KR20180092072A

KR20180092072A - 고성능, 고생산성 항체 라이브러리 및 이의 제작방법

Info

Publication number: KR20180092072A
Application number: KR1020170017395A
Authority: KR
Inventors: 박영우; 장세일; 이현경; 강원화; 박범찬; 박재은
Original assignee: 주식회사 와이바이오로직스
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2017-02-08
Publication date: 2018-08-17

Abstract

본 발명은 신규한 항체 라이브러리 및 그의 제작방법에 관한 것으로, 항체의 CDR에서의 서열 다양성 또는 서열 다양성 및 길이 다양성을 부여함으로써 항체 라이브러리의 다양성을 확보함과 동시에 활성이 우수한 항체 라이브러리를 제공할 수 있다.

Description

고성능, 고생산성 항체 라이브러리 및 이의 제작방법{Antibody Libraries Having high performance, high productivity and Methods for Preparation of Them}

본 발명은 (a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleontide) 분자를 준비하는 단계; (b) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링(annealing)하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭함으로써 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계;를 포함하는 항체 라이브러리 제작방법에 관한 것이다.

항체의약품은 2004년대 초반부터 현재까지 전체 의약품시장에서 가장 눈부신 고성장을 해 왔으며, 앞으로도 당분간 높은 성장률을 보일 것으로 예상된다. 따라서 해외유수의 제약기업들은 전체 신약 파이프라인의 30~40%를 항체의약품으로 채우고 있으나, 국내에서는 항체의약품 발굴을 위한 초기 기반기술의 부족으로 격차가 벌어지고 있는 실정이다.

항체의약품 개발과정은 크게 두 단계로 나뉘며, 대개 생산세포주 확립 이전의 기술은 '발굴(discovery)', 확립 이후 시료 생산 및 전임상·임상을 위한 기술은 '개발(development)'로 나뉘는데, 국내의 항체의약품 기술은 주로 바이오시밀러 사업 등을 통해 생산 및 정제공정 기술 등소위 의약품 개발의 downstream인 '개발'과정이 크게 발전해 왔으며, 특히 셀트리온이나 삼성바이오로직스 등이 주도하는 대용량 생산 설비에 의한 항체 바이오시밀러 사업은 전 세계적으로도 경쟁력이 있다.

그러나 바이오시밀러보다 부가가치가 훨씬 높은 항체 신약의 발굴을 위한 초기 기반 기술은 여전히 국내에서는 미비하며, 따라서 국내의 강점인 생산설비를 최대한 활용하여 부가가치를 높이기 위해서는 항체신약의 초기 '발굴' 과정에 대한 정부의 대폭적인 지원이 절실하다.

항체신약 "발굴"과정은 1) 타겟발굴, 2) 예비/선도항체 선별 및 최적화, 3)최종후보물질 선정, 4) 세포주 확립 및 생산공정으로 나눌 수 있으며, 이중 우수한 항체신약 '발굴'의 가장 첫 단계인 완전인간항체 선별기술인 인간항체 라이브러리 기술은 가장 먼저 개발되어야 할 기반 기술이다.

최근 항체 치료제가 바이오 의약품분야에서 각광을 받게 된 이유는 인간화 항체 및 인간 항체와 같은 인체가 만드는 항체와 동일한 구조의 완전 인간항체를 제조할 수 있는 기술이다. 그러나 항체의 제조 기술에 대한 접근이 매우 한정되어 있으며, 한국적 실정에 맞는 기술은 인간항체 라이브러리 기술로 항체 라이브러리로부터 치료용 목적에 맞는 인간항체를 제조하려면, 라이브러리가 세계적 항체회사들이 보유하고 있는 수준이어야 하는데, 이러한 수준의 고성능 라이브러리의 구축은 일반적인 실험실에서는 어려우며, 따라서 집중적인 투자가 필요하다.

본 발명은 (a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleontide) 분자를 준비하는 단계; (b) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링(annealing)하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭함으로써 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계;를 포함하는 항체 라이브러리 제작방법 등을 제공하고자 한다.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 (a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleontide) 분자를 준비하는 단계; (b) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링(annealing)하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭함으로써 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계;를 포함하는 항체 라이브러리 제작방법을 제공한다.

상기 (b) 단계의 프라이머는 DI-프라이머(Diversity imparting-primer)이고, 상기 DI-프라이머는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩되는 항체 가변영역의 CDR(complementarity determining region)의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성(diversity)이 도입되도록 하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머는 상기 아미노산 잔기 다양성이 발생되는 위치에 오는 복수의 아미노산을 코딩하는 복수의 코돈에 대응하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 상기 CDR의 특정 위치에서의 아미노산 잔기의 다양성 도입은 상기 특정 위치에서 2 내지 20 종류의 소정(predetermined)의 아미노산 잔기가 크기가 다르게 구성될 수 있다.

상기 아미노산 잔기의 크기는 2 내지 20개일 수 있다.

상기 CDR의 특정 위치는 중쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 3), CDR2 및 CDR3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 CDR의 특정위치일 수 있다.

본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDR의 라이브러리를 제공한다:

[일반식 1]

N1-N2-...-Nn-Cm-...-C3-C2-C1-Thy-Asp

상기 일반식에서, n+m은 0 내지 18의 정수이고, 상기 C1 내지 Cm은 다양성 아미노산 잔기이다.

본 발명은 상기 중쇄 가변영역의 CDR의 라이브러리를 포함하는 항체 라이브러리를 제공한다.

본 발명에 따른 항체 라이브러리는 다양성뿐만 아니라, 생산성이 향상되었는 바, 다양한 질환에서 새로운 치료용 항체 개발을 위한 타겟 유전자군을 규명할 수 있으므로 항체신약 파이프라인 구축에 기여할 수 있다.

또한, 조기 진단이 필요한 질환의 경우 진단용 항체를 라이브러리로부터 선별함으로써 진단용 ELISA kit를 개발할 수 있으며, 다양한 질환 관련 단백질의 발현을 예측할 수 있는 항체 칩(chip) 개발도 가능해지므로 질병의 진단 및 예후 예측에도 기여할 수 있다.

도 1은 중쇄의 CDR3에 Randomization을 갖는 Ymax-nABL phage-display library의 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 269개의 natural H0CDR-3에서 분석된 통계자료를 나타낸 것이다.
도 3은 발현율이 높은 인간항체 클론들의 germline 그룹을 나타낸 것이다.
도 4는 FR4 서열에 따른 2개의 서로 다른 backbone 그룹을 나타낸 것이다.
도 5는 합성 라이브러리 제작을 위한 primer design 및 PCR 모식도를 나타낸 것이다.
도 6은 그룹 I에 속하는 항체 backbone에 대한 1st PCR 증폭 산물을 나타낸 것이다.
도 7은 그룹 II에 속하는 항체 backbone에 대한 1st PCR 증폭 산물을 나타낸 것이다.
도 8은 1st PCR을 통해 얻어진 증폭산물의 정제 후 agarose gel electrophoresis 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 1st PCR에 대한 PCR cycle 수 및 정제된 증폭산물의 정량값을 나타낸 것이다.
도 10은 2nd PCR을 통해 얻어진 증폭산물의 정제 후 agarose gel electrophoresis 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 정제된 2nd PCR 증폭산물의 정량값을 나타낸 것이다.
도 12는 Library I, I, III의 DNA와 phagemid vector의 ligation 후 전기영동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 아미노산 서열수에 따른 라이브러리의 diversity 크기를 나타낸 것이다.
도 14는 인간항체 라이브러리로부터 개발후보항체 선별 과정을 나타낸 것이다.
도 15는 1~3차 패닝을 통해 enrich된 양성 파아지 titer와 항원에 대한 결합정도 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 Monoclone phage 96종의 항원에 대한 direct ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 VEGF에 결합하는 양성 Mono phage 27종에 대한 BstI fingerprinting 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 1차 선별한 hit 파아지 항체들의 불특정 항원에 대한 non-specificity test 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 Phagemid의 ScFv로부터 IgG conversion에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 20은 최종 선별된 항-VEGF 항체의 SDS-PAGE 분석 및 생산성 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 정제된 7종의 항체에 대하여 ELISA 방식으로 항원 VEGF에 대한 binding affinity를 Kd value로 나타낸 것이다.

종래 인간항체 파아지-디스플레이 라이브러리들은 항원과의 높은 결합력을 가진 항체를 선별하기 위하여 다양성(diversity size)만을 강조하여 동물세포에서의 생산성이 극히 낮은 항체들이 종종 선별된다는 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 다양성뿐만 아니라 생산성이 증대된 항체 라이브러리에 대해 연구하던 중, 이미 높은 생산성이 확인된 VH3, VH1, VH5 germline 항체(가장 빈번히 선별되는 항체 그룹) 30여종의 heavy chain backbone에 CDR3 부분을 주로 randomization한 결과, 2 × 10¹⁰ 이상의 다양성을 가질 뿐만 아니라, 생산성이 증대된 항체 라이브러리를 제작함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 내 "항체"란 면역체계에서 매우 중요한 역할을 하는 단백질로 혈액 내에 다량으로 존재하며 외부에서 침입한 병원균이나 내부에서 생성된 암세포와 같은 유해물질들을 제거함으로서 위협으로부터 인체를 보호하는 역할을 하는 것으로서, 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)가 assembly된 일반적으로 Y 형태로 항원과 특이적으로 결합하는 부위인 가변영역(variable region or V)과 결합된 항원을 제거하는 역할을 하는 불변영역(constant region or C)으로 구분된다. 구체적으로, 상기 가변영역은 항원에 대한 특이성을 갖고 있어 항체마다 서로 다르며, 상기 불변영역은 동일한 기능을 하여 항체의 종류에 상관없이 동일하다. 또한, 상기 중쇄는 4개의 immunoglobulin (Ig) domain으로 구성된 단백질로 3개의 불변영역(C1-C2-C3)과 1개의 가변영역(V_C)으로 나뉘고, 상기 경쇄는 2개의 Ig domain으로 구성되었으며 1개의 불변영역(C_L)과 1개의 가변영역(V_L)을 갖고 있다. 상기 중쇄와 경쇄의 가변영역에는 특히 항원을 인지하는 CDR(complementary determining region)을 각각 3군데 가지고 있으며 항체마다 이 부분은 다양한 아미노산 서열을 가짐으로써 서로 다른 항원을 인식하게 된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

항체 라이브러리의 제작방법

먼저, 본 발명의 일 구현예에 따른 항체 라이브러리의 제작방법은 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleontide) 분자를 준비하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

구체적으로, 상기 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 자연계에 존재하는(natural-occurring) 인간 항체의 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 분자는 인위적으로 합성하여 이용할 수 있으며, (b) 단계에서의 유전자 증폭 과정에서 주형으로서 이용된다.

다음으로, 본 발명의 일 구현예에 따른 항체 라이브러리의 제작방법은 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링(annealing)하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭함으로써 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계[(b) 단계]를 제공한다.

본 명세서 내 "프라이머"란 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 주형에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드 (dNTPs)와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 프라이머는, 중합효소의 존재 하에서 연장산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에서 이용되는 프라이머는 주형에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머가 주형에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 구체적으로 완전히 상보적인 것을 의미한다.

구체적으로, 상기 프라이머는 DI-프라이머(Diversity imparting-primer)이고, 상기 DI-프라이머는 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩되는 항체 가변영역의 CDR(complementarity determining region)의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성(diversity)이 도입되도록 하는 프라이머의 조합이며, 상기 DI-프라이머는 상기 아미노산 잔기 다양성이 발생되는 위치에 오는 복수의 아미노산을 코딩하는 복수의 코돈에 대응하는 서열을 포함할 수 있다.

상기 DI-프라이머는 크게 3개의 부위(portion)로 구성되어 있다: 5'-혼성화 및 비다양성 부위 Ⅰ-다양성 도입부위-비다양성 부위 Ⅱ-3'.

DI-프라이머에서 5‘-말단쪽에 있는 “혼성화 및 비다양성 부위 I(hybridizing and non-diversity portion I)”는 항체 유전자 주형에 상보적인 서열을 가지는 부위로서 주형과 혼성화(즉, 어닐링)하는 부위이며, 다양성이 도입되지 않는 주형과 동일한 아미노산 서열을 생성시키는 부위이다.

“다양성-도입 부위(diversity-imparting portion)” 및 "비다양성 부위 II(non-diversity portion II)”는 주형과 혼성화 하지 않는 부위이다.

“다양성-도입 부위(diversity-imparting portion)”는 CDR의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성이 발생되도 록 하는 부위로서, 아미노산 잔기 다양성이 발생되는 위치에 오는 복수의 아미노산을 코딩하는 복수의 코돈에 대응하는 서열을 포함한다.

DI-프라이머의 "비다양성 부위 II(non-diversity portion II)"는 항체 유전자 주형에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 동일한 서열을 코딩하는 부위이다. 비다양성 부위 II는 대체적으로, 주형에 대해 상보적인 서열을 갖지만, 다양성-도입 부위가 주형에 혼성화 되지 않기 때문에, 비다양성 부위 II도 주형에 대해 혼성화 되지 않는다.

또한, 상기 CDR의 특정 위치에서의 아미노산 잔기의 다양성 도입은 상기 특정 위치에서 2 내지 20 종류의 소정(predetermined)의 아미노산 잔기가 크기가 다르게 구성될 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산 잔기의 크기는 2 내지 20개일 수 있으며, 6 내지 24인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

더 나아가, 상기 상기 CDR의 특정 위치는 중쇄 가변영역의 CDR1(complementarity determining region 3), CDR2 및 CDR3로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 CDR의 특정위치 일 수 있으며, CDR3인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

마지막으로, 본 발명의 일 구현예에 따른 항체 라이브러리의 제작방법은 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계[(c) 단계]를 제공한다.

폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 얻는 과정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.

본 발명을 항체 파아지 디스플레이(antibody phage display: APD) 방식으로 실시하는 경우, 단계 (c)는 다음의 단계를 포함한다: (c-1) 단계 (b)에서 제작된 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 파아지미드 벡터에 삽입하고 숙주세포에 형질전환시키는 단계; 및 (c-2) 상기 숙주세포에서 항체를 발현시켜 항체 라이브러리를 수득하는 단계.

APD에서 이용될 수 있는 파아지미드 벡터는 당업계에 공지된 어떠한 파아지미드 벡터도 포함한다. 예를 들어, pComb3 시리즈의 벡터(예컨대, pComb3XSS 벡터)를 이용할 수 있다. 파아지미드 벡터는 “-프로모터-리더 서열-항체-항체 유전자-코트 단백질 코딩 유전자”의 발현 컨스트럭트를 포함할 수 있으며, 또한 6X His tag 또는 HA(hemagglutin) tag을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 발현 컨스트럭트에서 적합한 프로모터는 예컨대, LacZ 프로모터(lacZ), 알칼라인 포스파타아제 phoA 프로모터(Ap), 박테리오파아지 λPL 프로모터, tac 프로모터, 트립토판 프로모터 및 T7 프로모터를 포함한다. 상기 리더 서열은 예컨대, OmpA, LamB, OmpF, MalE 및 PhoA 리더 서열을 포함한다. 상기 코트 단백질 코딩 유전자는 gIII, PIII, PVIII, p3, Soc(T4), Hoc(T4), gpD, 6(pVI) 및 P8 코딩 유전자를 포함한다.

APD에서 이용될 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 세포도 포함하며, 예를 들어 Escherichia coli (E. coli)를 이용할 수 있으며, 구체적으로 전기천공(electroporation) 역량(competent) E. coli를 이용할 수 있다. 파아지미드 벡터를 숙주세포에 형질전환시키는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시할 수 있으며, 예를 들어 전기천공 방법으로 실시할 수 있다.

숙주세포에서 항체를 발현시키는 것은, 예컨대 프로모터로서 LacZ 프로모터를 이용하는 경우 적합한 발현 유도체(예컨대, IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside))를 배지에 첨가하여 항체를 대량 발현시킬 수 있다.

항체의 발현 후, 타겟으로 하는 항원과 발현된 항체를 이용하여 패닝 과정을 실시할 수 있다(Ehrlich GK, et al., Phage display technology. Affinity selection by biopanning. Methods in molecular biology., 147:195-208(2000). 패닝 과정에 의해 타겟으로 하는 항원과 친화도를 나타내는 항체 라이브러리를 본 발명의 항체 라이브러리로 선택한다.

본 발명에 따르면, 단계 (c)에서 제작된 항체 라이브러리의 다양성은 최소 10⁶ 내지 10¹⁵일 수 있고, 10⁸ 내지 10¹⁰인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

중쇄 가변영역의 CDR의 라이브러리

본 발명은 하기 일반식 1의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역의 CDR의 라이브러리를 제공한다.

[일반식 1]

N1-N2-...-Nn-Cm-...-C2-C1-Thy-Asp

구체적으로, 상기 C1은 페닐알라닌(Phenylalanine, F), 메티오닌(Methionine, M), 루신(Leucine, L) 및 발린(Valine, V)으로 구성된 군에서 선택되는 하나일 수 있으며, 페닐알라닌인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 C2는 티로신(Tyrosine, T), 글리신(Glycine, G), 알라닌(Alanine, a) 및 아스파르트산(Aspartic acid, D)로 구성된 군에서 선택되는 하나일 수 있으며, 티로신인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

항체 라이브러리

본 발명은 상기의 중쇄 가변영역의 CDR의 라이브러리를 포함하는 항체 라이브러리를 제공한다.

상기 CDR의 라이브러리의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 골격항체 제작

Ymax-sABL은 인간항체 합성 라이브러리로 항체의 중쇄(heavy chain) 가변영역 중 CDR3의 크기와 아미노산 서열을 randomize한 ScFv형태의 phage 디스플레이 라이브러리이다. 상기 라이브러리는 중쇄의 CDR3 (H-CDR3)를 제외한 모든 부분은 발현이 잘되는 VH3 germline, VH1 germline, VH5 germline의 일부 클론들을 backbone으로 사용하였다.

항체의 경쇄는 골수에서 유래된 인간 B 세포의 naive cDNA를 통해 구축한 라이브러리 DNA를 사용하였고, H-CDR3를 합성하는데 269개의 natural H-CDR3에서 분석된 통계자료(도 2)를 활용하여 하기와 같은 사항을 고려하였다.

ⅰ) H-CDR3의 길이는 6-14개 아미노산로 한정함.

ⅱ) H-CDR3의 C1은 Tyrosine (Y)으로, C2는 Aspartic acid (D)로 고정하였음. 길이가 작은 H-CDR3는 전체를 N(20개 아미노산)으로 함.

ⅲ) H-CDR3내에 termination codon (TAA, TAG, TGA)가 최소화 되면서 20개 아미노산이 모두 포함되도록 random codon을 조정함.

ⅳ) hapten과 같은 작은 peptide를 선별하기 위해 CDR3 loop 구조를 열어줄 수 있도록, C2의 Aspartic acid 잔기를 Alanine으로 치환함.

Ymax-sABL 라이브러리의 backbone은 기존에 ㈜와이바이오로직스에서 발굴한 인간항체들 중 발현율이 비교적 높은 클론들을 선정하고자 하였고, 46종의 인간항체 리스트를 하기 표 1에 나타냈다. 하기 표 1에 나타낸 인간항체 리스트는 HEK293 임시발현 시스템에서의 최종 정제 후 생산성이 100 mg/L 이상의 클론이다.

상기 표 1에 나타난 클론 중쇄의 아미노산 서열이 human germline의 어떤 그룹과 homology를 갖는지를 분석하였고, 클론들의 아미노산 alignment 결과를 토대로 FR4 서열에 따른 2개의 서로 다른 backbone 그룹을 선정하였다.

도 3은 발현율이 높은 인간항체 클론들의 germline그룹을 나타낸 그림이다.

도 3에 나타난 바와 같이, 발현율이 높은 다양한 그룹이 확인되었으나, 그 중에서도 대체로 발현이 잘 된다고 알려진 VH3 그룹이 25종, VH1 그룹이 8종, VH5 그룹이 2종이었다.

도 4은 FR4서열에 따른 2개의 서로 다른 backbone 그룹을 나타낸 그림이다.

도 4에 나타난 바와 같이, 대부분의 클론들이 FR4 지역에 L(/M) D V WGQGT T VTVSS 혹은 L(/F) D Y WGQGT L VTVSS의 2가지 서열을 가지고 있음이 확인되었으며, 따라서 FR4 서열에 따라 8개 또는 9개의 항체 서열이 포함된 크게 2개 그룹의 backbone을 최종 선정하였고, 최종 backbone으로 선정된 2개 그룹의 항체 클론 리스트, FR4서열 및 발현율을 하기 표 2에 나타냈다.

실시예 2. CDR 서열 다양성 생성을 위한 PCR 프라이머 제작

2-1) 라이브러리 구축을 위한 PCR 프라이머 제작

실시예 1에서 선정된 항체의 중쇄 backbone DNA를 주형으로 합성 라이브러리의 DNA를 증폭하기 위한 프라이머를 제작하였다. 두 번의 연속된 PCR을 통해 최종 항체의 DNA가 증폭이 되는데 upper primer의 경우, backbone DNA가 삽입된 pYG100 plasmid의 vector primer를 동일하게 사용하였으나, downstream primer는 CDR3가 포함되도록 하며 서열의 다양성을 줄 수 있도록 2가지 primer를 사용하였다. 그 결과, 첫 번째 PCR을 통해 library DNA를 증폭하고, 두 번째 overlapping PCR을 통해 subcloning이 가능하도록 FR4 전체와 restriction enzyme linker를 포함하도록 하였다.

두 가지 downstream primer 중 1^st downstream primer는 CDR3의 바로 앞에 위치한 FR3의 7개 아미노산을 포함하였다. 그 다음으로 CDR region을 포함하지만 4~12 아미노산이 random하게 들어갈 수 있도록 하기 위하여, 크기가 다르게 NNK가 반복되도록 design 하였으며, 마지막으로 CDR3 바로 뒤쪽의 FR4 5개 아미노산이 포함되도록 하는 63~87mer 의 긴 primer를 하기 표 3과 같이 design 하였다. 또한, 2^nd downstream primer는 1^st primer의 3' 끝부분과 overlapping이 되도록 하는 서열이 5'에 위치하며 전체 FR4가 모두 포함되도록 서열을 추가하여 60mer의 primer를 design하였다.

2-2) PCR에 의한 라이브러리 DNA 증폭- 1 ^st PCR

1^st PCR 조건은 template DNA인 17개 backbone 플라스미드 양을 달리하여 최적화하였다. PCR 반응 조건은 94℃ 5분 1 사이클과 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초 20 사이클, 그리고 72℃ 5분 1 사이클로 진행하였다. 그 결과, CDR3의 아미노산 서열수가 4개, 5개, 6개는 각각 0.5 ㎍, 0.6 ㎍, 0.7 ㎍이 적합하였으며, 7개~12개는 모두 1 ㎍이 적합하였다. Primer는 upper primer인 pYG100-F와 상기 표 1의 1^st downstream primer를 각각 최종 0.1 pmol이 되도록 넣었다. 최종적으로 PCR cycle 수는 아미노산 수에 따라 달리 하였는데 아미노산 서열수가 4~6개는 2회, 7~8개는 5회, 9개~12개는 9회 반복하여 수행하였다.

도 6 및 7은 표 1에 따른 그룹 Ⅰ 및 그룹 Ⅱ의 골격항체에 대한 1^st PCR 증폭 산물을 나타낸 그림이다.

상기에서 얻어진 PCR 산물은 group별로 backbone이 다르더라도 서열수가 같은 것을 모두 합쳤으며, agarose gel extraction kit을 통해 정제하였다.

도 8 및 도 9는 최종적으로 확보한 그룹 I 및 그룹 II의 1^st PCR 산물의 agarose gel 분석 및 정량값을 나타낸 것이다.

2-3) PCR에 의한 라이브러리 DNA 증폭- 2 ^nd PCR

2^nd PCR 조건은 1^st PCR product를 주형으로 하였고, 80 ng의 template DNA에 primer는 upper primer인 pYG100-F와 상기 표 1의 2^nd downstream primer를 각각 최종 0.05 pmol이 되도록 넣었고, PCR 반응 조건을 상기 2-2)와 동일하게 4회 반복하여 수행하였다. 상기와 같은 조건으로 충분한 양의 산물을 확보하기 위하여 그룹 I과 그룹 II에 대해 아미노산 서열이 4개인 경우 50개, 5~6개는 100개, 7~8개는 200개, 9~12개는 250개의 동일 시료를 준비하여 반복하였다.

도 10은 2^nd PCR에 의하여 얻어진 산물을 정제한 후 전기영동하여 최종 정제한 결과이며, 도 11은 최종 정제 산물의 정량값을 나타낸 것이다.

실시예 3. 라이게이션 및 형질전환 효율

다양성이 높은 라이브러리 제작을 위해서는 고효율의 라이게이션 및 형질전환 조건으로 진행되어야 하기 때문에, 라이게이션 및 형질전환의 효율을 확인하였다.

3-1) 라이게이션 효율

라이게이션 효율은 pYG100 phagemid vector를 이용하여 분석하였으며, 일반적으로 이용되는 CaCl₂ 열충격 형질전환 방법으로 진행하였으며, 라이게이션 조건은 하기 표 4에 나타냈다.

구분	DNA	㎍	Ligation
Library Ⅰ	Vector	5.5	O/n at RT
Library Ⅰ	MixⅠ	1.7
Library Ⅱ	Vector	38
Library Ⅱ	MixⅡ	8.7
Library Ⅲ	Vector	46
Library Ⅲ	MixⅢ	9.7

pYG100을 5.5㎍(Library Ⅰ)을 제한효소 () 로 50℃에서 1시간 동안 절단한 다음, 아가로오스 젤에 전기영동하여 벡터와 stuffer DNA를 분리하였다. 이후, 젤 용출 키트(QIAGEN, cat. #28706)로 분리된 두 종류의 DNA를 회수하였다. 회수된 DNA를 1 kb 래더 DNA 마커를 기준으로 아가로오스 젤상에서 정량한 다음, 벡터 40 ng, stuffer 40 ng를 총 부피 10 μL로 T4 리가아제(NEB) 10 unit을 처리하여 4℃ 하룻밤 인큐베이션 조건으로 라이게이션을 진행하였다.

pYG100 38㎍(Library Ⅱ) 및 46㎍(Library Ⅲ)을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 하기 표 5에 나타난 바와 같이, Library I의 경우 3.4 ㎍, Library II의 경우 10.7 ㎍, Library III의 경우 8.8 ㎍를 각각 확보할 수 있었다.

도 13은 CDR3의 아미노산 서열수에 따라 예상되는 라이브러리의 다양성을 나타낸 그림이다.

도 13에 나타난 바와 같이, 아미노산 4~6개인 Library I의 경우 10⁸ 이상, 7~8개인 Library II의 경우 10¹⁰ 이상, 9~12개인 Library III의 경우도 10¹⁰ 이상으로 예상된다.

3-2) 형질전환 효율

라이브러리 제작하는 E. coli transformation efficiency도 중요한 변수이므로 transformation 효율이 가장 높은 electroporation을 수행하였다. Electroporation 방법은 Phage Display A Laboratory Manual(Barbas et al., 2004)의 프로토콜을 참고하여 하기와 같이 진행하였으며, pUC19(Invitrogen)와 라이게이션된 pComb3XSS DNA를 사용하여 형질전환 효율의 적합성을 판단하였다.

E. coli strain ER2537(NEB)을 SB 배지(MOPS 10 g, 효모 추출물 20 g, 트립톤 30 g/1 L) 10 mL에 접종한 다음, 37℃에서 200 rpm으로 하룻밤 쉐이킹 인큐베이션 하였다. 배양된 ER2537을 글루코오스와 MgCl₂가 각각 5 mM과 1 mM 농도로 포함된 400 mL의 SB 배지에 1/100 비율로 희석하여 접종한 후, 37℃에서 200 rpm으로 쉐이킹 인큐베이션 하였다. OD600이 0.8에 도달한 ER2537 배양 플라스크를 얼음에서 15분 동안 인큐베이션 하여 세포를 차갑게 유지한 다음 4℃에서 4000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집하였다. 배지에 존재하는 염은 전기천공 과정에서 방전을 일으켜 형질전환 효율을 떨어뜨리므로 염 성분을 제거하기 위하여 배지를 제거한 다음 차갑게 유지된 10% 글라이세롤 용액 400 mL로 세포 펠릿을 재현탁하는 방법으로 세포를 세척하였다.

상기 세척 과정을 3회 반복한 후, 마지막으로 세포 펠릿을 새로운 10% 글라이세롤 용액 2 mL로 재현탁하여 전기천공을 위한 역량 세포를 준비하였다. 준비된 ER2537 전기천공-역량 세포 50 μL를 pUC19 10 pg와 섞어준 다음 0.2 mm 큐벳(BIO-RAD)에 옮긴 후, 전기천공기 (BIO-RAD)를 이용하여 2.5 kV, 25 μF, 그리고 200 Ω 조건으로 형질전환을 진행하였다. 형질전환된 ER2537을 SOC 배지 10 mL로 옮긴 후, 37℃에서 200 rpm으로 1시간 동안 쉐이킹 인큐베이션하여 세포 회수를 진행하였다. 회수된 ER2537을 카베니실린(100 μg/mL) 플레이트에 스프레딩 하여 형질전환체 수를 타이트레이션 하였다.

그 결과, 하기 표 6에 나타난 바와 같이, Library I의 경우, 6.3 x 10⁸, Library II의 경우, 6.0 x 10⁹, Library III의 경우, 3.9 x 10⁹을 얻었으며, 상기 3 그룹의 라이브러리를 모두 합쳤을 때의 diversity가 1×10¹⁰로써, 예상한 값을 도달한 것으로 판단하였다.

실시예 4. 주형 항체 라이브러리의 제작 및 서열분석

구축된 인간항체 합성 라이브러리인 Ymax-sABL의 다양성을 검증하고 quality를 확인하기 위하여 라이브러리로부터 100개의 random clone을 외부 CRO기관인 마크로젠을 통해 sequencing을 하여 분석하였고, 그 결과를 하기 표 7에 나타냈다.

	SCFVID	VH2	중복여부
1	>PYG100-SYNTHETIC/1/1-PYG100-F	QMQLVESGGNLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISWNSGTIGYADSVKGRFTISRDSAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARSLTFRVLDVWGQGTTVTVSS	OK
2	>PYG100-SYNTHETIC/1/2-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDYYMAWIRQAPGKGLEWLAFISSSGNTIYYADSVRGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARLSEELDVWGQGTTVTVSS	OK
3	>PYG100-SYNTHETIC/1/3-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANTYATAYATSVKGRFTISRDDSRSTAFLQMNSLRAEDTAVYYCARSKFNYPMDVWAKGPRSPSP	Stop
4	>PYG100-SYNTHETIC/1/4-PYG100-F	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSRYGMNWVRQAPGKGLEWVSSISGSSNYRYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARISLYAIFDYWGQGTLVTVSS	OK
5	>PYG100-SYNTHETIC/1/5-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFPFSSYEMIWVRQAPGKGLEWISYISSTGRDIFYADSVKGRFTISRDNAENFLYLEMNSLRAEDTAVYYCARLEFMLLMDVWGQGTTVTVSS	OK
6	>PYG100-SYNTHETIC/1/6-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANTYATAYATSVKGRFTISRDDSRSTAFLQMNSLRAEDTAVYYCARTXRTTMDVWGQGTTVTVSS	OK
7	>PYG100-SYNTHETIC/1/7-PYG100-F	QVQLVQSEAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARIFTPMKLDYWGQGTLVTVSS	OK
8	>PYG100-SYNTHETIC/1/8-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARWKXPDLDYWGQGTLVTVSS	OK
9	>PYG100-SYNTHETIC/1/9-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQTSDGQMDVWGQGTTVTVSS	OK
10	>PYG100-SYNTHETIC/1/10-PYG100-F	QMQLVESGGNLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARSGNTMGLDVWGQGTTAPSP	stop
11	>PYG100-SYNTHETIC/1/11-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARTNHMFDFDYWGQGTLVTVSS	OK
12	>PYG100-SYNTHETIC/1/12-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARASTPKTLDYWGQGTLVTVSS	OK
13	>PYG100-SYNTHETIC/1/13-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRISCETSGIAFSDAWMNWVRQAPGKGLEWIGHIKSNSDGGTTDYAAPVKGRFIISRDDSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARMTIYSRLDYWGQGTLVTVSS	OK
14	>PYG100-SYNTHETIC/1/14-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTQPLFDMDVWGQGTTVTVSS	OK
15	>PYG100-SYNTHETIC/1/15-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYHASLDVWGQGTTVTVSS	OK
16	>PYG100-SYNTHETIC/1/16-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSSAFSWVRQAPGHGLEWMGRIIPMFDMTDYAQRFQGRLTIIADESSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARTNMXEMDVWGQGTTVTVSS	OK
17	>PYG100-SYNTHETIC/1/17-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARCGAKPLFDYWGQGTLVTVSS	OK
18	>PYG100-SYNTHETIC/1/18-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSSAFSWVRQAPGHGLEWMGRIIPMFDMTDYAQRFQGRLTIIADESSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDPENMDVWGQGTTVTVP	OK
19	>PYG100-SYNTHETIC/1/19-PYG100-F	QMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYRISWVRQAPGKGLEWVADINQDGSEKNYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYVQDLRIRRCWTTGAKGPWSPSP	Stop
20	>PYG100-SYNTHETIC/1/20-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANTYATAYATSVKGRFTISRDDSRSTAFLQMNSLRAEDTAVYYCARNNTQMMMDVXAKGPRSPSP	Stop
21	>PYG100-SYNTHETIC/1/21-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDYYMAWIRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSLHALDVWGQGTTVTVSS	OK
22	>PYG100-SYNTHETIC/1/22-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARXFMNYLDYWGQGTLVTVSS	OK
23	>PYG100-SYNTHETIC/1/23-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRLGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHIFQHIFDYWGQGTLVTVSS	OK
24	>PYG100-SYNTHETIC/1/24-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDVWNLDLDVWGQGTTVTVSS	OK
25	>PYG100-SYNTHETIC/1/25-PYG100-F	QVQLGGVWGRLRYSLGGPXDSPVQPLDSPLAAMPXAGSARLQGRGWSGSQLLVVVVVAHTTQTPXRADSPSPETIPRTRCIFKXTVXEPRTRPCITVQDFVRFCVWTSGAKGPRSPSP	Stop
26	>PYG100-SYNTHETIC/1/26-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARNCAPRMDVWGQGTTVTVSS	OK
27	>PYG100-SYNTHETIC/1/27-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARPHWIMDVWGQGTTAPSP	Stop
28	>PYG100-SYNTHETIC/1/28-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARHCEXXXVXLLGPRDPGHRLL	Stop
29	>PYG100-SYNTHETIC/1/29-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARIMYHVLDVWGQGTTVTVSS	OK
30	>PYG100-SYNTHETIC/1/32-PYG100-F	QMQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRLGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARKKFXPVFDYWGQGTLVTVSS	OK
31	>PYG100-SYNTHETIC/1/33-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDYYMAWIRQAPGKGLEWLAFISSSGNTIYYADSVRGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARSLPPMDVWGQGTTVTVSS	OK
32	>PYG100-SYNTHETIC/1/34-PYG100-F	QVQLVESGGGVVXPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARARNKDKMDVWGQGTTVTVSS	OK
33	>PYG100-SYNTHETIC/1/35-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFPFSSYEMIWVRQAPGKGLEWISYISSTGRDIFYADSVKGRFTISRDNAENFLYLEMNSLRAEDTAVYYCARQSHLPMDVWGQGTTVTVSS	OK
34	>PYG100-SYNTHETIC/2/1-PYG100-F	QMQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQRLEWMGEINPGNGHTNYNEKFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLYSCNYRLDYWGQGTLVTVSS	OK
35	>PYG100-SYNTHETIC/2/2-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISNGGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEKSPTLPLDYWGQGTLVTVSS	OK
36	>PYG100-SYNTHETIC/2/3-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREHATQRQMDVWGQGDHGHRLL	Stop
37	>PYG100-SYNTHETIC/2/4-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFVFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVAGVTWDSDTIEYADSVKGRFTVSRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARQLPRGNRNLDYWGQGTLVTVSS	OK
38	>PYG100-SYNTHETIC/2/5-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVRLALSXHLDVWGQGTTVTVSS	OK
39	>PYG100-SYNTHETIC/2/6-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARHYVPPDAKFDYWGQGTLVTVSS	OK
40	>PYG100-SYNTHETIC/2/7-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARLSPKSFFFDYWGQGTLVTVSS	OK
41	>PYG100-SYNTHETIC/2/8-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARTPAVGILILTTGAKGPWSPSP	OK
42	>PYG100-SYNTHETIC/2/9-PYG100-F	QMQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQRLEWMGEINPGNGHTNYNEKFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARASHKLPNAMDVWGQGTLVTVSL	Stop
43	>PYG100-SYNTHETIC/2/10-PYG100-F	QMQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISWNSGRLGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARLEGSRDIFDYWGQGTLVTVSS	OK
44	>PYG100-SYNTHETIC/2/11-PYG100-F	QMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYRISWVRQAPGKGLEWVADINQDGSEKNYVDSVKGRFTISRDNAKNSMYLQMNSLRAEDTAVYYCARTSTTGTMAFDYWGQGTLVTVSS	OK
45	>PYG100-SYNTHETIC/2/12-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSDYYMAWIRQAPGKGLEWLAFISSSGNTIYYADSVRGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARDFLNPHHNLDVWGQGTTVTVSS	OK
46	>PYG100-SYNTHETIC/2/13-PYG100-F	QMQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYRISWVRQAPGKGLEWVADINQDGSEKNYVDSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARXACQPLIAFDYWGQGTLVTVSS	OK
47	>PYG100-SYNTHETIC/2/14-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISNGGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFTLKPTSILDYWGQGTLVTVSS	OK
48	>PYG100-SYNTHETIC/2/15-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCEASGFPFSSYEMIWVRQAPGKGLEWISYISSTGRDIFYADSVKGRFTISRDNAENFLYLEMNSLRAEDTAVYYCARTSLKNTSFDYWGQGTTVTVSS	OK
49	>PYG100-SYNTHETIC/2/17-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRSEDTAVYYCARDHDMHQRILDVWGQGTTVTVSS	OK
50	>PYG100-SYNTHETIC/2/18-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARIEKSTLPALDVWGQGTTVTVSS	OK
51	>PYG100-SYNTHETIC/2/19-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRISCETSGIAFSDAWMNWVRQAPGKGLEWIGHIKSNSDGGTTDYAAPVKGRFIISRDDSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARLFATGRTPLDYWGQGTLVTVSS	OK
52	>PYG100-SYNTHETIC/2/20-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARTETFTHNSLDYWGQGTLVTVSS	OK
53	>PYG100-SYNTHETIC/2/21-PYG100-F	QMQLVQSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARKSNRSDGSFDYWGQGTLVTVSS	OK
54	>PYG100-SYNTHETIC/2/22-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISNGGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRSSLHSHALDYWGQETLVTVSS	OK
55	>PYG100-SYNTHETIC/2/23-PYG100-F	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSRYGMNWVRQAPGKGLEWVSSISGSSNYRYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTPSXATTSLDYWGQGTLVTVSS	OK
56	>PYG100-SYNTHETIC/2/24-PYG100-F	QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISNGGTNTYYADSVKGRFTISRDNSKTTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTTTDWTAFDYWGQGTLVTVSS	OK
57	>PYG100-SYNTHETIC/2/25-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARENGEGWTLDVWGQGTTVTVSS	OK
58	>PYG100-SYNTHETIC/2/26-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARQERKKPSGFDYWGQGTLVTVSS	OK
59	>PYG100-SYNTHETIC/2/27-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSSAFSWVRQAPGHGLEWMGRIIPMFDMTDYAQRFQGRLTIIADESSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARAXPNPMEMDVWGQGTPVTVSS	OK
60	>PYG100-SYNTHETIC/2/28-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARNQTEKPSMDVWGQGTTVTVS	OK
61	>PYG100-SYNTHETIC/2/29-PYG100-F	QMQLVESGGVVVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYSMHWVRQSPGKGLEWVSVISWTGDSTYYADSVKGRFTISRDNSKNSLYLQMNSLEPRTRPCITVRAITMVRGFRPLLISGAKGHWSPSP	Stop
62	>PYG100-SYNTHETIC/2/30-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGMSLRLSCAASGFTFDEYAMHWVRQAPGKGLEWVSHISWNSGSIAYGDSVKGRFIISRDNAKNSLYLQMNSLEPRTRPCITVRENTMDGIAAAGHTRGTSISGAVAPWSPSP	Stop
63	>PYG100-SYNTHETIC/2/31-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFVFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVAGVTWDSDTIEYADSVKGRFTVSRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARKSNPTXEPLDYWGQGTLVTVSS	OK
64	>PYG100-SYNTHETIC/2/32-PYG100-F	QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSRYGMNWVRQAPGKGLEWVSSISGSSNYRYYADSVKGRFTVSRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCADFSMVMSRFWTTGAKGPWSPSP	Stop
65	>PYG100-SYNTHETIC/2/33-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANTYATAYATSVKGRFTISRDDSRSTAFLQMNSLRAEDTAVYYCARHACSPPSMDVWGQGTTVTVSS	OK
66	>PYG100-SYNTHETIC/2/34-PYG100-F	QMQLVQSGAEVKKPGDSLKISCAAFGYSFSTYWIVWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTTYSPSFRGQVTISADKSTSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARLTTRDYFDTWGQGTLVTVSS	OK
67	>PYG100-SYNTHETIC/2/35-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARQLTASLHFDYWGQGTLVTVSS	OK
68	>PYG100-SYNTHETIC/3/1-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTVHLQMNSLRAEDTAVYYCARTSASITTQESMDVWGQGTTVTVSS	OK
69	>PYG100-SYNTHETIC/3/2-PYG100-F	QMQLVESGGNLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARRRRSRFRRLIWTSGPRDHGHRLL	Stop
70	>PYG100-SYNTHETIC/3/4-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVFTVQELLLMFIRCRFWTSGAKGPRSPSP	Stop
71	>PYG100-SYNTHETIC/3/5-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNINIMQKGHNWTSGAKGPRSPSP	Stop
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77	>PYG100-SYNTHETIC/3/12-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANTYATAYATSVKGRFTISRDDSRSTAFLQMNSLRAEDTAVYYCARSGSISRMFLSXWTSGAKGPRSPSP	Stop
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80	>PYG100-SYNTHETIC/3/15-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSSAFSWVRQAPGHGLEWMGRIIPMFDMTDYAQRFQGRLTIIADESSSTAYMELSSLRSEDTAVITVQERIRLCILISRWTSGAKGPRSPSP	Stop
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83	>PYG100-SYNTHETIC/3/18-PYG100-F	QVQLVQSGGALVQPGGSLKLSCAASGFDFDDSAMHWVRQASGKGLEWVGRIRSKANTYATAYATSVKGRFTISRDDSRSTAFLQMNSLRAEDTAGITVQDGSLVRIFIGRWTSGAKGPRSPSP	Stop
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85	>PYG100-SYNTHETIC/3/20-PYG100-F	QMQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFSSYWMHWVRQAPGQRLEWMGEINPGNGHTNYNEKFKSRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSWQPPVLVYGFDYWGQGTLVTVSS	OK
86	>PYG100-SYNTHETIC/3/21-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTDRSERALAAALLDVWGPGTTVTVS	OK
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89	>PYG100-SYNTHETIC/3/24-PYG100-F	QMQLVESGGNLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVSSISWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRSEDTAVYYCARQXVNSVVLCSTMDVWGQGTTVTVSS	OK
90	>PYG100-SYNTHETIC/3/25-PYG100-F	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCEASGYTFTLYYMHWVRQAPGQGLEWMGGIIPILGTPNYAQKFQGRVTITADESTSTASMELSSLRSEDTAVYYCARPKELAYSPRIFDYWGQGTLVTVSS	OK
91	>PYG100-SYNTHETIC/3/26-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVGSGFVFDDYGMHWVRQAPGKGLEWVAGVTWDSDTIEYADSMKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGPALXVATRYESLDYWGQGTLVTVSS	OK
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93	>PYG100-SYNTHETIC/3/28-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQGPGKGLEWVAVISYDGSNEFYADSVKGRFTISRDNSQNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARIPKRGQSSKMDVWGQGTTVTVSS	OK
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96	>PYG100-SYNTHETIC/3/31-PYG100-F	QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDQLCAMYTLPMDVWGQGTTVTVSS	OK
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100	>PYG100-SYNTHETIC/3/35-PYG100-F	QVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFNDYAMHWVRQVPGKGLEWVSGISWNSGRIVYADSMKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHIPRTPHXLLDYWGQGTLVTVSS	OK

5-3) IgG conversion 및 hit 항체의 항원에 대한 affinity 분석

상기 실시예 5-2)에서 스크리닝된 VEGF에 대한 예비 양성 파아지 항체 7종 항체들을 ScFv에서 human IgG로 전환하기 위해 중쇄 및 경쇄의 가변영역 부분을 각각 PCR하여 중쇄 및 경쇄의 불변영역이 포함되어 있는 발현벡터에 각각 sub-cloning하였다(도 19). 이후, 항체별로 중쇄와 경쇄 두 종의 plasmid를 HEK 293F cell에 co-transfeciton 하여 6일간 배양하였다. 세포 배양액에서 세포와 cell debris를 제거한 후 protein A affinity chromatography를 수행하여 IgG 항체를 정제하였다. 이후, Glycine buffer를 통해 항체를 분리하고, 최종 resuspension buffer는 PBS가 되도록 buffer를 교환하한 후, 정제된 항체를 BCA 및 nano drop을 통해 정량하였다.

정제된 7 종의 항체에 대하여 ELISA 방식으로 항원 VEGF에 대한 binding affinity를 측정하였다. 이를 위해 항원인 hVEGF-His 단백질을 96 well plate에 well당 100 ng씩 직접 coating하고 항체의 양을 dilution해 가면서 얻어진 ELISA signal 값으로 그래프를 그려 Kd value를 측정하였다.

도 20은 최종 선별된 항-VEGF 항체의 SDS-PAGE 분석 및 생산성을 나타낸 그림이다.

도 20에 나타난 바와 같이, 7종의 항체의 경우 모두 목표치인 10 mg/L를 훨씬 뛰어넘는 40 mg/L 이상의 수율을 보였으며, 특히 1D10과 1H3 클론의 경우 100 mg/L에 육박하거나 이상의 수율을 보였다. 또한 정제된 항체의 순도도 모두 90% 이상인 것을 확인할 수 있었다.

도 21은 상기에서 정제된 7 종의 항체에 대하여 항원 VEGF에 대한 binding affinity를 ELISA signal 값으로 그래프를 그려 Kd value 측정 결과를 나타낸 것이다.

도 21에 나타난 바와 같이, 1B7=0.043 nM, 1D10=0.029 nM, 1E12=0.75 nM, 1G6=0.038 nM, 1H3=1.4 nM, 1B1=1.4 nM, 1E4=0.037 nM의 매우 높은 항원 결합력을 보여 목표치인 10 nM 미만보다 많게는 수십~ 수백배 높음을 확인할 수 있었다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 인간항체 합성 라이브러리인 Ymax-sABL은 1x10¹⁰의 다양성을 가진다. 또한 라이브러리의 우수성이 높아 VEGF에 결합할 것으로 보이는 400개의 random mono clone을 분석하여 최종적으로 7종의 항-VEGF 항체를 확보하였으며, 상기 항-VEGF 항체의 임시발현 생산성이 높고, 항원에 대한 결합력이 nM 수준 또는 미만의 높은 affinity를 보였는바, 고성능 및 고생산성 인간항체 합성 라이브러리를 구축할 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

(a) 항체 가변영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleontide) 분자를 준비하는 단계;
(b) 상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 어닐링(annealing)하는 프라이머를 이용하여 상기 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭함으로써 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 수득하는 단계; 및
(c) 상기 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 이용하여 항체 라이브러리를 수득하는 단계
를 포함하는 항체 라이브러리 제작방법.
제1항에 있어서,
상기 항체 가변영역은 6 내지 14개의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 CDR3(complementarity-determining region 3) 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 라이브러리 제작방법.
제1항에 있어서,
상기 항체 가변영역은 하기 일반식 1의 아미노산 서열로 기재되는 중쇄 CDR3 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 라이브러리 제작방법:
[일반식 1]
N1-N2-...-Nn-Cm-...-C3-C2-C1-Thy-Asp
상기 일반식에서, n+m은 0 내지 18의 정수이고, 상기 C1 내지 Cm은 다양성 아미노산 잔기이다.
제3항에 있어서,
상기 C1은 티로신(Tyrosine), 발린(Valine) 또는 루신(Leucine)이고, 상기 C2는 아스파르트산(Aspartic acid) 또는 알라닌(Alamine)인 것을 특징으로 하는 항체 라이브러리 제작방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계는 2번의 연속된 PCR을 통해 폴리뉴클레오타이드 분자를 증폭하는 것을 특징으로 하는 항체 라이브러리 제작방법.
제1항에 있어서,
상기 (b) 단계의 프라이머는
벡터 프라이머를 포함하는 제1프라이머(upper primer) 세트; 및
상기 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 코딩되는 항체 가변영역 CDR의 특정 위치에 아미노산 잔기의 다양성이 도입되도록 하는 서열을 포함하는 제2프라이머(downstream primer) 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 라이브러리 제작방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 한의 방법으로 제작된 항체 라이브러리.