CN110423277A - Pd-1的纳米抗体及其临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种PD‑1的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明还公开了一种PD‑1纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明所述的PD‑1的纳米抗体的VHH链或本发明所述的PD‑1纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达PD‑1的纳米抗体，还公开了该PD‑1纳米抗体用于检测PD‑1的用途。通过本发明所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于PD‑1检测试剂及生物制药的研发。

Description

PD-1的纳米抗体及其临床应用

技术领域

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，涉及针对于PD-1的纳米抗体及其编码序列。

背景技术

生物学家Ward在1989年分离检测骆驼血清中抗体时发现，骆驼血液中除了常规的四链抗体外，还有一些仅含重链的抗体。1993年，科学家Hamers-Casterman等研究表明，骆驼抗体天然缺失轻链，只含有重链，因此又称为重链抗体(heavy chain antibodies，HCAbs)。另有研究者发现，骆驼抗体中还缺少CH1。克隆重链抗体的可变区得到只由一个重链可变区组成的单域抗体，称为VHH抗体(Variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH)。VHH晶体直径2.5nm，长4nm，因此又称为纳米抗体 (nanobody，Nb)，是自然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米粒子具有的颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高等特点，以及表面效应、尺寸效应和宏观量子隧道效应使得纳米抗体在诸多方面均优于传统抗体。纳米抗体在疾病的检测和治疗方面具有显著的应用成果。

程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1，PD-1)是一种共刺激分子，属于CD28 家族，呈诱导性表达于活化的T细胞、B细胞和NK细胞表面，与其配体作用传递抑制性信号，发挥负向调控作用，这一信号在自身免疫性疾病、肿瘤发生、慢病毒感染中具有重要的生物学意义。PD-1通过与程序性细胞死亡因子配体1或者2结合后，招募并激活蛋白络氨酸磷酸酶等激活信号通路，对T细胞免疫起到负向调节的功能。PD-1还可以通过抑制辅助性T细胞间接影响体液免疫或者直接通过与B细胞上的PD-1结合影响抗体分泌。PD-1信号异常可以引起体内免疫微环境失去稳态，导致自身免疫性疾病或者肿瘤发生。因此利用抗PD-1的纳米抗体封闭PD-1信号通路，可以减弱对活化的T 细胞抑制作用，从而增强抗肿瘤的功能。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种针对PD-1的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。

技术方案：本发明的技术方案为：

本发明的第一方面，提供了一种针对PD-1重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4。

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。

优选地，所述的PD-1纳米抗体的VHH链，它具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。

本发明第二方面，一种针对PD-1重链抗体VHH，此抗体特异性识别PD-1抗原，包括一条具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。

本发明第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本发明所述的PD-1重链抗体VHH。

优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO： 9。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点如下：本发明将血液中提取的PD-1免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于PD-1的纳米抗体基因库，试验中将PD-1偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了针对PD-1特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

附图说明

图1是用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将PD-1蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。

图2是表达的PD-1纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示PD-1纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95％以上。

图3是PD-1纳米抗体检测特异性分析的结果图。

具体实施方式

本发明首先将PD-1的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了PD-1特异的单域重链抗体文库。将PD-1偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得PD-1的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选PD-1免疫性的纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

针对于PD-1的纳米抗体文库的构建：

(1)首先合成抗原PD-1，用于免疫所用的PD-1的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgPD-1与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂(购自sigma)，剩余几次全部使用弗式不全佐剂(购自sigma)，免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。(2)5 次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。(3)按照Super-ScriptIIIFIRSTSTRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：

第一轮PCR：

上游引物：GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC

下游引物：GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果显示该片段的大小约为700bp，即纳米抗体基因电泳带约为700bp。。

第二轮PCR：

以第一轮PCR产物作模板，

上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG

下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT

扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段(长片段和短片段)，60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果显示，该片段的大小约为500bp，即纳米抗体基因电泳带长度约为500bp。(4)使用限制性的内切酶(购自NEB)PstI及NotI酶切20μgpComb3 噬菌体展示载体(Biovector供应)及10μgVHH并用T4DNA连接酶(购自TaKaRa公司)连接两个片段。(5)将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1(北京神州红叶科技有限公司)中，构建PD-1的纳米抗体噬菌体展示文库并测定库容，库容的大小为3.1 ×10⁸。与此同时，通过菌落PCR检测引物使用第二轮PCR引物，Tm55℃。文库构建完成后，为检测文库的插入率，随机选取单颗克隆做菌落PCR。结果显示插入率已达到90％以上。

实施例2

针对PD-1的纳米抗体筛选过程：

(1)将溶解在PBS中的100μg/mL的PD-1包被在NUNC酶标板上，4℃放置过夜，同时设立负对照。(2)第二天两个孔中分别加入200μL1％牛奶，室温封闭2小时。(3) 2小时后，加入100μL噬菌体(8×10¹¹tfu免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，在室温下作用1小时。(4)用PBST(PBS中含有0.05％吐温20)洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体。(5)用三乙基胺(100mM)将与PD-1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复 2轮。结果如图1显示：在不断地筛选的过程中，阳性的克隆将不断的被富集，从而达到了利用噬菌体展示技术筛取抗体库中PD-1特异抗体的目的。

实施例3

用噬菌体的酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性单个阳性克隆：

该实验的原理模式图如图1所示，具体检测如下：

(1)从3-4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1LTB培养基中含有2.3g磷酸二氢钾，12.52g 磷酸氢二钾，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生长至对数期后，加终浓度 1mmol的IPTG，28℃培养过夜。(2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。(3)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouseanti-HAtagantibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1小时。(4)用PBST洗去未结合的抗体，加入二抗 anti-mousealkalinephosphataseconjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1小时。(5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。(6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆孔。(7)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL 的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

根据序列比对软件VectorNTI分析各个克隆株的基因序列，把CDR1，CDR2，CDR3 序列相同的株视为同一克隆株，而其序列不同的株视为不同克隆株，最终得到氨基酸序列SEQIDNO：8所示的纳米抗体。

实施例4

纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化：

(1)将前面测序分析所获得两种纳米抗体亚克隆至表达性的载体PET32a中，并将测序鉴定正确的重组质粒转化到表达型宿主菌DE3中，其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基的板上，37℃过夜。(2)挑选单个菌落接种在15mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。(3)接种1mL的过夜菌种至330mLLB培养基中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.6-1时，加入IPTG，28℃摇床培养过夜。(4) 第二天，离心收菌。(5)将菌体破碎以获得抗体粗提液。(6)经镍柱离子亲和层析纯化抗体蛋白，为获得高纯度的抗体，采用咪唑梯度洗脱法，低浓度咪唑洗脱液(50mmol) 用于洗去杂带，高浓度咪唑洗脱液(250mmol，500mmol)最终可制备纯度达90％以上的蛋白。图2所示从左到右的条带分别是：第一为标准蛋白分子，第二第三250mmol 咪唑的洗脱液洗脱的蛋白样品；结果显示，纳米抗体经过该纯化后，其纯度可达到95％以上。

实施例5

生物素化纳米抗体及其纯化方法：

(1)将针对PD-1的纳米抗体基因片段亚克隆至pBAD载体上，随后构建好的质粒pBAD与质粒BirA共转至大肠杆菌WK6中，并将其涂布在含有氨苄青霉素、氯霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；(2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(3)接种1mL的过夜菌种至330mL 含氨苄青霉素和氯霉素的TB培养液中，37℃摇床培养，培养到OD值达到0.4-0.5时，加入330μl50mM的D-生物素(D-biotion)溶液，37℃慢摇1h；(4)加入终浓度为 1mMIPTG，28℃摇床培养过夜；(4)离心，收菌；(5)利用渗透法，获得抗体粗提液； (6)使用链霉亲和素磁珠纯化偶联生物素的纳米抗体。

实施例6

PD-1纳米抗体检测特异性分析：

(1)将PD-1包被在酶标板上，同时做空白孔对照，各包被两个孔，将PD-1蛋白纳米抗体及对照抗体前白蛋白纳米抗体分别转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1小时。(2)用PBST洗去未结合的抗体，加入一抗mouseanti-HAtagantibody(抗鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪生物科技有限公司)，在室温下放置1小时。(3)用 PBST洗去未结合的抗体，加入二抗anti-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司)，在室温下放置1小时。(4)用PBST 洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。结果如图3显示PD-1纳米抗体能特异性的识别PD-1蛋白。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干修饰和改良，这些修饰和改良也应视为本发明的保护范围。

本发明提供一个PD-1纳米抗体，每个纳米抗体提供骨架区和互补决定区，其中所述的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4和互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸和氨基酸序列分别为：

PD-1纳米抗体

骨架区和互补决定区的核苷酸序列：

FR1:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCT

FR2:TGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAATT

FR3:AAATATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGTC

CAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAAACCTGAGGACACTGCCA TGTACTACTGT

FR4:TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

CDR1:GGATACACCTATAGTTACAATATCATGGGA

CDR2:ATAGATCGTGGTATTATGACC

CDR3:GCGGCGGGGCGCACATGGACTATGTCCCCCAACGAATATAACGCC

骨架区和互补决定区的氨基酸序列：

FR1:QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVS

FR2:WFRQAPGKEREGVAI

FR3:KYADSVKGRFTISQDKSKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC

FR4:WGQGTQVTVSS

CDR1:GYTYSYNIMG

CDR2:IDRGIMT

CDR3:AAGRTWTMSPNEYNA

整体核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTC TGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATACACCTATAGTTACAATATCATGGGATG GTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAATTATAGATCGTG GTATTATGACCAAATATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAG ACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGA CACTGCCATGTACTACTGTGCGGCGGGGCGCACATGGACTATGTCCCCCAACG AATATAACGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

整体氨基酸序列：

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGYTYSYNI M GWFRQAPGKEREGVAIIDRG I MTKYADSVKGRFTISQDKSKNTLYLQ M NSLKPEDTA M YYCAAGRTWT M SP NEYNAWGQGTQVTVSS

序列表

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PD-1的纳米抗体及其临床应用

本发明提供一个PD-1纳米抗体，每个纳米抗体提供骨架区和互补决定区，其中所述的骨架区FR1、FR2、FR3、FR4和互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸和氨基酸序列分别为：

PD-1纳米抗体

骨架区和互补决定区的核苷酸序列：

FR1:CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCT

FR2:TGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAATT

FR3:AAATATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGT

FR4:TGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

CDR1:GGATACACCTATAGTTACAATATCATGGGA

CDR2:ATAGATCGTGGTATTATGACC

CDR3:GCGGCGGGGCGCACATGGACTATGTCCCCCAACGAATATAACGCC

骨架区和互补决定区的氨基酸序列：

FR1:QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVS

FR2:WFRQAPGKEREGVAI

FR3:KYADSVKGRFTISQDKSKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYC

FR4:WGQGTQVTVSS

CDR1:GYTYSYNIMG

CDR2:IDRGIMT

CDR3:AAGRTWTMSPNEYNA

整体核苷酸序列：

CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGAGGAGGCTCGGTGCAGGCTGGAGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATACACCTATAGTTACAATATCATGGGATGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCGCAATTATAGATCGTGGTATTATGACCAAATATGCCGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCCAAGACAAGTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACTGCCATGTACTACTGTGCGGCGGGGCGCACATGGACTATGTCCCCCAACGAATATAACGCCTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA

整体氨基酸序列：

QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCAVSGYTYSYNI M GWFRQAPGKEREGVAIIDRGI MTKYADSVKGRFTISQDKSKNTLYLQ M NSLKPEDTA M YYCAAGRTWT M SPNEYNAWGQGTQVTVSS

Claims (5)

1.PD-1纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：

SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4；

所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：

SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。

2.根据权利要求1所述的PD-1重链抗体VHH，其特征在于它具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。

3.一种PD-1的重链抗体VHH，其特征在于它是针对PD-1表面抗原的纳米抗体，包括具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。

4.一种DNA分子，其特征在于，它编码选自下组的蛋白质：权利要求1或2所述的PD-1的重链抗体VHH。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO：9。