吸不畅并全身紫干而亡，症状与小儿呼吸窘迫综合征相似，但具体作用机制尚不明确。小鼠作为一种哺乳动物模式生物，特别适合用于此方面的研究。在对RCN3蛋白分子生物学作用机制方面的研究中急需特异性识别并结合该蛋白的抗体。但是目前国内尚无抗小鼠RCN3蛋白的抗体可以购买使用。
生物制药是近年来抗体诊断与药物医药行业中增长最迅速的行业之一，抗体已成为生物制药的最大产品类别，在治疗以肿瘤为主的人类多种疾病方面起着重要作用。随着生物技术的不断发展，抗体药物的市场前景将会越来越广泛。随着人类基因组学的进一步深入，越来越多的新靶点和新表位被发现和研究，抗原范围的扩大也必将扩大抗体药物的市场。随着生物技术的不断进步，提高抗体的科研和生产水平的同时也需要降低科研和生产的成本。
发明内容
本发明为解决难以鉴别和筛选小鼠RCN3蛋白的技术难题，公开了一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法。
为解决上述技术难题，本发明采用以下技术方案：
一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，所述单克隆ScFv抗体的碱基序列如SEQ IDNO：10所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
所述单克隆ScFv抗体包括轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述轻链可变区VL含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
所述单克隆ScFv抗体包括由ScFv通过二硫键形成全长的抗体，以及重链可变区和轻链可变区形成的ScFv、Fab、Fab2、IgG、Fv、Fv2、ScFv2或ScFv-Fc2抗体片段。
所述单克隆ScFv抗体的宿主为M13噬菌体，所述M13噬菌体的宿主为大肠杆菌XL1-blue。
一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体的淘选方法，所述淘选方法具体步骤如下：
（1）构建ScFv抗体噬菌体文库；
（2）利用小鼠RCN3蛋白对ScFv抗体噬菌体文库进行筛选，获得展示了高亲和力抗小鼠RCN3蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆；
（3）高亲和力抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆的活性测定；
（4）以高亲和力的抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆为模板，构建抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的表达载体；
（5）真核表达抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体，亲和纯化抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体及其活性检测。
本发明的有益效果在于：
1.本发明公开了一种对小鼠RCN3蛋白有很高的亲和力，在噬菌体表面展示的，可用于高效筛选的抗体噬菌体文库的构建及其淘选方法和抗体的序列及真核表达与抗原检测的方法。
2.本发明公开的抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体噬菌体文库构建及其淘选方法可以淘选得到特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子的ScFv抗体，所述抗体文库构建及其淘选方法对筛选用于小鼠RCN3蛋白相关的检测与疾病防治具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为三轮淘选产出噬菌体与小鼠RCN3蛋白结合力检测结果图。
图2为单克隆噬菌体与小鼠RCN3蛋白结合力检测结果图。
图3为小鼠RCN3带有Fc片段的单链ScFv抗体的SDS-PAGE检测结果图。
图4为单克隆ScFv抗体与小鼠RCN3蛋白酶联免疫吸附试验（Elisa）检测结合力结果图。
图5为单克隆ScFv抗体与重组小鼠RCN3蛋白的Western blot检测结果图。
具体实施方式
一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，所述单克隆ScFv抗体的碱基序列如SEQ IDNO：10所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
所述单克隆ScFv抗体包括轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述轻链可变区VL含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
所述单克隆ScFv抗体包括由ScFv通过二硫键形成全长的抗体，以及重链可变区和轻链可变区形成的ScFv、Fab、Fab2、IgG、Fv、Fv2、ScFv2或ScFv-Fc2抗体片段。
所述单克隆ScFv抗体的宿主为M13噬菌体，所述M13噬菌体的宿主为大肠杆菌XL1-blue。
一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体的淘选方法，所述淘选方法具体步骤如下：
（1）构建ScFv抗体噬菌体文库；
（2）利用小鼠RCN3蛋白对ScFv抗体噬菌体文库进行筛选，获得展示了高亲和力抗小鼠RCN3蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆；
（3）高亲和力抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆的活性测定；
（4）以高亲和力的抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的噬菌体克隆为模板，构建抗小鼠RCN3蛋白ScFv抗体的表达载体；
（5）真核表达抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体，亲和纯化抗小鼠RCN3蛋白ScFv-Fc抗体及其活性检测。
下面结合具体实施例和试验例对本发明做进一步的说明，具体操作如下。
一、单链ScFv抗体DNA文库的制备
用人白细胞提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增所有类型的轻链可变区和重链可变区基因后，重叠延伸PCR连接轻链和重链。PCR产物经1%琼脂糖凝胶（含EB）电泳后，在紫外灯下切胶回收约750bp大小位置的目的条带，用Qiagen的胶回收试剂盒回收其中的DNA片段，纯化的DNA即为单链ScFv抗体DNA文库。
二、构建单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库
将单链ScFv抗体免疫DNA文库用NEB的SfiI-HF进行双酶切，产物经1%琼脂糖凝胶（含EB）电泳后，在紫外灯下切胶回收约750bp大小位置的目的条带，用Qiagen的胶回收试剂盒回收其中的DNA片段，得到同时具有2个SfiI-HF酶切末端的单链ScFv抗体免疫DNA文库。
将同时具有2个SfiI酶切末端的单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库，与同样同时具有2个对应SfiI酶切末端的pSEX载体，在NEB的T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库。
三、构建具有单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库
将单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA文库，分多次电穿孔转化入大肠杆菌XL1-blue电转感受态中，在含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT固体培养基上，37℃条件下培养14-16h后，得到3×106个单克隆菌落，收集全部单克隆菌落并混匀，得到计数克隆测定库容为3×106CFU的，具有单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库。
四、包装单链ScFv抗体免疫噬菌体文库
具有单链ScFv抗体免疫噬菌体DNA的细菌文库，细菌增殖后用含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的2×YT液体培养基，稀释至OD600吸光值≤0.5，在20MOI的Progen公司的Hyperphage辅助下，30℃ 260rpm振荡培养12-16h包装噬菌体。
包装完成后，离心收集培养基上清。按照培养基上清：5×PEG8000/NaCl（20%PEG8000，150mM NaCl）溶液为4:1的比例向培养基上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS（pH7.4）中，12000×g离心1min，去除不可溶的沉淀。再次按照溶液上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向溶液上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀。溶液上清即为单链ScFv抗体免疫噬菌体文库，测定滴度为5×107PFU/mL。
五、高亲和力噬菌体克隆筛选
以小鼠重组RCN3蛋白为抗原按照1μg/100μL包被96孔酶标板的1个孔100μL，4℃孵育过夜。弃尽孔内液体，PBS（pH7.4）洗涤1次。弃尽孔内液体，加入200μL封闭液（2%脱脂奶粉溶解于含有0.25% Tween20的PBST（pH7.4）中），37℃封闭板孔2h。弃尽孔内液体，PBS（pH7.4）洗涤1次。弃尽孔内液体，加入100μL噬菌体，37℃孵育4h。弃尽孔内液体，含有0.25%Tween20的PBST（pH7.4）洗涤20次。弃尽孔内液体，向孔内加入100μL浓度为1.75μg/mL的胰酶，室温孵育15min。反复吹吸3-4次，转移所有液体至1mL新鲜的OD600吸光值为0.5的XL1-blue（F’）中，37℃孵育1h。取其中的1μL进行1000倍稀释涂布于含有1%葡萄糖、100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的 2×YT固体培养基平板上用于计数，余下的全部涂布于，大的方形含有1%葡萄糖、100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的 2×YT固体培养基平板上，37℃培养16-18h。收集全部菌落于10mL含有100μg/mL 羧苄青霉素和15μg/mL四环素的 2×YT液体培养基中混匀，取其中一部分稀释至OD600吸光值≤0.3，37℃ 260rpm振荡培养至OD600吸光值≈0.5。在20MOI的Progen公司的Hyperphage辅助下，30℃ 260rpm振荡培养12-16h包装噬菌体。包装完成后，高转速离心三次，收集培养基上清。按照培养基上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向培养基上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mLPBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀。再次按照溶液上清：5×PEG8000/NaCl溶液为4:1的比例向溶液上清中加入5×PEG8000/NaCl溶液，混合均匀后冰浴2h沉淀噬菌体，离心收集沉淀，充分溶解于1mL PBS（pH7.4）中，离心去除不可溶的沉淀。计数溶液中噬菌体的滴度。
重复以上亲和筛选过程2次。
经过3轮亲和筛选过程，测定投入和产出的噬菌体的数目，产出/投入比增加了约10000倍，说明特异性结合小鼠RCN3蛋白蛋白的噬菌体得到了有效富集。
通过ELISA试验证明3轮淘选产出的噬菌体结合小鼠RCN3蛋白分子的亲和力显著提高。以100μL溶解于PBS中的3μg/mL 小鼠RCN3蛋白包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳稀释的5×108PFU噬菌体，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，以200μL PBST（0.25% Tween20）洗板20次后，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗M13 抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，以200μL PBST（0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μLTMB底物显色液，15分钟后加入50μL的2M硫酸，3-5分钟后读值并进行统计分析，结果如图1所示。
六、筛选结合小鼠RCN3蛋白的阳性噬菌体抗体单克隆
每轮随机挑选5个左右分隔良好的单克隆，挑取2-3轮淘选之后产出的共10个单克隆进行序列测定，并对其进一步分析氨基酸序列和CDR 区。结果如SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。
七、噬菌体克隆的活性测定
用ELISA试验证明淘选出的全人源抗小鼠RCN3蛋白单链ScFv抗体的噬菌体克隆可以特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子。小鼠RCN3蛋白、GST蛋白和BSA蛋白分别以100μL溶解于PBS中的3μg/mL包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 以PBST（0.25%Tween20）配置的2%脱脂乳稀释的5×108PFU噬菌体，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，以200μLPBST（0.25% Tween20）洗板20次后，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗M13 抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，以200μLPBST（0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL TMB底物显色液，15分钟后加入50μL的2M硫酸，3-5分钟后读值并进行统计分析，结果如图2所示。
八、克隆ScFv-Fc抗体及其活性测定
将ELISA检测证实具有较强结合力的噬菌体上展示的编码SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和 SEQ ID NO：9的如SEQ ID NO：10所示的ScFv，导入真核表达载体pFUSERTL1中，转染到CHO-S悬浮细胞中进行表达7天，离心收集表达上清，利用Protein A亲和纯化全人源抗小鼠RCN3带有Fc标签的单链ScFv抗体。进行SDS-PAGE鉴定，结果如图3所示。
利用ELISA的方法，鉴定此ScFv-Fc抗体能与小鼠RCN3蛋白结合。小鼠RCN3蛋白、GST蛋白和BSA蛋白分别以100μL溶解于PBS中的3μg/mL包被ELISA板孔，4℃过夜。弃尽板孔内溶液，以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳每孔200μL 37℃封闭2h。弃尽板孔内溶液，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的5%脱脂乳稀释的300ng/μL的RCN3抗体作为一抗，37℃孵育1h。弃净板孔内溶液，用200μL PBST（0.25% Tween20）洗板5次后，每孔加入100μL 以PBST（0.25% Tween20）配置的2%脱脂乳1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗人IgG抗体，37℃孵育1h。弃尽板孔内溶液，用200μL PBST（0.25% Tween20）洗板3次后，每孔加入100μL TMB底物显色液，15分钟后加入50μL的2M硫酸，3-5分钟后读值并进行统计分析。结果如图4所示。此抗体可以特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白分子。
利用Western blot方法检测此抗体能识别重组小鼠RCN3蛋白。将重组小鼠RCN3蛋白进行SDS-PAGE电泳后，电转移到0.2μm的NC膜上。封闭液（5%脱脂乳溶于0.05%的PBST中）封闭过夜后，加入封闭液稀释的终浓度为2μg/mL的ScFv-Fc抗体室温孵育2h，0.05%的PBST洗涤3次后以封闭液1:5000稀释的 GE 的 HRP 标记的羊抗人IgG抗体孵育1h。PBST洗涤3次后用科晶生物科技有限公司的化学发光液显色，ProteinSimple公司的FluorChem Msystem进行荧光和化学发光捕获照相，结果如图5所示。此抗体可以特异性识别并结合小鼠RCN3蛋白。
<110> 郑州师范学院
<120> 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法
<160> 10
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(8)
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 2
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(8)
<400> 2
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(11)
<400> 3
Ala Arg Asp Leu Gly Thr His Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(6)
<400> 4
Gln Asp Ile Thr Tyr His
1 5
<210> 5
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(3)
<400> 5
Asp Ala Ser
1
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(9)
<400> 6
Gln His Tyr Tyr Asn Arg Pro Pro Thr
1 5
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(107)
<400> 7
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Tyr His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
35 40 45
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Asn Arg Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(118)
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Gly Thr His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> DOMAIN
<222> (1)...(243)
<400> 9
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr Tyr His
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Val Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Tyr Asn Arg Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser Ser Arg
100 105 110
Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln
115 120 125
Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile
165 170 175
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg
180 185 190
Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met
195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp
210 215 220
Leu Gly Thr His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
243
<210> 10
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> gene
<222> (1)...(729)
<400> 10
gagctccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc aggcgagtca ggacattacc taccatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gggaaagccc caaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggtaaccgg ggtcccatca 180
aggttcagtg gaagtggatc tgggacagac tttactgtca ccattagcag tctgcagcct 240
gaagattttg caacctacta ctgtcaacac tattataatc gccctcccac cttcggccaa 300
gggacacgac tggagattaa aggtggttcc tctagatctt cctcctctgg tggcggtggc 360
tcgggcggtg gtgggcaggt gcagctggtg cagtctgggg gaggcgtggt ccagcctggg 420
aggtccctga gactctcctg tgcagcctct ggattcacct tcagtagcta tggcatgcac 480
tgggtccgcc aggctccagg caaggggctg gagtgggtgg cagttatatc atatgatgga 540
agtaataaat actatgcaga ctccgtgaag ggccgattca ccatctccag agacaattcc 600
aagaacacgc tgtatctgca aatgaacagc ctgagagctg aggacacggc tgtgtattac 660
tgtgcgagag acctcgggac ccatgctttc gatatctggg gccaagggac aatggtcacc 720
gtctcttca 729
Claims (3)
1.一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，其特征在于：所述单克隆ScFv抗体的碱基序列如SEQ ID NO：10所示，所述碱基序列对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
所述单克隆ScFv抗体包括轻链可变区VL和重链可变区VH，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.如权利要求1所述的抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，其特征在于：所述重链可变区含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示；所述轻链可变区VL含有三个高变区，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQID NO：6所示。
3.如权利要求1所述的抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体，其特征在于：所述单克隆ScFv抗体从ScFv抗体噬菌体文库中筛选得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610993601.6A CN106749656B (zh) | 2016-11-11 | 2016-11-11 | 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610993601.6A CN106749656B (zh) | 2016-11-11 | 2016-11-11 | 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106749656A CN106749656A (zh) | 2017-05-31 |
| CN106749656B true CN106749656B (zh) | 2018-04-13 |
Family
ID=58973387
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610993601.6A Active CN106749656B (zh) | 2016-11-11 | 2016-11-11 | 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106749656B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110066337B (zh) * | 2019-05-16 | 2022-06-21 | 艾柏森(江苏)生物科技有限公司 | 一种抗TNF-α抗体 |
| CN113278068B (zh) * | 2020-06-04 | 2023-11-10 | 山东宽和正生物医药有限公司 | 针对新冠病毒SARS-CoV-2的单克隆抗体F5 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423660A (zh) * | 1999-11-18 | 2003-06-11 | 牛津生物医学（英国）有限公司 | 抗体 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1335324A (zh) * | 2001-07-24 | 2002-02-13 | 大连理工大学 | 抗乙型肝炎病毒preS1抗原的人源单链抗体 |
-
2016
- 2016-11-11 CN CN201610993601.6A patent/CN106749656B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1423660A (zh) * | 1999-11-18 | 2003-06-11 | 牛津生物医学（英国）有限公司 | 抗体 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RCN3基因在围产期小鼠呼吸过程中的功能研究;张一荻;《博士学位论文（中国科学院大学）》;20141231;摘要、正文第3-5页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106749656A (zh) | 2017-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103898615B (zh) | 一种黄曲霉毒素纳米抗体基因库、构建方法、用途及黄曲霉毒素m1纳米抗体2014afm-g2 | |
| CN106749656B (zh) | 一种抗小鼠RCN3蛋白单克隆ScFv抗体及其淘选方法 | |
| CN108299561A (zh) | 一种pd-1纳米抗体及其克隆表达方法与应用 | |
| CN108341870A (zh) | 一种抗bsa纳米抗体、其生产方法及应用 | |
| CN104926940B (zh) | 一种人源杀虫蛋白及其制备方法与应用 | |
| CN110551213A (zh) | 抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用 | |
| CN109678962A (zh) | 一种Cdk5纳米抗体和筛选方法 | |
| CN108949716A (zh) | 一种热启动Taq DNA聚合酶的制备方法 | |
| CN108892723A (zh) | 用于检测猪流行性腹泻病毒的单域重链抗体、制备方法及应用 | |
| CN108864281B (zh) | 一种抗肠炎沙门氏菌的纳米抗体及其应用 | |
| CN110423277A (zh) | Pd-1的纳米抗体及其临床应用 | |
| CN104804092B (zh) | 一种抗b细胞生长刺激因子的纳米抗体及其用途 | |
| CN108383908A (zh) | 识别人源ctla-4并阻断其功能的全人源单克隆抗体或抗体片段及其制备方法和用途 | |
| CN110396128B (zh) | 抗cd19纳米抗体的制备 | |
| CN109503711A (zh) | 一种用于血凝方法检测pcv2病毒的双功能纳米抗体、编码基因及其应用 | |
| CN113461814B (zh) | 特异识别副溶血性弧菌的纳米抗体、重组载体、宿主细胞及其应用 | |
| CN103361741A (zh) | 一种噬菌体抗体库及其在盐酸克伦特罗含量测定中的应用 | |
| CN110229230A (zh) | 一种靶向cd38的单域抗体及其应用 | |
| CN105777902B (zh) | 一种抗蝗虫微孢子虫AlocSWP2孢壁蛋白ScFv单克隆抗体及其淘选方法 | |
| CN104804070B (zh) | 可特异性结合玉米赤霉烯酮的多肽分子及其应用 | |
| CN113583119A (zh) | 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒 | |
| CN113667014B (zh) | 一种抗bsa纳米抗体及应用 | |
| CN107446021B (zh) | 叶酸受体α特异性结合肽5及其应用 | |
| CN106636105B (zh) | 金黄色葡萄球菌肠毒素c2的核酸适配体c203及其筛选方法和应用 | |
| CN107793471B (zh) | 叶酸受体α特异性结合肽4及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |