CN110273002A

CN110273002A - 生物标志物在黑色素瘤转移诊断中的应用

Info

Publication number: CN110273002A
Application number: CN201910649794.7A
Authority: CN
Inventors: 王麟; 唐美兰
Original assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Medintell Bioinformatic Technology Co Ltd
Priority date: 2019-07-18
Filing date: 2019-07-18
Publication date: 2019-09-24
Also published as: CN118207330A

Abstract

本发明公开了生物标志物在黑色素瘤转移诊断中的应用，所述生物标志物是BICDL2或SMIM5基因。本发明首次发现BICDL2或SMIM5基因在黑色素瘤转移患者中低表达。通过检测BICDL2或SMIM5基因的表达水平，可以判断患者是否发生黑色素瘤转移以及黑色素瘤转移的风险。同时本发明为黑色素瘤转移的治疗提供了基因靶点。

Description

生物标志物在黑色素瘤转移诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物在黑色素瘤转移诊断中的应用，具体涉及BICDL2或SMIM5在黑色素瘤转移诊断中的应用。

背景技术

黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)，是来源于神经嵴黑色素细胞的高度恶性肿瘤，常见于皮肤和其他器官黏膜，早期即可发生局部和远处转移，恶性程度高，进展迅速，总体中位生存期仅7.5个月，预后差，病死率高。近年来，其发病率在世界各地都呈上升趋势，成为排在首位的皮肤致死类疾病，且根据流行病学调查，我国皮肤黑色素瘤(Cutaneousmalignant melanoma，CMM)的发病率及死亡率也呈上升趋势。目前关于黑色素瘤基础和临床研究的探索不断增多，但其发病机制仍然未明，很多患者确诊时已经是中晚期。临床治疗上无显著进展，现状仍不容乐观。因此，进一步探索黑色素瘤发生和发展的相关机制，寻找新的肿瘤标志物以及治疗靶点延长患者生存期成为亟待解决的问题。

已显示某些基因与黑色素瘤及其转移相关。如CXCR4基因沉默对黑色素瘤侵袭及转移的影响，SPINK5在皮肤恶性黑色素瘤临床组织样本中的表达情况。寻找更多黑色素瘤的新靶标，对黑色素瘤的生物诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与黑色素瘤转移相关的基因标志物，将其应用到临床中，实现对黑色素瘤转移的诊断，提高患者的生存率和生存质量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测基因的水平的试剂在制备诊断黑色素瘤是否发生转移的产品中的应用，所述基因包括BICDL2或SMIM5。

进一步，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片、高通量测序平台或免疫法检测BICDL2或SMIM5表达水平的试剂。

高通量测序平台是一种特殊的诊断黑色素瘤转移的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的RNA表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病转移患者和非转移人群的RNA表达谱，容易分析出哪个RNA的异常与疾病转移相关。因此，在高通量测序中获知BICDL2或SMIM5基因的异常与黑色素瘤转移相关也属于BICDL2或SMIM5的用途，同样在本发明的保护范围之内。

优选的，所述试剂包括特异性针对BICDL2或SMIM5的引物、探针或抗体。

在本发明的具体实施方案中，特异性针对BICDL2的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示，特异性针对SMIM5的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

本发明提供了一种诊断黑色素瘤是否发生转移的产品，所述产品包括检测BICDL2或SMIM5表达水平的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

所述试剂盒包括检测BICDL2或SMIM5表达量的试剂，试剂包括与BICDL2或SMIM5序列结合的核酸或抗体，核酸包括SYBR Green、TaqMan探针、分子信标、双杂交探针、复合探针检测BICDL2或SMIM5表达量时使用的PCR扩增引物。

进一步，所述试剂盒包括特异性扩增BICDL2或SMIM5的引物。

所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测BICDL2或SMIM5基因转录水平的针对BICDL2或SMIM5基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的BICDL2或SMIM5蛋白的特异性抗体。

所述核酸膜条包括检测BICDL2或SMIM5表达量的试剂，所述试剂包括与BICDL2或SMIM5序列结合的核酸，所述核酸包括能够检测BICDL2或SMIM5表达量的探针。

本发明提供了上述检测产品在制备诊断黑色素瘤是否发生转移的工具中的应用。

本发明提供了BICDL2或SMIM5在制备治疗黑色素瘤转移的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括BICDL2或SMIM5的促进剂。

进一步，所述促进剂不受限制，只要是可以增加BICDL2或SMIM5表达水平的物质即可。

本发明的药物组合物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物组合物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物组合物的效果即可。

本发明的药物组合物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物组合物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物组合物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物组合物或预防药物组合物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

本发明还提供了一种黑色素瘤转移的抑制方法，所述方法包括增加BICDL2或SMIM5表达量或者增加BICDL2或SMIM5的功能活性。

本发明还提供了一种治疗黑色素瘤的药物的筛选方法，可以通过在对黑色素瘤细胞添加测试药物后的某个时期测量BICDL2或SMIM5的表达水平来测定黑色素瘤的药物改善黑色素瘤迁移或侵袭的效果。更具体地说，当BICDL2或SMIM5的表达水平在添加或施用测试药物后增加时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为治疗黑色素瘤的治疗药物。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。

本发明包括BICDL2或SMIM5的促进剂可用作新的治疗黑色素瘤的治疗药物。

BICDL2基因(NC_000016.10，3027682..3036985,complement)可在GeneBank数据库中查询到。

SMIM5基因(NC_000017.11，75633434..75641406)可在GeneBank数据库中查询到。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种诊断黑色素瘤转移的分子标志物，使用该分子标志物可以判断患者肿瘤是否发生转移或发生肿瘤的风险，以期实现精准化治疗，提高患者的生存率。

附图说明

图1是利用QPCR检测BICDL2或SMIM5基因在黑色素瘤转移与非转移组织中的表达情况图，其中图A为BICDL2，图B为SMIM5。

图2是利用QPCR检测BICDL2或SMIM5基因过表达的情况图，其中图A为BICDL2，图B为SMIM5。

图3是利用Transwell小室检测BICDL2或SMIM5基因对黑色素瘤细胞侵袭和转移的影响图；其中图A是BICDL2对黑色素瘤细胞侵袭的影响图；图B是BICDL2对黑色素瘤细胞迁移的影响图；图C是SMIM5对黑色素瘤细胞侵袭的影响图；图D是SMIM5对黑色素瘤细胞迁移的影响图。

具体实施方式

实施例1筛选黑色素瘤组织中差异表达基因

1、样本的收集

黑色素瘤原发组样本为肿瘤原发病灶(3例)，黑色素瘤转移组样本为肿瘤转移病灶，转移部位为肺部(3例)。

2、RNA样品的制备

利用TIANGEN公司的组织RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，具体操作详见说明书。

3、RNA的质量分析

利用Nanodrop2000对所提取的RNA浓度和纯度进行检测，Agilent2100测定RIN值。RNA完整，浓度≥20ng/μl，OD260/280介于1.8～2.2之间，进行文库构建。

4、高通量测序和数据分析

应用Illumina Hiseq x-ten第二代高通量测序技术对样品进行测序。

使用软件cuffquant、cuffdiff进行mRNA表达定量与差异表达分析。Cuffquant是Cufflinks套件中专门用来进行表达量评估和标准化的工具，而cuffdiff则是专门用来计算差异表达的工具，可利用cuffquant的定量结果比较每个基因/转录本在两个分组间的表达差异。显著差异mRNA筛选条件：P<0.05，|log₂FC|>1。

5、结果

RNA-seq结果显示，与原发组相比，黑色素瘤转移组中的BICDL2或SMIM5表达水平显著下调。

实施例2 QPCR验证差异表达的BICDL2或SMIM5基因

根据高通量测序的筛选结果，选择BICDL2或SMIM5基因为研究目标进行大样本验证。

1、样本收集

按照实施例1的方法收集黑色素瘤原发病灶组织36例，黑色素瘤转移病灶组织33例。

2、提取组织RNA

步骤同实施例1。

3、逆转录

利用TIANGEN公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录，具体反应体系如下：

(1)去除基因组DNA的反应体系

将1.0μg的总RNA模板与2.0μl的5×gDNA buffer和RNase Free水混合，终体积为10μl，42℃孵育3min。

(2)逆转录PCR反应体系

将2.0μl的10×Fast RT buffer、1.0μl的PrimerScript RT Enzyme Mix I与2.0μl的FQ-RT Primer Mix混合，加入10μl的去除基因组DNA的反应体系和5.0μl的RNase Free水，共20μl，42℃反应15min，之后95℃反应3min。

4、QPCR反应

(1)引物设计

根据基因序列，设计引物，引物序列如下：

BICDL2基因：

上游引物：5’-AGAAGCGAACATCCCTCAG-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物：5’-TCTCATCTTGCAGCTTGGC-3’(SEQ ID NO.2)。

SMIM5基因：

上游引物：5’-GAGGAAGGAGGAGGAGAG-3’(SEQ ID NO.3)；下游引物：5’-TTTGTTGTTGGTCGTCCT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

上游引物为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ ID NO.5)；下游引物为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.6)。

(2)配制20μl PCR反应体系：

利用TIANGEN公司的SuperReal PreMix Plus试剂盒。2×SuperReal PreMix Plus10μl，上游(下游)引物0.6μl，cDNA模板2μl，50×ROX Reference Dye 2μl，ddH₂O 4.8μl。

(3)PCR反应条件：95℃15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)进行40个循环，之后95℃15s，60℃60s，95℃15s。以SYBR Green作为荧光标志物，在ABI 7300型荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过熔解曲线分析和电泳确定目的条带，2-^ΔΔCT法进行相对定量。

5、结果

如图1所示，与原发组相比，黑色素瘤转移组样本中的BICDL2或SMIM5的表达水平显著下调，与高通量测序结果一致(P<0.05)，提示BICDL2或SMIM5可以作为临床检测标志物用于黑色素瘤是否发生转移的判断。

实施例3 BICDL2或SMIM5基因过表达

1、质粒构建

根据BICDL2或SMIM5基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟知。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号638831)中扩增全长的BICDL2或SMIM5基因的编码序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-BICDL2或pcDNA3.1-SMIM5用于后续实验。

2、转染

将人黑色素瘤细胞株A357细胞以5×10⁴细胞/孔的密度接种到6孔板，当汇合度达到约50％-80％时，按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)的说明书进行转染，实验分为阴性对照组(A357)、空白对照组(转染pcDNA3.1-NC)和实验组(转染pcDNA3.1-BICDL2或pcDNA3.1-SMIM5)。

3、QPCR检测过表达效果

3.1提取细胞总RNA

1)称取一定量的样品，液氮下迅速将样品研磨成粉末；

2)加入Trizol，于漩涡振荡器上混匀，室温静置5min；

3)4℃，12000×g离心10min，将上层水相转入新的1.5ml EP管(约400～500μl)，室温静置5min，使细胞充分裂解；

4)加入氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置3-5min，使其自然分相；

5)4℃，12000×g离心10min，混合物分成三层：下层红色为苯酚-氯仿有机相，中间蛋白层和无色上层水相，RNA主要集中在水相；

6)转移上层水相(约400～500μl)，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，混匀后，冰上静置5min，4℃，12000×g离心10min；

7)必要时重复一次氯仿/异戊醇抽提，至中间层较干净；

8)向转移的上清中加入等体积的异丙醇，-20℃放置1h；

9)4℃，13600rpm离心20min，弃掉上清；

10)RNA沉淀用1.0ml 75％乙醇漂洗两次，每次静置3min，期间颠倒洗涤，4℃13600rpm离心3min；

11)移去残留的乙醇，将沉淀置于超净工作台吹干，用30～50μl Nuclease-freewater溶解RNA沉淀，必要时可于55～60℃下孵育10min助溶。

3.2逆转录

具体步骤同实施例2。

3.3QPCR

具体步骤同实施例2。

3.4统计学方法

实验设置3次平行实验，结果数据以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

4、结果

结果如图2所示，与转染pcDNA3.1-NC的对照组相比，转染pcDNA3.1-BICDL2或pcDNA3.1-SMIM5的实验组中BICDL2或SMIM5的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4 BICDL2或SMIM5基因对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用

1、细胞转染

按照实施例3的方法对黑色素瘤A357细胞进行pcDNA3.1-NC和pcDNA3.1-BICDL2或pcDNA3.1-SMIM5的转染。每组设3个重复，转染48h后分别在实验孔内加入10μl CCK-8溶液，培养2h后测定450nm的吸光度(OD值)。

2、统计学方法

结果数据以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件进行分析，BICDL2或SMIM5过表达组与对照组之间的差异采用t检验，P<0.05时具有统计学意义。

3、结果

结果如表2所示，与转染pcDNA3.1-NC的对照组相比，转染pcDNA3.1-BICDL2或pcDNA3.1-SMIM5的实验组细胞增殖明显减慢，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表2黑色素瘤A357细胞OD值

组别	OD值(光密度)
		pcDNA3.1-NC(对照组)	1.324±0.005
pcDNA3.1-BICDL2(实验组)	0.861±0.002
		pcDNA3.1-SMIM5(实验组)	0.792±0.003

实施例5细胞侵袭和细胞迁移

1、细胞侵袭

Matrigel无菌冰浴融化后铺在Transwell小室进行包被。将转染的A357细胞以1×10⁸细胞/ml的密度重悬于无血清的DMEM培养基中，接种到上室，下室加入含500μl 10％FBS的DMEM培养基。细胞培养箱中培养24h后，取出transwell小室用磷酸盐缓冲液清洗2次，用棉签擦去上室上层的细胞，将小室在4℃用中性甲醛15min，常温下用20％吉姆萨染色20min，用磷酸盐缓冲液冲洗后，放在正置显微镜观察并计数。

2、细胞迁移

细胞迁移与细胞侵袭步骤基本相同，只是细胞迁移的transwell小室不需要Matrigel包被，直接接种细胞进行后续操作。

3、结果

如图3所示，在黑色素瘤细胞转染重组质粒后，与对照组相比，实验组的侵袭及迁移能力均有明显下降，说明BICDL2或SMIM5能够抑制黑色素瘤的迁移和侵袭。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围之内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 生物标志物在黑色素瘤转移诊断中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agaagcgaac atccctcag 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctcatcttg cagcttggc 19

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaggaaggag gaggagag 18

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttgttgttg gtcgtcct 18

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttaactctg gtaaagtgga tat 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims

1.检测基因的水平的试剂在制备诊断黑色素瘤是否发生转移的产品中的应用，其特征在于，所述基因包括BICDL2或SMIM5。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片、高通量测序平台或免疫法检测BICDL2或SMIM5表达水平的试剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性针对BICDL2或SMIM5的引物、探针或抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性针对BICDL2的引物序列如SEQID NO.1～2所示，特异性针对SMIM5的引物序列如SEQ ID NO.3～4所示。

5.一种诊断黑色素瘤是否发生转移的产品，其特征在于，所述产品包括检测BICDL2或SMIM5表达水平的试剂。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

7.根据权利要求6所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括特异性扩增BICDL2或SMIM5的引物。

8.BICDL2或SMIM5在制备治疗黑色素瘤转移的药物组合物中的应用。

9.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括BICDL2或SMIM5的促进剂；优选的，所述BICDL2或SMIM5的促进剂为增加BICDL2或SMIM5表达水平的物质。

10.一种治疗黑色素瘤的药物的筛选方法，通过在对黑色素瘤细胞添加测试药物后的某个时期测量BICDL2或SMIM5的表达水平来测定黑色素瘤的药物改善效果。