CN106053411B - 基于硫化银量子点的miRNA检测方法 - Google Patents

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Abstract

本案涉及一种基于硫化银量子点的miRNA检测方法，包括：制备硫化银量子点；将硫化银量子点偶联DNA的特异性近红外荧光探针，得到硫化银荧光探针；将硫化银荧光探针固定在反应界面上；将含待测miRNA的样本溶液与反应界面接触并进行链置换反应，将硫化银荧光探针置换回到样本溶液中；检测样本溶液中的近红外荧光信号，从而得出样本溶液中的miRNA含量。本案制得的近红外硫化银量子点荧光产率高，发射波长在800nm处，通过与DNA探针的偶联，实现了硫化银量子点在miRNA近红外荧光生物传感检测领域的应用。

Description

基于硫化银量子点的miRNA检测方法
技术领域
本发明属于miRNA检测领域，特别涉及一种基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法。
背景技术
量子点是由无机材料组成的具有一定晶格结构的纳米粒子，具有尺寸依赖的光学性能，被广泛引用于生物传感、生物成像等领域。但是，位于可见光区的量子点应用上存在诸多问题，比如会受到生物组织中许多内源性物质的吸收散射从而影响其光学检测的结果。
发明内容
近红外区的能量不容易被生物组织吸收，且其背景荧光信号弱，因而采用近红外量子点成像具有更有效穿透组织，灵敏度高的特点，因此近红外量子点在生物传感、生物成像上的应用引起了广发的关注。
针对现有技术存在的不足，本案提出一种基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其实现了近红外硫化银量子点在miRNA荧光生物传感的应用。
为实现上述目的，本案通过以下技术方案实现：
一种基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其包括：
制备硫化银量子点；
将所述硫化银量子点偶联DNA的特异性近红外荧光探针，得到硫化银荧光探针；
将所述硫化银荧光探针固定在反应界面上；
将含待测miRNA的样本溶液与所述反应界面接触并进行链置换反应，将所述硫化银荧光探针置换回到样本溶液中；
检测样本溶液中的近红外荧光信号，从而得出样本溶液中的miRNA含量。
优选的是，所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其中，所述硫化银量子点通过以下方法制得：
将半胱氨酸和硝酸银溶于水中，加入硫化钠，在pH＝7、100℃下搅拌反应3-5h；
冷却，透析24h，得到硫化银量子点；
所述硫化银荧光探针通过以下方法制得：
将硫化银量子点与EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应0.2-1h，以激活所述硫化银量子点表面的羧基基团；
加入DNA的特异性近红外荧光探针，反应0.2-2h，得到所述硫化银荧光探针。
优选的是，所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其中，所述反应界面上修饰有一段配对DNA，该配对DNA能够与所述硫化银荧光探针互补配对，形成双链结构，从而实现对所述硫化银荧光探针的固定。
优选的是，所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其中，以重量份计，
优选的是，所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其中，所述反应界面为金界面或磁珠界面。
本发明的有益效果是：本案制得的近红外硫化银量子点荧光产率高，发射波长在800nm处，通过与DNA探针的偶联，实现了硫化银量子点在miRNA近红外荧光生物传感检测领域的应用。
附图说明
图1为硫化银荧光探针的合成示意图。
图2为硫化银量子点的EDX能谱分析、紫外、荧光和红外测试图。
图3为基于硫化银量子点的荧光检测待测miRNA的结果图。
图4中(a)为qRT-PCR标准曲线图，(b)为本案方案与qRT-PCR检测miR-20a的结果对比图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本案列出一实施例的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其包括：
制备硫化银量子点；
将硫化银量子点偶联DNA的特异性近红外荧光探针，得到硫化银荧光探针；
将硫化银荧光探针固定在反应界面上；
将含待测miRNA的样本溶液与反应界面接触并进行链置换反应，将硫化银荧光探针置换回到样本溶液中；
检测样本溶液中的近红外荧光信号，从而得出样本溶液中的miRNA含量。
在上述实施例中，硫化银量子点通过以下方法制得：
将半胱氨酸和硝酸银溶于水中，加入硫化钠，在pH＝7、100℃下搅拌反应3-5h；
冷却，透析24h，得到硫化银量子点；
硫化银荧光探针通过以下方法制得：
将硫化银量子点与EDC、NHS反应0.2-1h，以激活硫化银量子点表面的羧基基团；
加入DNA的特异性近红外荧光探针，反应0.2-2h，得到硫化银荧光探针。
在上述实施例中，反应界面上修饰有一段配对DNA，该配对DNA能够与硫化银荧光探针互补配对，形成双链结构，从而实现对硫化银荧光探针的固定。
在上述实施例中，以重量份计，
在上述实施例中，反应界面优选为金界面或磁珠界面。采用反应界面的好处是可以方便分离。
实施例1
1)实验中使用的去离子水通入氮气除氧10min。
2)90mg半胱氨酸溶于75mL水中，pH值调为7。
3)将42.5mg硝酸银加入上述溶液中，pH值调为7。
4)将50mg硫化钠溶于25mL水中，并将该溶液缓慢加入到上述半胱氨酸与硝酸银的混合溶液中，溶液pH值调为7。
5)油浴加热到100℃，并剧烈搅拌4小时。
6)溶液冷却后，透析24小时。
7)38.4mg EDC与575mg NHS激活上述硫化银量子点表面的羧基基团，反应30分钟。
8)再与4.8mg DNA的特异性近红外荧光探针反应1小时，序列为NH2-ATTCTTAAAGTGCTTATAG
9)在金界面上修饰巯基DNA(SH-ATTCTCTACCTGCACTATAAGCACTTTA)，该序列与硫化银荧光探针表面的氨基化DNA互补配对，可形成双链，将溶液中的硫化银固定在金界面层。
10)再加入待测样本，由于待测样本中的miRNA(UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG)可以发生链置换反应，将硫化银荧光探针置换回溶液中，此时检测溶液的近红外荧光信号，即可推算出待测样本中miRNA的含量。
图2(a)中的EDX图中可看出所合成的量子点中的元素包含Ag、S、C、O，符合预期(Cu来自铜网)。图2(b)为硫化银量子点紫外光谱。图2(c)为硫化银量子点荧光发射光谱，在800nm附近出现发射峰，内嵌图为正常图片和受激发后的图片。图2(d)为硫化银量子点的红外光谱图，硫化银量子点表面存在的主要基团都出现了特征吸收峰。
图3(a)为不同浓度miRNA样本在反应界面与带有近红外硫化银量子点的荧光探针发生链置换反应后最终得到的荧光发射谱(浓度由右至左分别为10-16，10-15，10-14，10-13，10-12，10-11mol/L)，内嵌图为荧光发射峰值与miRNA浓度之间的线性关系。由图可知，miRNA浓度越高，所得到的荧光光谱峰值越高，且其值与浓度的对数呈线性关系。图3(b)为使用该方法检测目标miRNA与干扰miRNA所的的峰值结果的比较，检测的浓度分别为1pM和10fM。由图可知，该方法检测干扰miRNA时荧光发射峰值基本可以忽略不计，证实了该方法有良好的特异性。
图4(a)为使用qRT-PCR试剂盒检测miRNA时得到的标准曲线，用于检测目标miRNA并与本案提出的方法进行对比。图4(b)为使用本案提出的检测方法检测不同浓度目标miRNA的结果与qRT-PCR结果的对比图。目标miRNA浓度分别为20、50、80、100pM。由图可知，两种方法检测结果一致，并且与预期结果吻合。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一种基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其特征在于，包括：
制备硫化银量子点；
将所述硫化银量子点偶联DNA的特异性近红外荧光探针，得到硫化银荧光探针；
将所述硫化银荧光探针固定在反应界面上；
将含待测miRNA的样本溶液与所述反应界面接触并进行链置换反应，将所述硫化银荧光探针置换回到样本溶液中；
检测样本溶液中的近红外荧光信号，从而得出样本溶液中的miRNA含量。
2.如权利要求1所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其特征在于，所述硫化银量子点通过以下方法制得：
将半胱氨酸和硝酸银溶于水中，加入硫化钠，在pH＝7、100℃下搅拌反应3-5h；
冷却，透析24h，得到硫化银量子点；
所述硫化银荧光探针通过以下方法制得：
将硫化银量子点与EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应0.2-1h，以激活所述硫化银量子点表面的羧基基团；
加入DNA的特异性近红外荧光探针，反应0.2-2h，得到所述硫化银荧光探针。
3.如权利要求1所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其特征在于，所述反应界面上修饰有一段配对DNA，该配对DNA能够与所述硫化银荧光探针互补配对，形成双链结构，从而实现对所述硫化银荧光探针的固定。
4.如权利要求2所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其特征在于，以重量份计，
5.如权利要求1所述的基于近红外硫化银量子点的miRNA检测方法，其特征在于，所述反应界面为金界面或磁珠界面。
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