JP2019510507A - 合成抗体ライブラリーを作製する方法、前記ライブラリー、及びその適用 - Google Patents
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Abstract
Description
る。
・前記CDRの長さが4アミノ酸である場合、位置2におけるアミノ酸アスパラギン酸の頻度が約20%であり;
・前記CDRの長さが5から17アミノ酸までの範囲である場合、最後の位置におけるアミノ酸アスパラギン酸の頻度が約40%から約80%までの範囲であり、若しくは最後から2番目の位置におけるアミノ酸チロシンの頻度が約40%から約65%までの範囲であり;又は
・前記CDRの長さが18から23アミノ酸までの範囲である場合、最後の位置におけるアミノ酸バリンの頻度が約20%から約67%までの範囲であり、若しくは最後の位置におけるアミノ酸イソロイシンの頻度が約17%から約24%までの範囲である、
合成ライブラリーに関する。
・前記CDRの長さが4アミノ酸である場合、位置1及び3におけるアミノ酸グリシンの頻度が約16から36%の範囲であり;
・前記CDRの長さが5アミノ酸である場合、最初の3個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約20から38%の範囲であり;
・前記CDRの長さが6アミノ酸である場合、最初の4個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約11から35%の範囲であり;
・前記CDRの長さが7アミノ酸である場合、最初の4個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約12から38%の範囲であり;
・前記CDRの長さが8アミノ酸である場合、最初の5個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約14から34%の範囲であり;
・前記CDRの長さが9アミノ酸である場合、最初の6個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約12から43%の範囲であり;
・前記CDRの長さが10アミノ酸である場合、最初の7個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約14から30%の範囲であり;
・前記CDRの長さが11アミノ酸である場合、最初の8個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約14から28%の範囲であり;
・前記CDRの長さが12アミノ酸である場合、最初の9個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約15から28%の範囲であり;
・前記CDRの長さが13アミノ酸である場合、最初の10個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約13から26%の範囲であり;
・前記CDRの長さが14アミノ酸である場合、最初の11個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約8から26%の範囲であり;
・前記CDRの長さが15アミノ酸である場合、最初の12個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約8から30%の範囲であり;
・前記CDRの長さが16アミノ酸である場合、最初の13個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から35%の範囲であり;
・前記CDRの長さが17アミノ酸である場合、最初の14個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から36%の範囲であり;
・前記CDRの長さが18アミノ酸である場合、最初の15個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から30%の範囲であり;
・前記CDRの長さが19アミノ酸である場合、最初の16個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から45%の範囲であり;
・前記CDRの長さが20アミノ酸である場合、最初の17個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約3から44%の範囲であり;
・前記CDRの長さが21アミノ酸である場合、最初の18個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約2から44%の範囲であり;
・前記CDRの長さが22アミノ酸である場合、最初の19個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約3から58%の範囲であり;又は
・前記CDRの長さが23アミノ酸である場合、最初の20個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約0.5から58%の範囲である。
前記CDRの長さが4である場合、
a.位置1及び2におけるアミノ酸アスパラギン酸の頻度が、それぞれ、約10%及び約20%であり;
b.位置1〜3におけるアミノ酸プロリンの頻度が約0.05%から約0.15%まで様々であり、位置4においては約15%であり;
c.位置1におけるアミノ酸アルギニンの頻度が約5%であり、位置2、3、及び4においては約18%から約20%まで様々であり、
前記CDRの長さが5である場合、
a. 位置1、2、3、4、及び5におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約3%、0.05%、20%、0.1%、及び6%であり;
b. 位置1、2、3、4、及び5におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6%、18%、0.2%、0.1%、及び0.05%であり、
前記CDRの長さが6である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約3.00%、0.15%、2%、25%、0.05%、及び3.5%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約3.43%、5.61%、0.09%、0.06%、7.79%、及び0.08%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.05%、7.78%、7.48%、4.37%、4.53%、及び1.77%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸セリンの頻度が、それぞれ、約1.76%、9.44%、8.13%、8.93%、0.26%、及び1.43%であり、
前記CDRの長さが7である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、及び7 におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約3.65%、0.18%、0.08%、3.09%、43.63%、0.15%、及び3.01%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、及び7 におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約3.33%、7.19%、12.74%、1.11%、0.21%、0.09%、及び3.34%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、及び7におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.09%、4.68%、0.23%、2.74%、3.95%、0.06%、及び3.53%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、及び7におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6.98%、15.99%、3.98%、4.13%、1.00%、1.16%、及び0.67%であり、
前記CDRの長さが8である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約4.56%、6.02%、2.69%、4.00%、1.82%、35.24%、0.98%、及び2.61%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約3.17%、3.28%、3.30%、5.44%、2.19%、2.99%、0.93%、及び4.74%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.05%、6.05%、3.76%、1.04%、3.79%、1.47%、0.68%、及び4.64%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6.24%、5.58%、8.88%、8.36%、5.24%、0.10%、0.88%、及び3.18%であり、
前記CDRの長さが9である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.96%、1.92%、2.31%、2.13%、2.36%、2.05%、44.15%、0.86%、及び2.59%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.68%、2.83%、3.24%、3.36%、3.13%、3.94%、1.12%、0.93%、及び4.74%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.98%、3.49%、3.57%、3.96%、3.79%、9.19%、3.71%、1.06%、及び5.26%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約4.93%、9.19%、9.45%、9.10%、9.50%、3.21%、0.07%、0.83%、及び3.97%であり、
前記CDRの長さが10である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.12%、2.44%、2.27%、2.49%、2.18%、2.78%、2.64%、55.93%、0.56%、及び2.32%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.66%、2.95%、3.25%、3.15%、3.22%、3.10%、1.22%、1.35%、0.91%、及び4.76%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.42%、3.12%、3.57%、2.78%、3.00%、2.81%、4.00%、1.22%、0.78%、及び4.08%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.28%、9.13%、9.97%、9.70%、10.04%、9.91%、4.20%、0.07%、1.12%、及び3.81%であり、
前記CDRの長さが11である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.10%、2.30%、2.51%、2.24%、2.47%、2.43%、2.24%、2.10%、54.27%、0.58%、及び2.76%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.68%、2.74%、2.98%、3.40%、2.98%、3.33%、3.54%、4.20%、0.97%、1.26%、及び4.40%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.61%、3.72%、2.90%、3.27%、3.07%、2.90%、2.98%、5.78%、3.05%、0.99%、及び4.22%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.62%、9.57%、10.06%、10.35%、9.61%、9.14%、10.00%、2.18%、0.00%、1.11%、及び4.14%であり、
前記CDRの長さが12である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.06%、2.42%、2.08%、2.44%、1.88%、2.46%、2.59%、2.34%、2.17%、52.70%、0.65%、及び2.49%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.59%、3.31%、3.58%、3.12%、3.24%、3.27%、3.62%、6.42%、1.28%、0.89%、1.14%、及び4.65%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.62%、3.52%、3.50%、3.43%、3.64%、2.72%、3.35%、4.82%、6.23%、3.16%、0.82%、及び3.96%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.18%、10.28%、10.15%、10.64%、10.28%、10.11%、10.11%、5.52%、2.88%、0.00%、0.80%、及び3.50%であり、
前記CDRの長さが13である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.02%、2.09%、2.13%、2.28%、2.44%、2.32%、2.49%、2.40%、4.51%、4.85%、54.39%、0.86%、及び2.65%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.61%、3.28%、3.34%、3.07%、3.47%、3.22%、3.32%、3.34%、9.54%、2.13%、0.94%、1.11%、及び4.16%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.86%、3.70%、3.49%、3.53%、3.07%、3.07%、3.24%、3.24%、1.98%、4.26%、2.61%、0.75%、及び3.38%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.85%、9.77%、9.46%、9.38%、9.86%、9.94%、9.90%、9.54%、5.14%、1.34%、0.00%、0.81%、及び3.13%であり、
前記CDRの長さが14である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.00%、2.48%、2.33%、2.42%、2.37%、3.01%、2.42%、2.22%、2.79%、4.02%、4.09%、54.77%、0.70%、及び1.96%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.46%、3.49%、3.56%、3.41%、3.23%、3.58%、3.27%、3.25%、3.19%、2.04%、2.37%、0.92%、1.54%、2.94%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.82%、3.58%、3.41%、3.10%、2.86%、3.45%、2.50%、3.05%、2.53%、7.32%、5.36%、3.05%、0.81%、及び0.26%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.78%、9.69%、8.94%、9.53%、10.04%、9.89%、9.82%、10.26%、10.22%、10.26%、1.82%、0.00%、0.90%、及び1.14%であり、
前記CDRの長さが15である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.07%、2.02%、2.25%、2.29%、2.82%、2.43%、2.38%、2.32%、3.74%、3.23%、4.03%、4.38%、54.81%、0.80%、及び2.29%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.80%、3.32%、2.91%、2.98%、3.42%、3.46%、2.89%、3.44%、1.93%、2.34%、2.73%、2.77%、0.78%、1.33%、及び2.54%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.65%、3.44%、3.62%、3.58%、3.09%、3.12%、2.66%、2.61%、7.66%、6.92%、7.40%、3.12%、2.43%、0.69%、及び0.23%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.96%、10.13%、9.26%、9.58%、10.32%、10.09%、9.01%、9.67%、11.10%、10.45%、9.67%、3.42%、0.00%、0.83%、及び0.85%であり、
前記CDRの長さが16である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.12%、1.57%、1.75%、2.62%、2.85%、2.50%、2.85%、2.21%、2.97%、2.74%、3.38%、3.38%、2.39%、50.47%、1.22%、及び2.91%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.87%、2.33%、3.03%、2.85%、3.67%、2.56%、3.32%、2.74%、2.68%、1.98%、2.39%、2.27%、0.17%、0.64%、0.81%、及び2.79%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.44%、16.94%、3.61%、6.00%、3.61%、3.61%、3.73%、3.38%、7.51%、10.30%、11.76%、8.21%、4.95%、2.56%、0.81%、及び1.34%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6.40%、9.72%、8.91%、9.84%、10.01%、9.14%、9.66%、9.49%、8.21%、9.60%、8.15%、8.96%、0.58%、0.00%、1.34%、及び0.99%であり、
前記CDRの長さが17である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.06%、1.37%、2.47%、2.96%、2.91%、2.01%、2.85%、2.44%、3.05%、2.59%、3.31%、3.37%、2.59%、0.64%、37.93%、0.70%、及び3.31%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.64%、4.56%、3.14%、2.47%、3.69%、3.25%、3.11%、3.84%、3.55%、2.27%、1.95%、1.74%、2.35%、1.71%、0.00%、1.28%、1.39%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.79%、7.29%、3.31%、10.52%、2.44%、4.50%、3.89%、4.53%、3.95%、9.79%、9.82%、10.20%、10.32%、2.32%、1.63%、1.25%、及び7.90%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.81%、14.44%、9.97%、8.95%、8.78%、9.47%、8.37%、9.47%、9.33%、9.82%、10.29%、9.76%、9.85%、1.31%、0.00%、1.16%、及び1.02%であり、
前記CDRの長さが18である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.05%、1.37%、2.07%、2.43%、3.39%、2.28%、2.73%、3.39%、2.83%、2.53%、3.59%、3.19%、3.14%、3.14%、0.56%、37.96%、1.11%、及び3.39%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.66%、2.78%、2.83%、1.52%、2.33%、3.64%、3.90%、2.73%、3.64%、4.25%、2.02%、2.53%、2.63%、2.94%、0.51%、0.05%、1.32%、及び1.42%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.02%、4.35%、3.64%、11.69%、11.03%、3.29%、4.61%、3.54%、5.31%、4.55%、11.39%、8.76%、10.17%、8.76%、5.11%、2.13%、0.91%、及び9.67%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.97%、9.77%、9.01%、9.56%、8.50%、8.96%、9.36%、9.11%、10.98%、9.46%、10.58%、8.96%、9.36%、8.25%、2.23%、0.05%、0.76%、及び0.86%であり、
前記CDRの長さが19である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.17%、0.81%、2.20%、3.08%、2.84%、3.28%、6.30%、8.97%、2.40%、3.08%、3.39%、3.73%、3.45%、1.19%、4.20%、0.44%、40.09%、1.02%、及び3.49%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.98%、1.69%、2.88%、2.84%、2.64%、1.76%、4.03%、2.57%、4.30%、3.12%、2.47%、2.10%、2.64%、11.45%、7.31%、0.03%、0.00%、1.46%、及び1.19%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.54%、10.26%、3.66%、11.62%、9.82%、9.92%、0.44%、4.03%、4.27%、5.25%、9.85%、9.99%、8.84%、2.44%、3.05%、2.78%、1.42%、0.81%、及び9.72%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.38%、12.09%、7.92%、9.04%、9.21%、8.53%、0.61%、1.76%、9.18%、8.91%、10.19%、8.77%、9.11%、3.93%、0.54%、1.08%、0.00%、0.95%、及び1.05%であり、
前記CDRの長さが20である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸グルタミン酸の頻度が、それぞれ、約15.56%、4.65%、3.96%、7.86%、4.75%、2.14%、0.82%、3.96%、4.59%、3.99%、5.19%、4.71%、5.03%、0.31%、3.99%、0.06%、0.06%、0.00%、2.39%、及び0.00%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.66%、2.67%、3.17%、1.13%、2.01%、0.31%、3.52%、3.49%、3.36%、3.21%、2.36%、2.64%、2.42%、4.34%、4.09%、3.96%、1.16%、0.09%、1.45%、及び1.07%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.39%、3.49%、3.61%、3.11%、11.44%、1.76%、1.38%、4.37%、3.71%、5.00%、10.09%、9.90%、9.90%、6.38%、4.87%、6.44%、0.31%、1.19%、0.91%、及び9.55%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.41%、8.67%、9.71%、4.87%、9.37%、1.98%、3.49%、8.74%、9.21%、8.89%、8.96%、9.87%、10.47%、4.43%、1.67%、4.09%、2.83%、0.00%、0.97%、及び1.26%であり、
前記CDRの長さが21である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.00%、2.07%、0.28%、2.93%、2.31%、5.82%、6.92%、7.44%、7.10%、7.13%、7.20%、11.47%、0.59%、0.65%、4.34%、6.17%、2.20%、0.17%、35.45%、2.17%、及び2.58%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.65%、0.14%、4.17%、2.79%、3.44%、1.52%、1.31%、0.93%、1.17%、1.38%、1.76%、2.89%、6.48%、0.41%、4.20%、0.24%、4.51%、0.34%、0.00%、1.03%、及び2.17%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.20%、9.06%、4.48%、4.24%、4.13%、2.86%、2.55%、2.24%、3.10%、3.38%、3.31%、18.05%、6.44%、8.54%、2.79%、2.89%、8.27%、1.10%、1.83%、1.55%、及び8.23%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.99%、3.82%、8.96%、9.20%、9.20%、4.27%、4.13%、4.68%、4.99%、4.62%、4.00%、10.27%、6.30%、9.68%、5.99%、1.79%、3.41%、1.72%、0.24%、1.00%、及び0.03%であり、
前記CDRの長さが22である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.04%、5.37%、3.13%、6.33%、3.67%、0.27%、6.95%、6.49%、7.34%、3.79%、3.28%、3.79%、5.99%、7.34%、0.19%、0.27%、0.19%、0.31%、3.24%、36.27%、0.85%、及び9.35%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.50%、0.00%、4.21%、0.19%、4.17%、4.21%、1.04%、1.43%、1.51%、1.85%、2.90%、2.01%、1.27%、1.08%、0.39%、0.27%、0.12%、7.61%、0.12%、0.08%、1.47%、及び0.00%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.74%、7.96%、4.75%、18.23%、8.50%、3.59%、2.47%、2.94%、2.74%、10.31%、10.35%、9.62%、3.13%、3.05%、13.90%、0.27%、5.37%、0.23%、0.31%、1.78%、1.39%、and 2.47%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.83%、17.50%、8.42%、5.06%、4.52%、4.79%、4.91%、4.48%、4.60%、9.39%、8.42%、8.57%、4.36%、4.44%、0.58%、3.59%、6.06%、0.23%、6.30%、0.04%、0.77%、及び0.00%であり、
前記CDRの長さが23である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.00%、0.29%、0.15%、0.49%、8.00%、3.07%、3.76%、0.59%、9.03%、3.90%、4.25%、9.42%、0.44%、3.90%、0.34%、3.32%、3.51%、0.10%、3.90%、0.39%、43.24%、0.83%、及び4.73%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.24%、0.05%、0.15%、0.15%、4.69%、5.32%、0.10%、0.15%、14.84%、0.20%、4.49%、4.64%、4.25%、5.42%、0.10%、8.30%、0.05%、0.10%、4.69%、0.00%、0.00%、1.12%、及び0.00%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.24%、9.91%、3.71%、3.61%、5.32%、2.73%、3.61%、3.81%、7.42%、2.10%、6.69%、4.34%、2.93%、8.39%、11.27%、3.17%、0.20%、0.24%、0.34%、4.05%、0.88%、1.22%、及び9.22%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約0.44%、4.39%、8.69%、22.40%、7.76%、4.49%、4.05%、3.42%、0.78%、9.13%、10.35%、3.66%、11.52%、3.95%、0.29%、8.25%、0.20%、6.69%、0.20%、0.44%、0.00%、1.95%、及び0.05%である。
・抗体分子の重鎖は、配列番号1、3、5、7、9、11、又は13から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号2、4、6、8、10、12、又は14から選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み;
・抗体分子の軽鎖(カッパ)は、配列番号15、17、19、若しくは21から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号16、18、20、若しくは22から選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、又は抗体分子の軽鎖(ラムダ)は、配列番号23、25、若しくは29から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号24、26、若しくは28から選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み;
・重鎖のフレームワーク領域1、2、及び3は、配列番号30〜49から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・重鎖のCDR1及びCDR2は、配列番号50〜63から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(カッパ)のフレームワーク領域1、2、3、及び4は、配列番号64〜79から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(カッパ)のCDR1、CDR2、及びCDR3は、配列番号80〜91から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(ラムダ)のフレームワーク領域1、2、3、及び4は、配列番号92〜103から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(ラムダ)のCDR1、CDR2、及びCDR3は、配列番号104〜112から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。
a)少なくとも1つの所定の特徴を有する抗体分子をスクリーニング及び同定する工程、
b)同定された分子をCDR3重鎖(CDRH3)の長さ分布分析及び前記CDRH3内のアミノ酸の出現頻度に基づいて分析して、最適な鎖長及びアミノ酸頻度を決定する工程、
c)変化した抗体分子をデザインし、その後、分子を、上記のように定義されているように、前記最適な鎖長及びアミノ酸頻度に基づいて、コドン置き換えテクノロジーに供して、改変CDRH3を有する抗体分子を得る工程、並びに
d)前記分子をクローニングして、ライブラリーを形成する工程。
対応する抗体遺伝子をファージへクローニングして、ファージ抗体ライブラリーを得、その後、ディスプレイされた分子を抗原に対してスクリーニングして、パニングされたファージ抗体ライブラリーを得る工程、
パニングされたファージ抗体ライブラリーを、前記抗体分子の酵母の表面上でのディスプレイのために酵母へ移入し、その後、酵母にディスプレイされた抗体分子を抗原に対してスクリーニングして、酵母でスクリーニングされた抗体ライブラリーを得る工程、及び
所望の機能的特性を有するファージ若しくは酵母にディスプレイされた抗体を選択して、合成抗体ライブラリーを形成し、又は所望の機能的特性を有する選択された抗体分子をファージ抗体ライブラリー若しくは酵母抗体ライブラリーから単離して、スクリーニングされた抗体合成ライブラリーを作製する工程。
・配列番号1、3、5、7、9、11、又は13から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号2、4、6、8、10、12、又は14から選択される重鎖コンセンサスアミノ酸配列;
・配列番号15、17、19、若しくは21から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号16、18、20、若しくは22から選択される軽鎖コンセンサスアミノ酸配列、又は配列番号23、25、若しくは29から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号24、26、若しくは28から選択されるコンセンサスアミノ酸配列;
・配列番号30〜49、64〜79、又は92〜103から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるフレームワーク領域;及び
・配列番号50〜63、80〜91、又は104〜112から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるCDR
を含む抗体分子であって、
前記CDRの長さが4である場合、位置2、3、及び4におけるアミノ酸アルギニンの頻度が約18%から約20%まで様々であり;
前記CDRの長さが5である場合、位置3におけるアミノ酸プロリンの頻度が約20%であり;
前記CDRの長さが6である場合、位置4におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約25%であり;
前記CDRの長さが7である場合、位置5におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約43.63%であり;
前記CDRの長さが8である場合、位置6におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約35.24%であり;
前記CDRの長さが9である場合、位置7におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約44.15%であり;
前記CDRの長さが10である場合、位置8におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約55.93%であり;
前記CDRの長さが11である場合、位置9におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.27%であり;
前記CDRの長さが12である場合、位置10におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約52.70%であり;
前記CDRの長さが13である場合、位置11におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.39%であり;
前記CDRの長さが14である場合、位置12におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.77%であり;
前記CDRの長さが15である場合、位置13におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.81%であり;
前記CDRの長さが16である場合、位置14におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約50.47%であり;
前記CDRの長さが17である場合、位置15におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約37.93%であり;
前記CDRの長さが18である場合、位置16におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約37.96%であり;
前記CDRの長さが19である場合、位置17におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約40.09%であり;
前記CDRの長さが20である場合、位置1におけるアミノ酸グルタミン酸の頻度が約15.56%であり;
前記CDRの長さが21である場合、位置19におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約35.45%であり;
前記CDRの長さが22である場合、位置20におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約36.27%であり;
前記CDRの長さが23である場合、位置21におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約43.24%である、
抗体分子に関する。
a)抗体アミノ酸配列のインシリコ分析の行為/工程;
b)インシリコアプローチにより重鎖CDR3多様性をデザインし、創出する行為/工程;コドン置き換えテクノロジーによる全体の多様性の合成の行為/工程;
c)コンセンサス抗体核酸配列のファージミドベクターへのクローニングの行為/工程;合成核酸レパートリーをファージミドベクターへ組み入れて、合成ファージライブラリーを作製する行為/工程;
d)ファージディスプレイライブラリーを特定の抗原又は抗原産生細胞に対してスクリーニングする行為/工程;
e)工程d)のスクリーニングされた産物を酵母ベクターへ移入/クローニングし、その後、前記産物を抗原に対してスクリーニングする行為/工程;及び
f)所望の機能的特性を有する抗体分子を酵母ライブラリーから選択する行為/工程。
ラットフォームにおいてスクリーニングされた選択された分子のプールを、選択された多様性、すなわち、重鎖及び軽鎖の組合せをランダム化して、又はランダム化せずに、真核生物系へ移入し、それにより、重鎖及び軽鎖の特定の組合せ有り又は無しで、選択された分子のプールを保存する。この移入は、ファージディスプレイプラットフォームにおける重鎖及び軽鎖のフォールディング及びペア形成に関する問題を克服するために特定的に行われる。酵母ディスプレイプラットフォームは、異なるフォーマットでの様々な抗体部分を発現する様々な設定を含む。工程5:酵母プラットフォームを用いることによりディスプレイされた分子/抗体断片を、特定の抗原標的に対してスクリーニングする。標的抗原に対するより高い親和性を示す特定の抗体集団を分離する。これらの選択されたプールを更に、必要ならば、抗原特異性について試験する。工程6:スクリーニングされた抗体のプールからの個々のクローンを分離し、クローン集団を、「リード分子」をコードする核酸配列を単離するために用いる。いくつかのバイオインフォマティクスツールを用いる抗体-抗原相互作用研究の注意深い分析及び理解は、リード分子の核酸配列において更なる変化を組み入れることを可能にするだろう。
DPBS(GIBCO、米国);FBS(Moregate Biotech社、オーストラリア);dNTP(Ambion、米国);1Kb ラダー(Invitrogen、米国);Phusion酵素(NEB社、米国);アガロース(SIGMA社、米国);PCR精製キット(Qiagen社、米国);アガロース(SIGMA社、);ゲル溶出キット(Qiagen社、米国);Mini prepキット(Qiagen社、米国);dATP(NEB社、米国);T4 DNAリガーゼ(NEB社、米国);LB寒天(Himedia社、インド)、Neb5alpha(NEB社、米国);アンピシリン(MP Biomedicals社、米国);NcoI-HF(NEB社、米国);XbaI(NEB社、米国);HindIII-HF(NEB社、米国);AscI(NEB社、米国);BstEII(NEB社、米国);BstBI(NEB社、米国);AscI(NEB社、米国);NotI(NEB社、米国)、TG1細胞(Lucigen社、米国);PCR精製キット(Qiagen社、米国);LB寒天(Himedia社、インド);Mini prepキット(Qiagen社、米国);LBブロス(Himedia社、インド);アンピシリン(MP Biomedicals社、米国);dam-/dcm-コンピテント大腸菌(NEB社、米国);カナマイシン(MP biomedicals社、米国);M13KO7ヘルパーファージ(Thermo Scientific、米国);グリセロール(Fischer Scientific社、米国);PEG 8000(SIGMA社、米国);塩化ナトリウム(SIGMA社、米国);PBS(SIGMA社、米国);BSA(Biovision社、米国);抗FLAG(Sigma社、米国);HRPヤギ抗マウス(Biolegend社、米国);TMB基質(Sunmodics社、米国);Herclon(登録商標)(Roche社、米国);ヤギ抗ヒト_IgGFc-HRPコンジュゲート型(Bethyl社、米国);Tween 20(Fisher Scientific社、USA);Her2(Acrobiosystems社、中国)。
合成抗体ライブラリー作製のための一般的な手順
合成ライブラリーの成功は、多様でなければならない固有デザイン、及び十分大きくあるべきである最終ライブラリーサイズに単に依存するだけである。合成抗体ライブラリーサイズと多様性、及び抗体特異性と親和性は直接、関連づけられる。多様性及び固有性を網羅する合理的な数のクローンを有するために、多数の抗体配列をインシリコで分析する。コドン置き換えテクノロジーを用いて、確実性及び多様性を以て、変化した抗体配列を合成し、アクセッション番号MTCC 25125を有する自社製ファージミドベクターへクローニングする。合成ライブラリーのプールを表す特定のベクターにおけるクローニングされた遺伝子を、特定の抗原に対して、ただストリンジェンシーだけに基づいて、パニングする。選択された分子のプールを、特定の酵母ディスプレイベクター(アクセッション番号MTCC 25126、MTCC 25127、及びMTCC 25128)へ、コンビナトリアル又は非コンビナトリアルアプローチにより、移入する。しかしながら、重鎖と軽鎖のランダム化は、2つのディスプレイ系にわたる違いを補正するために許可される。ディスプレイされた断片を、特定の抗原性標的に対してスクリーニングし、標的抗原に対するより高い親和性を示す集団を分離する。選択されたプールを任意で、抗原特異性について試験し、プールからの個々のクローンを分離し、クローン集団を、リード分子をコードする核酸配列を単離するために用いる。
抗体配列を、NCBI、V-base、Genbank等により例示されるような様々なウェブサイトからダウンロードする。機能的な生殖系列抗体配列及び再編成された抗体配列を、IMGTデータベースからダウンロードする。重複配列(redundant sequences)の除去後、おおよその数として、4300個の固有配列を分析する。同じ抗原又は標的に対する抗体配列の複数のエントリーもまた、分析において考慮に入れない。重鎖のCDR3領域(CDRH3)が、主として、抗原結合に関与するため、CDRH3多様性のみが、合成ライブラリーにおいて組み入れられるように計画される。
ージライブラリー作製を、6×1010〜1011である計算された数のファージ粒子を用いて注意深く実行する。抗原に対するパニング実験について、結合性物質をより良く制御するために、磁気ビーズに基づいたアプローチを採用する。磁気Dynabeadsにコーティングされる抗原の調製について、ビーズコンジュゲーション効率は90%より高く設定される。更に、107個以下のファージ粒子に関して非結合性物質のみを除去するために、パニングは、1ラウンドに固定される。この工程は、酵母ディスプレイライブラリースクリーニングの次の工程で十分調整される。いかなる偏った増幅、又は標的に関係していない集団の濃縮を回避するために、固定された90分間のファージ増幅持続時間を利用する。パニングされたナイーブライブラリーを移入するために、ssDNAをサケ精子DNAの存在下で単離し、続いて、挿入断片、すなわち、重鎖及び短鎖レパートリーを増幅する。精製されたレパートリーを消化し、2つの異なるフォーマット、Fabフォーマット及びscFvフォーマットにおいて酵母発現ベクターへライゲーションする。抗体重鎖及び軽鎖を、同じベクターから同じプロモーターからか又は2つの別々のプロモーターからかのいずれかで、発現するように、及び酵母接合型を用いて2つの別々のベクターから発現するように、複数の酵母ベクターをデザインする。全ての場合において、酵母における形質転換効率は、107より高く得られる。形質転換された酵母細胞を、重鎖、軽鎖、及び全集団の15〜50%以上であるFab分子発現についてチェックする。接合型について、接合効率は、30〜50%の範囲である。重鎖及び軽鎖、それぞれについて、FLAG、c-Myc、及び(His)6タグ、並びにV5タグ等の複数のタグを用いて発現分析を実施する。抗原結合についてのフローに基づいたソーティングは、抗原と、重鎖又は軽鎖のいずれかとの両方について二重ポジティブに関して分析される。ソートされた酵母クローンを収集し、成長させ、特定の抗原に対して2〜3より多いラウンドでスクリーニングし、その後、それらを個々に成長させ、結合研究について試験する。
抗体配列を、IMGTデータベース(http://www.imgt.org/IMGT_jcta/jcta?livret=0)からダウンロードし、再編成された配列を以下のパラメータを用いて同定する: ANNOTATION_LEVEL=完全アノテーション化、SPECIES=ホモサピエンス(ヒト); CONFIGURATION_TYPE=生殖系列型、再編成型、GENE_TYPE= variable、diversity、joining; FUNCTIONALITY=機能的、生産的、GROUP=IGHV。配列は、重複チェックのフィルターにかけられ、それにより、総数約4300個の配列が約2830個の配列に減少する。最初の配列はまた、同じ抗原に対する抗体配列の任意の複数のエントリーがあるかどうかもチェックされる。固有配列のみが、その後の分析のために保持される。
パートリーを合成するためにコドン置き換えテクノロジーを採用する。コドン置き換えテクノロジーは、特定の位置を多様化するために、ビルディングブロックとして最適なトリヌクレオチドの使用を含む。これは、縮重コドンを用いるランダム化等の通常のテクノロジーを用いることによるよりも、有意により高い品質のライブラリーを達成するために、望ましくない停止コドン又はアミノ酸の出現を避けるアミノ酸組成の完全なカスタマイズを可能にする。まとめると、コドン置き換えテクノロジーは、アウトオブフレーム、停止コドン、及び望ましくないアミノ酸含有配列をほとんど含まない、所望のアミノ酸の組入れに対して完全な制御を提供する。したがって、そのテクノロジーは、最も多くの影響を与えることが予想される位置において合理的な多様性を生み出す。しかしながら、位置的相関指数なしに、完全な多様性を引き出すのに必要とされる270個の固有混合物がある。合成ライブラリーをデザインするための位置的相関概念の導入により、アミノ酸混合物が270個から101個の固有混合物へ減少している。この概念は、過程全体を極めて効率的に、且つ合成及び次の工程に関連したいくつかのテクノロジー的制限と適合性にさせる。この概念の結果は、12個の固有のアミノ酸混合物群であり、その代表的な混合物は選択される必要がある。代表的な混合物はいかなる組合せをも見逃すべきではないため、これは重要である。この困難を克服するために、真の多様性の概念、すなわち、シャノンエントロピーが利用され、これは、情報内容の予測不能性を測定する。シャノンエントロピー測定は、系における豊富度及び存在度等の2つのパラメータを含む。豊富度は、アミノ酸の種類を示し、一方、存在度は出現の確率を含む。計算は以下の方程式を用いて実施され、Piはアミノ酸の出現の確率に関する。
再編成された配列はある特定の位置においてアミノ酸残基に偏っており、支配的な配列の選択は、抗原に対するスクリーニング後に見られることが、生殖系列ファミリーにおいて見られる。したがって、最も頻繁に用いられる配列の選択に関して完全な非偏向性を後で有するために、(配列表のような)コンセンサス配列が合成され、一定のバックグラウンドとして用いられ、それに、CDRH3多様性が、合成ライブラリーの作製のために導入される。重鎖と軽鎖の両方のCDR1及びCDR2領域について、再編成された配列のコンセンサスは、対応するファミリーの1つの生殖系列配列のアミノ酸配列と置き換えられる。したがって、この手順は、いかなる偏りも除去し、再編成された配列及び変異した配列のCDRは、それらの特定の抗原に対する選択により、変異していることが知られているからである。
デザインされたCDRH3多様性の合成は、コドン置き換えテクノロジーを用いて完成される。合成されたライブラリーを、リアルタイムPCRにより定量化する(図7)。ライブラリーを、Ion Torrent PGM, Hi-Q-View chemistryを用いる次世代シーケンシングにより分析する。配列あたり読み取りの平均数は24.4である。分析により、105174個の配列のうち10947個が、リーディングフレーム内に欠失(3409個)、挿入(6558個)、又は置換(1525個)を有する間違った配列を含有することが示されている(図8A)。ライブラリーの生存率は91.2%であることが見出され、一方、ライブラリーの正確さは89.6%である。各CDRH3長さについての合成された分子の数は、おおよそで、等しく大量であることが見出される(図8B)。天然CDRH3長さ分布と違って、合成されたCDRH3長さ分布は、いかなるガウス分布にも従わない(図8C)。これはおそらく、4から23までの範囲の異なる長さを有する分子の偏りのない存在がある、デザインされたライブラリーの強さを暗示する。更に、4〜10アミノ酸長のCDRH3のパーセンテージ出現率(他のCDRH3長さと比較した場合、天然レパートリーにおいて少数しか存在しない)は、増加している;それにより、合成プールにおいて多様な分子の候補数を増加させる。加えて、10〜19アミノ酸長を有するCDRH3の支配的ロットは、類似したパーセンテージの出現頻度で同じようなレベルに維持される;したがって、これらのセグメントにおける最大多様性が保持される。20から23アミノ酸までの範囲のCDRH3長さに関して、天然レパートリーと合成されたレパートリーとの間で有意な変化は見られない。アミノ酸頻度分布分析を、全ての合成されたCDRH3長さについて実施する(図9〜図13)。合成ライブラリーはまた、同等者集団シーケンシングによりサンガーシーケンシングによって分析される。合計96個の個々のクローンが選び取られ、シーケンシングされる。95個のうち5個の配列が、リーディングフレーム内に欠失(1)、挿入(0)、又は置換(4)を有する間違った配列を含有した。まとめると、同等者集団シーケンシングから得られたライブラリーの正確さは95%であることが見出される。
合成ライブラリーを作製するために、(カッパ又はラムダのいずれかの軽鎖と共に)固定した重鎖を含有する個々の構築物をプールする。H1A重鎖ファミリーについて例示されているように、以下の組合せを有する7個の構築物がある:H1A-K1、H1A-K2、H1A-K3、H1A-K4、H1A-L1、H1A-L2、及びH1A-L3。これらの構築物全てを、それぞれ2.9μgの等量でプールし、H1A構築物のマスタープールを作製する。
ファージライブラリー作製を進める前に、細胞の数に関する寄与が同じに保たれている、CDRH3多様性を含有する全ての重鎖ファミリーのマスターストックを作製することが必須である。これは、もしあれば、標的分子に対するスクリーニング後に選択される重鎖ファミリーの優先度に関する情報を本発明者らに提供するだろう、偏りのないシナリオを利用することを目的として行われる。したがって、全ての重鎖合成ライブラリーを、ファミリーあたり1010個の細胞数でプールする。プールされたライブラリーは、ファージライブラリー調製のための次の工程に用いられる。
プールされた合成ライブラリーを含有する細菌マスターグリセロールストックの1mlを、200ml LB-AMP培地中、600nmにおけるODが0.8に達するまで、37℃で成長させる。更に、M13KO7ヘルパーファージを細菌へ10の感染効率(MOI)で加え、37℃で更に30分間、インキュベートする。感染後、感染した細菌を遠心分離し、ペレットを、100μg/ml アンピシリン及び25μg/ml カナマイシンを含む200mlのLBへ再懸濁し、その後、30℃、250rpmで一晩、増殖させる。懸濁液を、4℃、8000rpmで15分間、遠沈し、その後、ペレットを捨てる。分離された上清を、上清の1/4体積のPEG/NaCl溶液と混合し、その混合物を氷上で1時間、インキュベートする。その混合物を10000gで15分間、遠心分離し、ファージペレットを20mlのPBSへ再懸濁する。グリセロールを、ファージ懸濁液全体へ50%の最終濃度まで加え、ファージライブラリーストックとして1mlのアリコートで、-80℃において凍結する。
合成ライブラリーのスクリーニングは、これが、特定の標的抗原に対する候補結合性物質の流れを生じるため、最も重要な工程である。結合性物質の作製及び生成の全過程を考えると、パニングの目的は、ナイーブレパートリーのプールから非特異的結合性物質を除去することである。したがって、結合工程、増幅工程、及び制限消化工程、並びに配列確認工程からなるファージスクリーニングストラテジーは、注意深く決定される必要がある。効率的結合を有することに加えて、抗原とファージ分子の比率もまた、結合中、いかなる種類の偏向性も回避するために、それに応じて決定されなければならない。
TG1細菌プレートからの単一コロニーを、3ml LB培地中に、細菌として接種し、OD600≒0.9まで、37℃で成長させる。0.7%のアガロースを、Milli-Q水中に調製し、15mlのファルコンチューブにおいてそれぞれ3mlのアリコートとして50℃で保存する。ファージ上清及びペレットを、10-1から10-4までそれぞれの工程で希釈する。100μlの希釈されたファージ及び100μlのTG1細胞を、アガロースアリコートのそれぞれに加え、混合し、その後すぐに、LB寒天プレート上に広げる。そのプレートを37℃インキュベータ内で一晩、インキュベートする。プラーク形成が観察され、それを次の日にカウントする。パニングされた分子の数を、観察されたプラークの数に基づいて計算する。
Dynabeadsの、約108個のビーズに相当する0.5mgの量を計り、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー、pH7.4に溶解する。この懸濁液を、30秒間、ボルテックスし、その後、連続回転させながら、室温で10分間、インキュベートする。その懸濁液を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファーで2回、洗浄し、100μLの0.1Mリン酸ナトリウムバッファーへ再び、再懸濁する。Her2、リガンド溶液(約100μL)を、10μgのビーズ懸濁液に加える。更に、懸濁液を、100μLの硫酸アンモニウム溶液(3M硫酸アンモニウム)を加える前に、よく混合する。その混合物を、ゆっくり傾けるが、連続的に回転させながら、37℃で20時間、インキュベートする。インキュベーション後、チューブを、磁気分離のために、磁石ホルダー上に1分間、置く。(チューブが配置された)磁石ホルダーを、キャップ内にビーズが残っていないことを確実にするために、注意深く、2回、ひっくり返す。上清を除去し、ビーズを、BSA(0.05%)を含有する1mLの1×PBSで4回、洗浄する。最後に、ビーズを、BSA(0.05%)を含む100μLの1×PBS中に再懸濁し、パニングに用いる。
パニングのための磁気分離に基づいたアプローチを実施するために、抗原コーティング化磁気ビーズの作製を行う。コンジュゲーション効率を、フローサイトメーターを用いて決定する(図18)。精製されたHer2を抗原として用いる。実験は、様々な抗体組合せをもつ約105個のビーズのインキュベーションから開始する。ここにおいて、リガンドと結合する抗体は、ビオチンで標識されている。N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル活性化ビオチンが、ビオチン化試薬の最も人気のある型である。NHSエステルは、pH7〜9バッファーにおいて一級アミノ基(-NH)と効率的に反応して、安定なアミド結合を形成する。抗体及び他のタンパク質は一般的に、各ポリペプチドのN末端に加えて、複数のリジン(K)残基を含有するため、それらは、NHS活性化試薬での標識のための標的として利用可能な複数の一級アミンを有する。ビオチン標識の程度は、そのタンパク質上のアミノ基のサイズ及び分布、並びに用いられる試薬の量に依存する。10mM ビオチン溶液を、2.2mgのスルホ-NHS-ビオチンを500μLの水と混合することにより作製する。抗Her2抗体である、トラスツズマブの1×PBS中の溶液を、濃度2mg/mLで作製する。27μLのビオチン溶液を、1mLのトラスツズマブへ加え、その後、氷上で2時間、インキュベートする。Thermo Scientific ZebaSpin脱塩カラムを用いて、その溶液から過剰な、結合していないビオチン分子を脱塩する。タンパク質濃度を、分光光度計を用いて推定し、その濃度は、有意な変化がないことが見出される。非特異的抗体である、リツキシマブもまた、ビオチン化し、ビオチン化後の濃度推定は2mg/mLである。Alexa 633フルオロフォアを有するストレプトアビジンを、ビオチン化の程度を引き出すための二次抗体として用いる。1μLのビーズ単独、及びHer2リガンドでコーティングされたビーズを、抗体なし、0.05mg/mLの濃度でのビオチン化トラスツズマブ、ビオチン化リツキシマブと、混合し、その後、体積を、0.5%BSAを含有する1×PBSで100μLにする。その混合物を、氷上で2時間、インキュベートし、その後、0.5%BSAを含有する1×PBSで洗浄する。最後に、0.5%BSAを含有する1×PBSにおける25μLのストレプトアビジン- alexa 633溶液中に再懸濁し、読み取りを行う前に、体積を500μLに増加させる。全てのフロー実験は、Accuri C6フローサイトメーターを用いることにより行われ、分析は、BD Accuri C6ソフトウェアを用いることにより行われる。第一に、ゲートを固定するために前方及び側方散乱データが観察され、その後、FLH4フィルターにより蛍光が読まれる。少なくとも10000個のデータ点が各試料について収集される。
新鮮に画線されたTG1細菌プレートからの単一コロニーを、3ml LB培地に接種し、OD600≒0.9まで、37℃でインキュベートし、これを、後でファージ感染に用いる。100μl 0.5% MPBSを、抗原コンジュゲート化磁気ビーズの100μlの懸濁液に加え、室温で2時間、インキュベートする。ファージライブラリーアリコートを解凍し、ファージ粒子を、250μl(ファージ懸濁液体積の1/4)PEG/NaCl溶液(20% PEG 8000及び2.5M NaCl)で沈殿させ、氷上で30分間、インキュベートし、その後、10,000gで10分間、その沈殿したファージを遠心分離する。上清を捨て、ファージペレットを、200μl PBS溶液中に再懸濁する。ファージ懸濁液(200μl)を、抗原でコンジュゲートされたビーズに加え、回転装置上、室温で2時間、インキュベートする。ビーズを、1ml 0.05% PBST(PBS中 0.05% Tween-20)で少なくとも2回、洗浄する。最後に、ファージ粒子結合性物質と結合した磁気ビーズを100μl PBS中に再懸濁する。10μLのビーズ懸濁液を、後でのプラークアッセイのために別に取っておく。その懸濁液の残りの90μlを、前に調製された成長したTG1細胞の2mlに加え、その混合物を、37℃で1時間、インキュベートする。インキュベーション後、それを、アンピシリンを含有する10ml LB培地へ希釈して、25μg/mlの最終濃度にする。250rpmで振盪させながら、37℃で更に2時間のインキュベーション後、アンピシリンの濃度を、100μg/mlの最終濃度に増加させる。M13KO7、ヘルパーファージを、増幅されたTG1細胞へ10のMOIで混合し、37℃で更に30分間、インキュベートする。ヘルパーファージに感染した細菌を遠沈し、ペレットを、100μg/ml アンピシリン及び25μg/ml カナマイシンを追加した10mlのLB培地へ再懸濁し、その後、ファージ増幅のために30℃で90分間、インキュベートする。細菌培養物を、10,000gで10分間の遠心分離によりペレット化して、沈降させる。ペレットを捨て、上清を、その上清にPEG/NaCl溶液(上清の1/4の体積)を加えることにより、増幅されたファージ分子の沈殿のために用いる。その混合物を、氷上で30分間、インキュベートし、その後、沈殿したファージを10,000gで10分間、回転させる。上清を捨て、ペレットを、1mlのPBS中に再懸濁する。増幅したファージの数を推定するために、増幅したファージ懸濁液の10μLからプラークアッセイを実施し、一方、沈殿したファージの残りを、長期保存のために、50% グリセロールと共に-80℃冷凍庫で保存する。
増幅されたファージの1バイアルを解凍し、200μlの20% PEG/2.5M NaClを5μgのサケ精子DNAと共にそれに加え、その混合物を数回、反転させ、その後、4℃で2時間、そのまま留めておく。(更なる選択及びソーティングのためにパニングされたプールを酵母ディスプレイ系へ移行させるために、結合性物質のssDNAは、それがパニングされた多様性を表すように、十分な量で単離されなければならない。剪断され、且つ煮沸されたサケ精子DNAの使用は、特に、パニングされたssDNAの収量を向上させる。)使用前に、サケ精子DNAを剪断し、煮沸する。サケDNAの重量を測定し、ヌクレアーゼフリーの水と、5mg/mLの濃度まで混合する。そのDNAを、22ゲージの針を用いた3回の穏やかな混合で剪断し、その後、5分間、煮沸する。更に、断片化されたDNAを、将来の使用のために-20℃でアリコートとして保存する。ファージ、PEG/NaCl、及びサケ精子DNAを含有する混合物を、4℃において、14,000rpmで10分間、遠心分離し、上清を捨てる。ここで留意されるべき点は、ファージペレットが見られない場合、混合物を同じ速度で短時間、再び、回転させることである。上清を注意深く、ピペットで取り出し、ペレットのみを残す。ペレットを、100μlのヨウ化物バッファー(10mM Tris-HCl (pH 8.0)、1mM EDTA、4M ヨウ化ナトリウム(NaI))中に、チューブをボルテックスすることにより、完全に再懸濁する。250μlの100% エタノールを加え、-80℃で一晩、インキュベートする。その調製物を、4℃において、14,000rpmで30分間、遠心分離し、上清を捨てる。ぺレットを、0.5mlの70% エタノールで2回、洗浄し、続いて、ペレットを乾燥させる。ssDNAを含有するペレットを、20μLのヌクレアーゼフリーの水に再懸濁する。
プロトコールは、酵母系においてスクリーニング及びソーティングを行うためにファージから酵母発現ベクターへの全ての結合性物質の移行を含む。最良の結合性物質を更に選択し、ランク付けするために適合した方法、すなわち、FACSを用いる、親和性に基づいた方法が利用される。
大量のプラスミドDNA単離を、両方のライブラリーのために行い、その後、確認のために、それぞれの酵素で制限消化を行う。検証において、1μgの各DNAをとり、Frozen-EZ Yeast transformation II Kit(商標)によりOD600 1.2〜1.5で酵母細胞へ形質転換する。EBY100-ura3Δ-4及びYVH10を、重鎖ライブラリー及び軽鎖ライブラリー(カッパ及びラムダ)それぞれの細胞表面ディスプレイのための宿主として用いる。
ライブラリーのFabフォーマットを表面上にディスプレイするために、重鎖ライブラリー、及びカッパ又はラムダのいずれかの軽鎖ライブラリーを表す2つの成長した一倍体細胞間の接合を、同数の一倍体細胞を混合することにより実施する。接合効率は、単一選択プレートにおける総コロニーの数で割った二重選択プレートにおける二倍体コロニーの数として計算され、計算された接合パーセンテージは約25%である。更に、二倍体細胞を、いずれの成長及び発現分析の前にも、二重ドロップアウト培地(Ura-、Trp-)において濃縮する。
重鎖プール及び軽鎖プールを発現するプラスミドを有するサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)2Nライブラリーを、20mlのSDCAA培地へ接種し、30℃で一晩、成長させる。一晩成長した培養物のOD600を測定し、それに従って、20ml SDCAA Ura- Trp-二重ドロップアウトグルコース培地(非誘導培養)及び20ml 2×SGCAA培地(誘導培養)に、最終OD600nmが0.4になるように、接種する。非誘導及び誘導細胞を、20℃で、24〜48時間の範囲の異なる時点の間、成長させる。
1. 本開示の方法により得られる合成ライブラリーは、分子の種類を最大限にするための、そして、合成工程及びその後のスクリーニング工程に関連したテクノロジー的限界を克服するためのCDRH3の効率的なデザインであることを考慮すれば、より高度な抗体多様性を有する。これらは、抗体配列のより大きいデータセットから単に導かれた、特定の一連のインシリコ分析を用いて実行される。
a. 非-重複配列を除去して、生殖系列配列の同定によりふるいにかけた抗体データベース。
b. 重鎖CDR3配列の同定、その後の、アミノ酸出現頻度の推定及び長さ分析。
c. 位置的相関因子の導入によるデザインの分布マトリックスの作製、その後、様々な位置に渡るアミノ酸確率指数決定。
d. 真の多様性の概念の導入、すなわち、シャノンエントロピーに基づいた同定及び固有アミノ酸頻度分布の選択。
2. 合成ライブラリーのデザインに基づいて、重鎖CDR3の非常に類似したアミノ酸組成の多様性が合成後、達成されている。
3. 次世代シーケンシング及び同等者集団シーケンシング研究により判定された場合の合成ライブラリーの生産性は、80%から95%までの範囲である。
4. CDRH3長さ(4〜23アミノ酸)分布研究は、全てのCDRH3長さの均一な存在を示し
、天然レパートリーにおいては少数しか存在しないCDRH3長さ、特に、9アミノ酸までのCDRH3の長さについて存在する有意な量の多様性を確認している。したがって、4から23アミノ酸までの範囲のCDRH3長さについての偏りがなく、且つ均一の多様性の存在が達成される。
5. 本開示は、ファージと酵母抗体表面ディスプレイの独特な組合せを利用し、それは、大きなライブラリーサイズ(1011個より多いクローン)をスクリーニングすることを可能にし、酵母の翻訳後修飾のために抗体構造のより良いフォールディングを促進する。
6. ライブラリーは、前記抗体の結合の性質の向上のために抗体CDR最適化又はモチーフグラフティングアプローチを組み入れる。
7. ライブラリーは、高い抗体安定性、より少ない抗体凝集、より低い免疫原性、より良い溶解性、及び前記抗体の製造可能性の向上のための他の抗体の特徴のための抗体合理的デザインを組み入れる。
8. 本開示は、独占的スクリーニング方法論を採用し、その方法論において、ファージディスプレイスクリーニングが、非結合性物質だけを除去するために利用され、一方、その後の酵母スクリーニングが、結合性物質の親和性に基づいた選択を実行するために利用される。
9. ファージ及び酵母の表面発現に用いられるベクターは独特である。
10. ファージライブラリーから選択されたクローンは、重鎖及び軽鎖の特定の組合せ有り又は無しでの、scFv又はFabを含む異なる抗体フォーマットで酵母ライブラリーへ移行され、それにより、向上したスクリーニング過程で最初の多様性を保持する。
11. 本開示はまた、ディスプレイプラットフォームにおいてFab及び/又はscFv配列の複数のバリアントを収容することの柔軟性、並びにFabフォーマット及び/又はscFvフォーマットにおけるパニングされた分子をコンビナトリアル及び非コンビナトリアルアプローチにより酵母発現系へ移行する柔軟性を提供する。
Claims (18)
- 約4アミノ酸から約23アミノ酸までの長さを有する、抗体分子の重鎖の改変CDRを含む抗体分子の合成ライブラリーであって、
・前記CDRの長さが4アミノ酸である場合、位置2におけるアミノ酸アスパラギン酸の頻度が約20%であり;
・前記CDRの長さが5から17アミノ酸までの範囲である場合、最後の位置におけるアミノ酸アスパラギン酸の頻度が約40%から約80%までの範囲であり、若しくは最後から2番目の位置におけるアミノ酸チロシンの頻度が約40%から約65%までの範囲であり;又は
・前記CDRの長さが18から23アミノ酸までの範囲である場合、最後の位置におけるアミノ酸バリンの頻度が約20%から約67%までの範囲であり、若しくは最後の位置におけるアミノ酸イソロイシンの頻度が約17%から約24%までの範囲である、
合成ライブラリー。 - 長さが約4アミノ酸から約23アミノ酸まで様々であり、アミノ酸頻度の特定の組合せを有する、抗体分子の重鎖の改変CDRを含む抗体分子を含み、
・前記CDRの長さが4アミノ酸である場合、位置1及び3におけるアミノ酸グリシンの頻度が約16から36%の範囲であり;
・前記CDRの長さが5アミノ酸である場合、最初の3個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約20から38%の範囲であり;
・前記CDRの長さが6アミノ酸である場合、最初の4個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約11から35%の範囲であり;
・前記CDRの長さが7アミノ酸である場合、最初の4個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約12から38%の範囲であり;
・前記CDRの長さが8アミノ酸である場合、最初の5個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約14から34%の範囲であり;
・前記CDRの長さが9アミノ酸である場合、最初の6個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約12から43%の範囲であり;
・前記CDRの長さが10アミノ酸である場合、最初の7個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約14から30%の範囲であり;
・前記CDRの長さが11アミノ酸である場合、最初の8個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約14から28%の範囲であり;
・前記CDRの長さが12アミノ酸である場合、最初の9個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約15から28%の範囲であり;
・前記CDRの長さが13アミノ酸である場合、最初の10個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約13から26%の範囲であり;
・前記CDRの長さが14アミノ酸である場合、最初の11個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約8から26%の範囲であり;
・前記CDRの長さが15アミノ酸である場合、最初の12個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約8から30%の範囲であり;
・前記CDRの長さが16アミノ酸である場合、最初の13個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から35%の範囲であり;
・前記CDRの長さが17アミノ酸である場合、最初の14個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から36%の範囲であり;
・前記CDRの長さが18アミノ酸である場合、最初の15個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から30%の範囲であり;
・前記CDRの長さが19アミノ酸である場合、最初の16個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約7から45%の範囲であり;
・前記CDRの長さが20アミノ酸である場合、最初の17個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約3から44%の範囲であり;
・前記CDRの長さが21アミノ酸である場合、最初の18個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約2から44%の範囲であり;
・前記CDRの長さが22アミノ酸である場合、最初の19個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約3から58%の範囲であり;又は
・前記CDRの長さが23アミノ酸である場合、最初の20個の位置におけるアミノ酸グリシンの頻度が約0.5から58%の範囲である、
請求項1に記載の合成ライブラリー。 - 長さが約4アミノ酸から約23アミノ酸まで様々であり、各位置におけるアミノ酸頻度の特定の組合せを有する、抗体分子の重鎖の改変CDRを含む抗体分子を含み、
前記CDRの長さが4である場合、
a. 位置1及び2におけるアミノ酸アスパラギン酸の頻度が、それぞれ、約10%及び約20%であり;
b. 位置1〜3におけるアミノ酸プロリンの頻度が約0.05%から約0.15%まで様々であり、位置4においては約15%であり;
c. 位置1におけるアミノ酸アルギニンの頻度が約5%であり、位置2、3、及び4においては約18%から約20%まで様々であり、
前記CDRの長さが5である場合、
a. 位置1、2、3、4、及び5におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約3%、0.05%、20%、0.1%、及び6%であり;
b. 位置1、2、3、4、及び5におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6%、18%、0.2%、0.1%、及び0.05%であり、
前記CDRの長さが6である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約3.00%、0.15%、2%、25%、0.05%、及び3.5%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約3.43%、5.61%、0.09%、0.06%、7.79%、及び0.08%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.05%、7.78%、7.48%、4.37%、4.53%、及び1.77%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、及び6におけるアミノ酸セリンの頻度が、それぞれ、約1.76%、9.44%、8.13%、8.93%、0.26%、及び1.43%であり、
前記CDRの長さが7である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、及び7におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約3.65%、0.18%、0.08%、3.09%、43.63%、0.15%、及び3.01%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、及び7におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約3.33%、7.19%、12.74%、1.11%、0.21%、0.09%、及び3.34%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、及び7におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.09%、4.68%、0.23%、2.74%、3.95%、0.06%、及び3.53%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、及び7におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6.98%、15.99%、3.98%、4.13%、1.00%、1.16%、及び0.67%であり、
前記CDRの長さが8である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約4.56%、6.02%、2.69%、4.00%、1.82%、35.24%、0.98%、及び2.61%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約3.17%、3.28%、3.30%、5.44%、2.19%、2.99%、0.93%、及び4.74%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.05%、6.05%、3.76%、1.04%、3.79%、1.47%、0.68%、及び4.64%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、及び8におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6.24%、5.58%、8.88%、8.36%、5.24%、0.10%、0.88%、及び3.18%であり、
前記CDRの長さが9である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.96%、1.92%、2.31%、2.13%、2.36%、2.05%、44.15%、0.86%、及び2.59%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.68%、2.83%、3.24%、3.36%、3.13%、3.94%、1.12%、0.93%、及び4.74%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.98%、3.49%、3.57%、3.96%、3.79%、9.19%、3.71%、1.06%、及び5.26%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、及び9におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約4.93%、9.19%、9.45%、9.10%、9.50%、3.21%、0.07%、0.83%、及び3.97%であり、
前記CDRの長さが10である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.12%、2.44%、2.27%、2.49%、2.18%、2.78%、2.64%、55.93%、0.56%、及び2.32%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.66%、2.95%、3.25%、3.15%、3.22%、3.10%、1.22%、1.35%、0.91%、及び4.76%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.42%、3.12%、3.57%、2.78%、3.00%、2.81%、4.00%、1.22%、0.78%、及び4.08%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、及び10におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.28%、9.13%、9.97%、9.70%、10.04%、9.91%、4.20%、0.07%、1.12%、及び3.81%であり、
前記CDRの長さが11である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.10%、2.30%、2.51%、2.24%、2.47%、2.43%、2.24%、2.10%、54.27%、0.58%、及び2.76%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.68%、2.74%、2.98%、3.40%、2.98%、3.33%、3.54%、4.20%、0.97%、1.26%、及び4.40%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.61%、3.72%、2.90%、3.27%、3.07%、2.90%、2.98%、5.78%、3.05%、0.99%、及び4.22%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、及び11におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.62%、9.57%、10.06%、10.35%、9.61%、9.14%、10.00%、2.18%、0.00%、1.11%、及び4.14%であり、
前記CDRの長さが12である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.06%、2.42%、2.08%、2.44%、1.88%、2.46%、2.59%、2.34%、2.17%、52.70%、0.65%、及び2.49%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.59%、3.31%、3.58%、3.12%、3.24%、3.27%、3.62%、6.42%、1.28%、0.89%、1.14%、及び4.65%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.62%、3.52%、3.50%、3.43%、3.64%、2.72%、3.35%、4.82%、6.23%、3.16%、0.82%、及び3.96%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、及び12におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.18%、10.28%、10.15%、10.64%、10.28%、10.11%、10.11%、5.52%、2.88%、0.00%、0.80%、及び3.50%であり、
前記CDRの長さが13である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.02%、2.09%、2.13%、2.28%、2.44%、2.32%、2.49%、2.40%、4.51%、4.85%、54.39%、0.86%、及び2.65%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.61%、3.28%、3.34%、3.07%、3.47%、3.22%、3.32%、3.34%、9.54%、2.13%、0.94%、1.11%、及び4.16%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.86%、3.70%、3.49%、3.53%、3.07%、3.07%、3.24%、3.24%、1.98%、4.26%、2.61%、0.75%、及び3.38%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、及び13におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.85%、9.77%、9.46%、9.38%、9.86%、9.94%、9.90%、9.54%、5.14%、1.34%、0.00%、0.81%、及び3.13%であり、
前記CDRの長さが14である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.00%、2.48%、2.33%、2.42%、2.37%、3.01%、2.42%、2.22%、2.79%、4.02%、4.09%、54.77%、0.70%、及び1.96%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.46%、3.49%、3.56%、3.41%、3.23%、3.58%、3.27%、3.25%、3.19%、2.04%、2.37%、0.92%、1.54%、2.94%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.82%、3.58%、3.41%、3.10%、2.86%、3.45%、2.50%、3.05%、2.53%、7.32%、5.36%、3.05%、0.81%、及び0.26%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、及び14におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.78%、9.69%、8.94%、9.53%、10.04%、9.89%、9.82%、10.26%、10.22%、10.26%、1.82%、0.00%、0.90%、及び1.14%であり、
前記CDRの長さが15である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.07%、2.02%、2.25%、2.29%、2.82%、2.43%、2.38%、2.32%、3.74%、3.23%、4.03%、4.38%、54.81%、0.80%、及び2.29%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.80%、3.32%、2.91%、2.98%、3.42%、3.46%、2.89%、3.44%、1.93%、2.34%、2.73%、2.77%、0.78%、1.33%、及び2.54%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約1.65%、3.44%、3.62%、3.58%、3.09%、3.12%、2.66%、2.61%、7.66%、6.92%、7.40%、3.12%、2.43%、0.69%、及び0.23%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、及び15におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.96%、10.13%、9.26%、9.58%、10.32%、10.09%、9.01%、9.67%、11.10%、10.45%、9.67%、3.42%、0.00%、0.83%、及び0.85%であり、
前記CDRの長さが16である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.12%、1.57%、1.75%、2.62%、2.85%、2.50%、2.85%、2.21%、2.97%、2.74%、3.38%、3.38%、2.39%、50.47%、1.22%、及び2.91%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.87%、2.33%、3.03%、2.85%、3.67%、2.56%、3.32%、2.74%、2.68%、1.98%、2.39%、2.27%、0.17%、0.64%、0.81%、及び2.79%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.44%、16.94%、3.61%、6.00%、3.61%、3.61%、3.73%、3.38%、7.51%、10.30%、11.76%、8.21%、4.95%、2.56%、0.81%、及び1.34%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、及び16におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約6.40%、9.72%、8.91%、9.84%、10.01%、9.14%、9.66%、9.49%、8.21%、9.60%、8.15%、8.96%、0.58%、0.00%、1.34%、及び0.99%であり、
前記CDRの長さが17である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.06%、1.37%、2.47%、2.96%、2.91%、2.01%、2.85%、2.44%、3.05%、2.59%、3.31%、3.37%、2.59%、0.64%、37.93%、0.70%、及び3.31%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.64%、4.56%、3.14%、2.47%、3.69%、3.25%、3.11%、3.84%、3.55%、2.27%、1.95%、1.74%、2.35%、1.71%、0.00%、1.28%、1.39%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.79%、7.29%、3.31%、10.52%、2.44%、4.50%、3.89%、4.53%、3.95%、9.79%、9.82%、10.20%、10.32%、2.32%、1.63%、1.25%、及び7.90%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、及び17におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.81%、14.44%、9.97%、8.95%、8.78%、9.47%、8.37%、9.47%、9.33%、9.82%、10.29%、9.76%、9.85%、1.31%、0.00%、1.16%、及び1.02%であり、
前記CDRの長さが18である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.05%、1.37%、2.07%、2.43%、3.39%、2.28%、2.73%、3.39%、2.83%、2.53%、3.59%、3.19%、3.14%、3.14%、0.56%、37.96%、1.11%、及び3.39%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.66%、2.78%、2.83%、1.52%、2.33%、3.64%、3.90%、2.73%、3.64%、4.25%、2.02%、2.53%、2.63%、2.94%、0.51%、0.05%、1.32%、及び1.42%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.02%、4.35%、3.64%、11.69%、11.03%、3.29%、4.61%、3.54%、5.31%、4.55%、11.39%、8.76%、10.17%、8.76%、5.11%、2.13%、0.91%、及び9.67%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、及び18におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.97%、9.77%、9.01%、9.56%、8.50%、8.96%、9.36%、9.11%、10.98%、9.46%、10.58%、8.96%、9.36%、8.25%、2.23%、0.05%、0.76%、及び0.86%であり、
前記CDRの長さが19である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.17%、0.81%、2.20%、3.08%、2.84%、3.28%、6.30%、8.97%、2.40%、3.08%、3.39%、3.73%、3.45%、1.19%、4.20%、0.44%、40.09%、1.02%、及び3.49%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.98%、1.69%、2.88%、2.84%、2.64%、1.76%、4.03%、2.57%、4.30%、3.12%、2.47%、2.10%、2.64%、11.45%、7.31%、0.03%、0.00%、1.46%、及び1.19%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.54%、10.26%、3.66%、11.62%、9.82%、9.92%、0.44%、4.03%、4.27%、5.25%、9.85%、9.99%、8.84%、2.44%、3.05%、2.78%、1.42%、0.81%、及び9.72%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、及び19におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.38%、12.09%、7.92%、9.04%、9.21%、8.53%、0.61%、1.76%、9.18%、8.91%、10.19%、8.77%、9.11%、3.93%、0.54%、1.08%、0.00%、0.95%、及び1.05%であり、
前記CDRの長さが20である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸グルタミン酸の頻度が、それぞれ、約15.56%、4.65%、3.96%、7.86%、4.75%、2.14%、0.82%、3.96%、4.59%、3.99%、5.19%、4.71%、5.03%、0.31%、3.99%、0.06%、0.06%、0.00%、2.39%、及び0.00%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.66%、2.67%、3.17%、1.13%、2.01%、0.31%、3.52%、3.49%、3.36%、3.21%、2.36%、2.64%、2.42%、4.34%、4.09%、3.96%、1.16%、0.09%、1.45%、及び1.07%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.39%、3.49%、3.61%、3.11%、11.44%、1.76%、1.38%、4.37%、3.71%、5.00%、10.09%、9.90%、9.90%、6.38%、4.87%、6.44%、0.31%、1.19%、0.91%、及び9.55%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、及び20におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.41%、8.67%、9.71%、4.87%、9.37%、1.98%、3.49%、8.74%、9.21%、8.89%、8.96%、9.87%、10.47%、4.43%、1.67%、4.09%、2.83%、0.00%、0.97%、及び1.26%であり、
前記CDRの長さが21である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.00%、2.07%、0.28%、2.93%、2.31%、5.82%、6.92%、7.44%、7.10%、7.13%、7.20%、11.47%、0.59%、0.65%、4.34%、6.17%、2.20%、0.17%、35.45%、2.17%、及び2.58%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.65%、0.14%、4.17%、2.79%、3.44%、1.52%、1.31%、0.93%、1.17%、1.38%、1.76%、2.89%、6.48%、0.41%、4.20%、0.24%、4.51%、0.34%、0.00%、1.03%、及び2.17%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.20%、9.06%、4.48%、4.24%、4.13%、2.86%、2.55%、2.24%、3.10%、3.38%、3.31%、18.05%、6.44%、8.54%、2.79%、2.89%、8.27%、1.10%、1.83%、1.55%、及び8.23%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及び21におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.99%、3.82%、8.96%、9.20%、9.20%、4.27%、4.13%、4.68%、4.99%、4.62%、4.00%、10.27%、6.30%、9.68%、5.99%、1.79%、3.41%、1.72%、0.24%、1.00%、及び0.03%であり、
前記CDRの長さが22である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.04%、5.37%、3.13%、6.33%、3.67%、0.27%、6.95%、6.49%、7.34%、3.79%、3.28%、3.79%、5.99%、7.34%、0.19%、0.27%、0.19%、0.31%、3.24%、36.27%、0.85%、及び9.35%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.50%、0.00%、4.21%、0.19%、4.17%、4.21%、1.04%、1.43%、1.51%、1.85%、2.90%、2.01%、1.27%、1.08%、0.39%、0.27%、0.12%、7.61%、0.12%、0.08%、1.47%、及び0.00%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約2.74%、7.96%、4.75%、18.23%、8.50%、3.59%、2.47%、2.94%、2.74%、10.31%、10.35%、9.62%、3.13%、3.05%、13.90%、0.27%、5.37%、0.23%、0.31%、1.78%、1.39%、and 2.47%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、及び22におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約5.83%、17.50%、8.42%、5.06%、4.52%、4.79%、4.91%、4.48%、4.60%、9.39%、8.42%、8.57%、4.36%、4.44%、0.58%、3.59%、6.06%、0.23%、6.30%、0.04%、0.77%、及び0.00%であり、
前記CDRの長さが23である場合、
a. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が、それぞれ、約0.00%、0.29%、0.15%、0.49%、8.00%、3.07%、3.76%、0.59%、9.03%、3.90%、4.25%、9.42%、0.44%、3.90%、0.34%、3.32%、3.51%、0.10%、3.90%、0.39%、43.24%、0.83%、及び4.73%であり;
b. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸アスパラギンの頻度が、それぞれ、約0.24%、0.05%、0.15%、0.15%、4.69%、5.32%、0.10%、0.15%、14.84%、0.20%、4.49%、4.64%、4.25%、5.42%、0.10%、8.30%、0.05%、0.10%、4.69%、0.00%、0.00%、1.12%、及び0.00%であり;
c. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸プロリンの頻度が、それぞれ、約0.24%、9.91%、3.71%、3.61%、5.32%、2.73%、3.61%、3.81%、7.42%、2.10%、6.69%、4.34%、2.93%、8.39%、11.27%、3.17%、0.20%、0.24%、0.34%、4.05%、0.88%、1.22%、及び9.22%であり;
d. 位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、及び23におけるアミノ酸アルギニンの頻度が、それぞれ、約0.44%、4.39%、8.69%、22.40%、7.76%、4.49%、4.05%、3.42%、0.78%、9.13%、10.35%、3.66%、11.52%、3.95%、0.29%、8.25%、0.20%、6.69%、0.20%、0.44%、0.00%、1.95%、及び0.05%である、
請求項1に記載の合成ライブラリー。 - CDRが、CDR1、CDR2、及びCDR3を含む群から選択され、好ましくは、CDRがCDR3である、請求項1に記載の合成ライブラリー。
- ・抗体分子の重鎖が、配列番号1、3、5、7、9、11、又は13から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号2、4、6、8、10、12、又は14から選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み;
・抗体分子の軽鎖(カッパ)が、配列番号15、17、19、若しくは21から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号16、18、20、若しくは22から選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み、又は抗体分子の軽鎖(ラムダ)が、配列番号23、25、若しくは29から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号24、26、若しくは28から選択されるコンセンサスアミノ酸配列を含み;
・重鎖のフレームワーク領域1、2、及び3が、配列番号30〜49から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・重鎖のCDR1及びCDR2が、配列番号50〜63から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(カッパ)のフレームワーク領域1、2、3、及び4が、配列番号64〜79から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(カッパ)のCDR1、CDR2、及びCDR3が、配列番号80〜91から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(ラムダ)のフレームワーク領域1、2、3、及び4が、配列番号92〜103から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含み;
・軽鎖(ラムダ)のCDR1、CDR2、及びCDR3が、配列番号104〜112から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の合成ライブラリー。 - ライブラリーが約1010〜約1011個のクローンを含み、合成抗体ライブラリーが、ファージ若しくは酵母の表面上に発現した一群の抗体分子であり、又はファージ若しくは酵母若しくはそれらの組合せから単離された一群の抗体分子である、請求項1に記載の合成ライブラリー。
- a)少なくとも1つの所定の特徴を有する抗体分子をスクリーニング及び同定する工程、
b)同定された分子を、
CDR3重鎖(CDRH3)の長さ分布分析及び前記CDRH3内のアミノ酸の出現頻度に基づいて分析して、最適な鎖長及びアミノ酸頻度を決定する工程、
c)変化した抗体分子をデザインし、その後、分子を、請求項1に規定の前記最適な鎖長及びアミノ酸頻度に基づいて、コドン置き換えテクノロジーに供して、改変CDRH3を有する抗体分子を得る工程、並びに
d)前記分子をクローニングして、ライブラリーを形成する工程
を含む、請求項1に記載の合成ライブラリーを得る方法。 - スクリーニング工程が、重複の除去のために、利用可能なオンラインデータベース(IMGTデータベース)に由来する抗体遺伝子配列を分析することを含み、所定の特徴が、アノテーションレベル、種、立体配置の型、再編成された遺伝子の型、及び機能性、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項7に記載の方法。
- デザインする工程が、配列番号2、4、6、8、10、12、又は14から選択される重鎖アミノ酸配列、及び配列番号16、18、20、22、24、26、又は28から選択される軽鎖アミノ酸配列、並びに配列番号30〜112から選択される核酸配列によりコードされる1つ又は複数のアミノ酸配列を有するフレームワーク領域及びCDRを含む抗体分子を合成することを含む、請求項7に記載の方法。
- 改変CDRH3を有する抗体分子が、ファージベクターにより個々にディスプレイされ、又はファージベクター、その後、酵母ベクターにより逐次的にディスプレイされる、請求項7に記載の方法。
- ファージ又は酵母ベクターによる抗体分子のディスプレイが
対応する抗体遺伝子をファージへクローニングして、ファージ抗体ライブラリーを得、その後、ディスプレイされた分子を抗原に対してスクリーニングして、パニングされたファージ抗体ライブラリーを得る工程、
パニングされたファージ抗体ライブラリーを、前記抗体分子の酵母の表面上でのディスプレイのために酵母へ移入し、その後、酵母にディスプレイされた抗体分子を抗原に対してスクリーニングして、酵母でスクリーニングされた抗体ライブラリーを得る工程、及び
所望の機能的特性を有するファージ若しくは酵母にディスプレイされた抗体分子を選択して、合成抗体ライブラリーを形成し、又は所望の機能的特性を有する選択された抗体分子をファージ抗体ライブラリー若しくは酵母抗体ライブラリーから単離して、スクリーニングされた抗体合成ライブラリーを作製する工程
を含む、請求項10に記載の方法。 - 抗体分子が、ファージ又は酵母ベクターへのクローニングのためのFab又はscFvのフォーマットであり、ファージベクターへの形質転換効率が約109から約1010の範囲であり、酵母ベクターへの形質転換効率が約106から約108の範囲である、請求項10又は11に記載の方法。
- ファージライブラリーを得るためのスクリーニング工程が、磁気ビーズ上にコーティングされた抗原でパニングして、対象とする抗体を単離することを含み、前記ファージディスプレイスクリーニング/パニングが、非結合性抗体を除去するために利用される、請求項11に記載の方法。
- 表面ディスプレイによる酵母ライブラリーを得るためのスクリーニング工程が、競合抗原エピトープ、抗体パラトープ立体構造、配列及び配列モチーフ、又はそれらの任意の組合せを利用することにより行われて、タバコエッチウイルス(Tobacco Etch Virus)(TEV)、エンテロキナーゼ、トロンビン、第Xa因子、HRV 3Cプロテアーゼ、及び類似したプロテアーゼ切断部位、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択されるプロテアーゼ切断部位を用いてFab又はscFv分子を単離する、請求項11に記載の方法。
- 合成抗体ライブラリーが、ファージ若しくは酵母の表面上に発現した一群の抗体分子であり、又はファージ若しくは酵母若しくはそれらの組合せから単離された一群の抗体分子である、請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の合成ライブラリー、又は請求項7に記載の方法により得られるような合成ライブラリーから単離された抗体分子。
- ・配列番号1、3、5、7、9、11、又は13から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号2、4、6、8、10、12、又は14から選択される重鎖コンセンサスアミノ酸配列;
・配列番号15、17、19、若しくは21から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号16、18、20、若しくは22から選択される軽鎖コンセンサスアミノ酸配列、又は配列番号23、25、若しくは29から選択される対応する核酸配列によりコードされる配列番号24、26、若しくは28から選択されるコンセンサスアミノ酸配列;
・配列番号30〜49、64〜79、又は92〜103から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるフレームワーク領域;及び
・配列番号50〜63、80〜91、又は104〜112から選択されるコンセンサス核酸配列によりコードされるCDR
を含む抗体分子であって、
前記CDRの長さが4である場合、位置2、3、及び4におけるアミノ酸アルギニンの頻度が約18%から約20%まで様々であり;
前記CDRの長さが5である場合、位置3におけるアミノ酸プロリンの頻度が約20%であり;
前記CDRの長さが6である場合、位置4におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約25%であり;
前記CDRの長さが7である場合、位置5におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約43.63%であり;
前記CDRの長さが8である場合、位置6におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約35.24%であり;
前記CDRの長さが9である場合、位置7におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約44.15%であり;
前記CDRの長さが10である場合、位置8におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約55.93%であり;
前記CDRの長さが11である場合、位置9におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.27%であり;
前記CDRの長さが12である場合、位置10におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約52.70%であり;
前記CDRの長さが13である場合、位置11におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.39%であり;
前記CDRの長さが14である場合、位置12におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.77%であり;
前記CDRの長さが15である場合、位置13におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約54.81%であり;
前記CDRの長さが16である場合、位置14におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約50.47%であり;
前記CDRの長さが17である場合、位置15におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約37.93%であり;
前記CDRの長さが18である場合、位置16におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約37.96%であり;
前記CDRの長さが19である場合、位置17におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約40.09%であり;
前記CDRの長さが20である場合、位置1におけるアミノ酸グルタミン酸の頻度が約15.56%であり;
前記CDRの長さが21である場合、位置19におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約35.45%であり;
前記CDRの長さが22である場合、位置20におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約36.27%であり;
前記CDRの長さが23である場合、位置21におけるアミノ酸フェニルアラニンの頻度が約43.24%である、
抗体分子。 - 癌、関節リウマチ、神経障害、感染性疾患、及び代謝障害、又はそれらの任意の組合せを含む群から選択される疾患の処置のための治療用物質において、診断用物質として、予後診断用物質として、研究目的で、標的発見、機能ゲノミクスにおける検証、又は抗体若しくは抗体の誘導体が利用される任意の適用で使用するための、請求項1に記載の合成抗体ライブラリー、又は請求項7の方法により得られるような合成抗体ライブラリー。
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