CN102676677B - 一种microRNA定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种microRNA定量检测方法，包括如下步骤：（1）提取样本的总RNA；（2）用polyA聚合酶处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；（3）用5’端含有接头序列的oligo(dT)反转录引物进行反转录，使得到的第一链cDNA加上一段接头；（4）使用待测miRNA序列特异性正向引物和与所述接头序列互补的通用反向引物进行定量实时PCR扩增，其中，所述通用反向引物是长度不同的两种反向引物的混合物。本发明的方法可以对miRNA的表达进行定量检测和分析，大大提高了现有检测方法的特异性、灵敏性和重复性。

Description

一种microRNA定量检测方法
技术领域
本发明涉及核酸检测领域，具体来说是一种microRNA三步定量检测方法。该方法主要应用于microRNA表达谱分析、microRNA临床诊断、microRNA研究检测和microRNA相关药物研究以及筛选。
背景技术
microRNA（miRNA）是一类长度约为20-24个核苷酸（nt）的具有调控功能的非编码RNA。miRNA主要参与基因转录后水平的调控。miRNA基因首先在细胞核内转录成前体转录本（primary transcripts miRNA，pri-miRNA），在一种核糖核酸酶Drosha的作用下剪切形成约60-70nt的miRNA前体（pre-miRNA）；转运到细胞质后，另一种核糖核酸酶Dicer将其剪切成约为22nt的miRNA:miRNA双链。这种双链miRNA很快被引导进入RNA诱导沉默复合体（RISC）中，其中一条单链miRNA被降解，另一条成熟的单链miRNA分子通过与靶基因互补配对而促进其降解或抑制其翻译。相同的miRNA分子在不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间具有相似的调控功能，因此其具有保守性。但不同组织器官、不同细胞以及细胞发育的不同阶段，其miRNA的表达谱并不相同。这一细胞及“时空”特异性使其可以作为某些组织器官、不同细胞以及细胞发育不同阶段的特异性分子标志。miRNA已经成为近年来的研究热点，利用芯片及qPCR技术可以对其定量并分析。
目前采用qPCR技术对miRNA进行定量检测的方法主要有三种：(1)在常规引物延伸技术（PE）的基础上建立的引物延伸定量PCR法（PE-qPCR），即先通过一个加尾的miRNA特异性引物（GSP）将miRNA反转录成加尾cDNA，然后利用一个锁核酸（Locked nucleic acid，LNA）修饰的miRNA特异性反向引物（RP）和一个与加尾序列一致的通用引物（UP）进行PCR扩增。由于在DNA转录过程中，miRNA的3’端序列产生的多样化现象，使得目前市场上qPCR两步检测法的准确性受到很大影响。(2)利用茎-环状引物反转录miRNA，称为stem-loop RT-qPCR检测法，茎-环状反转录引物中除含有一段与miRNA互补的特异性序列外，还含有一段较长的共有序列，与靶miRNA退火反转录后，能得到一个较长的反转录扩增子（cDNA），共有序列提供了一个通用引物结合位点，然后通过一个与miRNA序列特异的引物和一个通用引物进行PCR扩增。深度测序结果表明，miRNA的3’末端多发生降解，茎环结构反转录引物扩增中存在潜在的扩增灵敏度问题。(3)三步检测法，先用polyA聚合酶（PAP）处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴，然后用5’端含有接头序列的polyT引物进行反转录，使第一链cDNA加上一段接头，为随后的PCR扩增提供通用反向引物序列，再利用一条miRNA序列特异性正向引物就可实现PCR扩增。然而，常规三步检测法的特异性和灵敏度都相对较差。
发明内容
为了克服现有技术中miRNA定量检测方法存在的问题，本发明对常规的miRNA三步定量检测法进行了改进，建立了一种新的miRNA三步定量检测法，该方法可以对miRNA的表达进行定量检测和分析，大大提高了现有检测方法的特异性、灵敏性和重复性。
发明人分析了miRNA数据库中的1600多条人类miRNA和900多条小鼠的miRNA序列后设计了独特的接头序列，其序列不与库中的任意一条miRNA发生错配或形成二聚体，在提高检测灵敏性的同时保证了扩增的特异性。另一方面，反向引物还采取了双引物混搭的特殊设计，长度不同的两条反向引物均能够以加尾反转录处理得到的带有接头序列的cDNA为模板进行扩增，长引物充分保证扩增的特异性，短引物则大大提高扩增的灵敏性。
本发明提供了一种miRNA定量检测方法，包括如下步骤：
（1）提取样本的总RNA；
（2）用polyA聚合酶处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；
（3）用5’端含有接头序列的oligo(dT)反转录引物进行反转录，使得到的第一链cDNA加上一段接头；
（4）使用待测miRNA序列特异性正向引物和与所述接头序列互补的通用反向引物进行定量实时PCR扩增；
其中，所述通用反向引物是长度不同的两种反向引物的混合物；长反向引物由3’部分和5’部分组成，其中，3’部分与步骤（3）中反转录得到的第一链cDNA的接头5’端的部分序列互补，5’部分不与所述第一链cDNA的接头互补；短反向引物是长反向引物的片段，其缺少长反向引物3’端的部分序列。
在一个特定的实施方案中，步骤（1）中，提取样本总RNA之前先在样本中加入External Control-1，以监控样本中RNA的提取质量。优选地，所述External Control-1的序列为5’-CAACCUCCUAGAAAGA-3’（SEQ ID NO：1）。
在一个特定的实施方案中，步骤（2）中，加polyA反应体系中加入ExternalControl-2，以监控miRNA的加尾及反转录质量。优选地，所述External Control-2的序列为5’-UGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：2）。
在一个特定的实施方案中，所述接头序列为5’-AGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGC-3’（SEQ ID NO：3）；反转录引物序列为5’-AGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：4）（其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G）；所述短反向引物和长反向引物的序列分别为5’-CTACCACTGCTCAGCACAGGCAAGGCA-3’（SEQ ID NO：5）和5’-CTACCACTGCTCAGCACAGGCAAGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGC-3’（SEQID NO：6）。
优选地，通过测定定量实时PCR扩增过程中样本中待测miRNA及两种ExternalControl的Ct值来计算样本中待测miRNA的相对含量。以2-ΔCt的方式表示样本中待测miRNA的水平，其中ΔCt为待测miRNA与External Control-1的Ct值之差。将样本中待测miRNA的相对含量与正常样本中同样miRNA的相对含量进行比较，即可看出样本中待测miRNA表达量的变化。
本发明的有益效果：
（1）准确性高：在DNA编辑过程中，miRNA3’端序列经常会出现退化（degeneration）现象，这种退化的发生使得目前市场上qPCR两步检测法的准确性受到影响。而本发明的三步检测法因加入了oligo(dT)和接头序列极大地提高了检测的敏感性。
（2）可重复性：外源miRNA标准品比传统的U6以及U1基因作为标准更加可靠，可以更加准确的监控整个流程，同时也可以更加准确地对样品进行定量。
（3）敏感性：本发明独特设计的反向长短引物共同使用极大地增强了样品检测的敏感性。
附图说明
图1本发明的microRNA三步定量检测方法的流程图。
图2Hsa-miR-103a扩增产物的熔解曲线。
具体实施方式
实施例1血清中Hsa-miR-103a含量的检测
Hsa-miR-103a的序列为5’-AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA-3’（SEQ IDNO：7）。
1.血清中总RNA的提取
抽取两个成人各2ml血液，凝血后进行离心，最后取上层血清1ml置于1.5ml的RNase/DNase-free离心管中。
使用RNA提取试剂盒（北京旷博生物技术有限公司）自血清中提取总RNA，每250μl血清中加入1μl（20nM）序列为5’-CAACCUCCUAGAAAGA-3’（SEQ ID NO：1）的External Control-1（上海生工生物工程技术有限公司合成）来监控血清中RNA的提取质量。提取的总RNA使用Thermo NanoDrop2000c测定浓度。
2.三步法定量检测血清中的HSA-miR-103a
（1）加polyA尾：
i.在无RNA酶的PCR管（Axygen公司，200μl）中配制加polyA尾的反应液，体系为20μl。每20μl体系中加入1μl（20nM）序列为5’-UGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：2）的External Control-2（上海生工生物工程技术有限公司合成）来监控miRNA的加尾及反转录质量。
（注：加入的RNA体积由RNA的浓度确定，x=500ng/RNA浓度，本实验所使用的酶均为北京旷博生物技术有限公司的产品。）
ii将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪（Thermo）中37℃孵育1小时。
（2）RT-PCR得到cDNA单链：
i.向（1）得到的反应液中加入0.5μl（0.5ng/μl）序列为5’-AGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：4）的RT-Primer（上海生工生物工程技术有限公司合成），70℃孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。
ii配制反转录反应液：
Figure GDA00002793851500051
（注：所用产品均为北京旷博生物技术有限公司的产品。）
iii.将i与ii得到的溶液混合，50℃孵育50min后70℃保温15min，置冰上冷却，得到cDNA。
iv.将iii得到的产物稀释至1μl体系中含有1ng总RNA的反转录产物，分装后-20℃保存。
（3）qPCR定量检测：
i.在2ml EP管（Axygen公司）中配制反应液：
Figure GDA00002793851500052
（注：UPM-long、UPM-short和GSP均在Invitrogen公司合成，其余试剂均来自北京旷博生物技术有限公司的
Figure GDA00002793851500053
Green PCR Master Mix。）
其中，通用反向引物UPM-short和UPM-long的序列分别为5’-CTACCACTGCTCAGCACAGGCAAGGCA-3’（SEQ ID NO：5）和5’-CTACCACTGCTCAGCACAGGCAAGGCAGAGCTATGAACGCAGTCTGC-3’（SEQID NO：6）；Hsa-miR-103a特异性正向引物GSP的序列为5’-AGCATTGTACAGGGCT-3’（SEQ ID NO：8）。
ii加入10μl石蜡油液封后用专用贴膜（ABI公司）密封。
iii.放入ABI7900PCR定量检测仪中，程序设定为：
Figure GDA00002793851500061
iv.绘制熔解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃15s,60℃15s,95℃15s。结果如图2所示，HSA-miR-103a扩增产物的熔解曲线为单峰，其Tm值为80.7℃，表明PCR扩增无非特异性扩增，其扩增是目的miRNA的真实扩增，特异性好。
3.数据分析
（1）用上述方法可测得2份样本血清中的HSA-miR-103a以及两种ExternalControl的Ct值，结果如下：
Figure GDA00002793851500062
（2）首先对参照的稳定性进行评价，选取波动性最小的参照的Ct值作为数据均一化的标准。从上表中可以明显的看出External Control-1的结果比External Control-2的结果更为稳定，因此选取External Control-1作为数据均一化的标准。将两个样本External Control-1的Ct值统一到一个相同的值20，则相应的待测Hsa-miR-103a的Ct值相应地调整为以下结果：
Figure GDA00002793851500063
（3）样本中待测miRNA含量越高，进行qPCR扩增时Ct值就越小，其浓度的比值可以通过下面公式得出：
样本1中Hsa-miR-103a含量/样本2中Hsa-miR-103a含量=2-ΔΔCt=2-(26-18.5)=1/181
即样本2中Hsa-miR-103a含量是样本1中Hsa-miR-103a含量的181倍。
<110>  北京旷博生物技术有限公司
 
<120>  一种microRNA定量检测方法
 
<160>  8    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
caaccuccua gaaaga                                                    16
 
 
<210>  2
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ugagcaacgc gaacaa                                                    16
 
 
<210>  3
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
aggcagagct atgaacgcag tctgc                                            25
 
 
<210>  4
<211>  56
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
aggcagagct atgaacgcag tctgcttttt tttttttttt tttttttttt ttttvn                        56
 
 
<210>  5
<211>  27
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  5
ctaccactgc tcagcacagg caaggca                                          27
 
 
<210>  6
<211>  47
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  6
ctaccactgc tcagcacagg caaggcagag ctatgaacgc agtctgc                        47
 
 
<210>  7
<211>  23
<212>  RNA
<213>  智人（Homo sapiens）
 
<400>  7
agcagcauug uacagggcua uga                                            23
 
 
<210>  8
<211>  16
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  8
agcattgtac agggct                                                     16
 

Claims (9)

1.一种miRNA定量检测方法，包括如下步骤：
（1）提取样本的总RNA；
（2）用polyA聚合酶处理总RNA，使miRNA的3’端加上一段polyA尾巴；
（3）用5’端含有接头序列的oligo(dT)反转录引物进行反转录，使得到的第一链cDNA加上一段接头；
（4）使用待测miRNA序列特异性正向引物和与所述接头序列互补的通用反向引物进行定量实时PCR扩增；
其中，所述通用反向引物是长度不同的两种反向引物的混合物；长反向引物由3’部分和5’部分组成，其中，3’部分与步骤（3）中反转录得到的第一链cDNA的接头5’端的部分序列互补，5’部分不与所述第一链cDNA的接头互补；短反向引物是长反向引物的片段，其缺少长反向引物3’端的部分序列。
2.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中在步骤（1）中，提取样本总RNA之前先在样本中加入External Control-1，以监控样本中RNA的提取质量。
3.根据权利要求2所述的miRNA定量检测方法，其中所述External Control-1的序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中在步骤（2）中，加polyA反应体系中加入External Control-2，以监控miRNA的加尾及反转录质量。
5.根据权利要求4所述的miRNA定量检测方法，其中所述External Control-2的序列如SEQ ID NO：2所示。
6.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中步骤（3）中，所述接头序列如SEQ ID NO：3所示。
7.根据权利要求6所述的miRNA定量检测方法，其中步骤（3）中，所述反转录引物序列如SEQ ID NO：4所示。
8.根据权利要求1所述的miRNA定量检测方法，其中步骤（4）中，所述短反向引物和长反向引物的序列分别如SEQ ID NO：5和6所示。
9.根据权利要求1-8任一项所述的miRNA定量检测方法，还包括如下步骤：
（5）测定定量实时PCR扩增过程中样本中待测miRNA及两种External Control的Ct值；
（6）以2-ΔCt的方式表示样本中待测miRNA的水平，其中ΔCt为待测miRNA与External Control-1的Ct值之差。
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Denomination of invention: Quantitative detection method for micro RNA (Ribose Nucleic Acid)

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Address after: 100176 Beijing City, Beijing economic and Technological Development Zone Sheng Road No. 1 Building 2 Building 3 layer aipuyi

Patentee after: BEIJING QUANTOBIO BIOTECH CO., LTD.

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Patentee before: Beijing Quanto Biotechnology Co., Ltd.

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Address before: 100176 Beijing Economic and Technological Development Zone

Patentee before: BEIJING QUANTOBIO BIOTECH CO., LTD.