JP2022551318A - Ｂ７－ｈ３ナノ抗体、その製造方法および使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体、その製造方法および使用を提供する。前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記相補性決定領域が相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む。前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体は、特異的にＢ７－Ｈ３と結合し、敏感的にＢ７－Ｈ３分子を検出することができ、治療性抗体として様々なＢ７－Ｈ３分子過剰表現の悪性腫瘍の治療に用いられる見込みがある。

Description

本発明は、Ｂ７－Ｈ３ポリペプチド分子抗原エピトープに対するナノ抗体、当該ナノ抗体の製造方法並びに当該ナノ抗体の使用に関する。
Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６とも呼ばれる）は、Ｂ７ファミリーのメンバーであり、その配列が、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）の細胞外領域と類似し、多種の生物学的機能を有する系統発育保存タンパク質である。Ｂ７－Ｈ３は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、マウスでは、その細胞外ドメインが、１ペアの免疫グロブリン可変ドメイン（ＩｇＶ）と免疫グロブリン定常ドメイン（ＩｇＣ）とで構成され（２ＩｇＢ７－Ｈ３サブタイプ）；人では、エキソン複製により全く同じの２ペアの免疫グロブリン（４ＩｇＢ７－Ｈ３サブタイプ）を生成し、当該サブタイプが最も一般的な形式で表現される。Ｂ７－Ｈ３が、ｍＲＮＡレベルでの表現が比較的によく見られ、肝臓、心臓、前立腺のような非リンパ臓器や、脾臓と胸腺のようなリンパ臓器にも検出されることができるが、タンパク質表現が厳格的にレギュレートされる。Ｂ７－Ｈ３は、非免疫安静期線維芽細胞、内皮細胞、骨芽細胞、及び羊水幹細胞に構造的に発現する。誘導によって、Ｂ７－Ｈ３は、免疫細胞、特に抗原提示細胞に発現することができる。調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）と共培養すると、ＩＦＮ－γ、リポ多糖（ＬＰＳ）またはａｎｔｉ－ＣＤ４０体外刺激は、樹状細胞発現Ｂ７－Ｈ３蛋白を誘導することができる。また、単核細胞と単核細胞由来のＤＣはそれぞれＬＰＳ刺激またはサイトカイン誘導分化後にＢ７－Ｈ３発現レベルを上昇させる。ＰＭＡ／Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ刺激後に、ＮＫ細胞、Ｂ細胞と少量のＴ細胞でもＢ７－Ｈ３蛋白を検出することができる。正常細胞での厳格なレギュレーションとは異なり、Ｂ７－Ｈ３は、メラノーマ、白血病、乳がん、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌など多くの悪性腫瘍で異常な過剰発現を示す。Ｂ７－Ｈ３の過剰発現は、予後不良と臨床治療効果の低下にも関係しており、Ｂ７－Ｈ３を標的とする抗体薬の開発は有望な腫瘍治療策略となっている。
ナノ抗体技術は、生物医学科学者が伝統的な抗体に基づいて分子生物学技術を用いてナノ粒子科学の概念と結び付けて行った抗体工学革命によって開発された最新かつ最小の抗体分子であり、最初はベルギーの科学者Ｈａｍｅｒｓ，Ｒがラクダの血液中で発見した。通常の抗体タンパク質は、２本の重鎖と２本の軽鎖で構成されているが、ラクダの血液から発見された新型抗体は２本の重鎖だけである。これらの「重鎖抗体」は正常抗体のように抗原などのターゲットとしっかり結合できるが、一本鎖抗体のように互いにくっついて集まって塊になることはない。この「重鎖抗体」をベースとしたナノ抗体は分子量が通常の抗体の１/１０にすぎないだけでなく、化学的性質もより柔軟で、安定性が高く、可溶性が高く、発現が容易で、腫瘍組織の透過性が高く、他の分子と結合しやすい。
そのため、ナノ抗体技術を応用してＢ７－Ｈ３の治療性抗体を開発することは広い見込みがある。
一態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体であって、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記相補性決定領域が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３４、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５８、配列番号６３および配列番号６８からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９からなる群より選ばれるいずれか一種であり；並びに
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６５および配列番号７０からなる群より選ばれるいずれか一種である、Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体を提供する。
本発明のＢ７－Ｈ３ナノ抗体は、特異的にＢ７－Ｈ３と結合し、敏感的にＢ７－Ｈ３分子を検出することができ、治療性抗体として様々なＢ７－Ｈ３分子過剰表現の悪性腫瘍の治療に用いられる見込みがある。
実施例３におけるＯｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅ イムノブロット図である。 実施例４におけるｐｈａｇｅ Ｅｌｉｓａにて陽性クローンをさらに検証する結果である。 実施例５における１－１３＃ナノ抗体精製のＳＤＳ－ＰＡＧＥ図である。
以上の課題を鑑みると、一態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体であって、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記相補性決定領域が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３４、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５８、配列番号６３および配列番号６８からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９からなる群より選ばれるいずれか一種であり；並びに
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６５および配列番号７０からなる群より選ばれるいずれか一種である、Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体を提供する。
具体的な実施形態では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、順次に、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）およびフレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、
前記フレームワーク領域１（ＦＲ１）が、配列番号１、配列番号８、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号６１および配列番号６６からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３４、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５８、配列番号６３および配列番号６８からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記フレームワーク領域２（ＦＲ２）が、配列番号２、配列番号９、配列番号１６、配列番号３９、配列番号５５からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記フレームワーク領域３（ＦＲ３）が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２８、配列番号３３、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６７からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６５および配列番号７０からなる群より選ばれるいずれか一種であり；および
前記フレームワーク領域４（ＦＲ４）が、配列番号４、配列番号１１、配列番号１８および配列番号５７からなる群より選ばれるいずれか一種である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号１２であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号１３であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号１４である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号１９であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号２０であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号２１である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号２４であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号２５であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号２６である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号２９であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号３０であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号３１である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号３４であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号３５であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号３６である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号１２であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号１３であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号３７である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号４１であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号４２であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号４３である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号４６であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号４７であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号４８である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５１であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号５２であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号５３である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５８であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号５９であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号６０である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号６３であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６４であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号６５である。
一つの具体的な実例では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号６８であり、
前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６９であり、
前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７０である。
具体的な実施形態では、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、
配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２および配列番号８３からなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有する。
別の態様では、本発明は、前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体の製造方法であって、
１）．Ｂ７－Ｈ３分子ナノ抗体ライブラリを構築する工程と；
２）．Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体をスクリーンする工程と；
３）．イムノブロット法にて個別の陽性クローンを検出する工程と；
４）．ｐｈａｇｅ Ｅｌｉｓａにて陽性クローンをさらに検証する工程と；
５）．真核表現系でＢ７－Ｈ３ナノ抗体を表現・精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体をコードする、ＤＮＡ分子を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、上記ＤＮＡ分子を含む、表現ベクターを提供する。
更なる態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３分子検出試薬を製造するための上記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体の使用を提供する。
更なる態様では、本発明は、Ｂ７－Ｈ３分子過剰表現の悪性腫瘍を治療する医薬の製造のための上記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体の使用を提供する。
以下、具体的な実施例により本願のナノ抗体の具体的な製造過程を説明するが、当業者であれば、本願の範囲がこれらの実施例により制限されず、当業者により実施され可能な様々な均等形質転換形式を含むことを理解すべきである。
完全／不完全フロイントアジュバント（ｓｉｇｍａ，Ｆ５５０６），ストレプトアビジン磁性ビーズ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，６５００２），ｃａｓｅｉｎ （Ｔｈｅｒｍｏ，３７５２８），ＰＲＯＴＲＡＮ ＢＡ ８５（Ｗｈａｔｍａｎ，１０４０１１１６），マイクロプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ，６５００６１），ヒツジ抗Ｍ１３ＨＲＰ（ＧＥ，２７９４２１）。
＜実施例１：Ｂ７－Ｈ３分子ナノ抗体に対するライブラリの構築＞
（１）ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３抗原分子をタンパク質表現させ、１ｍｇ ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３抗原と完全フロイントアジュバントとを等体積で混合させ、一匹の新疆単峰性ラクダを免疫した。
（２）２周目から、１ｍｇ ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３抗原と不完全フロイントアジュバントとを等体積で混合させ、合計７回免疫し、Ｂ細胞を刺激して抗原特異的なナノ抗体を表現させた。
（３）７回免疫が終了した後、１００ｍＬラクダの末梢血リンパ球を抽出し、そしてトータルＲＮＡを抽出した。
（４）逆転写でｃＤＮＡを取得し、ネストＰＣＲにてＶＨＨ断片を増幅した。
（５）ｋｕｎｋｅｌ反応を利用して、ＶＨＨ一本鎖ＤＮＡをファージベクターにアニールした。
（６）ｋｕｎｋｅｌ生成物を電気形質転換受容性ＤＨ１０Ｂに形質転換し、Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体ライブラリを構築し、そしてライブラリ容量を測定し、ライブラリ容量の大きさが１．０７×１０ｅ９であった。
＜実施例２：Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体に対するスクリーニング過程＞
（１）液相パンニング：
１．最終濃度０．５％ｃａｓｅｉｎブロッキングバッファーで１０ｅ１２ｐｆｕ ｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅをブロッキングし、室温で１ｈインキュベートした。
２．同時に１００μＬストレプトアビジン磁性ビーズを取り、殺菌ＰＢＳで三回洗浄し、上澄み液を捨てて、５００μＬ １％ｃａｓｅｉｎブロッキングバッファーで、室温で１ｈブロッキングした。
３．工程２でのブロッキング液を捨てて、１ｍＬ ブロッキング済みのｐｈａｇｅを磁性ビーズに添加し、十分に均一に混合し、回転しながら均一に混合して１５ｍｉｎ結合した（陰性スクリーニング）。
４．上澄み液を新たな殺菌ＥＰチューブに取り、最終濃度１００ｎＭ ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３－ｂｉｏｔｉｎ抗原を添加し、室温で回転しながら均一に混合して２ｈ結合した。
５．同時に１００μＬ ストレプトアビジン磁性ビーズを取り、殺菌ＰＢＳで三回洗浄し、上澄み液を捨てて、５００μＬ １％ｃａｓｅｉｎブロッキングバッファーで、室温で１ｈブロッキングした。
６．工程５でのブロッキング液を捨てて、１ｍＬ ｐｈａｇｅ－ｈｕ ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３－ｂｉｏｔｉｎ混合物を磁性ビーズに添加し、十分に均一に混合し、回転しながら均一に混合して１５ｍｉｎ結合した。
７．上澄み液を捨てて、１×ＰＢＳで１０回洗浄し、磁性ビーズを回収した。
８．４００μＬ新鮮に調製された溶出バッファー１００ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを工程７の磁性ビーズに添加し、回転しながら１０ｍｉｎ溶出した。
９．４００μＬ上澄み液を殺菌ＥＰチューブに転移し、２００μＬ ｐＨ６．４ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して中和し、スクリーニングによりｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅを取得した。
（２）固相パンニング：
１．１ｍＬ最終濃度１００ｎＭ ｈｕ－ ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３抗原溶液で免疫チューブをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。
２．二日目、１×ＰＢＳでコーティングなしの免疫チューブを３回リンスし、回転乾燥し、４ｍＬ １％ｃａｓｅｉｎブロッキングバッファーを添加し、室温で回転しながら１ｈブロッキングした。
３．最終濃度１％のＢＳＡで５×１０ｅ１２ ｐｆｕで一回目のｉｎｐｕｔ ｐｈａｇｅをブロッキングし、１×ＰＢＳで１ｍＬ最終体積まで補充し、室温で回転しながら１ｈブロッキングした。
４．抗原コーティングなしの免疫チューブにおけるブロッキング液を捨てて、ブロッキング済みのｐｈａｇｅを抗原コーティングなしの免疫チューブに投入し、回転しながら２ｈ結合した（陰性スクリーニング）。
５．同時に抗原コーティングした免疫チューブにおけるコーティング液を捨てて、１×ＰＢＳで３回リンスし、回転乾燥し、４ｍＬブロッキングバッファーを添加し室温で回転しながら１ｈブロッキングした。
６．抗原コーティングした免疫チューブにおけるブロッキング液を捨てて、陰性スクリーニング後のｐｈａｇｅを免疫チューブに転移し、回転しながら２ｈ結合した。
７．上澄み液を捨てて、１×ＰＢＳＴで免疫チューブを１０回リンスし、回転乾燥した。
８．１ｍＬ新鮮に調製された溶出バッファー １００ｍＭ Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅを免疫チューブに添加し、室温でインキュベートを１０ｍｉｎ静置した。
９．１ｍＬ溶出液を殺菌ＥＰチューブに転移し、５００μＬ ｐＨ６．４ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して中和し、スクリーニングによりｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅを取得した。
＜実施例３：イムノブロット法にて個別の陽性クローンの検出（Ｍｃｃａｆｆｅｒｔｙ Ｊ ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ａ Ｄ ，Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｇｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ[Ｊ]．Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４８（６３０１）：５５２－５５４．Ｈｕｓｅ Ｗ ，Ｓａｓｔｒｙ Ｌ ，Ｉｖｅｒｓｏｎ Ｓ ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌａｒｇｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｉｎ ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ[Ｊ]．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８９，２４６（４９３５）：１２７５－１２８１．）＞
（１）各ＬＢプレートに２０００ｐｆｕ ｏｕｔｐｕｔ ｐｈａｇｅを接種し、３７℃で６－８ｈ培養した；
（２）５ｍＬ ２μｇ／ｍＬ ａｎｔｉ－Ｍ１３で抗体コーティングしたＷｈａｔｍａｎ ０．４５μｍ ＮＣ膜を、室温で２．５ｈインキュベートした。
（３）コーティング液を捨てて、５ｍＬ １％ｃａｓｅｉｎブロッキングバッファーでＮＣ膜をブロッキングし、室温で１ｈインキュベートした。
（４）ブロッキング液を捨てて、１×ＰＢＳで３回洗浄し、通風乾燥した。
（５）ＮＣ膜をｐｈａｇｅが成長したＬＢプレートに貼り、穴を開けて位置決めをして、室温で一晩培養した。
（６）二日目、膜を開けて新たなシャーレに置き、１×ＰＢＳで３回リンスし、１００ｎＭのｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３－ｂｉｏｔｉｎを添加して室温で１ｈインキュベートした。
（７）０．１％ＰＢＳＴで８回リンスし、１：１０００希釈したＮｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ－ＡＰを添加して室温で３０ｍｉｎインキュベートした。
（８）０．１％ＰＢＳＴで８回リンスし、１０ｍＬ ＡＰ発色基質（１００μＬ ＢＣＩＰ＋１００μＬ ＮＢＴ）を添加し、室温で１０－３０ｍｉｎ発色させた。
（９）陽性クローンを選択し、ｐｌａｑｕｅ ＰＣＲを行い、シーケンシングに用意した。
（１０）ＤＮＡｍａｎ配列比較ソフトにて配列を比較し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３が同じであるクローンを同一クローンとみなされた。
＜実施例４：ｐｈａｇｅ Ｅｌｉｓａにて陽性クローンのさらなる検証＞
（１）ｐｈａｇｅの増幅：１：１００でＸＬ１ｂｌｕｅ大腸菌をＬＢ液体培地（１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン含有）に接種し、ＯＤ６０＝０．６まで成長させた。Ｘｌ１ｂｌｕｅを９６ウェル深いプレートに分取し、６００μＬ／ウェルで、１５μＬ選択されたｐｈａｇｅ ｅｌｕｔｉｏｎを添加した。一晩増幅し、４０００ｒｐｍで３０ｍｉｎ遠心し、上澄み液を取り、ｐｈａｇｅ Ｅｌｉｓａとして用いられることができた。
（２）Ｅｌｉｓａ検出：
１．ｈｕ４ＩｇＢ７－Ｈ３抗原を１×ＰＢＳで１００ｎＭまで希釈し、各ウェル５０μＬでＥＬＩＳＡプレートを、４℃で一晩コーティングした。
２．コーティング液を捨てて、ＥＬＩＳＡプレートを回転乾燥し、１×ＰＢＳで３回リンスした。
３．各ウェルに２００μＬ １％ｃａｓｅｉｎブロッキングバッファーを添加し、室温で１ｈブロッキングした。
４．ブロッキング液を捨てて、各ウェルに５０μＬ高力価ｐｈａｇｅを添加し、室温で２ｈインキュベートした。
５．０．１％ＰＢＳＴで６回リンスし、回転乾燥した。
６．１：５０００で希釈したヒツジ抗Ｍ１３－ＨＲＰ抗体を添加し、５０μＬ／ウェルで、室温で１ｈインキュベートした。０．１％ＰＢＳＴで６回リンスし、回転乾燥した。
７．各ウェルに５０μＬ ＴＭＢ発色液を添加し、室温で５ｍｉｎ発色した。５０μＬ ２ＭのＨ２ＳＯ４を添加し反応を終了させ、ＯＤ４５０値を測定した。
８．サンプルウェルＯＤ値が対照ウェルＯＤ値の３倍である場合、陽性とみなされ、最終的に１３個の陽性クローン株を取得した。（得られた１３個のナノ抗体のＤＮＡ配列が、それぞれ、配列番号８４－９６である。）
＜実施例５：ナノ抗体の真核表現系における表現、精製＞
（１）前記シーケンシング解析により得られた様々なクローン株のＶＨＨ断片をＰＩＮｆｕｓｅ真核表現ベクターにクローンした。
（２）シーケンシングで正確と確認した後、プラスミドを抽出した。
（３）ＨＥＫ２９３Ｆ懸濁細胞をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ 表現培地に培養し、密度１×１０ｅ６／ｍＬとなるまで、生存率＞９０％である場合、トランスフェクションに用いた。
（４）ＰＥＩ：プラスミドの質量比が３：１となるように、１μｇプラスミド／１ｍＬ ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の割合でトランスフェクションした。
（５）トランスフェクションしてから５－６日目、細胞の上澄み液を回収し、ｐｒｏｔｅｉｎＡ株にて精製して、高純度の抗体タンパク質を取得し、限界濾過カラムにて溶出バッファーをＰＢＳに置換した。（得られた１３個のナノ抗体のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号７１－８３である。）

Claims (21)

  1. Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体であって、フレームワーク領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記相補性決定領域が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３４、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５８、配列番号６３および配列番号６８からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９からなる群より選ばれるいずれか一種であり；並びに
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６５および配列番号７０からなる群より選ばれるいずれか一種である、
    Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体。
  2. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、順次に、フレームワーク領域１（ＦＲ１）、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）およびフレームワーク領域４（ＦＲ４）を含み、
    前記フレームワーク領域１（ＦＲ１）が、配列番号１、配列番号８、配列番号１５、配列番号２２、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４４、配列番号４９、配列番号５４、配列番号６１および配列番号６６からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５、配列番号１２、配列番号１９、配列番号２４、配列番号２９、配列番号３４、配列番号４１、配列番号４６、配列番号５１、配列番号５８、配列番号６３および配列番号６８からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
    前記フレームワーク領域２（ＦＲ２）が、配列番号２、配列番号９、配列番号１６、配列番号３９、配列番号５５からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６、配列番号１３、配列番号２０、配列番号２５、配列番号３０、配列番号３５、配列番号４２、配列番号４７、配列番号５２、配列番号５９、配列番号６４および配列番号６９からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
    前記フレームワーク領域３（ＦＲ３）が、配列番号３、配列番号１０、配列番号１７、配列番号２３、配列番号２８、配列番号３３、配列番号４０、配列番号４５、配列番号５０、配列番号５６、配列番号６２および配列番号６７からなる群より選ばれるいずれか一種であり；
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７、配列番号１４、配列番号２１、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４３、配列番号４８、配列番号５３、配列番号６０、配列番号６５および配列番号７０からなる群より選ばれるいずれか一種であり；および
    前記フレームワーク領域４（ＦＲ４）が、配列番号４、配列番号１１、配列番号１８および配列番号５７からなる群より選ばれるいずれか一種である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  3. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  4. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号１２であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号１３であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号１４である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  5. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号１９であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号２０であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号２１である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  6. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号２４であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号２５であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号２６である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  7. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号２９であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号３０であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号３１である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  8. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号３４であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号３５であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号３６である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  9. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号１２であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号１３であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号３７である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  10. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号４１であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号４２であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号４３である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  11. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号４６であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号４７であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号４８である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  12. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５１であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号５２であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号５３である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  13. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号５８であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号５９であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号６０である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  14. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号６３であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６４であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号６５である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  15. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、相補性決定領域２（ＣＤＲ２）および相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み、
    前記相補性決定領域１（ＣＤＲ１）が、配列番号６８であり、
    前記相補性決定領域２（ＣＤＲ２）が、配列番号６９であり、
    前記相補性決定領域３（ＣＤＲ３）が、配列番号７０である、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  16. 前記Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体が、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２および配列番号８３からなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有する、
    請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体。
  17. 請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体の製造方法であって、
    １）．Ｂ７－Ｈ３分子ナノ抗体ライブラリを構築する工程と；
    ２）．Ｂ７－Ｈ３ナノ抗体をスクリーンする工程と；
    ３）．イムノブロット法にて個別の陽性クローンを検出する工程と；
    ４）．ｐｈａｇｅ Ｅｌｉｓａにて陽性クローンをさらに検証する工程と；
    ５）．真核表現系でＢ７－Ｈ３ナノ抗体を表現・精製する工程と、
    を含む、方法。
  18. 請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体をコードする、ＤＮＡ分子。
  19. 請求項１８に記載のＤＮＡ分子を含む、表現ベクター。
  20. Ｂ７－Ｈ３分子検出試薬の製造における請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体の使用。
  21. Ｂ７－Ｈ３分子過剰表現の悪性腫瘍を治療する医薬の製造のための請求項１に記載のＢ７－Ｈ３ナノ抗体の使用。
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