CN111208240A - 用于诊断黑色素瘤的尿液蛋白标记物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诊断黑色素瘤的尿液蛋白标记物。具体地，本发明涉及检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断所述受试者黑色素瘤的药物中的用途，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

Description

用于诊断黑色素瘤的尿液蛋白标记物

技术领域

本发明涉及临床诊断的技术领域。具体地，本发明涉及用于诊断黑色素瘤的尿液蛋白标记物。具体而言，本发明涉及利用质谱分析蛋白组学技术获得的与人黑色素瘤相关的尿液蛋白标志物及其用途。

背景技术

皮肤黑色素瘤是全球第12大最常见的癌症，参见Ferlay,J.等人Cancerincidence and mortality worldwide:Sources,methods and major patterns inGLOBOCAN 2012.International Journal of Cancer,2015，136(5):p.E359-E386。黑色素瘤由黑素细胞恶性转化产生，可以发生在皮肤和黏膜的所有部位，易转移，具有高度侵袭性、高度恶性导致高死亡率。黑色素瘤的诊断由临床和病理学标准相结合，包括查体、病理组织学检查和影像学检查，参见CSCO黑色素瘤专家委员会,中国黑色素瘤诊治指南(2011版)临床肿瘤学杂志,2012.17(2):p.159-171。然而，由于其组织学形态多变，或仅有少量甚至没有任何可见色素，患者自身早期发现困难，临床有时与良性痣鉴别不易，早期诊断困难，参见，Li,H等人,Primary malignant melanoma of the duodenum without visiblemelanin pigment:a mimicker of lymphoma or carcinoma.Diagn Pathol,2012.7:p.74。黑色素瘤早期治疗以外科手术为主，晚期则包括化疗、靶向治疗和免疫治疗。相较于单独使用化疗治疗，靶向治疗和免疫治疗目前已明显改善晚期黑色素瘤患者的生存率，但这两种疗法通常受到耐药率的限制，且不具有普遍适用性，参见Hugo,W.等人,Genomic andTranscriptomic Features of Response to Anti-PD-1Therapy in MetastaticMelanoma Cell 2016，165(1):p.35-44；Caenepeel,S.等人,MAPK pathway inhibitioninduces MET and GAB1 levels,priming BRAF mutant melanoma for rescue byhepatocyte growth factor，Oncotarget,2017，8(11):p17795-17809，患者绝对生存率仍然很低，参见Hamid,O.等人,Five-year survival outcomes for patients withadvanced melanoma treated with pembrolizumab in KEYNOTE-001.Ann Oncol,2019.30(4):p.582-588。据报道，皮肤黑色素瘤I～IV期的5年生存率依次为97％(IA期)、84％(IB期)、68％、55％、17％，参见Aubuchon,M.M.F.等人,Epidemiology,management andsurvival outcomes of primary cutaneous melanoma:a ten-year overview.ActaChirurgica Belgica:p.1-7。因此，早期诊断可为早期治疗提供帮助，从而提高患者生存率。

生物标志物是能够客观反应正常生理、病理过程的一类指示物，参见Strimbu,K.和J.A.Tavel,What are biomarkers？Curr Opin HIV AIDS,2010.5(6):p.463-6。从临床的角度来看，生物标志物能够帮助多因素疾病不同阶段的监测、预测和诊断，参见Gerszten,R.E.和T.J.Wang,The search for new cardiovascular biomarkers.Nature,2008.451(7181):p.949-952。血液是一个相对稳定的系统，随着病情的推进，当血液到达代偿的临界点时，开始失代偿。在达到失代偿的临界点之前，疾病引起的变化被血液排除，在这个过程中，一个最重要的废品收集站就是尿液。所以，在存在多种变化的尿液中更有可能找到敏感的早期标志物，参见Gao,Y.,Urine—an untapped goldmine for biomarker discovery？Science China Life Sciences,2013.56(12):p.1145-1146。

尿液易受性别，年龄，饮食等多种因素影响，参见Wu,J.and Y.Gao,Physiologicalconditions can be reflected in human urine proteome and metabolome.ExpertReview of Proteomics,2015.12(6):p.623-636，使用生存条件可控、遗传背景清晰的动物模型既可避免以上因素干扰，又可对病程进行连续监控。已有研究表明，尿液能够敏感反映肿瘤细胞在动物模型中的变化，参见Wu,J.,Z.Guo,and Y.Gao,Dynamic changes of urineproteome in a Walker 256tumor-bearing rat model.Cancer medicine,2017.6(11):p.2713-2722；Zhang,L.,Y.Li,and Y.Gao,Early changes in the urine proteome in adiethyldithiocarbamate-induced chronic pancreatitis rat model.Journal ofProteomics,2018.186:p.8-14。因此，为探索黑色素瘤的发生发展对尿液蛋白质组中的影响，本研究通过皮下注射B16肿瘤细胞建立荷瘤小鼠模型，收集与肿瘤发生发展对应的4个时间点的尿液样本，利用液相色谱串联高分辨率质谱(LC-MS/MS)分析尿液蛋白质组，寻找差异蛋白，为黑色素瘤的早期诊断提供一些线索。

发明内容

本发明通过皮下注射B16细胞建立荷瘤小鼠模型，收集肿瘤生长期间4个时间点的尿液样本，通过液相色谱串联高分辨质谱技术(LC-MS/MS)进行分析。与注射肿瘤细胞前相比，B16荷瘤模型共鉴定到38种人同源差异蛋白质，其中4种蛋白质在肿瘤可见前出现显著差异。通过以上实验与分析，可以在尿液中找到黑色素肿瘤的早期生物标志物信息，并为相关肿瘤的临床早期诊断提供线索。

一方面，本发明提供了检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断所述受试者黑色素瘤的药物中的用途，其中所述尿液中蛋白质选自以下的一种或多种、或其组合：骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13、肌动蛋白α心肌1、三肽基肽酶1、线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4、溶质载体家族12成员3、生长停滞特异性蛋白6、肝细胞生长因子激活剂、铜转运蛋白ATOX1、前列腺素-H2 D-异构酶、唾液酸酶1、真核翻译起始因子6、免疫球蛋白κ常数、C4b结合蛋白、细胞间粘附分子1、凝血酶原、肝细胞生长因子样蛋白、核运输因子2、体细胞细胞色素c、微管蛋白beta-4B链、CVB3结合蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Costars家族蛋白ABRACL、ATP结合盒亚家族A成员13、α-1-酸性糖蛋白1整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9、白介素1受体辅助蛋白、细胞粘附分子4、酸性哺乳动物几丁质酶、转铁蛋白、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、迁移和入侵增强子1、细胞色素B5型、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、中性神经酰胺酶和类酪氨酸蛋白10

优选地，根据本发明所述的用途，其中所述诊断为早期诊断，优选地，所述早期诊断定义为肿瘤形成，但没有可见或可触及的肿块或临床症状。

另一方面，本发明提供了检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于早期诊断所述受试者黑色素瘤的药物中的用途，所述早期诊断定义为肿瘤形成，但没有可见或可触及的肿块或临床症状，其中所述尿液中蛋白质选自骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13和肌动蛋白α心肌1中的一种或多种。

优选地，根据本发明所述的用途，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

进一步优选地，根据本发明所述的用途，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是单克隆抗体。

进一步优选地，根据本发明所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选是人。

在本发明提供的检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断所述受试者黑色素瘤的药物中的用途的进一步优选的实施方案中，其中与健康对照相比，尿液中的骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13、线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、溶质载体家族12成员3、生长停滞特异性蛋白6、铜转运蛋白ATOX1、前列腺素-H2 D-异构酶、真核翻译起始因子6、免疫球蛋白κ常数、C4b结合蛋白、凝血酶原、肝细胞生长因子样蛋白、核运输因子2、体细胞细胞色素c、CVB3结合蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Costars家族蛋白ABRACL、整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9、细胞粘附分子4、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、迁移和入侵增强子1、细胞色素B5型、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、中性神经酰胺酶、类酪氨酸蛋白10含量升高，和/或肌动蛋白α心肌1、三肽基肽酶1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、肝细胞生长因子激活剂、唾液酸酶1、细胞间粘附分子1、微管蛋白beta-4B链、ATP结合盒亚家族A成员13、白介素1受体辅助蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、酸性哺乳动物几丁质酶、转铁蛋白含量降低，指示受试者患有黑色素瘤；优选地，所述健康对照是未患有黑色素瘤或其他疾病的健康受试者。

另一方方面，本发明提供了一种用于早期诊断黑色素瘤的试剂盒或芯片，其中所述尿液中蛋白质为以下蛋白质的组合：骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13、肌动蛋白α心肌1、三肽基肽酶1、线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4、溶质载体家族12成员3、生长停滞特异性蛋白6、肝细胞生长因子激活剂、铜转运蛋白ATOX1、前列腺素-H2 D-异构酶、唾液酸酶1、真核翻译起始因子6、免疫球蛋白κ常数、C4b结合蛋白、细胞间粘附分子1、凝血酶原、肝细胞生长因子样蛋白、核运输因子2、体细胞细胞色素c、微管蛋白beta-4B链、CVB3结合蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Costars家族蛋白ABRACL、ATP结合盒亚家族A成员13、α-1-酸性糖蛋白1、整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9、白介素1受体辅助蛋白、细胞粘附分子4、酸性哺乳动物几丁质酶、转铁蛋白、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、迁移和入侵增强子1、细胞色素B5型、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、中性神经酰胺酶和类酪氨酸蛋白10。

附图说明

图1显示用苏木精和曙红(H&E)染色对肿瘤组织进行的病理检查，在肿瘤块中观察到大量的肿瘤细胞。

图2为B16荷瘤小鼠不同时间点差异蛋白个数的Venn图。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。

实施例1实验动物模型的建立

B16小鼠黑素瘤细胞购自中国科学院细胞库。细胞在37℃、5％CO₂的条件下，于含有10％胎牛血清(Sigma Chemical)的RPMI-1640(Corning)中培养。

7周龄雄性C57BL/6小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证为SCXK(京)2016-0006。动物实验遵循审查和批准(动物福利保证号：ACUC-A02-2014-007)。所有动物饲养在12小时明暗循环的标准环境中(室温22±1℃，湿度65％-70％)。

皮下注射B16(参见Kormosh,N.G.等人,Conformational changes in inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 4activate its tumor-specific activity inmice with B16 melanoma.2015.12(3):p.4483；Wu,C.-M.,X.-Y.Li和T.-H.Huang,Anti-tumor effect of pEgr-IFNgamma gene-radiotherapy in B16 melanoma-bearingmice.World journal of gastroenterology,2004.10(20):p.3011-3015；和Xiong,F.,Y.-Z.Mou和X.-Y.Xiang,Inhibition of mouse B16 melanoma by sodium butyratecorrelated to tumor associated macrophages differentiationsuppression.International journal of clinical and experimental medicine,2015.8(3):p.4170-4174)细胞建立荷瘤小鼠模型的方法如下：经台盼蓝染色计算活细胞数＞95％，通过在小鼠右后肢皮下注射0.1mL B16细胞(1.8×10⁵)以建立黑色素瘤荷瘤小鼠模型(n＝8)。本实验使用自身对照，未注射肿瘤细胞前所收集尿液即为对照组，该时间记为第0天，皮下注射肿瘤细胞的时间记为第1天。

实施例2尿液收集及样品制备

收集第0、4、7、14天的B16荷瘤小鼠尿液样本。将小鼠单独置于代谢笼中过夜(12h)，以收集尿液样本。尿液收集期间，不提供食物，可自由饮水，以避免尿液污染。

将收集到的尿液在4℃、3000×g条件下离心10min，以除去细胞及颗粒物沉淀，上清置于-80℃保存。在尿蛋白提取前，将尿液样本在4℃、12000×g条件下离心10min，以除去细胞碎片。使用四倍体积的预冷乙醇，于4℃沉淀上清液12h。将上述样品在4℃、12000×g条件下离心10min。将沉淀物重悬于裂解液(8mol/L尿素，2mol/L硫脲，25mmol/L DTT和50mmol/L Tris)中。使用Bradford法测定蛋白质浓度。

使用滤器辅助的蛋白质酶切方法(filter-aided sample preparation，FASP)(参见

J.R.等人,Universal sample preparation method for proteomeanalysis.Nature Methods,2009.6(5):p.359-362)对尿液蛋白质进行膜上辅助酶切。每个样本各取100μg蛋白质加到10kDa滤膜(Pall，Port Washington，NY，USA)上。依次加入UA(8mol/L尿素，0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.5)和50mmol/L NH₄HCO₃清洗尿液蛋白质。加入20mmol/L DTT还原蛋白质(37℃、1h)，50mmol/L IAA避光反应30min，使蛋白质二硫键烷基化。按照蛋白质量：酶质量＝1∶50加入胰蛋白酶((Trypsin Gold,Promega,Fitchburg,WI,USA)，37℃孵育过夜。离心收集肽段，使用Oasis HLB固相萃取柱(Waters,Milford,MA)对肽段除盐。通过真空浓缩仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)进行干燥，并于-80℃保存。

使用高pH反相多肽分级法对混合肽段样本进行分级。使用高pH反相多肽分级试剂盒(84868,Thermo Fisher,USA)将混合肽段样本装载到旋转小柱上。用乙腈浓度递增的梯度洗脱结合肽，共收集得到10个组分，包括1个流动组分、1个洗脱组分和8个梯度样本组分。分级后的样本使用真空浓缩仪进行干燥，并在20μL 0.1％甲酸水中重新溶解。

实施例3LC-MS/MS分析

3.1级分分级样本的DDA数据库采集

使用EASY-nLC 1200超高效液相色谱搭载Orbitrap Fusion Lumos高分辨质谱仪对10个组分进行数据采集。将溶于0.1％甲酸水中的肽段装载至预柱(75μm×2cm,3μm,C18,100A°)，将洗脱液装载至反相分析柱(50μm×250mm,2μm,C18,100A°)，洗脱梯度为5-30％流动相B(99.9％乙腈，0.1％甲酸，流速为0.5μL/min)，60min。为实现全自动、灵敏的信号处理，在所有样品中使用校准试剂盒(iRT kit,Biognosys,Switzerland)，浓度为1:20v/v。

以DDA-MS模式采集，参数设置如下：Orbitrap的一级分辨率为60000、350-1550m/z进行全扫描，循环时间为3s(最高速度模式)，自动增益控制(AGC)为1e6，最大注射时间为50ms。二级扫描在Orbitrap中进行，分辨率为15000，筛选窗口为2Da，碰撞能量为32％(HCD)。AGC目标为5e4，最大进样时间为30ms。

3.2实验样本的DIA数据采集

以DIA-MS模式分析48个实验样品。质谱参数设置如下：以60000分辨率、350-1550m/z进行一级全扫描；接下来进行二级扫描，分辨率为30000，建立36个筛选窗口，HCD碰撞能量为32％，AGC目标为1e6，最大注入时间为50ms。窗口计算方式：建库采集到的DDA搜库结果，依据m/z将所有鉴定到的肽段数量进行排序，分成36组，每一组的m/z范围即为采集DIA数据的窗口宽度。

3.3数据分析

使用Proteome Discoverer(2.3版,Thermo Scientific,Germany)对级分样本进行数据处理，构建数据库。采用附加iRT肽序列的SwissProt小鼠数据库(2019年5月更新，包含17016个蛋白序列信息)进行搜库。搜索参数设置如下：母离子质量偏差为10ppm，碎片离子质量偏差为0.02Da；固定修饰为半胱氨酸的脲基甲基化(+58.00Da)，可变修饰为甲硫氨酸的氧化(+15.995Da)，其他设置为默认参数。蛋白质和肽水平的错误发现率(FDR)设置为0.01。将上述搜库结果导入Spectronaut Pulsar(Biognosys,Switzerland)，建立谱图库：798个蛋白质，28356张二级谱。

将DIA-MS原始文件使用默认设置导入Spectronaut Pulsar。基于所有二级碎片离子峰面积进行定量。以肽段水平q值<0.1，每个蛋白质至少鉴定到2条特异性肽段，鉴定到532个高可信度蛋白质。差异蛋白质的筛选标准是：p值<0.01，蛋白质丰度变化倍数>1.5。

3.4生物信息学分析

使用在线免费软件DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)对鉴定到的差异蛋白进行生物功能注释评估，包括蛋白质分子功能、细胞组分、生物过程。使用IPA(IngenuitySystems,Mountain View,CA,USA)对差异蛋白进行通路分析。

LC-MS/MS结果

1、荷瘤小鼠特征

接种肿瘤细胞后，每天观察荷瘤小鼠皮下肿瘤块的生长。

对接种B16细胞的荷瘤小鼠，从D7开始，可观察到黑色、不可触及的小肿瘤块，并且肿瘤块逐渐长大。D15处死小鼠，对肿瘤块称重，8只荷瘤小鼠的平均肿瘤块重量为0.68±0.15g。将肿瘤组织用苏木精和曙红(H&E)染色以进行病理检查，在肿瘤块中观察到大量的肿瘤细胞(图1)。

2、尿液蛋白质组变化

差异蛋白筛选标准是：蛋白质丰度变化倍数在1.5倍以上，p值小于0.01。同时，使用Uniprot数据库寻找这些蛋白质所对应的人同源蛋白，进行后续分析。

经DIA定量分析，共鉴定532个高可信度蛋白，经筛选，与D0相比，在注射肿瘤后的第4、7和14天共鉴定到38种人同源的差异蛋白；在第4天共4种差异蛋白，3种上调，1种下调；第7天共7种差异蛋白，3种上调，4种下调；第14天共29种差异蛋白，21种上调，8种下调。无连续变化蛋白。(图2、表1)

表1：B16荷瘤小鼠的差异蛋白

3、差异蛋白分析

荷瘤模型各时间点的差异蛋白均随着肿瘤生长发生明显的变化，提示尿液蛋白质组具有反映肿瘤发生发展的巨大潜力，具体分析如下。

第4天，肿瘤还不可见，共有4种差异蛋白显著变化，均被报道与黑色素瘤相关。例如，骨桥蛋白(Osteopontin)可充当细胞因子，参与I型免疫反应。骨桥蛋白依赖的自分泌/旁分泌信号通路与转移性黑色素瘤相关参见Konstantakou,E.G.等人,Deep-proteomemapping of WM-266-4human metastatic melanoma cells:From oncogenic addictionto druggable targets.PLoS One,2017.12(2):p.e0171512，该蛋白参与调控肿瘤进程和转移的细胞信号传导，参见Rangaswami,H.,A.Bulbule,and G.C.Kundu,Osteopontin:rolein cell signaling and cancer progression.Trends Cell Biol,2006.16(2):p.79-87；碳酸酐酶1(Carbonic anhydrase1)参与白介素12介导的信号通路，而碳酸酐酶IX(CAIX)抑制剂能够提高化疗敏感性，促进黑素瘤细胞的凋亡，参见Andreucci,E.,等人,Thecarbonic anhydrase IX inhibitor SLC-0111sensitises cancer cells toconventional chemotherapy.Journal of enzyme inhibition and medicinalchemistry,2019.34(1):p.117-123；粘蛋白13(Mucin-13)是多种上皮癌中异常表达的细胞表面糖蛋白，70％的活动性皮肤黑色素瘤患者(除葡萄膜黑色素瘤)血清粘蛋白13升高，参见Filippou,P.S.等人,Exploring the potential of mucin 13(MUC13)as a biomarkerfor carcinomas and other diseases.Clin Chem Lab Med,2018.56(11):p.1945-1953；肌动蛋白α心肌1(Actin,alpha cardiac muscle 1)参与各种类型的细胞运动，癌细胞需要进行连续的肌动蛋白细胞骨架重塑，以适应环境机械刺激，从而促进其存活、迁移和转移参见Butcher,D.T.,T.Alliston,and V.M.Weaver,A tense situation:forcing tumourprogression.Nat Rev Cancer,2009.9(2):p.108-22；Paszek,M.J.等人,Tensionalhomeostasis and the malignant phenotype.Cancer Cell,2005.8(3):p.241-54，另外，β-肌动蛋白被发现在黑色素瘤，结肠直肠，胃癌，胰腺癌，前列腺癌，卵巢癌等疾病中异常表达，参见Guo,C.等人,ACTB in cancer.Clin Chim Acta,2013.417:p.39-44。

第7天，肿瘤刚可见，共有7种差异蛋白显著变化，其中，有5种被报道与黑色素瘤相关。例如，肝细胞生长因子激活剂(Hepatocyte growth factor activator)的蛋白水解抑制剂SPINT2在抑制恶性黑素瘤进展中具有重要作用，参见Hwang,S.等人,EpigeneticSilencing of SPINT2 Promotes Cancer Cell Motility via HGF-MET PathwayActivation in Melanoma.The Journal of investigative dermatology,2015.135(9):p.2283-2291；胰岛素样生长因子结合蛋白4(Insulin-like growth factor-bindingprotein 4)表达下调可能是原发性黑色素瘤向转移性黑色素瘤发展的一步，参见Yu,J.Z.等人,Assessing the clinical utility of measuring Insulin-like Growth FactorBinding Proteins in tissues and sera of melanoma patients.J Transl Med,2008.6:p.70；线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶(Thioredoxin-dependentperoxide reductase,mitochondrial)在细胞抗氧化应激中发挥保护作用。该蛋白在基质成纤维细胞的细胞质中的表达与黑色素瘤特异性存活相关，参见Hintsala,H.R.等人,Dysregulation of redox-state-regulating enzymes in melanocytic skin tumoursand the surrounding microenvironment.Histopathology,2015.67(3):p.348-57；三肽基肽酶1(Tripeptidyl-peptidase 1)即TPP1，POT1-A532P是一种与黑素瘤相关的POT1突变，可导致TPP1-POT1相互作用减弱，参见Liu,J.,等人,Dissecting Fission YeastShelterin Interactions via MICro-MS Links Disruption of Shelterin Bridge toTumorigenesis.Cell Rep,2015.12(12):p.2169-80。

第14天共有29种差异蛋白显著变化，其中，有10种被报道与黑色素瘤相关。例如，半乳糖凝集素-3结合蛋白(Galectin-3-binding protein)在血清或肿瘤组织中显著上调与黑色素瘤患者的不良临床结果相关，参见Nyakas,M.等人,Prognostic biomarkers forimmunotherapy with ipilimumab in metastatic melanoma.Clinical andexperimental immunology,2019.197(1):p.74-82；Morandi,F.等人,Serum levels ofcytoplasmic melanoma-associated antigen at diagnosis may predict clinicalrelapse in neuroblastoma patients.Cancer immunology,immunotherapy:CII,2011.60(10):p.1485-1495；Giansanti,F等人,Secreted Gal-3BP is a novel promising targetfor non-internalizing Antibody–Drug Conjugates.Journal of Controlled Release,2019.294:p.176-184，其抑制剂具有作为抗转移癌症药物的潜力，参见Duckworth,C.A等人,Chemically modified,non-anticoagulant heparin derivatives are potentgalectin-3binding inhibitors and inhibit circulating galectin-3-promotedmetastasis.Oncotarget,2015.6(27):p.23671-23687；凝血酶原(Prothrombin)复合物参与B16F10黑素瘤细胞凝血酶的产生，参见Kirszberg,C.,V.M.Rumjanek,andR.Q.Monteiro,Assembly and regulation of prothrombinase complex on B16F10melanoma cells.Thrombosis Research,2005.115(1):p.123-129；前列腺素-H2 D-异构酶(Prostaglandin-H2 D-isomerase)可能在葡萄膜黑色素瘤的进展中发挥重要作用，参见Shi,K.,等人,Identify the signature genes for diagnose of uveal melanoma byweight gene co-expression network analysis.International journal ofophthalmology,2015.8(2):p.269-274；细胞间粘附分子1(Intercellular adhesionmolecule1)上调是引发黑色素瘤的淋巴扩散的关键，参见Galore-Haskel,G.等人,Histopathological expression analysis of intercellular adhesion molecule 1(ICAM-1)along development and progression of human melanoma.Oncotarget,2017.8(59):p.99580-99586；细胞粘附分子4(Cell adhesion molecule 4)参与细胞间粘附，可能具有抑癌活性，参见Fukami,T.等人,Isolation of the mouse Tsll1 and Tsll2 genes,orthologues of the human TSLC1-like genes 1and 2(TSLL1 and TSLL2).Gene,2003.323:p.11-8，黑色素瘤细胞粘附分子(Mel-CAM)，已被证明是上皮样黑素瘤的敏感标志物，参见Koch,M.B.等人,Microphthalmia Transcription Factor and Melanoma CellAdhesion Molecule Expression Distinguish Desmoplastic/Spindle Cell MelanomaFrom Morphologic Mimics.American Journal of Surgical Pathology.25(1):p.58-64；核运输因子2(Nuclear transport factor 2)对运货受体介导的核质运输过程至关重要，间接发挥更普遍的作用，RanBP3(人黑素瘤治疗干预的潜在靶点)通过核输出的选择性控制调节黑素瘤细胞增殖，参见Pathria,G.等人,RanBP3 Regulates Melanoma CellProliferation via Selective Control of Nuclear Export.Journal ofInvestigative Dermatology,2016.136(1):p.264-274；真核翻译起始因子6(Eukaryotictranslation initiation factor 6)与转移性黑色素瘤患者的肿瘤组织含量正相关，参见Welinder,C.等人,Correlation of histopathologic characteristics to proteinexpression and function in malignant melanoma.PLOS ONE,2017.12(4):p.e0176167；在基质成纤维细胞特异表达的整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9(Disintegrin andmetalloproteinase domain-containing)可在体内外调节黑色素瘤细胞的增殖和凋亡，参见Abety,A.N.等人,Stromal fibroblast-specific expression of ADAM-9modulatesproliferation and apoptosis in melanoma cells in vitro and in vivo.J InvestDermatol,2012.132(10):p.2451-2458，其表达有助黑色素瘤侵袭，参见Zigrino,P.,R.Nischt和C.Mauch,The disintegrin-like and cysteine-rich domains of ADAM-9mediate interactions between melanoma cells and fibroblasts.J Biol Chem,2011.286(8):p.6801-7；对中性神经酰胺酶(Neutral ceramidase)来说，酸性神经酰胺酶的表达调节A375黑色素瘤细胞对达卡巴嗪(转移性黑色素瘤的首选治疗药物)的敏感性，参见Bedia,C.等人,Acid ceramidase expression modulates the sensitivity ofA375melanoma cells to dacarbazine.J Biol Chem,2011.286(32):p.28200-9。

4、差异蛋白的生物功能分析

使用DAVID对差异蛋白进行功能注释，展示每个时间点差异蛋白的生物过程、细胞组成和分子功能相关信息。使用IPA对差异蛋白进行通路分析。

对生物过程分析，第7天显示出凋亡过程，第14天显示出细胞粘附、炎症相关过程，与肿瘤的侵袭、转移相关。对细胞组成分析，显示出差异蛋白为分泌蛋白，大多来自细胞外基质，细胞表面和膜。对分子功能，从第7天开始，显示出参与细胞凋亡、结合、运输功能。对通路分析，显示出不同时间点的通路具有各自的特点，且部分被报道与黑色素瘤有关。例如，在肿瘤可观察到之前，RhoA信号显著富集，据报道，RhoA是黑色素瘤细胞中GPR56激活的主要信号传导因子，从而促进细胞运动，参见Chiang,N.-Y.等人,GPR56/ADGRG1Activation Promotes Melanoma Cell Migration via NTF Dissociation and CTF-Mediated Gα12/13/RhoA Signaling.Journal of Investigative Dermatology,2017.137(3):p.727-736，CMSP通过RhoA-MAPK信号通路诱导B16-F1黑色素瘤细胞分化，参见Zhao,L.等人.,<b><i>P</i></b>-Hydroxycinnamaldehyde Induces B16-F1 Melanoma CellDifferentiation via the RhoA-MAPK Signaling Pathway.Cellular Physiology andBiochemistry,2016.38(6):p.2247-2260。树突状细胞与自然杀伤细胞之间的串扰可能代表生长的肿瘤逃避免疫反应的机制，这种相互作用对病原体和可能的肿瘤细胞的免疫反应具有重要的影响，在黑色素瘤细胞中得到印证，参见Capobianco,A等人,Melanoma cellsinterfere with the interaction of dendritic cells with NK/LAK cells.Int JCancer,2006.119(12):p.2861-9。FAK信号knockdown可抑制B16F10细胞迁移和转移，该信号可能是黑色素瘤治疗的潜在靶标，参见Pei,G.等人,FAK regulates E-cadherinexpression via p-SrcY416/p-ERK1/2/p-Stat3Y705 and PPARgamma/miR-125b/Stat3signaling pathway in B16F10 melanoma cells.Oncotarget,2017.8(8):p.13898-13908，黏着斑激酶(FAK)是一种非受体酪氨酸激酶，参与肿瘤血管生成，参见Sulzmaier,F.J.,C.Jean,and D.D.Schlaepfer,FAK in cancer:mechanistic findings andclinical applications.Nat Rev Cancer,2014.14(9):p.598-610；Tavora,B.等人,Endothelial FAK is required for tumour angiogenesis.EMBO Mol Med,2010.2(12):p.516-28，除具有激酶作用外，还参与细胞增殖、粘附、迁移、侵袭和凋亡，参见Luo,M.andJ.L.Guan,Focal adhesion kinase:a prominent determinant in breast cancerinitiation,progression and metastasis.Cancer Lett,2010.289(2):p.127-39；Arold,S.T.,How focal adhesion kinase achieves regulation by linking ligand binding,localization and action.Curr Opin Struct Biol,2011.21(6):p.808-13；而急性期反应信号、LXR/RXR激活、FXR/RXR激活等则在肿瘤可观察到之后显著富集，据报道，和FXR/RXR激活可能试图减轻炎症，通常与LXR等受体共同作用，激活胆固醇体内稳态、甘油三酸酯代谢并抑制炎症，参见Kong,Z.等人,Multi-Omics Analysis Reveals Up-Regulation ofAPR Signaling,LXR/RXR and FXR/RXR Activation Pathways in Holstein Dairy CowsExposed to High-Altitude Hypoxia.Animals:an open access journal from MDPI,2019.9(7):p.406。

本研究结果显示，尿液蛋白质组能够反映黑色素瘤发生发展的变化。在肿瘤不可见、不可触摸前，B16黑色素瘤的尿液中均鉴定到显著变化的差异蛋白，提示尿液具有早期诊断、区分不同肿瘤类型、提示其发生发展的巨大潜力。同时，标志物的不同组合能够为肿瘤的早期诊断提供新思路、新线索，具有开展大规模临床研究的价值。

Claims (7)

1.检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断所述受试者黑色素瘤的药物中的用途，其中所述尿液中蛋白质选自以下的一种或多种、或其组合：骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13、肌动蛋白α心肌1、三肽基肽酶1、线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4、溶质载体家族12成员3、生长停滞特异性蛋白6、肝细胞生长因子激活剂、铜转运蛋白ATOX1、前列腺素-H2D-异构酶、唾液酸酶1、真核翻译起始因子6、免疫球蛋白κ常数、C4b结合蛋白、细胞间粘附分子1、凝血酶原、肝细胞生长因子样蛋白、核运输因子2、体细胞细胞色素c、微管蛋白beta-4B链、CVB3结合蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Costars家族蛋白ABRACL、ATP结合盒亚家族A成员13、α-1-酸性糖蛋白1、整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9、白介素1受体辅助蛋白、细胞粘附分子4、酸性哺乳动物几丁质酶、转铁蛋白、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、迁移和入侵增强子1、细胞色素B5型、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、中性神经酰胺酶和类酪氨酸蛋白10。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述诊断为早期诊断，优选地，所述早期诊断定义为肿瘤形成，但没有可见或可触及的肿块或临床症状，优选地所述尿液中蛋白质选自骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13和肌动蛋白α心肌1中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。

4.根据权利要求3所述的用途，其中所述检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂是单克隆抗体。

5.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述受试者是哺乳动物，优选是人。

6.根据权利要求1或2所述的用途，其中与健康对照相比，尿液中的骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13、线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、溶质载体家族12成员3、生长停滞特异性蛋白6、铜转运蛋白ATOX1、前列腺素-H2 D-异构酶、真核翻译起始因子6、免疫球蛋白κ常数、C4b结合蛋白、凝血酶原、肝细胞生长因子样蛋白、核运输因子2、体细胞细胞色素c、CVB3结合蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Costars家族蛋白ABRACL、整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9、细胞粘附分子4、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、迁移和入侵增强子1、细胞色素B5型、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、中性神经酰胺酶、类酪氨酸蛋白10含量升高，和/或肌动蛋白α心肌1、三肽基肽酶1、胰岛素样生长因子结合蛋白4、肝细胞生长因子激活剂、唾液酸酶1、细胞间粘附分子1、微管蛋白beta-4B链、ATP结合盒亚家族A成员13、白介素1受体辅助蛋白、α-1-酸性糖蛋白1、酸性哺乳动物几丁质酶、转铁蛋白含量降低，指示受试者患有黑色素瘤。

7.一种用于早期诊断黑色素瘤的试剂盒或芯片，其包含检测受试者尿液中蛋白质含量的试剂，其中所述尿液中蛋白质为以下蛋白质的组合：骨桥蛋白、碳酸酐酶1、粘蛋白13、肌动蛋白α心肌1、三肽基肽酶1、线粒体硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶、胰岛素样生长因子结合蛋白4、溶质载体家族12成员3、生长停滞特异性蛋白6、肝细胞生长因子激活剂、铜转运蛋白ATOX1、前列腺素-H2 D-异构酶、唾液酸酶1、真核翻译起始因子6、免疫球蛋白κ常数、C4b结合蛋白、细胞间粘附分子1、凝血酶原、肝细胞生长因子样蛋白、核运输因子2、体细胞细胞色素c、微管蛋白beta-4B链、CVB3结合蛋白、半乳糖凝集素-3结合蛋白、Costars家族蛋白ABRACL、ATP结合盒亚家族A成员13、α-1-酸性糖蛋白1、整合素和金属蛋白酶结构域蛋白9、白介素1受体辅助蛋白、细胞粘附分子4、酸性哺乳动物几丁质酶、转铁蛋白、6-磷酸葡萄糖酸内酯酶、迁移和入侵增强子1、细胞色素B5型、14kDa磷酸组氨酸磷酸酶、中性神经酰胺酶和类酪氨酸蛋白10。

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