WO2021068871A1 - B7-h3纳米抗体、其制备方法及用途 - Google Patents

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determining region
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王春河
陈艺丽
刘鑫圆
罗伟东
刘国键
李欢欢
林以均
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达石药业(广东)有限公司
上海迈石生物技术有限公司
深圳创石生物医药有限公司
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    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
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    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a Nanobody directed against the epitope of the B7-H3 polypeptide molecule, a preparation method of the Nanobody and the use of the Nanobody.
  • B7-H3 (also known as CD276) is a member of the B7 family. Its sequence is similar to the extracellular domain of PD-L1 (B7-H1). It is a phylogenetic conserved protein with multiple biological functions. B7-H3 is a type I transmembrane protein. In mice, its extracellular domain consists of a pair of immunoglobulin variable domains (IgV) and immunoglobulin constant domains (IgC) (2IgB7-H3 sub Type); In humans, two pairs of identical immunoglobulins (4IgB7-H3 subtype) are produced due to exon duplication, and this subtype is expressed in a more common form.
  • IgV immunoglobulin variable domains
  • IgC immunoglobulin constant domains
  • B7-H3 is widely expressed at the mRNA level and can be detected in non-lymphatic organs such as liver, heart, prostate, and lymphoid organs such as spleen and thymus, but protein expression is strictly regulated.
  • B7-H3 is structurally expressed on non-immune resting period fibroblasts, endothelial cells, osteoblasts and amniotic fluid stem cells. After induction, B7-H3 can be expressed on immune cells, especially antigen-presenting cells.
  • Co-cultured with regulatory T cells (Treg), IFN- ⁇ , lipopolysaccharide (LPS) or anti-CD40 in vitro stimulation can induce dendritic cells to express B7-H3 protein.
  • monocytes and monocyte-derived DCs will up-regulate the expression of B7-H3 after LPS stimulation or cytokine-induced differentiation; it can also be detected on NK cells, B cells and a small number of T cells after PMA/Ionomycin stimulation To the B7-H3 protein.
  • B7-H3 is abnormally overexpressed in a variety of malignant tumors, including melanoma, leukemia, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, rectal cancer and other cancers.
  • the high expression of B7-H3 is also related to poor prognosis and poor clinical efficacy.
  • the development of antibody drugs targeting B7-H3 has become a promising tumor treatment strategy.
  • Nanobody technology is a revolution in antibody engineering carried out by biomedical scientists on the basis of traditional antibodies, using molecular biology technology and the concept of nanoparticle science to develop the latest and smallest antibody molecules. It was originally developed by Belgian scientist Hamers, R Found in camel blood. Common antibody proteins are composed of two heavy chains and two light chains. However, new antibodies found in camel blood only have two heavy chains. These "heavy chain antibodies” can bind to targets such as antigens as tightly as normal antibodies, but not Like single-chain antibodies, they adhere to each other and aggregate into pieces.
  • Nanobodies based on the "heavy chain antibody” are not only 1/10 of the molecular weight of ordinary antibodies, but also have more flexible chemical properties, good stability, high solubility, easy expression, high tumor tissue penetration, and easy coupling Other molecules. Therefore, the application of Nanobody technology to develop B7-H3 therapeutic antibodies has broad prospects.
  • the present invention provides a B7-H3 Nanobody, which includes a framework region (FR) and a complementarity determining region (CDR), the complementarity determining region comprising complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), of which,
  • the complementarity determining region 1 is selected from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID Any one of NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 63, and SEQ ID NO: 68;
  • the complementarity determining region 2 is selected from SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID Any one of NO: 42, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 69; and
  • the complementarity determining region 3 is selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID Any one of NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 70.
  • the B7-H3 Nanobody in turn comprises the following regions: framework region 1 (FR1), complementarity determining region 1 (CDR1), framework region 2 (FR2), complementarity determining region 2 (CDR2), framework region 3 (FR3), complementarity determining region 3 (CDR3) and framework region 4 (FR4), of which,
  • the framework region 1 is selected from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO : 38, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 61, and SEQ ID NO: 66;
  • the complementarity determining region 1 is selected from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 34, SEQ ID Any one of NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 63, and SEQ ID NO: 68;
  • the framework region 2 is any one selected from SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 55;
  • the complementarity determining region 2 is selected from SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 35, SEQ ID Any one of NO: 42, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 64, and SEQ ID NO: 69;
  • the framework region 3 is selected from SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO : 40, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 62, and SEQ ID NO: 67;
  • the complementarity determining region 3 is selected from SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 36, SEQ ID Any one of NO: 37, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 65, and SEQ ID NO: 70; and
  • the framework region 4 is any one selected from SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 57.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 (CDR1) is SEQ ID NO: 5,
  • CDR2 complementarity determining region 2
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 7.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 (CDR1) is SEQ ID NO: 12,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 13,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 14.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 19,
  • CDR2 complementarity determining region 2
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO:21.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 24,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 25,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 26.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 29,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 30,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 31.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 34,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 35,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 36.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 (CDR1) is SEQ ID NO: 12,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 13,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 37.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 41,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 42,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 43.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 46,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 47,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 48.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 51,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 52,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO:53.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 58,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 59,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 60.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 63,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 64,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 65.
  • the B7-H3 Nanobody comprises complementarity determining region 1 (CDR1), complementarity determining region 2 (CDR2) and complementarity determining region 3 (CDR3), wherein,
  • the complementarity determining region 1 is SEQ ID NO: 68,
  • the complementarity determining region 2 (CDR2) is SEQ ID NO: 69,
  • the complementarity determining region 3 (CDR3) is SEQ ID NO: 70.
  • the B7-H3 Nanobody has an amino acid sequence selected from any one of the following:
  • the present invention provides a method for preparing the aforementioned B7-H3 Nanobody, which includes the following steps:
  • the present invention provides a DNA molecule encoding the above-mentioned B7-H3 Nanobody.
  • the present invention provides an expression vector comprising the above-mentioned DNA molecule.
  • the present invention provides the use of the above-mentioned B7-H3 Nanobody in the preparation of B7-H3 molecular detection reagents.
  • the present invention provides the use of the above-mentioned B7-H3 Nanobody in the preparation of a medicament for treating malignant tumors with high expression of B7-H3 molecules.
  • the B7-H3 Nanobody of the present invention can specifically bind to B7-H3, sensitively detect B7-H3 molecules, and is expected to be used as a therapeutic antibody for the treatment of various malignant tumors with high expression of B7-H3 molecules.
  • Fig. 1 is the output phage immunoblotting diagram in Example 3.
  • Figure 2 is the result of further verification of positive clones with phage Elisa in Example 4.
  • Figure 3 is an SDS-PAGE chart of the purification of 1-13# Nanobody in Example 5.
  • Complete/incomplete Freund's adjuvant (sigma, F5506), streptavidin magnetic beads (invitrogen, 65002), casein (Thermo, 37528), PROTRAN BA 85 (Whatman, 10401116), ELISA plate (greiner, 650061) ), goat anti-M13HRP (GE, 279421).
  • the protein expresses the hu4IgB7-H3 antigen molecule.
  • the kunkel product was transformed into electrotransformation competent DH10B, and the B7-H3 Nanobody library was constructed and the storage capacity was determined.
  • the storage capacity was 1.07 ⁇ 10e9.
  • step 3 Discard the blocking solution in step 2, add 1ml of the blocked phage to the magnetic beads, mix well, rotate and mix and combine for 15 minutes; (negative screening)
  • step 5 Discard the blocking solution in step 5, add 1ml phage-hu hu4IgB7-H3-biotin mixture to the magnetic beads, mix well, rotate and mix for 15 minutes;
  • Example 3 Detection of a single positive clone by Western blotting (Mccafferty J, Griffiths AD, Winter G, et al. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains[J].Nature,1990,348(6301):552- 554.Huse W,Sastry L,Iverson S,et al. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda[J].Biotechnology,1989,246(4935):1275-1281.)
  • Example 4 Use phage Elisa to further verify positive clones
  • Example 5 Expression and purification of Nanobody in eukaryotic expression system
  • the mass ratio of PEI:plasmid is 3:1, transfected according to the ratio of 1 ⁇ g plasmid/1ml HEK293F cells;

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Abstract

提供了一种B7-H3纳米抗体、其制备方法及用途。该纳米抗体包括框架区1-4 (FR1-4)和互补决定区1-3 (CDR1-3)，能特异性地与B7-H3结合，可用于检测B7-H3分子以及各种B7-H3分子异常表达的恶性肿瘤的治疗。

Description

B7-H3纳米抗体、其制备方法及用途 技术领域
本发明涉及针对于B7-H3多肽分子抗原表位的纳米抗体，该纳米抗体的制备方法以及该纳米抗体的用途。
背景技术
B7-H3(又称CD276)是B7家族成员，其序列与PD-L1(B7-H1)胞外区域相似，是一种具有多种生物学功能的系统发育保守蛋白。B7-H3是一种I型跨膜蛋白，在小鼠中其胞外结构域由一对免疫球蛋白可变结构域(IgV)和免疫球蛋白恒定结构域(IgC)组成(2IgB7-H3亚型)；在人体中则因外显子复制而产生了两对完全相同的免疫球蛋白(4IgB7-H3亚型)，该亚型为更常见的形式表达。B7-H3在mRNA水平上表达较为广泛，在非淋巴器官如肝脏、心脏、前列腺以及淋巴器官如脾脏和胸腺中都能够检测到，但蛋白表达受到严格的调控。B7-H3结构性表达在非免疫静息期成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞和羊水干细胞上。经诱导B7-H3能够表达在免疫细胞特别是抗原呈递细胞上。和调节性T细胞(Treg)共培养，IFN-γ、脂多糖(LPS)或anti-CD40体外刺激都能够诱导树突状细胞表达B7-H3蛋白。此外，单核细胞和单核细胞来源的DCs分别在LPS刺激或细胞因子诱导分化后会上调B7-H3表达水平；经PMA/Ionomycin刺激后在NK细胞、B细胞和少量T细胞上也可以检测到B7-H3蛋白。与在正常细胞中严格的调控不同，B7-H3在多种恶性肿瘤，包括黑素瘤、白血病、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌等癌症中呈现异常过表达。B7-H3的高表达也与预后不良和临床疗效差有关，开发靶向B7-H3的抗体药物成为一种有前景的肿瘤治疗策略。
纳米抗体技术，是生物医学科学家在传统抗体的基础上，运用分子生物学技术结合纳米粒子科学的概念进行的抗体工程革命，从而研发出的最新和最小的抗体分子，最初由比利时科学家Hamers,R在骆驼血液中发现。普通抗体蛋白由两条重链和两条轻链组成，而从骆驼血液中发现新型抗体只有两条重链，这些“重链抗体”能像正常抗体一样与抗原等靶标紧紧结合，但不像单链抗体那样相互黏连聚集成块。以该“重链抗体”为基础的纳米抗体不仅 分子量只是普通抗体的1/10，而且化学性质也更加灵活，稳定性好，可溶性高，表达容易，肿瘤组织穿透性高，且容易偶联其它分子。因此应用纳米抗体技术研发B7-H3的治疗性抗体具有广阔的前景。
发明内容
鉴于以上问题，一方面，本发明提供一种B7-H3纳米抗体，其包括框架区(FR)和互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:68中的任一种；
所述互补决定区2(CDR2)为选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:69中的任一种；以及
所述互补决定区3(CDR3)为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:70中的任一种。
在具体实施方式中，所述B7-H3纳米抗体依次包含以下区域：框架区1(FR1)、互补决定区1(CDR1)、框架区2(FR2)、互补决定区2(CDR2)、框架区3(FR3)、互补决定区3(CDR3)和框架区4(FR4)，其中，
所述框架区1(FR1)为选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:66中的任一种；
所述互补决定区1(CDR1)为选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:68中的任一种；
所述框架区2(FR2)为选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55中的任一种；
所述互补决定区2(CDR2)为选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:69中的任一种；
所述框架区3(FR3)选自为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:67中的任一种；
所述互补决定区3(CDR3)为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:70中的任一种；和
所述框架区4(FR4)为选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:57中的任一种。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:5，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:6，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:7。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:12，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:13，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:14。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:19，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:20，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:21。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:24，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:25，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:26。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:29，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:30，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:31。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:34，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:35，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:36。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:12，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:13，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:37。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:41，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:42，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:43。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:46，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:47，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:48。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:51，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:52，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:53。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:58，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:59，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:60。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:63，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:64，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:65。
在一个具体实例中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:68，
所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:69，
所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:70。
在具体实施方式中，所述B7-H3纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：
SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83。
另一方面，本发明提供一种制备前述B7-H3纳米抗体的方法，包括以下步骤：
1).构建B7-H3分子纳米抗体文库；
2).筛选B7-H3纳米抗体；
3).用免疫印迹法检测单个阳性克隆；
4).用phage Elisa对阳性克隆进一步验证；以及
5).在真核表达系统中表达纯化B7-H3纳米抗体。
再一方面，本发明提供了一种DNA分子，其编码上述B7-H3纳米抗体。
再一方面，本发明提供了一种表达载体，其包含上述DNA分子。
又一方面，本发明提供了上述B7-H3纳米抗体在制备B7-H3分子检测试剂中的用途。
又一方面，本发明提供了上述B7-H3纳米抗体在制备用于治疗B7-H3分子高表达的恶性肿瘤的药物中的用途。
本发明的效果
本发明的B7-H3纳米抗体可以特异性地与B7-H3结合，灵敏地检测B7-H3分子，并有望作为治疗性抗体用于各种B7-H3分子高表达的恶性肿瘤的治疗。
附图说明
图1为实施例3中的Output phage免疫印迹图。
图2为实施例4中用phage Elisa对阳性克隆进一步验证的结果。
图3为实施例5中1-13#纳米抗体纯化的SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下通过具体实施例来描述本申请的纳米抗体的具体制备过程，然而本领域的技术人员应当了解，本申请的范围不应受这些实施例的限制，而是包含本领域的技术人员可以做出的各种等同变换形式。
完全/不完全弗氏佐剂(sigma,F5506),链霉亲和素磁珠(invitrogen,65002),casein(Thermo,37528),PROTRAN BA 85(Whatman,10401116),酶标板(greiner,650061),羊抗M13HRP(GE,279421)。
实施例1：针对B7-H3分子纳米抗体文库的构建
(1)蛋白表达hu4IgB7-H3抗原分子，将1mg hu4IgB7-H3抗原与完全弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼；
(2)第二周开始，将1mg hu4IgB7-H3抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
(3)7次免疫结束后，提取100ml骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；
(4)反转录获得cDNA并用巢式PCR扩增VHH片段；
(5)利用kunkel反应将VHH单链DNA退火到噬菌体载体中；
(6)将kunkel产物转化至电转化感受态DH10B中，构建B7-H3纳米抗体文库并测定库容，库容大小为1.07×10e9。
实施例2：针对B7-H3纳米抗体的筛选过程
(1)液相淘选：
1.用终浓度0.5％casein封闭缓冲液封闭10e12pfu input phage，室温孵育1h；
2.同时取100μl链霉亲和素磁珠用无菌PBS洗三次，弃上清，用500μl 1％casein封闭缓冲液室温封闭1h；
3.弃掉步骤2中的封闭液，将1ml封闭好的phage加至磁珠中，充分混匀，旋转混匀结合15min；(阴性筛选)
4.取上清至新的无菌EP管中，加入终浓度为100nM hu4IgB7-H3-biotin抗原，室温旋转混匀结合2h；
5.同时取100μl链霉亲和素磁珠用无菌PBS洗三次，弃上清，用500μl 1％casein封闭缓冲液室温封闭1h；
6.弃掉步骤5中的封闭液，将1ml phage-hu hu4IgB7-H3-biotin混合物加至磁珠中，充分混匀，旋转混匀结合15min；
7.弃上清，用1×PBS洗10次，收集磁珠；
8.将400μl新鲜配置的洗脱缓冲液100mM Triethylamine加到步骤7的磁珠中，旋转洗脱10min；
9.将400μl上清转移至无菌EP管中，加入200μl pH6.4 Tris-HCl中和，筛选获得output phage。
(2)固相淘选：
1.用1ml终浓度为100nM hu-hu4IgB7-H3抗原溶液包被免疫管，4℃孵育过夜；
2.第二天，用1×PBS冲洗未包被的免疫管3次，甩干，加4ml 1％casein封闭缓冲液室温旋转封闭1h；
3.用终浓度1％的BSA封闭5×10e12pfu第一轮input phage，用1×PBS补充到1ml终体积，室温旋转封闭1h；
4.弃去未包被抗原的免疫管中的封闭液，将封闭好的phage投入未包被抗原的免疫管中，旋转结合2h(阴性筛选)；
5.同时弃去包被抗原的免疫管中的包被液，用1×PBS冲洗3次，甩干，加4ml封闭缓冲液室温旋转封闭1h；
6.弃去包被抗原的免疫管中的封闭液，将阴性筛选后的phage转移到免疫管中，旋转结合2h；
7.弃去上清，用1×PBST冲洗免疫管10次，甩干；
8.将1ml新鲜配置的洗脱缓冲液100mM Triethylamine加到免疫管中，室温静置孵育10min；
9.将1ml洗脱液转移至无菌EP管中，加入500μl pH6.4 Tris-HCl中和，筛选获得output phage。
实施例3：用免疫印迹法检测单个阳性克隆(Mccafferty J,Griffiths A D,Winter G,et al.Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains[J].Nature,1990,348(6301):552-554.Huse W,Sastry L,Iverson S,et al.Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda[J].Biotechnology,1989,246(4935):1275-1281.)
(1)每块LB平板铺2000pfu output phage，37℃培养6-8h；
(2)用5ml 2μg/ml anti-M13抗体包被Whatman 0.45μm NC膜，室温孵育2.5h；
(3)弃去包被液，用5ml 1％casein封闭缓冲液封闭NC膜，室温孵育1h；
(4)弃去封闭液，用1×PBS洗3次，晾干；
(5)将NC膜贴于长有phage的LB平板上，打孔定位，室温培养过夜；
(6)第二天揭膜置于新的培养皿中，1×PBS冲洗3次，加入100nM的hu4IgB7-H3-biotin室温孵育1h；
(7)0.1％PBST冲洗8次，加入1:1000稀释的Neutravidin-AP室温孵育30min；
(8)0.1％PBST冲洗8次，加入10ml AP显色底物(100μl BCIP+100μl NBT),室温显色10-30min；
(9)将阳性克隆挑取出来，做plaque PCR，待测序；
(10)通过DNAman序列比对软件比对序列，将CDR1、CDR2、CDR3相同的克隆视为同一克隆。
实施例4：用phage Elisa对阳性克隆进一步验证
(1)phage的扩增：1:100接种XL1blue大肠杆菌于LB液体培养基中(含10μg/ml四环素)，长至OD60＝0.6；将Xl1blue分装到96孔深孔板中，600μl/孔，加入15μl挑取的phage elution；过夜扩增，4000rpm离心30min，取上清，即可用来做phage Elisa；
(2)Elisa检测：
1.将hu4IgB7-H3抗原用1×PBS稀释至100nM,按每孔50μl包被ELISA板，4℃过夜；
2.弃去包被液，甩干ELISA板，用1×PBS冲洗3次；
3.每孔加入200μl1％casein封闭缓冲液,室温封闭1h；
4.弃去封闭液，在每孔中加入50μl高滴度phage，室温孵育2h；
5.用0.1％PBST冲洗6次，甩干；
6.加入1:5000稀释的羊抗M13-HRP抗体，50μl/孔，室温孵育1h。用0.1％PBST冲洗6次，甩干；
7.每孔加入50μlTMB显色液，室温显色5min。加入50μl 2M的H 2SO 4终止反应，测OD450值；
8.当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍视为阳性，最终得到13个阳性克隆株。(所得到的13个纳米抗体的DNA序列分别为SEQ ID No.:84-96。)
实施例5：纳米抗体在真核表达系统中的表达、纯化
(1)将前面测序分析获得不同克隆株的VHH片段克隆到PINfuse真核表达载体中；
(2)测序正确后，提取质粒；
(3)将HEK293F悬浮细胞培养在Freestyle 293表达培养基中，密度达到1×10e6/ml,成活率＞90％时，用于转染；
(4)PEI:质粒的质量比为3:1，按照1μg质粒/1ml HEK293F细胞的比例转染；
(5)转染后5-6天，收集细胞上清，用proteinA株纯化获得高纯度的抗体蛋白，并用超滤柱将洗脱缓冲液置换成PBS。(所得到的13个纳米抗体的氨基酸序列分别为SEQ ID No.:71-83。)

Claims (21)

  1. 一种B7-H3纳米抗体，其包括框架区(FR)和互补决定区(CDR)，所述互补决定区包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:68中的任一种；
    所述互补决定区2(CDR2)为选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:69中的任一种；以及
    所述互补决定区3(CDR3)为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:70中的任一种。
  2. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体依次包含以下区域：框架区1(FR1)、互补决定区1(CDR1)、框架区2(FR2)、互补决定区2(CDR2)、框架区3(FR3)、互补决定区3(CDR3)和框架区4(FR4)，其中，
    所述框架区1(FR1)为选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:66中的任一种；
    所述互补决定区1(CDR1)为选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:68中的任一种；
    所述框架区2(FR2)为选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55中的任一种；
    所述互补决定区2(CDR2)为选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:69中的任一种；
    所述框架区3(FR3)选自为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62和SEQ ID NO:67中的任一种；
    所述互补决定区3(CDR3)为选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:70中的任一种；和
    所述框架区4(FR4)为选自SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:57中的任一种。
  3. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:5，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:6，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:7。
  4. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:12，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:13，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:14。
  5. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:19，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:20，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:21。
  6. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:24，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:25，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:26。
  7. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:29，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:30，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:31。
  8. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:34，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:35，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:36。
  9. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:12，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:13，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:37。
  10. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:41，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:42，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:43。
  11. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:46，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:47，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:48。
  12. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:51，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:52，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:53。
  13. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:58，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:59，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:60。
  14. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:63，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:64，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:65。
  15. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中，
    所述互补决定区1(CDR1)为SEQ ID NO:68，
    所述互补决定区2(CDR2)为SEQ ID NO:69，
    所述互补决定区3(CDR3)为SEQ ID NO:70。
  16. 根据权利要求1所述的B7-H3纳米抗体，其中，所述B7-H3纳米抗体具有选自以下任一种的氨基酸序列：
    SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:83。
  17. 一种制备如权利要求1所述的B7-H3纳米抗体的方法，包括以下步骤：
    1).构建B7-H3分子纳米抗体文库；
    2).筛选B7-H3纳米抗体；
    3).用免疫印迹法检测单个阳性克隆；
    4).用phage Elisa对阳性克隆进一步验证；以及
    5).在真核表达系统中表达纯化B7-H3纳米抗体。
  18. 一种DNA分子，其编码如权利要求1所述的B7-H3纳米抗体。
  19. 一种表达载体，其包含如权利要求18所述的DNA分子。
  20. 如权利要求1所述的B7-H3纳米抗体在制备B7-H3分子检测试剂中的用途。
  21. 如权利要求1所述的B7-H3纳米抗体在制备用于治疗B7-H3分子高表达的恶性肿瘤的药物中的用途。
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