JP2022551318A - B7-h3ナノ抗体、その製造方法および使用 - Google Patents
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Abstract
Description
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5、配列番号12、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号58、配列番号63および配列番号68からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6、配列番号13、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号42、配列番号47、配列番号52、配列番号59、配列番号64および配列番号69からなる群より選ばれるいずれか一種であり;並びに
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7、配列番号14、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号37、配列番号43、配列番号48、配列番号53、配列番号60、配列番号65および配列番号70からなる群より選ばれるいずれか一種である、B7-H3ナノ抗体を提供する。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5、配列番号12、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号58、配列番号63および配列番号68からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6、配列番号13、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号42、配列番号47、配列番号52、配列番号59、配列番号64および配列番号69からなる群より選ばれるいずれか一種であり;並びに
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7、配列番号14、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号37、配列番号43、配列番号48、配列番号53、配列番号60、配列番号65および配列番号70からなる群より選ばれるいずれか一種である、B7-H3ナノ抗体を提供する。
前記フレームワーク領域1(FR1)が、配列番号1、配列番号8、配列番号15、配列番号22、配列番号27、配列番号32、配列番号38、配列番号44、配列番号49、配列番号54、配列番号61および配列番号66からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5、配列番号12、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号58、配列番号63および配列番号68からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記フレームワーク領域2(FR2)が、配列番号2、配列番号9、配列番号16、配列番号39、配列番号55からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6、配列番号13、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号42、配列番号47、配列番号52、配列番号59、配列番号64および配列番号69からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記フレームワーク領域3(FR3)が、配列番号3、配列番号10、配列番号17、配列番号23、配列番号28、配列番号33、配列番号40、配列番号45、配列番号50、配列番号56、配列番号62および配列番号67からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7、配列番号14、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号37、配列番号43、配列番号48、配列番号53、配列番号60、配列番号65および配列番号70からなる群より選ばれるいずれか一種であり;および
前記フレームワーク領域4(FR4)が、配列番号4、配列番号11、配列番号18および配列番号57からなる群より選ばれるいずれか一種である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号12であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号13であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号14である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号19であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号20であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号21である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号24であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号25であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号26である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号29であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号30であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号31である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号34であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号35であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号36である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号12であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号13であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号37である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号41であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号42であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号43である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号46であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号47であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号48である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号51であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号52であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号53である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号58であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号59であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号60である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号63であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号64であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号65である。
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号68であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号69であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号70である。
配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82および配列番号83からなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有する。
1).B7-H3分子ナノ抗体ライブラリを構築する工程と;
2).B7-H3ナノ抗体をスクリーンする工程と;
3).イムノブロット法にて個別の陽性クローンを検出する工程と;
4).phage Elisaにて陽性クローンをさらに検証する工程と;
5).真核表現系でB7-H3ナノ抗体を表現・精製する工程と、
を含む、方法を提供する。
(1)hu4IgB7-H3抗原分子をタンパク質表現させ、1mg hu4IgB7-H3抗原と完全フロイントアジュバントとを等体積で混合させ、一匹の新疆単峰性ラクダを免疫した。
(2)2周目から、1mg hu4IgB7-H3抗原と不完全フロイントアジュバントとを等体積で混合させ、合計7回免疫し、B細胞を刺激して抗原特異的なナノ抗体を表現させた。
(3)7回免疫が終了した後、100mLラクダの末梢血リンパ球を抽出し、そしてトータルRNAを抽出した。
(4)逆転写でcDNAを取得し、ネストPCRにてVHH断片を増幅した。
(5)kunkel反応を利用して、VHH一本鎖DNAをファージベクターにアニールした。
(6)kunkel生成物を電気形質転換受容性DH10Bに形質転換し、B7-H3ナノ抗体ライブラリを構築し、そしてライブラリ容量を測定し、ライブラリ容量の大きさが1.07×10e9であった。
(1)液相パンニング:
1.最終濃度0.5%caseinブロッキングバッファーで10e12pfu input phageをブロッキングし、室温で1hインキュベートした。
2.同時に100μLストレプトアビジン磁性ビーズを取り、殺菌PBSで三回洗浄し、上澄み液を捨てて、500μL 1%caseinブロッキングバッファーで、室温で1hブロッキングした。
3.工程2でのブロッキング液を捨てて、1mL ブロッキング済みのphageを磁性ビーズに添加し、十分に均一に混合し、回転しながら均一に混合して15min結合した(陰性スクリーニング)。
4.上澄み液を新たな殺菌EPチューブに取り、最終濃度100nM hu4IgB7-H3-biotin抗原を添加し、室温で回転しながら均一に混合して2h結合した。
5.同時に100μL ストレプトアビジン磁性ビーズを取り、殺菌PBSで三回洗浄し、上澄み液を捨てて、500μL 1%caseinブロッキングバッファーで、室温で1hブロッキングした。
6.工程5でのブロッキング液を捨てて、1mL phage-hu hu4IgB7-H3-biotin混合物を磁性ビーズに添加し、十分に均一に混合し、回転しながら均一に混合して15min結合した。
7.上澄み液を捨てて、1×PBSで10回洗浄し、磁性ビーズを回収した。
8.400μL新鮮に調製された溶出バッファー100mM Triethylamineを工程7の磁性ビーズに添加し、回転しながら10min溶出した。
9.400μL上澄み液を殺菌EPチューブに転移し、200μL pH6.4 Tris-HClを添加して中和し、スクリーニングによりoutput phageを取得した。
1.1mL最終濃度100nM hu- hu4IgB7-H3抗原溶液で免疫チューブをコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。
2.二日目、1×PBSでコーティングなしの免疫チューブを3回リンスし、回転乾燥し、4mL 1%caseinブロッキングバッファーを添加し、室温で回転しながら1hブロッキングした。
3.最終濃度1%のBSAで5×10e12 pfuで一回目のinput phageをブロッキングし、1×PBSで1mL最終体積まで補充し、室温で回転しながら1hブロッキングした。
4.抗原コーティングなしの免疫チューブにおけるブロッキング液を捨てて、ブロッキング済みのphageを抗原コーティングなしの免疫チューブに投入し、回転しながら2h結合した(陰性スクリーニング)。
5.同時に抗原コーティングした免疫チューブにおけるコーティング液を捨てて、1×PBSで3回リンスし、回転乾燥し、4mLブロッキングバッファーを添加し室温で回転しながら1hブロッキングした。
6.抗原コーティングした免疫チューブにおけるブロッキング液を捨てて、陰性スクリーニング後のphageを免疫チューブに転移し、回転しながら2h結合した。
7.上澄み液を捨てて、1×PBSTで免疫チューブを10回リンスし、回転乾燥した。
8.1mL新鮮に調製された溶出バッファー 100mM Triethylamineを免疫チューブに添加し、室温でインキュベートを10min静置した。
9.1mL溶出液を殺菌EPチューブに転移し、500μL pH6.4 Tris-HClを添加して中和し、スクリーニングによりoutput phageを取得した。
(1)各LBプレートに2000pfu output phageを接種し、37℃で6-8h培養した;
(2)5mL 2μg/mL anti-M13で抗体コーティングしたWhatman 0.45μm NC膜を、室温で2.5hインキュベートした。
(3)コーティング液を捨てて、5mL 1%caseinブロッキングバッファーでNC膜をブロッキングし、室温で1hインキュベートした。
(4)ブロッキング液を捨てて、1×PBSで3回洗浄し、通風乾燥した。
(5)NC膜をphageが成長したLBプレートに貼り、穴を開けて位置決めをして、室温で一晩培養した。
(6)二日目、膜を開けて新たなシャーレに置き、1×PBSで3回リンスし、100nMのhu4IgB7-H3-biotinを添加して室温で1hインキュベートした。
(7)0.1%PBSTで8回リンスし、1:1000希釈したNeutravidin-APを添加して室温で30minインキュベートした。
(8)0.1%PBSTで8回リンスし、10mL AP発色基質(100μL BCIP+100μL NBT)を添加し、室温で10-30min発色させた。
(9)陽性クローンを選択し、plaque PCRを行い、シーケンシングに用意した。
(10)DNAman配列比較ソフトにて配列を比較し、CDR1、CDR2、CDR3が同じであるクローンを同一クローンとみなされた。
(1)phageの増幅:1:100でXL1blue大腸菌をLB液体培地(10μg/mLテトラサイクリン含有)に接種し、OD60=0.6まで成長させた。Xl1blueを96ウェル深いプレートに分取し、600μL/ウェルで、15μL選択されたphage elutionを添加した。一晩増幅し、4000rpmで30min遠心し、上澄み液を取り、phage Elisaとして用いられることができた。
1.hu4IgB7-H3抗原を1×PBSで100nMまで希釈し、各ウェル50μLでELISAプレートを、4℃で一晩コーティングした。
2.コーティング液を捨てて、ELISAプレートを回転乾燥し、1×PBSで3回リンスした。
3.各ウェルに200μL 1%caseinブロッキングバッファーを添加し、室温で1hブロッキングした。
4.ブロッキング液を捨てて、各ウェルに50μL高力価phageを添加し、室温で2hインキュベートした。
5.0.1%PBSTで6回リンスし、回転乾燥した。
6.1:5000で希釈したヒツジ抗M13-HRP抗体を添加し、50μL/ウェルで、室温で1hインキュベートした。0.1%PBSTで6回リンスし、回転乾燥した。
7.各ウェルに50μL TMB発色液を添加し、室温で5min発色した。50μL 2MのH2SO4を添加し反応を終了させ、OD450値を測定した。
8.サンプルウェルOD値が対照ウェルOD値の3倍である場合、陽性とみなされ、最終的に13個の陽性クローン株を取得した。(得られた13個のナノ抗体のDNA配列が、それぞれ、配列番号84-96である。)
(1)前記シーケンシング解析により得られた様々なクローン株のVHH断片をPINfuse真核表現ベクターにクローンした。
(2)シーケンシングで正確と確認した後、プラスミドを抽出した。
(3)HEK293F懸濁細胞をFreestyle 293 表現培地に培養し、密度1×10e6/mLとなるまで、生存率>90%である場合、トランスフェクションに用いた。
(4)PEI:プラスミドの質量比が3:1となるように、1μgプラスミド/1mL HEK293F細胞の割合でトランスフェクションした。
(5)トランスフェクションしてから5-6日目、細胞の上澄み液を回収し、proteinA株にて精製して、高純度の抗体タンパク質を取得し、限界濾過カラムにて溶出バッファーをPBSに置換した。(得られた13個のナノ抗体のアミノ酸配列が、それぞれ、配列番号71-83である。)
Claims (21)
- B7-H3ナノ抗体であって、フレームワーク領域(FR)および相補性決定領域(CDR)を含み、前記相補性決定領域が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5、配列番号12、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号58、配列番号63および配列番号68からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6、配列番号13、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号42、配列番号47、配列番号52、配列番号59、配列番号64および配列番号69からなる群より選ばれるいずれか一種であり;並びに
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7、配列番号14、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号37、配列番号43、配列番号48、配列番号53、配列番号60、配列番号65および配列番号70からなる群より選ばれるいずれか一種である、
B7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、順次に、フレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CDR1)、フレームワーク領域2(FR2)、相補性決定領域2(CDR2)、フレームワーク領域3(FR3)、相補性決定領域3(CDR3)およびフレームワーク領域4(FR4)を含み、
前記フレームワーク領域1(FR1)が、配列番号1、配列番号8、配列番号15、配列番号22、配列番号27、配列番号32、配列番号38、配列番号44、配列番号49、配列番号54、配列番号61および配列番号66からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5、配列番号12、配列番号19、配列番号24、配列番号29、配列番号34、配列番号41、配列番号46、配列番号51、配列番号58、配列番号63および配列番号68からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記フレームワーク領域2(FR2)が、配列番号2、配列番号9、配列番号16、配列番号39、配列番号55からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6、配列番号13、配列番号20、配列番号25、配列番号30、配列番号35、配列番号42、配列番号47、配列番号52、配列番号59、配列番号64および配列番号69からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記フレームワーク領域3(FR3)が、配列番号3、配列番号10、配列番号17、配列番号23、配列番号28、配列番号33、配列番号40、配列番号45、配列番号50、配列番号56、配列番号62および配列番号67からなる群より選ばれるいずれか一種であり;
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7、配列番号14、配列番号21、配列番号26、配列番号31、配列番号36、配列番号37、配列番号43、配列番号48、配列番号53、配列番号60、配列番号65および配列番号70からなる群より選ばれるいずれか一種であり;および
前記フレームワーク領域4(FR4)が、配列番号4、配列番号11、配列番号18および配列番号57からなる群より選ばれるいずれか一種である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号5であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号6であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号7である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号12であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号13であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号14である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号19であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号20であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号21である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号24であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号25であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号26である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号29であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号30であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号31である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号34であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号35であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号36である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号12であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号13であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号37である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号41であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号42であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号43である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号46であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号47であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号48である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号51であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号52であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号53である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号58であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号59であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号60である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号63であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号64であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号65である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、相補性決定領域1(CDR1)、相補性決定領域2(CDR2)および相補性決定領域3(CDR3)を含み、
前記相補性決定領域1(CDR1)が、配列番号68であり、
前記相補性決定領域2(CDR2)が、配列番号69であり、
前記相補性決定領域3(CDR3)が、配列番号70である、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 前記B7-H3ナノ抗体が、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82および配列番号83からなる群より選ばれるいずれかのアミノ酸配列を有する、
請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体。 - 請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体の製造方法であって、
1).B7-H3分子ナノ抗体ライブラリを構築する工程と;
2).B7-H3ナノ抗体をスクリーンする工程と;
3).イムノブロット法にて個別の陽性クローンを検出する工程と;
4).phage Elisaにて陽性クローンをさらに検証する工程と;
5).真核表現系でB7-H3ナノ抗体を表現・精製する工程と、
を含む、方法。 - 請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体をコードする、DNA分子。
- 請求項18に記載のDNA分子を含む、表現ベクター。
- B7-H3分子検出試薬の製造における請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体の使用。
- B7-H3分子過剰表現の悪性腫瘍を治療する医薬の製造のための請求項1に記載のB7-H3ナノ抗体の使用。
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