CN100374164C - 一种用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒，属于生物技术领域，GRIM19表达序列位于载体PcDNA3.1(+)的CMV启动子下，通过KpnI及EcoRI酶切位点相连，U6启动子-siRNA-stat3特异序列位于PcDNA3.1(+)CMV启动子前，通过BglII及NruI酶切位点相连。局部注射本发明可明显抑制前列腺癌及黑色素瘤的生长，诱导其凋亡。

Description

一种用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种重组质粒，涉及应用RNAi技术抑制Stat3在前列腺癌及黑色素瘤中的过度表达以达到治疗肿瘤的目的，GRIM19可明显增强其对肿瘤的抑制作用。
背景技术
信号转导子与转录激活子Stat3的过度激活及表达可导致细胞无限生长，抵抗凋亡，发生癌变。目前，已在许多种恶性肿瘤中发现有Stat3的过度表达，包括前列腺癌及黑色素瘤，因此将Stat3作为肿瘤治疗的靶点，会给肿瘤的治疗带来新的希望。
GRIM19是一种在正常组织表达的基因，研究发现，癌发生时其表达关闭，将其表达质粒导入癌细胞可诱导该细胞凋亡。
RNA干扰是一种转录后的基因沉默。它能触发某种转录后监控程序，导致特定mRNA单链的降解。其作用的主要机制为mRNA经核酸酶降解为21-23bp的小片段，并以其为模板，特定位点，特定间隔降解与之序列相应的mRNA。
目前将STAT3siRNA表达载体与GRIM19表达载体通过亚克隆的方法共同构建为一种新的重组质粒，用于前列腺癌及黑色素瘤的治疗，无相关报道。
发明内容
本发明提供一种用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒，以解决目前没有局部注射治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒的问题。本发明采取的技术方案是：
GRIM19表达序列位于载体PcDNA3.1(+)的CMV启动子下，通过KpnI及EcoR I酶切位点相连，U6启动子-siRNA-stat3特异序列位于PcDNA3.1(+)CMV启动子前，通过BglII及NruI酶切位点相连。
siRNA-stat3特异序列如SEQ ID NO.1所述。
GRIM19表达序列如SEQ ID NO.2所述。
本发明重组质粒构建过程：
(一)、pSilencer U6-Stat3siRNA载体的构建：pSilencer U6质粒购于美国ambion公司，根据基因BANK中已知人Stat3mRNA序列NM003150，寻找合适的靶位点(2143-2162)，合成编码siRNA的DNA模板，将pSilencer U6用BamH I及Hind III线性化后，与其在T4连接酶作用下连接；
(二)、GRIM19表达载体的构建：用RT-PCR方法钓取GRIM19的编码序列，将表达载体pCXN2mycA，美国invitrogen公司，用KpnI-及EcoR I线性化后，用T4连接酶将两者连接；
(三)、用PCR方法以(一)为模板，钓取编码U6启动子及Stat3 siRNA的编码序列；将PcDNA3.1(+)表达载体，购于美国invitrogen公司，用BgIII及NruI线性化，通过亚克隆的方法将两者在T4连接酶的作用下连接；
(四)、用RT-PCR方法以(二)为模板，钓取GRIM19的编码序列，通过KpnI及EcoR I酶切位点将其克隆到(三)得到的PcDNA3.1(+)-U6-Stat3 siRNA的CMV启动子下；通过上述过程将编码U6-Stat3 siRNA的序列及编码GRIM19的序列共同构建到PcDNA3.1(+)表达载体上。
本发明的有益效果：
1 pSilencerU6-Stat3 siRNA重组质粒局部注射前列腺癌及黑色素瘤可明显抑制其生长，诱导其细胞凋亡。
2 GRIM19表达质粒可明显增强pSilencerU6-Stat3 siRNA对前列腺癌及黑色素瘤局部注射的抑制作用。
3pSilencerU6-Stat3 siRNA与GRIM19共表达质粒PcDNA3.1(+)-U6stat3 siRNA-GRIM19局部注射可明显抑制前列腺癌及黑色素瘤的生长，诱导其凋亡。其抑癌作用高于1及2。
本发明使用时可采用局部给药，包括局部注射或电渗透。
附图说明
图1、裸鼠前列腺癌局部注射重组质粒(20μg/mouse)后，肿瘤体积明显缩小；
图2、裸鼠前列腺癌局部注射重组质粒(20μg/mouse)后，肿瘤细胞出现凋亡。
图3、裸鼠前列腺癌局部注射重组质粒(20μg/mouse)后，瘤体内stat3mRNA表达明显减少；A、Northem blot分析，左边起第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA组，第4道stat3 siRNA-GRIM19组；B、RT-PCR分析，左边起第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA组，第4道stat3siRNA-GRIM19组。
图4、裸鼠前列腺癌局部注射重组质粒(20μg/mouse)后，瘤体内stat3及p-stat3蛋白表达明显减少；A、Western blot分析stat3表达，左边起第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA组，第4道stat3 siRNA-GRIM19组；B、Western blot分析-p-stat3表达，左边起第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA组，第4道stat3 siRNA-GRIM19组。
图5、裸鼠前列腺癌局部注射重组质粒(20μg/mouse)后，瘤体内cyclin D1，C-Myc，BcL2蛋白明显减少；A、Western blot分析BcL2蛋白表达，左边起第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA-GRIM19组；B、Western blot分析Cyclin D1表达，左边起第1道第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA组，第4道stat3 siRNA-GRIM19组；C、RT-PCR分析C-myc蛋白表达，左边起第1道空白对照组，第2道阴性对照组，第3道stat3 siRNA组，第4道stat3 siRNA-GRIM19组。
图6、A C57小鼠黑色素瘤局部注射重组质粒(20ug/mouse)，局部肿瘤明显变小，B C57小鼠黑色素瘤局部注射重组质粒(20ug/mouse)，肿瘤生长曲线。
具体实施方式
实验例本发明重组质粒PcDNA3.1(+)-U6stat3 siRNA-GRIM19对裸鼠前列腺癌及C57小鼠黑色素瘤生长抑制作用
1荷瘤裸鼠体内抑瘤试验
裸鼠15只，每只2×106/100ulPC3 cell接种至左腹侧壁，每天用游标卡尺进行测量，体积按公式m1 2×m2×0.5236计算，其中m1为短轴距离，m2为长轴距离，待肿瘤体积长至一定大小时，将动物分为四组，1、空白盐水对照组、2阴性(19个与人体内所有序列都不同源的碱基序列构建的siRNA表达载体)对照组；3pSilencerU6-stat3siRNA组；4PcDNA3.1-siRNAstat3-GRIM19重组质粒组。质粒注射剂量为20μg/只(间隔7天重复给药)，在注射结束后于注射局部实行电转染以提高质粒在瘤体内的转染效率。观察肿瘤大小，接种后当对照组肿瘤长至足够大时处死动物，取肿瘤，测量大小，部份石腊包埋，切片，H&E染色，组化；另一部份提取蛋白。结果发现PcDNA3.1-U6stat3 siRNA-GRIM 19肿瘤局部注射明显抑制肿瘤生长(图1)，并诱导其发生凋亡(图2)；PcDNA3.1-U6stat3 siRNA-GRIM 19肿瘤局部注射(剂量20μg/只)明显抑制肿瘤内stat3表达，并导致Bcl-2，Cyclin D1及C-Myc表达水平下调(图3、图4、图5)；
2PcDNA3.1-U6stat3 siRNA-GRIM19对C57小鼠黑色素瘤模型的抑瘤效应
C57小鼠21只，每只以2X106/100ul个B16 cell接种至右脚趾垫，于接种后的第9天全部出瘤，测量肿瘤平均大小为(4.12mm3)，将其随机分为三组，盐水对照组，阴性(19个与人体内所有序列都不同源的碱基序列构建的siRNA表达载体)对照组，实验组.注射剂量为20-30ug/只，注射局部用电转染，于接种后30天，对照组肿瘤长到12.1mm3，空质粒对照组为9.89mm3，而PcDNA3.1-U6stat3 siRNA-GRIM19转染组为5.25mm3(Figure29)，与对照组相比差异显著(P＜0.01)(图6)。
实施例：发明重组质粒构建过程
(一)、pSilencerU6-Stat3 siRNA载体的构建：pSilencer U6质粒购于美国ambion公司，根据基因BANK中已知人Stat3mRNA序列NM003150，寻找合适的靶位点(2143-2162)，合成编码siRNA的DNA模板，将pSilencer-U6用BamHI及HindIII线性化后，与其在T4连接酶作用下连接；
(二)、pCXN2mycA-GRIM19表达载体的构建：用RT-PCR方法钓取GRIM19的编码序列，将表达载体pCXN2mycA，购于美国invitrogen公司，用KpnI及EcoRI线性化后，用T4连接酶将两者连接；
(三)、用PCR方法以(一)为模板，钓取编码U6启动子及Stat3 siRNA的编码序列；将PcDNA3.1(+)表达载体，购于美国invitrogen公司，用BglII及NruI线性化，通过亚克隆的方法将两者在T4连接酶的作用下连接；
(四)、用RT-PCR方法以(二)为模板，钓取GRIM19的编码序列，通过KpnI及EcoR I酶切位点将其克隆到(三)得到的PcDNA3.1(+)-U6-Stat3 siRNA的CMV启动子下；通过上述过程将编码U6-Stat3 siRNA的序列及编码GRIM19的序列共同构建到PcDNA3.1(+)表达载体上。
序列表
<110>吉林大学
<120>用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒
<130>jlugao2005
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<111>19
<212>DNA
<213>Human
<400>1
gcagcagctg aacaacatg                                               19
<210>2
<211>435
<212>DNA
<213>Human
<400>2
atggcggcgt caaaggtgaa gcaggacatg cctccgccgg ggggctatgg gcccatcgac  60
tacaaacgga acttgccgcg tcgaggactg tcgggctaca gcatgctggc catagggatt  120
ggaaccctga tctacgggca ctggagcata atgaagtgga accgtgagcg caggcgccta    180
caaatcgagg acttcgaggc tcgcatcgcg ctgttgccac tgttacaggc agaaaccgac    240
cggaggacct tgcagatgct tcgggagaac ctggaggagg aggccatcat catgaaggac    300
gtgcccgact ggaaggtggg ggagtctgtg ttccacacaa cccgctgggt gccccccttg    360
atcggggagc tgtacgggct gcgcaccaca gaggaggctc tccatgccag ccacggcttc    420
atgtggtaca cgtag                                                     435

Claims (2)

1.一种用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒，其特征在于：GRIM19编码序列位于载体PcDNA3.1(+)的CMV启动子下，通过KpnI及EcoR I酶切位点相连，U6启动子-siRNA-stat3特异序列位于PcDNA3.1(+)CMV启动子前，通过Bgl II及NruI酶切位点相连，该-siRNA-stat3特异序列如SEQ ID NO.1所述，GRIM19编码序列如SEQ ID NO.2所述。
2.如权利要求1所述的用于治疗前列腺癌及黑色素瘤的重组质粒的构建方法：包括下列步骤：
(一)、pSilencer U6-Stat3 siRNA载体的构建：根据基因BANK中已知人Stat3mRNA序列NM003150，寻找合适的靶位点从2143到2162，合成编码siRNA的DNA模板，该合成编码siRNA的DNA模板的序列如SEQ ID NO.1所述，将pSilencer U6用BamHI及HindIII线性化后，与编码siRNA的DNA模板在T4连接酶作用下连接；
(二)、GRIM 19表达载体的构建：用RT-PCR方法钓取GRIM19的编码序列，将表达载体pCXN2mycA用KpnI及EcoR I线性化后，用T4连接酶将两者连接；
(三)、用PCR方法以步骤(一)获得的载体为模板，钓取编码U6启动子及-siRNA-stat3特异序列的序列；将PcDNA3.1(+)表达载体用BglII及NruI线性化，通过亚克隆的方法将两者在T4连接酶的作用下连接；
(四)、用RT-PCR方法以步骤(二)获得的表达载体为模板，钓取GRIM19的编码序列，通过KpnI及EcoR I酶切位点将其克隆到步骤(三)得到的载体的CMV启动子下。
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