CN101619312B - 人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码rna序列及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA(lncRNA-UN)及其RNA干扰靶点，以及RNA干扰靶点的短发夹RNA(shRNA)、小分子干扰RNA(siRNA)、编码短发夹RNA的正义链DNA和反义链DNA、转录短发夹RNA的重组质粒。实验表明，lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达，在癌旁组织中不表达，可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中应用。实验表明，转录短发夹RNA的重组质粒在黑色素瘤细胞中表达shRNA和siRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-UN并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长，因而本发明所述lncRNA-UN的RNA干扰靶点的shRNA及siRNA，以及转录shRNA的重组质粒可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中应用。

Description

人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA序列及其用途 

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA(long non-coding RNA，简称lncRNA，下文中“lncRNA”的含义为长非编码RNA)及其用途。 

背景技术

人体中编码蛋白质的基因大约有2～3万个，仅占人类基因组的2％，其余98％不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾DNA”(junk DNA)。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，简称ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA、miRNA、piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和lncRNA(long≥200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对lncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，lncRNA不能被翻译成蛋白质，通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等，越来越多的证据表明lncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现，lncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，例如与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等疾病有关，研究结果表明lncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用(见Tarantul V.，Nilolaev A.，Hanning H.，et al.，Detection of abundantly transcribed genes and gene translocation inhuman immunodeficiency virus-associated non-Hodgkin’slymphoma.Neoplasia，2001，3：132-142.)。因此，通过大范围分析肿瘤和正常组织的lncRNA，可以鉴定与肿瘤特异相关的lncRNA，使其成为潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的lncRNA的短发夹RNA(short-hairpin RNA，简称shRNA，下文中“shRNA”的含义为短发夹RNA)可以有效地表达特异性的小分子干扰RNA(small interference RNA，简称siRNA，下文中“siRNA”含义为小分子干扰RNA)并抑制lncRNA作用的发挥，比其他的治疗手段的毒副作用会更低。相反，通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的lncRNA，进而抑制其调控的特定靶基因的表达，也可以达到抑制肿瘤生长的效果。为了人类的健康，开发更多的肿瘤特异性表达的lncRNA对基于lncRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种人黑色素瘤细胞特异表达的lncRNA及其RNA干扰靶点(RNA interference，简称“RNAi”，下文中“RNAi”的含义为RNA干扰)，以及 RNA干扰靶点shRNA、siRNA、编码shRNA的正义链DNA和反义链DNA及转录shRNA的重组质粒；本发明的再一目的是提供所述人黑色素瘤细胞特异表达的lncRNA及shRNA、siRNA和转录shRNA的重组质粒的用途。 

本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的lncRNA克隆自人恶性黑色素瘤细胞yusac，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示(长239nt)，或与序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列，命名为“lncRNA-UN’。 

本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点(RNAi靶点)，来自lncRNA-UN，含有序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO：2所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。 

本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的短发夹RNA(shRNA)，含有序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO：3所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。 

本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干扰RNA(siRNA)，含有序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQID NO：4所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO：4所示核苷酸序列进行了硫代修饰或/和甲氧基修饰的序列。 

本发明所述编码人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA，根据lncRNA-UN的RNAi靶点序列设计；所述正义链DNA含有序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO：5所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列；所述反义链DNA含有序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，或与序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列具有90％以上的同源性，或为序列表中SEQ ID NO：6所示核苷酸序列进行了硫代修饰的序列。 

本发明所述转录短发夹RNA的真核重组质粒，由编码人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段与真核表达载体构建而成。 

实验表明，本发明所述lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达，在癌旁组织中不表达，因而lncRNA-UN可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。 

实验表明，在黑色素瘤细胞中表达lncRNA-UN对应的shRNA和siRNA能明显降解细胞内源性lncRNA-UN并抑制黑色素瘤细胞的恶性生长，因而本发明所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的shRNA及siRNA，以及编码shRNA的重组质粒可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。 

本发明所述lncRNA-UN序列、lncRNA-UN的RNAi靶点序列，lncRNA-UN干扰靶点的shRNA序列，siRNA序列，及编码shRNA的DNA序列既可通过生物学方法获得，又可通过化学合成方法获得，若通过化学合成方法制备，只要将其核苷酸序列提供给有关专业公司，委托其合成即可。为增强其稳定性、生物利用度、组织靶向性等药学特征，可对其进行硫代修饰或/和甲氧基修饰。 

本发明具有以下有益效果： 

1、本发明为黑色素瘤疾病的诊断提供了新的方法和试剂，有利于黑色素瘤疾病的确诊与治疗。 

2、本发明为黑色素瘤疾病的治疗提供了新的方法和药物，对于挽救黑色素瘤疾病患者的生命具有重要意义。 

附图说明

图1是定量PCR检测本发明所述lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中表达的结果图。 

图2是对单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1进行软琼脂集落生长检测的结果图。 

图3是将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2为第1只裸鼠的移植瘤，2-1、2-2为第2只裸鼠的移植瘤，3-1、3-2为为第3只裸鼠的移植瘤。 

图4是本发明所述lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC和稳定低表达细胞株yusac-shUN中的表达情况图，图中，1泳道为lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC中的表达，2泳道为lncRNA-UN在稳定细胞株yusac-shUN中的表达。 

图5是对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测的结果图。 

图6是将稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC注入裸鼠后的实验结果图，图中，1-1和1-2为各实验组中第1只裸鼠的移植瘤，2-1、2-2为各实验组中第2只裸鼠的移植瘤，3-1、3-2为各实验组中第3只裸鼠的移植瘤。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。下属实施例中，凡未注明具体实验条件的， 均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等著的分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Freshney著的动物细胞培养：基本技术指南第五版(John Wiley&Sons，Inc，2005)中所述的条件及实验步骤，或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。 

实施例1：lncRNA-UN的克隆与分析 

1、试剂 

Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；MMLV逆转录酶、DNA聚合酶、pfu酶、Nde I酶、Xho I酶、RNase抑制剂均购自立陶宛Fermentas公司；T7 RNA聚合酶购自美国NEB公司；随机引物购自美国Promega公司；TALON金属离子树脂购自美国BDClontech公司；PCR引物由Invitrogen公司合成。 

2、菌株、细胞株和载体 

人恶性黑色素瘤细胞yusac购自美国标准菌种收藏所(ATCC)；E.coli BL2菌株购自天津天有利科技有限公司；PCR-blunt-TOPO载体购自美国Invitrogen公司；pET-28a(+)载体购自德国Novagen公司。 

3、实验方法 

3.1人恶性黑色素瘤细胞yusac总cDNA文库的构建 

3.1.1 yusac细胞总RNA的提取 

1)人恶性黑色素瘤细胞yusac培养至75％汇合度，加入1mL Trizol试剂，用枪头吹打混匀； 

2)用5mL带7号针头的1次性注射器吹打10次进行匀浆，将匀浆样品在室温孵育5min； 

3)加0.2mL氯仿，盖紧Ep管盖，用手剧烈振荡15s并于室温孵育2～3min； 

4)4℃，12,000×g离心15min； 

5)将水相层转移到1干净的1.5mL Ep管中，加入0.5mL异丙醇及20μg糖原，颠倒混匀，将混匀后的样品于室温孵育10min； 

6)4℃，12,000×g离心10min。倒掉上清液，用75％的乙醇1mL洗涤RNA沉淀1-2次，旋涡振荡混合样品后，4℃，7,500×g离心5min； 

7)倒掉乙醇，常温干燥RNA沉淀10min，加入50μL无RNA酶的H₂O，并于55℃孵育5min，以使RNA充分溶解，于260nm测定RNA浓度。 

3.1.2逆转录(RT) 

在500μL EP管中加入以下组分： 

yusac细胞RNA 10μL 

随机引物(10μmol/L)1μL 

H₂O 18μL 

混匀后70℃温育5min，迅速置冰浴中，静置3min后加样如下： 

RNase抑制剂1μL 

dNTP(10mmol/L)1μL 

5×buffer 8μL 

MMLV逆转录酶1μL 

混匀后42℃温育1h，70℃ 10min灭活逆转录酶，-20℃保存样品。 

3.1.3yusac细胞总cDNA文库的构建 

将本实施例3.1.2所得单链cDNA经DNA聚合酶及pfu酶处理得到平末端双链cDNA(操作步骤见DNA聚合酶、pfu酶操作手册)。所得平末端双链cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体上，构建yusac细胞总cDNA文库。 

3.2带组氨酸标签His-PSF融合蛋白的原核表达及亲和纯化 

3.2.1多聚酶链式反应(PCR)扩增PSF基因的编码序列(Coding Sequence，CDS)反应体系为： 

PCR缓冲液(10×)5μL 

MgCl₂(2.5m mol/L)2.5μL 

dNTP(2.5m mol/L)1.0μL 

上游引物(10μmol/L)0.5μL 

下游引物(10μmol/L)0.5μL 

pcDNA3.1-PSF(连接位点为EcoR I和EcoRV)0.1μL 

Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.1μL 

Pfu DNA聚合酶(5U/μL)0.3μL 

ddH₂O 40μL 

矿物油30μL 

反应参数为：94℃1min(预变性)；94℃30sec(变性)，65℃30sec(复性)，72℃2min(延伸)，所述变性-复性-延伸23个循环；72℃10min(终延伸)。 

引物序列如下： 

上游引物(FP)：5’-ATATTACCATATGTCTCGGGATCGGTTCCGG-3’(下划线标示Nde I酶切位点) 

下游引物(RP)：5’GGGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTT-3’(下划线标示Xho I酶切位点) 

3.2.2His-PSF融合蛋白的原核表达载体的构建 

将PSF的编码序列通过Nde I和Xho I酶切位点克隆到原核表达载体pET-28a(+)的 多克隆位点区，得到重组质粒pET-28a(+)-PSF(载体多克隆位点区末端自带组氨酸His标签)。 

3.2.3His-PSF融合蛋白的表达 

1)将本实施例3.2.2所得重组质粒pET-28a(+)-PSF转化到E.coli BL21菌株中； 

2)接种转化了重组质粒pET-28a(+)-PSF的E.coli BL21单菌落于LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃震荡培养； 

3)检测菌液OD₆₀₀至0.6-0.7时加入1.0mmol/L IPTG，并将温度调至25℃，诱导培养过夜。 

3.2.4His-PSF融合蛋白的亲和纯化 

1)离心收集菌体，菌体经PBS缓冲液(140mmol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，5mmol/L Na₂HPO₄，1.8mmol/L KH₂PO₄及5mmol/L EDTA，pH7.2)洗涤后重新悬浮于20mL PBS(含0.5mol/L NaCl，1mmol/L PMSF及1mmol/L DTT)； 

2)冰浴超声破壁，13,000×g离心30min收集上清； 

3)沉淀以相同步骤重复处理一次，合并两次上清收集液，得到蛋白粗提液； 

4)将TALON金属离子亲和树脂(BD Clontech)用平衡-洗涤缓冲液(250mmol/LNa₃PO₄，1.5mol/LNaCl，pH7.0)预平衡； 

5)加适量蛋白粗提液于预平衡后的TALON金属离子亲和树脂，轻柔摇晃1.5hrs； 

6)加入平衡-洗涤缓冲液(含有10mmol/L咪唑)洗涤树脂两次； 

7)用平衡-洗涤缓冲液(含有250mmol/L咪唑)洗脱树脂上结合的His-PSF重组蛋白； 

8)洗脱得到的重组蛋白用50倍体积的透析缓冲液(20mM Hepes，20％glycerol，100mM KCl，0.2mM EDTA，0.2mM PMSF，0.5mM DTT，pH7.9)在4℃透析过夜，中途更换透析缓冲液一次； 

9)得到的透析产物用液氮速冻，1h后长期冻存于-80℃； 

3.3PSF蛋白结合RNA的筛选及编码PSF结合RNA的cDNA子文库的构建 

利用组氨酸标签将原核重组质粒表达的His-PSF融合蛋白结合于TALON金属离子树脂上；用T7 RNA聚合酶将yusac细胞总cDNA文库中的cDNA插入片段体外转录为RNA混合体，RNA混合体通过5次反复过柱，使能够与PSF蛋白结合的RNA吸附于树脂上；将RNA从树脂上洗脱，逆转录合成cDNA，将cDNA连接到PCR-blunt-TOPO载体上构建cDNA子文库，文库中富集了编码与PSF蛋白结合的RNA的克隆，挑取阳性克隆测序。 

3.4所获克隆序列的分析 

所获克隆序列测序，对人基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行BLAST 分析，并找到它们在人染色体上的精确定位(http://genome.ucsc.edu/)。挑选出≥200bp且位于基因组非蛋白质编码区的序列。其中获得一条239nt的lncRNA，其序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，定位于6号染色体的165453538-165453778位核苷酸，其为一未知序列编码，命名为lncRNA-UN。 

3.5lncRNA-UN的RT-PCR鉴定 

使用Trizol试剂从人恶性黑色素瘤组织提取总RNA(方法同本实施例3.1.1)，按照常规RT-PCR方法检测lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织中的表达。 

3.5.1RT(方法同本实施例3.1.2)获得黑色素瘤组织cDNA 

3.5.2PCR 

PCR缓冲液(10×)2.5μL 

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL 

上游引物(10μmol/L)1.0μL 

下游引物(10μmol/L)1.0μL 

黑色素瘤组织cDNA 0.3μL 

DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL 

ddH₂O 19μL 

反应参数均为：94℃ 3min(预变性)；94℃ 30sec(变性)，64℃ 30sec(复性)，72℃ 60sec(延伸)，所述变性-复性-延伸30次循环。 

引物序列如下： 

5’-tttgacacgagtgactgtattttgaa-3’ 

5’-atttatgaattgtcacaggacctct-3’ 

测序检测RT-PCR扩增获得的序列，并与序列表中SEQ ID NO：1比对，结果显示吻合。 

实施例2：定量PCR检测lncRNA-UN在人恶性黑色素瘤组织及癌旁组织中的表达 

1、试剂、菌株、细胞株和载体 

常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例一相同。 

QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒购自德国Qiagen公司。 

2、实验方法 

2.1.1合成的总cDNA 

以人黑色素瘤组织及对应癌旁组织为材料，用Trizol试剂分别提取黑色素瘤组织及对应癌旁组织的总RNA(方法同实施1中的3.1.1)。将黑色素瘤组织总RNA和对应癌旁组织总RNA各取1μg，用随机引物进行逆转录反应(方法同实施例1中的3.1.2)获黑色素瘤组织总cDNA和对应癌旁组织的总cDNA，合成的黑色素瘤组织及对应癌旁组织的 总cDNA即为定量PCR反应的模板。 

2.1.2黑色素瘤组织及癌旁组织的lncRNA-UN表达 

以本实施例2.1.1所得黑色素瘤组织总cDNA和对应癌旁组织的总cDNA为PCR反应的模板，以特异于lncRNA-UN序列的RT-PCR引物(同实施例1的3.5.2中引物)为引物，用QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒进行定量PCR反应，即获黑色素瘤组织及癌旁组织的lncRNA-UN表达。 

2.1.3实验结果 

黑色素瘤组织及癌旁组织lncRNA-UN的表达情况见图1，图1中1，3，5，7对应的为黑色素瘤癌旁组织；2，4，6，8对应的为黑色素瘤组织。从图1可以看出，lncRNA-UN在黑色素瘤组织中高表达，而在癌旁组织中不表达。实验结果表明，lncRNA-UN在黑色素瘤组织和癌旁组织中的表达水平存在明显差异，因而lncRNA-UN可在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。 

实施例3：lncRNA-UN的过量表达对黑色素瘤细胞生长的影响 

1、试剂、菌株、细胞株和载体 

常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例1相同。 

pcDNA-3.1真核表达载体、lipofectamine 2000转染试剂、G418抗生素均购自美国Invitrogen公司；DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibico公司；硝基蓝四唑(nitro bluetetrazolium，NBT)购自美国Sigma公司。 

Perfection 4990平板式扫描仪购自日本Epson公司。 

BALB/c裸鼠，SPF(Specific Pathogen-free，无特定病原体)级，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司 

2、实验方法 

2.1稳定高表达lncRNA-UN的单克隆细胞株的构建 

2.1.1构建lncRNA-UN的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN 

将原本克隆于PCR-blunt-TOPO载体上的编码lncRNA-UN的DNA序列(由实施例1的3.3和3.4获得)重新连接到真核表达载体pcDNA-3.1的Nhe I和Apa I酶切位点，构建lncRNA-UN的真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN。 

2.1.2构建单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN 

用含10％胎牛血清的DMEM培养基将人黑色素瘤细胞yusac培养于5％CO₂的37℃培养箱中。转染前一天于6孔板中接入1×10⁶个细胞/孔，用lipofectamine 2000进行转染，每孔转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN 3μg。细胞转染24小时后用浓度为700mg/L的G418连续筛选1-2周，得到稳定转染的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN。同时以空载体pcDNA-3.1稳定转染yusac细胞(见lipofectamine 2000 说明书)，得到对照细胞株yusac-pcDNA3.1。 

2.1.3单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-UN的表达量检测 

以常规半定量RT-PCR检测各单克隆黑色素瘤细胞株中lncRNA-UN的表达量，挑选得到lncRNA-UN表达量最高的稳定黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN。并以转入空真核表达载体pcDNA-3.1的黑色素瘤细胞株yusac-pcDNA3.1作为对照。 

50μL半定量PCR反应体系，其组分为 

PCR缓冲液(10×)5μL 

MgCl₂(25mM)5μL 

dNTP(2.5mmol/L)1.0μL 

上游引物(10μmol/L)0.5μL 

下游引物(10μmol/L)0.5μL 

模板(yusac-lncRNA-UN或yusac-pcDNA3.1的cDNA)2μL 

DNA聚合酶(5U/μL)0.4μL 

ddH₂O 35.6μL 

所有PCR的反应参数为：94℃ 3min(预变性)；94℃ 30ec(变性)，64℃ 30sec(复性)，72℃ 60sec(延伸)，所述变性-复性-延伸×n cycles。循环次数根据PCR反应的起跳点确定，一般情况下，每次具体的PCR反应较起跳点多1-2个循环。 

2.2软琼脂集落生长检测 

在6孔板中用1mL含0.6％琼脂糖、700mg/LG418及10％胎牛血清的DMEM培养基铺设下层琼脂；待下层琼脂凝固后，将本实施例2.1.2构建的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体的对照细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5×10³个细胞/孔的数量接入1mL含0.3％琼脂糖、700mg/LG418及10％胎牛血清的DMEM培养基，混匀后铺设上层琼脂；待上层琼脂凝固后，培养于5％CO₂的37℃培养箱中培养。2周后，加入400μL 1.25g/L的硝基蓝四唑(nitro blue tetrazolium，NBT)染色液，置于5％CO₂的37℃培养箱中孵育过夜，透射扫描仪扫描的图像见图2。 

图2表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1相比，转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN稳定过量表达lncRNA-UN，可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的集落性生长，增强了yusac细胞的体外恶性生长特性。 

2.3裸鼠移植瘤生长检测 

实验裸鼠为5周龄裸鼠，分成两组，每组3只，一组用于注射本实施例2.1.2构建的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN，一组用于注射本实施例2.1.2构建的转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1。 

将单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN和转入空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1分别以5×10⁵个细胞/注射点的剂量对裸鼠进行颈部皮下注射(每只裸鼠2个注射点)，待移植瘤长出后，每3天检测一次大小，移植瘤长出后约一个月，将裸鼠脱颈椎处死，取出肿瘤，两组裸鼠的实验结果见图3，从图3可以看出，注射单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN的裸鼠长有移植瘤，注射对照细胞株yusac-pcDNA3.1的裸鼠未长有移植瘤。 

图3表明，与转染空真核表达载体pcDNA-3.1的对照细胞株yusac-pcDNA3.1相比，转染真核重组质粒pcDNA-lncRNA-UN的单克隆黑色素瘤细胞株yusac-lncRNA-UN稳定过量表达lncRNA-UN可以显著促进黑色素瘤细胞yusac的体内成瘤性，增强了yusac细胞的体内恶性生长特性。 

实施例4：lncRNA-UN特异性shRNA抑制黑色素瘤细胞的恶性生长特性 

1、试剂、菌株、细胞株和载体 

常规试剂、菌株、细胞株和载体与实施例1相同。 

正义链DNA和反义链DNA模板由美国Invitrogen公司合成；限制性内切酶BamH1和HindIII均购自立陶宛Fermentas公司；真核表达载体pGenesil-1购自武汉赛晶公司。 

2、实验方法 

2.1lncRNA-UN特异性RNA干扰载体的构建 

将lncRNA-UN的序列信息提交siRNA互联网设计工具(www.dharmacon.com)，获得可信度最高的RNAi靶点序列(如序列表中SEQ ID NO：2所示)。根据lncRNA-UN的RNAi靶点序列设计编码特异性shRNA分子的正义链DNA和反义链DNA模板，将所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体pGenesil-1，构建lncRNA-UN干扰重组质粒。将构建好的lncRNA-UN干扰重组质粒导入哺乳动物细胞后，能在其中转录出shRNA(如序列表中SEQ ID NO：3所示)，shRNA在动物细胞内被动物细胞固有的Dicer酶进一步切割形成具有RNA干扰功能的siRNA(如序列表中SEQ ID NO：4所示)，从而诱导RNA干扰程序的启动。正义链DNA和反义链DNA模板序列如下： 

1)编码lncRNA-UN RNAi靶点shRNA的正义链DNA： 

5′- 

TGGTCTTCCTCAGCTCCATTTCAAGAGAATGGAGCTGAGGAAGACCATTTTTT 

-3′ 

2)编码lncRNA-UN RNAi靶点shRNA的反义链DNA： 

5′- 

AAAAAATGGTCTTCCTCAGCTCCATTCTCTTGAAATGGAGCTGAGGAAGACCA

-3′ 

序列中下划线部分为靶基因的RNAi靶点序列及相应互补序列；方框部分为限制性内切酶BamH1和HindIII的识别位点，用于退火后形成的双链DNA片段克隆进RNA干扰载体；中间未标示部分编码shRNA的茎环(loop)。 

2.1.1正义链DNA和反义链DNA的退火 

将编码lncRNA-UN RNAi靶点的shRNA的正义链DNA和反义链DNA片段浓度分别调整为250μM，退火形成互补双链DNA分子(经退火处理后5’及3’端分别带有BamH1/HindIII酶切位点)。退火反应条件如下： 

shRNA-S模板(250μM)5μL 

shRNA-A模板(250μM)5μL 

10×退火缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1MNaCl)1.25μLH₂O 1.25μL 

混匀，石蜡油覆盖后离心10s，95℃温育5min，经1-2小时缓慢降温至室温，此时两条寡核苷酸精确退火为寡核苷酸双链(浓度为100μM)；退火后的双链DNA用灭菌水稀释100倍，浓度为1μM。 

2.1.2构建lncRNA-UN干扰重组质粒 

将退火形成的双链DNA片段连接到RNA干扰载体pGenesil-1的BamH1/HindIII酶切位点，构建lncRNA-UN特异性shRNA的真核重组质粒pGenesil-shUN。连接反应条件如下： 

pGenesil-1载体(约0.005μM)10μL 

双链DNA(1μM)0.5μL 

10×连接酶缓冲液2μL 

H₂O 5.5μL 

连接酶2μL 

混匀，离心5sec，16℃连接过夜，70℃ 10min灭活连接酶，-20℃保存样。 

2.1.3构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC 

构建作为负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC的方法同本实施例2.1.1和2.1.2。将负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC导入哺乳动物细胞后转录出萤火虫荧光素酶基因luciferase特异的shRNA-shLUC，其编码DNA序列的正义及反义链分别为： 

5′- 

gtagcgcggtgtattatacttcaagagagtataatacaccgcgctactttttt 

-3′   5′- 

aaaaaagtagcgcggtgtattatactctcttgaagtataatacaccgcgctac

-3′。 

2.2稳定低表达lncRNA-UN的单克隆细胞株的构建 

同实施例3中的2.1.2所述方法将获得的真核重组质粒pGenesil-shUN稳定转染人黑色素瘤细胞yusac，经G418筛选、半定量RT-PCR检测后，获得lncRNA-UC表达量最低、RNAi效果最好的稳定细胞株yusac-shUN。同时，以负对照的RNA干扰重组质粒pGenesil-shLUC转染yusac细胞，得到对照细胞株yusac-shLUC。lncRNA-UN在对照细胞株yusac-shLUC和稳定细胞株yusac-shUN中的表达情况见图4。图4表明，稳定细胞株yusac-shUN中，lncRNA-UN的表达量较对照细胞株yusac-shLUC明显降低，说明选用的RNAi靶点序列正确无误，shRNA诱导的RNAi效果明显，稳定低表达lncRNA-UN的单克隆细胞株构建成功。 

2.3软琼脂集落生长检测 

同实施例3中2.2所述方法分别对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行软琼脂集落生长检测(细胞接种量为1×10⁴个细胞/孔)，检测结果见图5。由图5可知，转染真核重组质粒pGenesil-shUN降解yusac细胞内源性lncRNA-UN后，yusac细胞的集落性生长受到了一定程度的抑制，其体外恶性生长特性减弱，而转染对照重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体外恶性生长特性没有影响。这表明lncRNA-UN特异性的shRNA对黑色素瘤细胞的生长具有抑制作用，并具有治疗黑色素瘤疾病的作用，可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。 

2.4裸鼠移植瘤生长检测 

同实施例3中的2.3所述方法分别对稳定细胞株yusac-shUN和对照细胞株yusac-shLUC进行裸鼠移植瘤生长检测(细胞注射剂量为2×10⁶个细胞/注射点)，检测结果见图6。由图6可知，转染真核重组质粒pGenesil-shUN降解yusac细胞内源性lncRNA-UN后，yusac细胞的体内成瘤性受到了一定程度的抑制，其体内恶性生长特性减弱，而转染对照真核重组质粒pGenesil-shLUC对yusac细胞的体内恶性生长特性没有影响。这进一步表明lncRNA-UN特异性的shRNA对黑色素瘤的发生发展具有抑制作用，具有治疗黑色素瘤相关疾病的用途，可在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。 

序列表 

<110>四川大学 

<120>人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA序列及其用途 

<160>6 

<170>PatenIn Version 3.2 

<210>1 

<211>239 

<212>RNA 

<213>人 

<400>1 

ugugugugug uaugugagag agagagagag agagcccucu cuucaugguc uuccucagcu   60 

ccauuugcca gaguuugaca cgagugacug uauuuugaau cuuacaacuu ucacagauua  120 

cauauauuuu aagaaaauuc cuacuuaagc uagaugagcu uucucuuuca gagguccugu  180 

gacaauucau aaauuuaaug uuugcauuua aaucuuacuu gcuuauuaug agcauuguu   239 

<210>2 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人 

<400>2 

uggucuuccu cagcuccau  19 

<210>3 

<211>47 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<400>3 

uggucuuccu cagcuccauu ucaagagaau ggagcugagg aagacca  47 

<210>4 

<211>19 

<212>RNA 

<213>人工序列 

<400>4 

uggucuuccu cagcuccau    19 

accagaagga gucgaggua    19 

<210>5 

<211>59 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>5 

gatcctggtc ttcctcagct ccatttcaag agaatggagc tgaggaagac catttttta  59 

<210>6 

<211>59 

<212>DNA 

<213>人工序列 

<400>6 

agcttaaaaa atggtcttcc tcagctccat tctcttgaaa tggagctgag gaagaccag  59 

Claims (9)

1.一种人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA，其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

2.一种权利要求1所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点，其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

3.一种权利要求2所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的短发夹RNA，其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

4.一种权利要求2所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA的RNA干扰靶点的小分子干扰RNA，其特征在于它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

5.一种编码权利要求3所述短发夹RNA的正义链DNA和反义链DNA，其特征在于所述正义链DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，所述反义链DNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示。

6.一种转录权利要求3所述短发夹RNA的真核重组质粒，含有权利要求5所述正义链DNA和反义链DNA退火后形成的双链DNA片段。

7.权利要求1所述人黑色素瘤细胞特异表达的长非编码RNA在制备诊断黑色素瘤疾病的试剂中的应用。

8.权利要求3所述短发夹RNA在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。

9.权利要求4所述小分子干扰RNA在制备治疗黑色素瘤疾病的药物中的应用。

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