CN102465178B - 一种cot-1DNA、其制备方法及用途 - Google Patents

一种cot-1DNA、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于分子生物学领域，涉及一种cot-1DNA、其制备方法及用途。具体地，所述制备方法包括下述步骤：1)将基因组DNA打断成100bp-1000bp的DNA片段；2)将打断的DNA片段进行纯化；3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性；4)去除经过步骤3)中复性后DNA产物中的单链DNA；5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到cot-1DNA。本发明还涉及根据该制备方法制得的cot-1DNA。本发明还涉及一种核酸杂交的方法、含有所述cot-1DNA的组合物、一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒、以及所述cot-1DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。

Description

一种cot-1DNA、其制备方法及用途
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种cot-1DNA、其制备方法及用途。本发明还涉及一种核酸杂交的方法、含有本发明的cot-1DNA的组合物、一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒、以及本发明的cot-1DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。 
背景技术
在分子生物学中，将Cot＝1的一类DNA定义为Cot-1DNA。其中，Cot是DNA复性动力学中的一个单位，表示的是单位浓度(Co，mol/L)下DNA单链的复性时间(t，sec)，Cot值实际上是杂交液中单链起始浓度(Co)和反应时间(t)的乘积。在相同的条件下，DNA重复序列的Cot值小，而非重复序列具有较大的Cot值。 
Cot-1DNA通常作为DNA竞争性阻断剂，在基因组杂交中阻断可能引起非特异性杂交的重复序列。例如，当用含有重复序列的探针来进行Northern杂交、Southern杂交、FISH定位和体细胞原位杂交等实验时，存在于探针中的重复序列将会产生广泛的非特异性强杂交背景信号，从而将那些要检测的低拷贝或单拷贝序列的杂交信号掩盖掉。所以，在进行以上实验操作时，应首先考虑去掉探针中的这些重复序列避免非特异性杂交信号。从而达到捕获单拷贝或低拷贝序列外显子，增强外显子的检测信号的目的。最理想的方法是采用过量的基因组重复序列DNA，如cot-1DNA来预先对这类探针进行封闭杂交，去掉存在于探针中的那些重复序列DNA(革文新等，人cot-1DNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期，(127))。 
序列捕获(exon capture)将全基因组中感兴趣的目标序列和区域分离出来进行后续研究的技术。序列捕获技术的兴起能更好的将测 序这种方法应用到分析、疾病诊断以及个性化(个体化)医疗等新领域。但是，如果要快速、大规模地实施序列捕获技术，获取大量的基因组重复序列就显得十分必要了。 
目前查到的cot-1DNA的制备方法主要是采用羟基磷石灰柱层析法(HAP柱分离法)分离制备cot-1DNA。该方法是将获得的基因组DNA用超声波打断到需要大小，根据HAP的吸附能力和分离柱所装的HAP的量计算出所需要用的打断的DNA的量，100℃变性10min，冰浴骤冷，按照公式cot＝1＝mol/L×Ts计算DNA复性时间t，于60℃ cot-1DNA复性t秒，复性结束后，立即置于冰浴中10min，加入等体积的水溶液，将样品加入到HAP分离柱上，经过调整磷酸盐的浓度，依次洗脱游离核苷酸等杂质，单链核苷酸，最终洗脱cot-1DNA洗脱峰，并收集，用两倍体积的乙醇室温沉淀收集的cot-1DNA，8000r/min室温离心20min，用适当的水溶解所得到的盐和cot-1DNA所得到的共沉淀混合物，然后用Sephadex G-50脱盐，收集DNA峰，加入1/10体积3M的醋酸钠，和两倍体积的酒精8000r/min4℃离心20min，收集沉淀得到cot-1DNA(革文新等，人cot-1DNA的制备[J]《肿瘤》，1998年5月，第18卷第3期(127))。 
但是，上述的cot-1DNA的制备方法——HAP柱分离法，虽然制的产品效果可以满足杂交的需要，但是制作方法繁琐，且耗时耗力。 
目前，Invitrogen公司的商品cot-1DNA是常见的商品化的cot-1DNA，但是价格较为昂贵。 
发明内容
本发明的一个方面涉及一种制备cot-1DNA的方法，包括下述步骤： 
1)将基因组DNA打断成100bp-1000bp的DNA片段； 
2)将打断的DNA片段进行纯化； 
3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性； 
4)去除经过步骤3)所得DNA产物中的单链DNA； 
5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到cot-1DNA。 
关于步骤1)，所述基因组并不特别限定，本领域技术人员可以理解，所述基因组最好与待杂交或待封闭的样本来源于同一物种。并且用于提取基因组的组织部位或者细胞类型并不特别限定，由于不同部位组织的基因组的丰度不同，通过调整组织或者细胞的用量，可以得到适当量的基因组DNA。可以使用人的基因组。提取基因组的样本可以是人的组织或者细胞。所述基因组可以是现成的，也可以是从组织或者细胞进行提取得到。因此，可选地，在步骤1)之前还可以包括提取基因组DNA的步骤。 
基因组DNA的提取可以使用本领域的现有技术，包括使用商品化的基因组提取试剂盒。也可以，例如采用下面的步骤： 
提取基因组DNA的时候加入核裂解液，蛋白酶K，SDS使组织能够充分裂解，37℃-56℃消化12-16小时，优选56℃。由于给予充分的消化时间，此时的DNA已经得到很好的消化，因此只需3000-10000rpm离心5-15min即可将DNA与蛋白等杂质成功分离，因为延长了消化的时间使DNA裂解更充分，因此不必要特意配置高速离心机，例如经过4700rpm离心10min即可使DNA和蛋白等杂质分离，因此可免去对DNA进行纯化的步骤，不仅节约了一部分对DNA进行纯化的试剂，还可避免在纯化过程中减少提出的DNA的损失。 
可以使用本领域已知的技术进行打断，例如超声波、氮气、机械打断等。优选的是超声波打断。具体地，可以采用下面的步骤： 
将提取得到的基因组DNA用超声波细胞粉碎仪，按照说明书通过设置参数，将DNA打断为100bp-1000bp的DNA片段。如果DNA片段大于1000bp，扩散速度低，使DNA片段线状单链互相发现互补的机会减少，对后面的变性复性不利；如果DNA片段小于100bp，扩散速度又会太快，在变性复性的时候难以把握时间。超声波细胞粉碎仪一次可打断40ml DNA，比起现有的打断设备可快速的获得大批量的打断完成的DNA。 
在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为200bp-800bp的DNA 片段。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为200bp-600bp的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为250bp-600bp的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，将DNA打断为300bp-500bp的DNA片段，例如：300、350、400、450、或500bp。 
关于步骤2)和步骤5)，DNA的纯化上可以采用本领域的现有技术，例如采用市售的DNA纯化试剂盒也可以采用酚氯仿纯化(例如，可以参考Herrmann BG，Frischauf AM：Isolation of genomic DNA.Methods Enzymol 1987，152：180-183)。并且步骤3)和步骤6)中的纯化方法可以相同或者不同。具体地，例如可以采用下面的方法： 
采用酚氯仿纯化，并用一倍体积的异丙醇沉淀DNA。此方法不仅可以进行DNA的大规模的纯化，且还能够节约试剂，一倍异丙醇沉淀的效果和乙醇沉淀的效果一样可以满足生产的需求。 
关于步骤3)，可以采用本领域已知的技术进行DNA的变性和复性，例如加热和冷却。具体地，可以采用下面的步骤： 
采用沸水浴的方法对DNA进行变性后将DNA快速降温，以达到DNA的复性温度，从而确保按照公式cot＝1＝mol/L×Ts计算DNA复性时间t的精确性。 
对DNA进行复性时，将变性后的DNA放于65℃水浴锅中让其缓慢降温至65℃，才开始对DNA进行复性，复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若DNA热变后快速冷却，可能导致DNA不能复性，如图1所示。而按照公式cot＝1＝mol/L×Ts(此处mol/L是指进行变性反应时所有DNA的初始浓度)计算出的复性时间。由于序列的重复性越高，其复性的速度就会越快，因此在该复性时间T，复性得到的双链重复序列只能是高度重复或者是少量的中度重复序列。此外，在这个过程中还有一些没有来得及复性的DNA单链，可以通过步骤5)中的S1nuclease来降解。 
具体地，按照公式T＝330/c×1000(DNA平均分子量M＝330，起始浓度Co＝ng/μl＝g/L×10-3，则Co＝mol/L＝c/M×10-3＝c/330×10-3；由cot-1DNA的定义可得Co×Ts＝1＝mol/L×s；则Ts＝1/Co＝330/c× 1000)计算每一管的DNA复性时间T(单位为秒)，其中c为DNA的浓度(指DNA[包括单链和双链]的浓度，单位是ng/μl)。例如测得第N管的DNA浓度为550ng/μl，则这一管所需的复性时间TN＝330/550×1000＝600秒。 
本发明人通过实验发现，复性时间采用上面计算的T时，复性的效果最佳。实施例2中对此进行了验证。 
关于步骤4)，可以采用本领域已知的技术除去溶液中的单链DNA以及未复性的DNA分子。具体地，采用下面的方法： 
复性完后采用S1 nuclease消化的方法，去除溶液中的单链DNA以及未复性的DNA分子。具体地，所用S1 nuclease的量＝c×20/320μl，其中c为DNA的浓度(指DNA[包括单链和双链]的浓度，单位是ng/μl)。 
本发明的另一个方面涉及一种cot-1DNA，其由本发明的制备方法制得。
本发明的又一方面涉及一种核酸杂交的方法，包括使用本发明的cot-1DNA进行封闭的步骤。具体地，所述核酸杂交为Northern杂交、Southern杂交、或原位杂交；具体地，所述原位杂交为组织原位杂交、体细胞原位杂交、或荧光原位杂交。对于原位杂交，样品是指组织；对于核酸杂交，样品是指核酸。不管是那种杂交，计算用量都是按核酸的量计算；总的来说，cot-1DNA都是过量使用的，一般是样品核酸量的20-30倍左右。 
本发明的又一方面涉及一种序列捕获方法，包括使用本发明的cot-1DNA进行封闭的步骤。 
本发明的又一方面涉及一种组合物，其包含本发明的cot-1DNA。 
本发明的又一方面涉及一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，其包含本发明的cot-1DNA。 
本发明的又一方面涉及本发明的cot-1DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。 
在本发明中，术语“中度重复序列”是指10到几百拷贝的DNA序列，复性时间以分计。中等重复序列通常是非编码序列，重复单元的平均长度300bp，往往构成序列家族，用单一序列相隔排列，分散在基因组中。可能在基因调控中起作用。 
术语“高度重复序列”是指在一个基因组中有几百份甚至几百万份拷贝的DNA序列，重复单元的平均长度300bp，复性时间以秒计。 
发明的有益效果 
本发明的cot-1DNA制备方法能够简洁、高效、高通量地制备cot-1DNA，并且制得的cot-1DNA效果良好。相对于目前较为昂贵的商品化的cot-1DNA产品，本发明制备的cot-1DNA成本较低，从而提供了一种良好的可替代的选择。 
附图说明
图1：热变性过程和两种冷却过程示意图。 
图2：打断的基因组DNA片段的电泳检测。3个样品是相同的平行样品。左侧为100bp ladder marker，右侧为DL2000 marker。 
图3：mixer和芯片。 
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 
实施例1：c o t-1DNA样品1的制备
一、仪器设备和试剂耗材 
分别如下面的表1和表2所示。 
表1：仪器设备 
Figure BSA00000343704800071
表2：试剂耗材 
  耗材/试剂名称   型号/规格   厂家
  EB   E3565   Invitrogen
  Low Range Ultra Agarose   161-3106   BIO-RAD
  无水乙醇   分析纯   西陇化工股份有限公司
  异丙醇   分析纯   西陇化工股份有限公司
  氯仿   分析纯   西陇化工股份有限公司
  异戊醇   分析纯   西陇化工股份有限公司
  Tris饱和酚   DH243-1   北京鼎国
  甘油   G5516   SIGMA
  醋酸锌   ZB1002   上海生工
  Tris HCl   AM9856   AMbion
  盐酸胍   GB0242   上海生工
  Na2EDTA·2H2O   0322   上海生工
  SDS   SS0228   上海生工
  TE buffer   AM9849   AMbion
  50bp ladder marker   MD108-01   TIANGEN
  DL2000 marker   MD114-02   TIANGEN
Figure BSA00000343704800081
二、实验方法 
1.超声波打断 
1)将人基因组DNA分装于50ml离心管中，每管不超过40ml。 
2)用清洗过的超声波细胞粉碎仪进行打断。 
按下面的表3设置参数(40ml体系)： 
表3：打断条件参数设置 
 总时间(min)   60
 超声开(s)   8.0
 超声关(s)   3.0
 功率   70％
由于在用超声波打断的过程中仪器本身会发出大量的热，加上打断的时间较长，如果不加碎冰可能会引起DNA的变性。优选地，在内室放入自制的大小合适的冰盒，装满碎冰，将DNA固定，并将离心管放入碎冰中。注意不要使碎冰堆积到离心管的管口，以免造成污染。
3)将打断完的DNA进行电泳检测，理想的打断片段大小在100bp-1000bp，优选主带位于300bp的位置。如果打断的片段未能符合要求，则需根据打断的情况重新调整打断参数进行二次打断。 
电泳结果如图2所示。其中，3个平行的样品1-3的上样量为1μl，两个Marker的上样量均为6μl。结果显示，片段范围在100-1000bp，主带集中在200-600bp，符合打断要求。 
2.打断后DNA的纯化 
采用酚氯仿方法对DNA进行纯化，具体操作如下： 
1)加入1倍体积的酚氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，充分混匀后，放置3min到5min，4700rpm离心5min。 
2)将上清转移到新的离心管中，加入1倍体积的氯仿，充分混匀后，放置3min到5min，4700rpm离心5min。 
3)将上清转移到新的离心管中，加入1/10体积的3M的醋酸钠，混合均匀，加入-20℃预冷的0.8倍到1倍体积的异丙醇，-20℃放置沉淀1小时以上。 
4)-20℃取出后室温放置10min，4700rpm离心10min。 
5)去掉上清，加入40ml 70％的乙醇洗涤，4700rpm离心5min。 
6)去掉上清，加入20ml无水乙醇洗涤，4700rpm离心5min。 
7)去掉上清，将DNA放于恒温培养箱中50℃干燥。 
8)溶于20ml milli-Q水中。 
Nanodrop测定DNA浓度a。 
在DNA的纯化中，也可以使用市售的DNA纯化试剂盒，例如PALL、QIAGEN等公司的产品。 
3.打断后DNA的变性和复性 
进行变复性DNA之前的准备工作： 
将水浴锅打开，调整水量，设置3个温度分别为100℃、65℃和37℃；计算所需的试剂量：设总共有N管，则所需的3M的NaCl为2.22×N ml、10×S1 buffer为2.47×N ml、每管所需S1 nuclease的酶量为c×20/320μl。准备一个冰盒。 
1)用50ml离心管将DNA溶液分装成10ml每管。 
2)根据上面Nanodrop测定的DNA浓度a，按照50ml离心管每管20ml，终浓度为550ng/μl DNA溶液的量计算所需的DNA溶液的量。例如DNA浓度a为750ng/μl，则所需的DNA溶液的量xml＝20ml×550ng/μl/(750ng/μl)。 
3)从浓度a的DNA溶液中取x ml加入到1个新的50ml离心管中，用milli-Q水将其总体积补到20ml。留取100μl加入1.5ml 离心管中备用作为qPCR检测的未变性前的DNA和制备的cot-1DNA进行比较。用Nanodrop准确测定每一管的DNA溶液的浓度c。 
4)将3)中分装好DNA溶液的50ml离心管放入100℃水浴中10min，同时将3M的NaCl溶液放入65℃水浴备用。将3M的NaCl提前加热至65℃是为了在后面加入其时，对液体的温度不造成影响。 
5)将4)中的50ml离心管转入65℃水浴平衡5min。 
6)向每管中加入2.22ml预热的3M NaCl，上下颠倒混匀，放入65℃水浴并按照计算的DNA复性时间T进行复性。 
7)复性时间到了以后，迅速将50ml离心管取出插入冰盒的冰中，向每管中加入2.47ml的10×S1 buffer，上下颠倒混匀，再插入冰中。 
8)等待2到3分钟，向每管中加入所计算的S1酶量，上下颠倒混匀，并用离心机快速离心至3000rpm以上。 
9)将离心管转入37℃水浴1h消化。消化后的DNA溶液应该立即进行下一步的抽提纯化。 
4.变复性后DNA的纯化 
1)加入25ml的酚氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，充分混匀后，放置3min到5min，4700rpm离心5min。 
2)将上清转移到新的离心管中，加入25ml的氯仿，充分混匀后，放置3min到5min，4700rpm离心5min。 
3)将上清转移到新的离心管中，加入1/10体积的3M的醋酸钠，混合均匀，加入-20℃预冷的等体积的异丙醇，-20℃放置沉淀1小时以上。 
4)-20℃取出后室温放置10min，用吸水纸擦净离心管外壁上的水后，4700rpm离心10min。 
5)注意离心管底部的沉淀，小心的倒掉上清，然后将沉淀的DNA转移至1新的50ml离心管，加入25ml 70％的乙醇洗涤，4700rpm离心5min。 
6)去掉上清，加入20mL无水乙醇洗涤，4700rpm离心5min。 
7)去掉上清，将DNA放于恒温培养箱中50℃干燥。 
8)加入pH 8.0的TE溶液溶解干燥后的DNA，标记好日期和批次，则cot-1DNA制备完成。 
如此制得cot-1DNA样品1。 
实施例2：复性时间的选择
在确定实施例1中DNA的复性时间上，本发明人做了不同时间的探索，方法如下： 
按照实施例1中类似的方法制备8个cot-1DNA样品，其复性时间如表4所示。将8个样品分别稀释至10ng/μl，加入引物以及SYBR试剂，一起放入QPCR专用板中，上机做QPCR检测(实时荧光定量PCR)。QPCR所用引物根据NimbleGen Arrays User’s Guide-Sequence Capture Array Delivery提供的序列，由Invitrogen公司合成，使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TagTM(prefect Real Time)200 reactions试剂盒，货号为DRR041A，进行QPCR检测。 
具体操作参照试剂盒的说明书进行。 
反应体系如下： 
cot-1DNA样品            1μl 
ROX Dye                 0.4μl 
SYBR premix             10μl 
引物1μl 
水                      7.6μl 
总体积                  20μl 
反应程序如下： 
95℃  30s 
Figure BSA00000343704800111
45个循环。 
QPCR结果如表4所示。 
表4：8个不同复性时间制备的cot-1DNA的QPCR检测结果 
 8个样品的复性时间   Reporter   Ct值
 1/2T   SYBR Green I   28.70608
 1/2T   SYBR Green I   27.47551
 T   SYBR Green I   31.15781
 T   SYBR Green I   32.52058
 2T   SYBR Green I   27.10918
 2T   SYBR Green I   27.59618
 4T   SYBR Green I   5.503951
 4T   SYBR Green I   5.14319
表4中，Ct值指从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。这里的Ct指的是经过处理，即经过变复性后的样品的Ct值。而基线则是指扩增曲线中的水平部分。
表4显示，随着复性时间延长，Ct值就越小，则制备的cot-1DNA质量就越难保证，时间缩短1/2影响较小，但这将会造成可以复性的DNA减少，因此而影响产率，因此优选时间T，作为最佳复性时间。 
实施例3：在序列捕获中的杂交效果验证
一、实验所用样本： 
验证样本：实施例1制备的cot-1DNA样品1。 
对照样本：Invitrogen公司的商品cot-1DNA(货号是15279-011)。 
杂交样本：人基因组文库，构建流程使用iliumina公司Paired-End DNA Sample Prep Kit(PE-102-1001)，按照试剂盒说明规范操作。 
二、实验仪器：罗氏(Roche)NimbleGen芯片。 
三、实验方法： 
实验前的准备工作： 
将杂交仪电源打开，杂交仪温度调至42℃。将2个干浴器打开分别调至70℃和95℃。利用PAMT将芯片和mixer组装好(图3)，将组装好的mixer-array放于杂交仪上。 
1)将验证样本和对照样本分别按照每管450μg进行分装，用注射器针孔在分装的1.5ml离心管盖上戳一个孔，然后置于SpeedVac中减压蒸干。 
2)分别取5μg杂交样本置于步骤1)的离心管中，加入11.2μl纯水，移至70℃干浴器中5分钟。 
3)将离心管从干浴器中取出，震荡后置于离心机上全速离心。加入以下两种试剂： 
2X SC Hybridiation Buffer       18.5μl 
SC Hybridiation Component A     7.3μl 
4)震荡混匀后置于离心机上全速离心3-30秒。将离心后样品转移至95℃干浴器中5分钟。 
5)将样品取出震荡后置于离心机上全速离心30秒，置于杂交仪器上42℃离心管放置位置准备杂交。 
6)确认芯片放置位置吻合杂交仪，使用M100移液器取37μl样品通过Fill Port小心将移液器中样品注入芯片中。 
7)使用Port seals将两个样品口封住，使用两指分别按住两个样品口，同时用力，注意要确认封口没有问题，42℃杂交。 
8)杂交完毕后，按仪器说明使用罗氏NimbleGen芯片洗脱仪(NimbleGen Elution System)将NimbleGen序列捕获芯片上杂交的DNA洗脱下来。得到第1批次杂交后的样本。 
重复上述操作9次，分别得到第2-10批次杂交后的样本，然后利用实施例2中的QPCR方法进行杂交富集度的检测。 
四、实验结果及数据分析： 
如下面的表5所示。 
表5：验证样本和对照样本杂交前后的富集度比较 
Figure BSA00000343704800141
Figure BSA00000343704800151
富集度的计算： 
QPCR可以将杂交前样本的Ct值和经过杂交过后的样本的Ct值分别测出来，经过这两者之前的对比可以将样品的富集度算出来。富集度的公式为(1+E)ΔCt，其中，E代表引物的扩增效率，理想状态下1+E＝2，即富集度＝2ΔCt。ΔCt则指的是杂交前的样品的Ct值和经过杂交之后的样品的Ct值的差值。 
通过QPCR检测将实施例1制备的cot-1DNA与Invitrogen公司生产的cot-1DNA商品(货号是15279-011)分别应用于罗氏(Roche)NimbleGen芯片杂交，两者通过富集度的比较，可见本发明制备的cot-1DNA能够成功应用于序列捕获技术中。 
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。 

Claims (13)

1.一种制备cot-1DNA的方法，包括下述步骤：
1)将基因组DNA打断成100bp-1000bp的DNA片段；
2)将打断的DNA片段进行纯化；
3)将纯化后的DNA片段进行变性、复性；
4)去除经过步骤3)中复性后得到的DNA产物中的单链DNA；
5)将步骤4)中得到的DNA片段产物进行纯化，得到cot-1DNA；
其中步骤3)中的所述复性的时间按照T＝330/c×1000计算，其中，c为DNA的浓度，单位是ng/μl。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)为将基因组DNA打断成200bp-600bp的DNA片段。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)所述打断为通过超声波进行打断。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤2)和步骤5)中的纯化为酚氯仿法纯化，其中使用一倍体积的异丙醇沉淀DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤4)中使用S1nuclease去除单链DNA。
6.一种cot-1DNA，其由权利要求1至5中任一项所述的方法制得。
7.一种核酸杂交的方法，包括使用权利要求6所述的cot-1DNA进行封闭的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述核酸杂交为Northern杂交、Southern杂交或原位杂交。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述原位杂交为组织原位杂交、体细胞原位杂交、或荧光原位杂交。
10.一种序列捕获方法，包括使用权利要求6所述的cot-1DNA进行封闭的步骤。
11.一种组合物，其包含权利要求6所述的cot-1DNA。
12.一种用于核酸杂交或核酸检测的试剂盒，其包含权利要求6所述的cot-1DNA。
13.权利要求6所述的cot-1DNA在制备核酸杂交或核酸检测的试剂中的用途。
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