CN109689896A - 使用在胎儿和怀孕雌性动物之间差异甲基化的dna区域检测胎儿染色体非整倍性 - Google Patents

使用在胎儿和怀孕雌性动物之间差异甲基化的dna区域检测胎儿染色体非整倍性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的方法。这类方法基于两个或更多个DNA的区域的具体配置和/或检测和/或分析中的一个或多个，包括在来源于胎儿(和/或胎儿胎盘)的细胞的DNA和母体来源的DNA之间显示出差异甲基化的那些。这些方法使用了采集自所述怀孕雌性动物的样品，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA。这些方法具有诊断、预后和/或预测应用；具体地，用于胎儿中染色体非整倍性如三体性的检测/诊断，和/或用于检测怀孕雌性动物经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险。本发明还涉及可以在这些方法的实践中使用的、适用的或与之有关的组合物、试剂盒、计算机程序产品和其他方面。

Description

使用在胎儿和怀孕雌性动物之间差异甲基化的DNA区域检测 胎儿染色体非整倍性
本发明涉及检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的方法。这类方法基于DNA的两个或更多个区域的具体配置和/或检测和/或分析中的一个或多个，区域包括在来源于胎儿(和/或胎儿胎盘)细胞的DNA和母体来源的DNA之间显示出差异甲基化的那些。这些方法利用采集自所述怀孕雌性动物的样品，该样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA。这些方法具有诊断、预后和/或预测应用；特别是用于胎儿中染色体非整倍性如三体性的检测/诊断，和/或用于检测怀孕雌性动物经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险。本发明还涉及可以在这些方法的实践中使用的、对其有用的或与之有关的组合物、试剂盒、计算机程序产品和其他方面。
在大多数发达国家中，众多怀孕女性经历产前检测，其主要目标在于识别发育中胎儿的染色体非整倍性。直到最近，几乎所有可靠的这类产前检测是侵入性的，如绒毛膜绒毛采样(CVS)或羊膜穿刺术，并且具有并非不显著的(not insignificant)程序相关流产的风险，尽管据报道这类测试的诊断准确性在97.％至99.8％之间(有关综述，参见Norwitz&Levy 2013，Rev Obs Gyn 6：48)。用于胎儿染色体非整倍性的常规无创产前检测包括通过超声的筛查和/或多种母体血清生物化学标志物的分析。然而，这些检测主要针对唐氏综合症(三体性21号染色体(T21)，和在较小程度上，T18)。然而，具有仅75％至96％的报告检出率(取决于所使用的筛查方法)和5％至10％的假阳性率，通常认为这些超声和母体血清分析仅作为筛查程序，并且两者均需要通过在筛查阳性病例中的CVS或羊膜穿刺术进行后续检测，用于明确诊断胎儿中的染色体异常(Norwitz&Levy 2013)。
母体循环中来源于胎儿的游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)的发现(Lo等人1997，Lancet 350：485)为开发用于无创产前检测(NIPT)的测定提供了替代方法，这类测定包括用于胎儿性别确定的测定(Lo等人1997)以及在母体为Rhesus D阴性的妊娠中的胎儿Rhesus D测试(Lo 1998，N Eng J Med 229：1734)。然而，考虑到这些胎儿cfDNA作为分离自材料血浆的总cfDNA的少数部分存在(Lo等人1998，Am J Hum Genet 63：768)，根据来自母体血浆的胎儿cfDNA检测胎儿染色体非整倍性仍存在困难。下一代高通量测序(NGS)技术的应用使得能够对胎儿和母体对母体血浆中cfDNA的贡献进行测序，并且仅在近些年才有可能为怀孕女性常规地提供用于21号染色体和某些其他常见胎儿非整倍性的基于NGS的NIPT，例如，随着商品化测试的出现和常规可用。可商购的测试可以使用随机NGS，如“MATERNIT21”(www.sequenom.com)、“PRENATEST”(www.lifecodexx.com)、“VERIFI”(www.illumina.com)或者IONA(www.premaitha.con)，或者可以使用靶向方法，其目标为在测序前富集所关心的特定基因组区域以减少需要实施可靠统计分析(例如，“HARMONY”www.ariosadx.com或者“PANORAMA”www.natera.com)、多态性分析或数字PCR的序列标签的数目(有关综述，参见Go等人2011，Human Reprod Update 17：372)。
到目前为止，遵照测序方法的这些可商购的NIPT需要使用复杂且非常昂贵的设备如大规模平行测序仪，并且具有几天至长达10天的周转时间；在很大程度上，由分析前需要大量样品处理所推动。例如，通过NGS的胎儿非整倍性的NIPT需要包括具有数百万分离的cfDNA的单个片段的所谓“测序库”的耗时且高成本的步骤。跟随数字PCR的替代NIPT需要使用除了在非常专业和有限的研究实验室以外通常不可用且相对低通量的这类设备和技术(Hindson等人2011，Anal Chem 83：8604)。
认识到来自cfDNA的NIPT的这种显著限制，一些研究已寻求研究和开发替代性并且特别是更廉价和更快速的实施胎儿非整倍性的NIPT方法。NIPT的众多这些替代方法聚焦于使用在母体血浆中发现的胎儿DNA的胎儿特异性特征(如胎儿cfDNA中的特定物质或多态性)。特别是，与母体DNA相比，胎儿DNA中特异性甲基化的DNA区域的存在已经使得大量工作投入到用于所关心的胎儿染色体的NIPT的这些表观遗传标志物的使用。
早在2002年，已首次证实了使用表观遗传标志物来特异性识别母体血浆中的胎儿DNA(Poon等人2002，Clin CHem 48：35；WO 2003/020974)，尽管由于所使用的标志物是多态性依赖的而使其应用受限于某些胎儿-母体对。更一般地，适用的胎儿特异性表观遗传标志物为丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)肽酶抑制剂进化枝B成员5(也称为乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(maspin))基因(“U-乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂”或者“U-SERPINB5”)的甲基化形式，其在2005年按照候选基因法所识别(Chim等人2005，PNAS 102：14753)。乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因位于人18号染色体上，并且首次证实了可以使用这种表观遗传标志物进行胎儿18三体性的无创识别的原理(Tong等人2006，Clin Chem 52：2194；WO 2005/118852)。
通过这种原理上的证实，一些研究组开始识别其他胎儿表观遗传标志物，特别是与胎儿非整倍性有关的染色体如21号染色体上的那些(例如，Old等人2007，Reprod BiomedOnline；Chim等人2008，Clin Chem 54：500；Papageorgiou等人2009，Am J Pathol 174：1609；WO 2007/132166；WO 2007/132167；WO 2011/034631；和WO 2011/092592)，目标在于相对于来源于另一个常染色体或性染色体的参考序列，通过在表观遗传识别的胎儿cfDNA中定量(例如)21号染色体来源的序列，将这些表观遗传标志物用于胎儿非整倍性的NIPT(例如Old等人2007)。
已作为NIPT的工具研究了某些这些表观遗传标志物。的确，已在胎儿21三体性的NIPT测试中使用了磷酸二酯酶9A基因(U-PDE9A)的未甲基化形式(Lim等人2011，PLoS One6：e27709)。在另一个研究中，已将羧化全酶合成酶基因(M-HLCS)的甲基化形式用作胎儿表观遗传标志物以比较对于Y染色体上的胎儿遗传标志物锌指蛋白Y连锁(Y-Linked)(ZFY)基因的浓度归一化的相对的21号染色体的量。这种表观遗传-遗传(“EGG”)方法证明对胎儿21三体性的无创检测是有用的(Tong等人2010，Clin Chem 56：90)。使用不同的方法，Papageorgiou和同事描述了使用免疫沉淀和实时定量聚合酶链反应(qPCR)的方法来定量与来自全血的母体DNA相比胎儿特异性差异甲基化区域(DMR)21号染色体的相对量，从而证明可以检测三体性病例中21号染色体的量的轻微过量和诊断胎儿21三体性(Papageorgiou等人2011，Nat Med 17：510)，并且他们假设DMR的组合，而不是单一DMR可能能够提供正常和21三体性病例的准确NIPD。在随后的研究中，据报导在更大的盲式验证研究中，这种方法显示出100％的灵敏度和99.2的特异性(Tsaliki等人2012，Prenat Diag 21：996)。这种方法不仅需要繁重和技术上困难的甲基化的DNA免疫沉淀(MeDiP)步骤，而且已出现了有关使用这种方法的显著技术问题(Tong等人2012，Nat Med 18：1327)。特别是通过使用这种方法，不可能得出以下结论：与恰巧将大量无细胞胎儿DNA或大量胎儿细胞释放至母体血液的整倍体胎儿相比，对母体血液中21号染色体标志物的胎儿来源的DNA甲基化水平升高的观察是由于存在具有21三体性的胎儿。在他们对MeDiP方法的注释中，Tong和同事建议可以包括使用21号染色体之外的胎儿表观遗传标志物的归一化步骤以控制胎儿-DNA浓度中的变化，但是先前所公开的使用3号染色体上的基因RASSF1的研究表明与EGG方法相比，这种归一化的作用通常是次优的，即使对于主要含有胎儿DNA的胎盘组织而言也是如此(Tong等人2010)。
然而，在近期的研究中，从富集来自母体引物的甲基化DNA的步骤开始，Lim和同事使用常规qPCR来测量与参考3号染色体(M-RASSF1A)相比，21号染色体(使用M-HLCS)的相对量，从而在胎儿21三体性的无创产前检测中报告了90％的灵敏度和92.5％的特异性(Lim等人2014，Clin Chem Lab Med 52：641)。尽管这似乎改善了Tong和同事所报道的初始工作(Tong等人2010)，但据报道Lim的方法仍有改善的空间(Chim 2014，Clin Chem Lab Med52：585)。事实上，为了研究改善使用胎儿表观遗传标志物用于胎儿21三体性的NIPT的表现的方法，Chim概括了与Lim类似的其他研究的显著特征(参见表A，根据Chim 2014修改)。
表A：使用胎儿表观遗传标志物的21三体性无创产前检测的研究(根据Chim 2014修改)
*MSRE：甲基化敏感的限制性内切酶消化；MBD：基于甲基-CpG结合域的富集；
Chim总结到：(a)与常规定量PCR相比，数字PCR似乎提供了更好的灵敏度和特异性，并且建议将qPCR的指数的但是模拟的性质转化为数字PCR中的“1”或“0”信号，数字计数平台应当有利于更精确和准确的定量；和(2)胎儿遗传标志物而不是胎儿表观遗传标志物的使用似乎为用于相关染色体量分析的参考染色体的定量提供了更好的灵敏度和特异性。事实上，Tong和同事(2010)在他们与类似的表观遗传-表观遗传方法相比的EGG方法的比较研究中获得了类似的结果，Chim描述对胎儿表观遗传标志物，即位于3号染色体上的M-RASSF1A的归一化，Tong和同事发现超过一半的研究的21三体性胎盘的21号染色体的相对量与整倍体(正常)参考间隔重叠，从而导致了25％的不可用的灵敏度(参见表B)。
表B：Tong等人(2010)使用胎儿表观遗传或遗传标志物作为参考的21三体性产前检测的数据(根据Chim 2014修改)
因此，尽管长期以来需要胎儿非整倍性的改善的NIPT，并且从2002年起，使用胎儿特异性表观遗传标志物在理论上是可能的，但是到目前为止尚没有令人满意的、可靠的、灵敏的、特异性的、经济合算的和/或技术上直接的方法来完成。事实上，即使在他近期的综述中，Chim要求保护仍需要改善并且得出以下结论：仅使用数字PCR平台和通过胎儿遗传标志物的归一化将进一步改善该类基于表观遗传测试的表现。然而，数字PCR方法需要使用技术上困难的装置，这些装置除了在非常专业和有限的研究实验室以外通常是不可用的，并且胎儿遗传标志物(即在基因上不同于母体基因组的标志物)的使用将这些测试的可应用性仅限制在其中存在这种遗传差异的某些胎儿-母体对中(如男性胎儿和ZFY作为遗传标志物的使用)并且在可以解释胎儿非整倍性的NIPT之前，需要这种遗传差异的其他性别或遗传测试。
因此，从一个或多个以上观点，需要改善的方法和相关其他方面以检测、指示或诊断胎儿中染色体非整倍性的存在，特别是这些方法是无创的和/或使用更常规的处理、技术和/或检测步骤/设备，并因此可以更快速、更成本有效地和/或更广泛地在社区中进行。
因此，本发明的目标是提供解决一个或多个这些或其他问题的替代、改善、更简单、更廉价和/或整合的方式或方法。通过如本文所公开或在其他处所定义的主题，例如，通过所附权利要求的主题，解决了本发明潜在的这种目标。
通常并且通过简要说明，可以如下描述本发明的主要方面：
在第一个方面，并且如可以在本文中进一步描述、定义、要求保护或另外公开的，本发明涉及用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供采集自所述怀孕雌性动物的样品，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA；
(b)用差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；
(c)通过检测所述样品中位于所述染色体上的两个或更多个第一目标差异甲基化区域(DMR)处甲基化的存在，确定所述样品中作为与染色体非整倍性相关的染色体的第一目标DNA物质的量，所述第一目标DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对所述第一目标DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述第一目标DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中第一目标DNA物质的所述量；
(d)通过检测所述样品中位于一个或多个参考染色体上的两个或更多个参考DMR处的甲基化的存在，确定所述样品中作为所述一个或多个参考染色体的参考DNA物质的量，所述参考DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对这些参考DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述参考DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中参考DNA物质的量；和
(e)确定根据步骤(c)所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的一个或多个相对量，优选一个或多个比值，其中一个或多个所述相对量表示胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在，
优选地其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测，并且可选地使用：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个所述第一目标DMR，使用不同的可检测标记物。
在第二个方面，并且如可以在本文中进一步描述、定义、要求保护或另外公开的，本发明涉及用于检测怀孕雌性动物经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)实施所述第一方面的方法，其中该方法还包括以下步骤：
(f)通过检测来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间甲基化无差异的至少一个其他区域(OR)确定所述样品中总DNA的量，通过所述试剂修饰该OR对DNA甲基化不敏感，优选地其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR和所述其他区域进行步骤(c)和步骤(d)和步骤(f)中的所述检测，并且可选地使用：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个所述第一目标DMR和对于至少一个所述OR，使用不同的可检测标记物。
(ii)确定存在于所述样品中的胎儿DNA的至少一个量，如绝对量或相对量；和
(iii)将所确定的胎儿DNA的量与阈值和/或参考分布相比较，
其中所述胎儿DNA的量相对于所述阈值和/或参考分布的增加或远离表示怀孕雌性动物经受或发展所述妊娠相关医学病况的升高的风险。
在其他方面，本发明还涉及组合物、试剂盒(或其成分)和计算机程序产品，在每种情况下如可以在本文中描述、定义、要求保护或另外公开的，其中这些其他方面可以涉及本发明所述的方法，对所述方法有用或者在所述方法内或结合所述方法使用。
附图显示：
图1显示：(a)在第一基于差异甲基化的DNA检测方法中使用的差异甲基化区域(“DMR”)和其他区域(“OR”)的示意图；和(b)在第二基于差异甲基化的DNA检测方法中使用的差异甲基化区域(“DMR”)和其他区域(“OR”)的示意图。
图2显示了实施例1中使用的差异甲基化区域(“DMR”)和其他区域(“OR”)的示意图。
图3显示了对于具有已知胎儿性别的双胎情况的研究，如通过基于差异甲基化的DNA检测方法(实施例1)所测量的，雄性特异性DNA的量(Y染色体表示)与胎儿cfDNA部分的相关性。
图4显示了与使用单一DMR的单独的反应检测的参考染色体的检测相比，使用多路(多样，multiplex)基于差异甲基化的DNA检测方法的参考染色体的检测的改善的灵敏度。单独使用RASSF1A或TBX3作为单一DMR，或者作为RASSF1A和TBX3的多路(使用相同标记物)检测，样品中来源于参考染色体(实施例2)的胎儿cfDNA的检测需要PCR循环数(Cp)。
图5显示了通过实施例3的计算机程序产品所实施的操作的示意图。
图6显示了在实施例4中作为本发明方法使用的差异甲基化区域(“DMR”)(和可选的其他区域(“OR”))的示意图。
图7显示了对于来自第一轮59个样品中的每个样品，21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的一个目标DMR所确定的)与参考染色体(5号和12号)的量的比值[x轴]相对于21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的另一个目标DMR所确定的)与参考染色体的量的比值[y轴]的散点图，其中通过如在实施例4中所述的本发明方法确定这些量。代表携带具有21三体性(T21)的胎儿的女性的点标记为“+”，并与非T21样品相区分。
图8显示了对于来自全部三轮、总计168个样品中的每个样品，21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的一个目标DMR所确定的)与参考染色体(5和12)的量的归一化比值[x轴]相对于21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的另一个目标DMR所确定的)与参考染色体的量的归一化比值的散点图，其中通过如实施例4中所述的本发明方法确定这些量。代表携带具有21三体性(T21)的胎儿的女性的点标记为“+”，并与非T21样品区别聚类，例如，如通过所示虚线边界区分。注意，实施例4中所提及的离群的(outlying)非T21样品位于x轴的范围之外(但不在T21聚类内)。
图9显示了针对轮次数目，来自图8的每个点距曲线分界线中点(0.5，0.55)的距离的散点图。跨全部轮次，在9个T21样品(在该图中由“o”所表示)与非T21样品(在该图中由“+”所表示)之间显示出清楚的分离。
图10显示了对于来自全部三轮、总计168个样品中的每个样品，21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的一个目标DMR所确定的)与参考染色体(5和12)的量的比值的z得分[x轴]相对于21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的另一个目标DMR所确定的)与参考染色体的量的比值的z得分的散点图，其中通过如实施例4中所述的本发明方法确定这些量。代表携带具有21三体性(T21)的胎儿的女性的点标记为“+”，并与非T21样品区别聚类。注意，实施例4中所提及的离群的非T21样品位于x轴范围之外(但不在T21聚类内)。
图11显示了对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的3个样品)，21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的一个目标DMR：C21orf57所确定的)与参考染色体(5和12)的量的归一化比值[y轴]相对于21号染色体的量(如通过位于21号染色体上的另一个目标DMR：DSCAM所确定的[x轴])与参考染色体的量的归一化比值的散点图，其中通过如实施例4中所述的测定所描述的本发明方法确定这些量。代表携带具有21三体性(T21)的胎儿的女性的点标记为空心正方形，并与标记为实心正方形的非T21样品区别聚类。将任何假阳性标记为“+”，任何假阴性标记为“X”。
图12显示了如实施例10中所述的通过测定V10.1所描述的，对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的4个样品)的散点图。点如图11所限定。如在图11中一样，y轴21号染色体DMR为C21orf57，而x轴21号染色体DMR为DSCAM。
图13显示了如实施例10中所述的通过测定V10.2所描述的，对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的3个样品)的散点图。点如图11所限定。如在图11中一样，y轴21号染色体DMR为C21orf57，而x轴21号染色体DMR为DSCAM。
图14显示了如实施例10中所述的通过测定V10.3所描述的，对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的2个样品)的散点图。点如图11所限定。如在图11中一样，y轴21号染色体DMR为C21orf57，而x轴21号染色体DMR为DSCAM。
图15显示了如实施例10中所述的通过测定V10.4所描述的，对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的3个样品)的散点图。点如图11所限定。如在图11中一样，y轴21号染色体DMR为C21orf57，而x轴21号染色体DMR为DSCAM。
图16显示了如实施例10中所述的通过测定V10.5所描述的，对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的2个样品)的散点图。点如图11所限定。在该测定中，y轴21号染色体DMR为C21orf29，而x轴21号染色体DMR为DSCAM。
图17显示了如实施例10中所述的通过测定V10.6所描述的，对于来自qPCR轮次的、总计58个样品中的每个样品(包括来自携带具有21三体性的胎儿的女性的2个样品)的散点图。点如图11所限定。在该测定中，y轴21号染色体DMR为CGI149，而x轴21号染色体DMR为DSCAM。
可以如下所示更详细地描述本发明及其具体的非限制方面和/或实施方式：
在第一个方面，并且如可以在本文中进一步描述、定义、要求保护或另外公开的，本发明涉及用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供采集自所述怀孕雌性动物的样品，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA；
(b)用差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；
(c)通过检测所述样品中位于所述染色体上的两个或更多个第一目标差异甲基化区域(DMR)处甲基化的存在，确定所述样品中作为与染色体非整倍性相关的染色体的第一目标DNA物质的量，所述第一目标DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对所述第一目标DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述第一目标DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中第一目标DNA物质的量；
(d)通过检测所述样品中位于所述参考染色体上的两个或更多个参考DMR处的甲基化的存在，确定所述样品中作为一个或多个参考染色体的参考DNA物质的量，所述参考DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对这些参考DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述参考DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中参考DNA物质的量；和
(e)确定根据步骤(c)所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的相对量，优选它们的比值，其中一个或多个所述相对量表示胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在，
优选地其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测，并且可选地使用：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个所述第一目标DMR，使用不同的可检测标记物。
除非另外说明，否则如本文所描述的术语通常应理解为它们常见的含义。当在本文中使用术语“包含(comprising)”或“包括(comprising of)”时，它不排除其他元素。出于本发明的目的，术语“由...组成(consisting of)”应认为是术语“包括”的具体实施方式。如果在下文中将组定义为包括至少某些实施方式，则这还应理解为公开了由全部这些实施方式和/或仅由这些实施方式组成的组。在本文中使用时，“和/或”将作为两种指定的特征或组成中的每一个与另一个或不与另一个一起的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B和(iii)A和B中每一个的具体公开，就好像它们中的每一个在本文中单独说明一样。在本发明的背景中，术语“约(about)”和“大约(approximately)”表示本领域技术人员将理解以确保所讨论的特征的技术影响的准确度间隔。该术语通常表示与指定数值±20％、±15％、±10％和(例如)±5％的偏差。如技术人员将理解的，对于给定技术影响，对于数值具体的这种偏差将取决于技术影响的性质。例如，天然或生物技术影响通常可以具有比人为或工程技术影响更大的这种偏差。当对于单数名词使用不定冠词或定冠词时，例如，“一个(a)”、“一种(an)”或“该(the)”，除非具体说明了其他事物，否则这包括该名词的复数。
在本发明的某些实施方式中，怀孕雌性动物为人或非人动物，其中在具体的实施方式中，这种非人动物可以选自由以下各项组成的组：马、绵羊、牛、猪、鸡、小鼠和大鼠。在更具体的实施方式中，怀孕雌性动物可以怀疑具有发展或经受(或遭受)医学病况，如本文所公开的一种或多种医学病况的高风险。本发明的这种方法不意欲对人或动物体进行实践；例如，该方法旨在以体外方式实践。
在本发明的某些实施方式中，所述DNA物质和/或所述差异甲基化的DNA是游离DNA，并且在具体的实施方式中，是循环游离DNA。在一个具体的实施方式中，所述DNA物质和与之混合的差异甲基化DNA是循环游离DNA。术语“游离DNA”(或“cfDNA”)是本领域所承认的，并且包括在细胞外如个体的生物流体(例如，血液或血液部分)中发现的DNA的含义。“循环”也是本领域所承认的术语，并且包括在个体循环系统，如血液系统或淋巴系统中存在、检测到或识别出或从中分离的实体或物质(例如，cfDNA)的含义。特别是当cfDNA是“循环的”时，它不位于细胞中，并因此可以存在于血液的血浆或血清中，或者它可以存在于淋巴流体的淋巴液中。
本领域的常规技术人员将承认术语“差异甲基化区域”或“DMR”并且它还旨在表示在所述(胎儿)DNA物质和样品中它所混合的另一种(母体)DNA之间差异甲基化(例如，在CpG基序处)的染色体DNA中的区域。例如，本发明中使用的DMR是在胎儿和母体DNA之间差异甲基化的。在本发明具体的实施方式中，DMR在胎儿DNA中是高甲基化的而在母体DNA中是低甲基化的。即，在与另一种(母体)DNA相比，在所述(胎儿)DNA物质中表现出更大程度(即更多)的甲基化，如多约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％或以上的这些区域中，与另一种(母体)DNA中的相同位点相比，在所述(胎儿)DNA物质中，在给定DMR处对于甲基化可用的位点是甲基化的。在具体的实施方式中，所述区域在母体DNA中为小于约10％甲基化，而在胎儿DNA中为大于约30％(如大于约50％)甲基化。
如常规技术人员将理解的，术语“量”可以表示变量，如浓度、基因组等价物、摩尔数或质量以及作为任何这些变量的替代的值。例如，(定量)信号或测量，如通过模拟或数字(计数)定量技术所产生的信号或测量也可以认为是“量”。特别是对于使用定量PCR的本发明方法的那些实施方式，可以通过由qPCR装置所采集的测量表示所述量，如Ct(阈值循环数)[对于LightCycler术语，也称为Cp，交叉点循环]：来自qPCR的(荧光)信号与阈值交叉的循环数。如常规技术人员将理解的，这种Ct(或Cp)数与待定量的DNA模板(例如，差异甲基化的DNA物质)的初始浓度(量)负相关。
在本发明方法的步骤(e)中，根据步骤(c)所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的相对量指示胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在。例如，与对于整倍体样品所预期的量相比，(第一)目标DNA物质(作为与染色体非整倍性相关的染色体)的量的过量或增加(例如，通过与参考DNA物质的量相比，为一种或多种参考染色体)表示存在过量的目标DNA物质并且表示在胎儿中存在与染色体非整倍性相关的部分或全部的额外的染色体拷贝。特别是目标DNA物质的量的这种过量可以表示部分或完全染色体三体性，如人21三体性(T21)。在对比实施例中，与对于整倍体样品所预期的量相比，(第一)目标DNA物质(作为与染色体非整倍性相关的染色体)的量的缺失或降低(例如，通过与参考DNA物质的量相比，为一种或多种参考染色体)表示存在目标DNA物质的量的降低并且表示在胎儿中不存在与染色体非整倍性相关的染色体的至少一种拷贝的全部或部分。特别是目标DNA物质的量的这种降低可以表示部分或完全的染色体丢失(例如，单体性)，如特纳综合征(45，X)。
可以从理论视角比较根据步骤(c)确定的量和根据步骤(d)确定的量。例如，对于人三体性(如T21、T18和/或T13)，与参考DNA物质的量相比(作为一种或多种参考染色体)，所述(第一)目标DNA物质(作为与染色体非整倍性相关的染色体)的量在理论上应具有相当于3∶2的量的比值。然而，由于对于目标和/或参考染色体(和/或DMR)的不同区域的检测灵敏度和定量方面的差异，这种理论比值实际上可能不能实现。因此，当根据步骤(c)确定的量不等于根据步骤(d)确定的量时，可以指示胎儿中染色体非整倍性的存在，其中量的相等不表示它们具有相同的值。事实上，可以通过与对于整倍体胎儿所预期的量，如根据步骤(d)确定的量相比，根据步骤(c)确定的量中的差异(difference)、偏离(distortion)或偏差(bias)表示胎儿中染色体非整倍性的存在。
如通过常规技术人员将理解的，在所有情况或样品中，明确指示胎儿中染色体非整倍性的存在(或不存在)可能是不可能的。因此，本发明还设想了以下方法，其中在步骤(e)中，将胎儿中染色体非整倍性的存在(或不存在)的指示表示为可能性或可能存在(或不存在)，而不是明确指示。这种设想的方法包括这样的实施方式，其中所述方法包括实施额外的诊断测试以提供更多的确定性、置信度或明确诊断的额外信号或标记(flagging)步骤。这种后续测试可以包括用于胎儿非整倍性检测的不同的NIPT(如在实施例1在所描述的基于NGS的NIPT)和/或可以包括CVS或羊膜穿刺术。
在本发明的这种方法的某些实施方式中，使用以下进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测：(x)对于至少两个所述参考DMR，使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR，使用不同的可检测标记物；并且在具体的这些实施方式中，使用以下进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测：(x)对于所述至少两个参考DMR中的每一个，使用相同的可检测标记物；和(y)对于所述至少两个第一目标DMR中的每一个，使用不同的可检测标记物。
在本发明的这种方法的替代实施方式中，使用以下进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测：(x)对于至少两个所述第一目标DMR，使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个所述参考DMR，使用不同的可检测标记物；并且在具体的这些实施方式中，使用以下进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测：(x)对于所述至少两个第一目标DMR中的每一个，使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于所述至少两个参考DMR中的每一个，使用不同的可检测标记物进行步骤(c)和/或步骤(d)中的所述检测。
在本发明的这种方法的其他替代实施方式中，使用以下进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测：(x)对于至少两个(优选地每个)所述参考DMR，使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个(优选地每个)所述第一目标DMR，使用相同的可检测标记物，其中用于(x)的所述可检测标记物不同于用于(y)的所述可检测标记物。
在本发明的这种方法的替代实施方式中，使用以下进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测：(x)对于至少两个所述第一目标DMR(优选地所述第一目标DMR的每个)，使用不同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个所述参考DMR(优选地所述参考DMR的每个)，使用不 同的可检测标记物。
在具体的某些实施方式中，对于这些第一目标DMR，使用不同的可检测标记物，并且如对于参考DMR所使用的，并且如果在所述方法中使用OR，如对于这些OR所使用的。
在本发明的某些实施方式中，在步骤(c)中，可以使用超过两个第一目标DMR。例如，可以使用3、4、5、6、7、8、9或9个以上的第一目标DMR(如约10、15、20、30、50或50个以上的这种第一目标DMR)。在其中对于至少两个所述第一目标DMR使用不同的可检测标记物的本发明的那些实施方式中，则可以使用其他不同的可检测标记物检测一个或多个(优选地，2、3、4、5或5个以上)其他第一目标DMR。可替代地，对于至少两个所述第一目标DMR所使用的不 同的可检测标记物和一个或多个(优选地，2、3、4、5、6、7、8或8个以上)其他第一目标DMR可以具有对于所述两个所述第一目标DMR中的一种所使用的相同的可检测标记物。例如，两个第一目标DMR可以具有相同的可检测标记物，并且两个其他第一目标DMR可以具有不同的可检测标记物。这些实施方式可以为本发明提供其他优势，如在不必须借助于额外的可检测标记物的情况下，提供进一步提高的灵敏度和特异性；考虑到多通道检测装置的费用和技术需要，并且(例如)对于荧光标记物，检测光谱的重叠和颜色漂白，实际上可以限制可检测标记物的数目。
在本发明中使用了与非甲基化DNA相比差异(例如，选择性)修饰甲基化DNA的试剂。例如，用包括亚硫酸氢盐(酸式亚硫酸盐)(bisulphite(bisulfite))的试剂处理DNA将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶，但保持5-甲基胞嘧啶残基不受影响。因此，亚硫酸氢盐处理在DNA序列中引入了取决于单个胞嘧啶残基甲基化状态的具体变化，从而获得了有关DNA片段甲基化状态的单核苷酸分辨率信息。可以对改变的序列实施多种分析以获取该信息，包括使用可以区分这种单核苷酸变化的PCR引物和/或探针。
作为另外一种选择(或者另外)，这种试剂可以包含对DNA甲基化状态敏感的限制性内切酶。当酶识别位点中特定碱基被修饰(例如，被甲基化)时，可以阻断或破坏这种限制性内切酶识别序列的切割。在本发明所有方面的具体实施方式中，试剂包括甲基化敏感的限制性内切酶，如本文所公开的甲基化敏感的限制性内切酶；包括包含2、3、4、5或更多个这种甲基化敏感的限制性内切酶的这些实施方式。
在步骤(b)之前，可以处理样品以分离、富集和/或纯化其中所存在的DNA。例如，可以使用cfDNA分离方法或试剂盒处理血浆样品以提供包含所述DNA物质和非来源于胎儿和/或胎儿胎盘(例如，母体来源)的差异甲基化DNA的混合物的(非天然)后续溶液。(b)中的处理步骤可以包括将包含所述试剂(例如，甲基化敏感性限制性内切酶)的分离的溶液添加至样品的混合的DNA中(例如，添加至包含这种混合的DNA的非天然溶液中)；和/或可以包括维持(或改变至)特定条件。特别是当所述试剂包含一种或多种甲基化敏感性限制性内切酶时，(b)中的处理步骤可以包括将DNA和酶共同在约37℃培育约5min至300min，如约30min至90min之间或者约60min，并且可选地可以包括将这些混合物在更高的温度(例如，在约50℃至90℃之间，如约80℃)培育的步骤以使酶失活。在某些实施方式中，对于(b)的处理步骤所形成的组合物可以是非天然存在的。例如，溶液(或缓冲液)组分的具体的盐；和/或(例如人)cfDNA与一种或多种细菌-来源的限制性内切酶(或其非天然突变体)的混合物可以是非天然组合物或混合物。此外，本发明的任何方法可以产生(并因此，本发明的组合物可以包含)体外产生的核酸分子，如PCR反应的DNA产物(例如，“PCR产物”)。这些体外产生的核酸分子中的一个或多个可以是非天然的，这是因为它们包含含有至少一种可检测标记物的核苷酸引物和/或探针，这种核酸分子已通过这种标记的引物和/或探针的聚合酶延伸(或者部分核酸酶消化)产生，并因此提供了包含可检测标记物的这些核酸分子的至少一部分，从而即使核酸分子的核酸序列可能包含天然存在的序列(或其片段)，但由于(至少)它所包含的非天然可检测标记物，这种体外产生的核酸分子是非天然的。在具体的实施方式中，在步骤(b)之前，可以处理从所述怀孕雌性动物所采集的样品以提取存在于所述样品中的DNA；例如，所述方法可以从所述样品中提取总游离DNA，或所述方法可以提取和/或富集胎儿游离DNA。
在本发明所述方法的某些实施方式中，将在步骤(e)中所确定的相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中一个或多个(优选地，两个或更多个)所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表示胎儿中染色体非整倍性的存在。阈值和/或参考分布可以来自在先研究，包括对照样品的那些阈值和/或参考分布，或者可以从通过本发明所述的方法分析的多个样品产生它们。例如，如果这样分析了一些不同的样品(如约10、20、30、40、50、60、80、90、100、120、150、175、200、250、500个或约500个以上的样品；特别是约60个样品，并且更特别是大于500个样品)并且一个或其他单个样品显示来自(c)的量或者来自(e)的相对量是来自大部分其他样品的类似量的群体的离群值，则这表示从中采集单个样品的怀孕雌性动物所携带的胎儿具有染色体非整倍性。如上所述，将理解即使将步骤(e)中所确定的相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，在所有情况下或每个样品中明确指示胎儿中染色体非整倍性的存在(或不存在)可能是不可能的。因此，在本发明的这些实施方式中，还包括其中指示染色体非整倍性的很可能(likely)或有可能(possible)存在(或不存在)而不是明确指示的那些，包括包含实施另外的诊断测试以提供更多的确定性或明确诊断的信号转导或加标记(flagging)的另外的步骤的那些实施方式。示例性的另外的诊断测试包括在本文其他处所描述的任何那些，特别是如实施例1中所描述的基于NGS的NIPT。
通过考虑以下，可以作为替代或另外评价胎儿中存在染色体非整倍性的指示：(i)与关于表示参考DNA物质的量(如根据参考DMR所确定的量)的测量或信号预期的那些相比，表示第一目标DNA物质的量(如从第一目标DMR中的一个或其他所确定的量)的测量或信号的升高(或降低)；和/或(ii)通过考虑参考分布，表示根据样品所确定的第一目标DNA物质的量(如从第一目标DMR中的一个或其他所确定的量)的测量或信号降低。
在某些实施方式中，可以通过标准对照建立阈值量；例如，通过实验一次或单独从已知样品(或者多个已知样品)建立阈值量，和/或与测试样品在大致相同时间，如在相同实验轮次中建立阈值量(例如，从样品或多种已知样品建立阈值量)，特别是通过对包含在微量滴定板的孔中的样品(其中将一个或多个已知样品放置在一个或多个(单独的)孔中并且将一个或多个测试样品放置在其他孔中)实践本发明方法建立阈值量。在本发明的其他实施方式中，根据第一(或者第二)目标DNA物质(即与染色体非整倍性有关的染色体)的量与参考DNA物质(即参考染色体)的量的相对量(如比值)进行所述量与阈值量和/或参考分布的比较。例如，从理论视角，来源于正常人21号染色体的二倍体组的第一目标DNA物质的量将预期与来源于(例如)2号染色体的参考(二倍体)组的参考DNA物质的量显示出约2∶2(即1∶1)的比值。然而，在21三体性的事件中，该比值将预期为约3∶2。如常规技术人员现将理解的，其他染色体(或部分染色体)非整倍性将预期显示其他理论比值，与包含第二DNA物质的位置的参考染色体相比，例如，在完全染色体丢失的情况下为1∶2，或者部分缺失，如第一DNA物质的位置的部分丢失。在某些实施方式中，例如，如果(如)通过甲基化差异不能区分，取决于(整倍体)母体与(非整倍体)胎儿cfDNA的相对量，其他DNA(即与这种其他DNA混合)的存在，如与非整倍体胎儿cfDNA混合的整倍体母体cfDNA的存在可以导致这些比值改变。如通过常规技术人员还将理解的，这些比值的改变可能是由其他因素造成的，如每个扩增子的相对反应(例如PCR反应)效率。因此，在某些这些实施方式中，阈值量是(可检测地和/或显著地)大于或小于2∶2(100％)的比值，如约3∶2(150％)、约2∶3(66％)、约1∶2(50％)或约2∶1(200％)的比值；包括大于约200％，小于约50％的阈值量和/或比值，或者是选自由以下各项组成的列表的阈值量和/或比值：约190％、180％、170％、160％、150％、140％、130％、120％、110％、105％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％和55％。可替代地，在具体的实施方式中，可以仅通过不存在可检测量的第一(或第二)DNA物质来确定阈值量，如在特纳氏综合症(具有“45，X”染色体组型而不是完全整倍体“46，XX”染色体组型的女性人类)中。然而，如上所述，由于对于目标和/或参考染色体(和/或DMR)的不同区的检测灵敏度和定量中的差异，这种理论比值实际上可能不能实现。因此，当根据步骤(c)确定的量不等于根据步骤(d)确定的量时，可以指示胎儿中染色体非整倍性的存在，其中量的相等不表示它们具有相同的值。事实上，通过与对于整倍体胎儿所预期的量如根据步骤(d)确定的量相比，在根据步骤(c)确定的量中的差异、偏离或偏差可以表示胎儿中染色体非整倍性的存在。
在某些实施方式中，在每个轮次、板或检测/分析数据组内，相对于一组样品计算参数(如平均值、中值、标准偏差、绝对中位差或z得分)。在某些这些实施方式中，将这些计算的参数用于从每个轮次、板或数据组(例如，“轮次-特异性”分析)中所检测/分析的那些测试样品识别离群值(如三体性样品)。在具体的实施方式中，在不了解任何离群值的身份(identity)的情况下，从所有测试样品计算该参数(例如，“屏蔽(masked)”分析)。在其他具体的实施方式中，从已知为(非离群)标准品(如已知含有来自整倍体胎儿的cfDNA的样品)的一组参考样品或者假设为(或者不可能为)这类标准品的测试样品计算该参数。
对于常规技术人员来说，比较和检测样本分布和参考分布之间的差异，或根据参考分布的样品离群值将是已知的，并且其包括参数和非参数统计检验的使用，如使用(单尾或双尾)t检验、曼-惠特尼秩和检验等，包括z得分，如基于绝对中位差的z得分(例如，如通过Stumm等人2014，Prenat Diagn 34：185所使用的)。当将分布与参考分布相比(或根据参考分布的离群值)时，在本发明的某些实施方式中，如果平均值、中值或单个样品的分离大于参考分布的约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、1.95、1.97、2.0或大于约2.0个标准分布(“SD”)；和/或如果单个样品以大于约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.75、4.0、4.5、5.0或大于约5.0的z得分与参考分布分离时，所述比较是显著的(和/或识别为显著不同的)。
在某些实施方式中，在数据集的背景中，可以计算z得分(或基于参数重复实验的分布类型的等价统计量)以识别离群数据点(例如，表示DNA物质过量，如在寻求识别预期患有子痫前期或具有经受或发展子痫前期的高风险的怀孕雌性动物的测试的背景中，或者表示相对于参考染色体，一种染色体过量，如在寻求识别经受染色体非整倍性的胎儿的测试的背景中)，从数据集除去表示该数据点的数据并且对数据集进行后续z得分分析以寻求识别其他离群值。这种迭代z得分分析在使用本发明方法的胎儿染色体非整倍性检测中可以是特别有帮助的，其中有时在一轮测试中两个或更多个非整倍性样品可能会偏离单一z得分分析，和/或其中后续测试是可用的以确认假阳性，并因此避免假阴性比假阳性的(初始)识别潜在地更重要。
实践本发明方法可以使得能够进行第一(或第二)目标DNA物质(例如，来自与染色体非整倍性有关的染色体或其部分，如人21号染色体)和参考DNA物质(例如，来自参考染色体或其部分，如12、5或2号染色体)的相对检测(或量)，并因此辅助快速、简便且成本有效地检测、识别或诊断胎儿中的染色体非整倍性。可以在多个实验室中更容易地建立和实践这种方法，其需要(例如)相对简单、可靠且成本有效的定量PCR仪；并且不需要昂贵且专用的高通量下一代测序仪。事实上，在本发明的这些实施方式的某一些中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同的反应/检测容器中并且有效地同时对于这些DMR进行所述第一目标DMR在步骤(c)中的检测和所述参考DMR在步骤(d)中的所述检测，并且使用：(x)对于至少两个(优选地每个)所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个(优选地每个)所述第一目标DMR使用不同的可检测标记物。在相同反应/检测容器并且有效地同时进行的那些实施方式中，可以有利地通过使用可以将第一(或第二)目标DMR中的至少两个与参考DMR和在可选的步骤(f)中检测的它们相应的OR(如果使用)相区分的可检测标记物进行第一(或第二)目标和参考DNA物质的相对检测、识别或定量(通过所述目标DMR和参考DMR)。在其中在相同反应/检测容器中且有效地同时进行检测(c)和(d)的具体的其他这些实施方式中，包括了其中使用对每个所述DMR和每个OR(如果使用)特异的至少一种经标记的探针，通过基于探针的多路实时定量PCR进行步骤(c)中的所述检测和步骤(d)中的所述检测的实施方式。
在本发明的所有方面，包括了其中对于与胎儿异常和/或先天性病症有关的染色体异常，所存在的染色体非整倍性为全部或部分这种非整倍性的实施方式。例如，这种染色体异常可以选自：三体性(如21三体性、18三体性或13三体性)、性染色体异常(如特纳氏综合症、克兰费尔特综合征、[努南综合征、]三重X综合征、XXY综合征或者脆性X综合征或XYY综合征或XXYY综合征)、染色体缺失(如普拉德-威利综合征、Cris-du-chat综合征、Wolf-Hirschhorn综合征或22q11缺失综合征、杜兴氏肌营养不良)、贝克威斯-韦德曼氏综合征、Canvan综合征和神经纤维瘤。最相关地，就发病率以及因此的医学和社会意义而言，这种染色体异常是三体性，如选自由21三体性、18三体性或13三体性组成的列表中的一种。
在其中所述怀孕雌性动物为人的本发明的那些实施方式中，与染色体非整倍性有关的染色体可以是选自由以下各项组成的列表的人染色体：21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体，优选地21号染色体、18号染色体、13号染色体。在具体的这些实施方式中，与染色体非整倍性有关的染色体为人21号染色体。在任何这些实施方式的某一些中，所述染色体非整倍性可以是所述染色体的非整倍性。在本发明的所有方面，所述染色体非整倍性为所述染色体的单体性或三体性，其如常规技术人员已知的，并且可以是部分或完全非整倍性，如所述染色体的部分或完全单体性或三体性，其中“部分”非整倍性包括由染色体部分的丢失或增加所造成的遗传材料的不平衡的含义。例如，部分非整倍性可以包括不平衡易位的情况，其中个体携带通过两个不同染色体的断裂和融合所形成的衍生染色体。在本实例中，个体将具有一个染色体的部分的三个拷贝(两个正常拷贝和存在于衍生染色体上的部分)和涉及衍生染色体的另一个染色体部分的仅一个拷贝。
相应地，在其中所述怀孕雌性动物为人的本发明的那些实施方式中，参考染色体中的一个或多个可以是选自由以下各项组成的列表的染色体：人1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12号染色体、人14、15、16、17号染色体、人19号染色体、人20号染色体、人22号染色体和人23号染色体。在具体的这些实施方式中，参考染色体为人5号染色体或人12号染色体。
在本发明的某些实施方式中，两个或更多个所述参考DMR位于不同的参考染色体上。例如，在某些实施方式中，一个所述参考DMR位于人5号染色体上，另一个所述参考DMR位于人12号染色体上。
然而，其中用作参考染色体的一个(或多个)染色体是可以与染色体非整倍性有关的染色体，但是与正在应用所述检测方法的染色体非整倍性有关的不同的染色体的实施方式也涵盖在本发明的范围内。例如，如果实践本发明所述的方法以检测怀孕的女性人类所携带的胎儿中的21三体性，则(例如)人18号染色体或人13号染色体，具体地13号染色体可以用作“参考”染色体。在该实例中，考虑到胎儿具有21三体性和13三体性两者可忽略的可能性，与13号染色体相比，过量的21号染色体将表示21号染色体的三体性。相应地，通过使用相同测定，但现在作为替代考虑13号染色体作为与正在对其应用检测方法的染色体非整倍性有关的染色体，则与21号染色体相比，过量的13号染色体(相当于与13号染色体相比，21号染色体减少)将表示13号染色体的三体性。这种“参考”染色体的选择和本发明所述方法的实践/考虑将具有以下具体优势：提供了在单一测定中在不止一个与染色体非整倍性有关的染色体处检测非整倍性的存在(或不存在)的可能性。这种测定不仅将节约时间和成本，而且还将可以使得能够从单一样品检测这种不止一个染色体非整倍性的存在；考虑到通常存在于母体样品中的胎儿来源的DNA相对低的水平，则这将需要从怀孕雌性动物较少的采样或采集更少的样品。
在具体的实施方式中，本发明的方法还包括以下步骤：
(f)通过检测来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间甲基化无差异的至少一个其他区域(OR)确定所述样品中总DNA的量，通过所述试剂修饰该OR对DNA甲基化不敏感，
优选地其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR和所述其他区域，并且在一个实施方式中：(x)对于至少两个(优选地每个)所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个(优选地每个)所述第一目标DMR和对于至少一个(优选地每个)所述OR，使用不同的可检测标记物进行步骤(c)和步骤(d)和步骤(f)中的所述检测。在可替代的实施方式中，可以：对于至少两个(优选地每个)所述参考DMR，对于至少两个(优选地每个)所述第一目标DMR和对于至少一个(优选地每个)所述，使用不同的可检测标记物进行步骤(c)和步骤(d)和步骤(f)中的所述检测。
与DMR相反，如果在本发明中使用时，在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞DNA物质和在样品中混合的材料来源的DNA物质之间，“其他区域”(“OR”)未(显著)差异甲基化。例如，在所使用试剂的条件和性质下，与所混合的(母体)DNA的另一个区域的相比，在另一个区域处通过该试剂对所述(胎儿)DNA物质的修饰无可检测的差异。如果所述另一个区域不包含甲基化位点，如果甲基化程度无差异，如果存在这些位点或通过使用不识别存在于另一个区域中的任何甲基化位点的试剂，则可以实现这种无差异。因此，在本发明的可替代的实施方式中，在可选的步骤(f)中使用的至少一个OR为对其来说，在所述(胎儿)DNA物质和另一种(母体)DNA之间在甲基化方面没有(显著)差异是(或可以)使用所述试剂识别或检测(或可识别或可检测)的OR。
在本发明方法的某些实施方式中，所述OR位于一个或多个参考染色体上。就怀孕的人类女性来说，所述参考染色体中的一个或多个可以选自由以下各项组成的列表：人1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12号染色体、人14、15、16、17号染色体、人19号染色体、人20号染色体、人22号染色体和人23号染色体。在具体的这些实施方式中，参考染色体为人5号染色体或人12号染色体。在某些具体的实施方式中，至少一个所述OR可以位于和所述参考DMR中至少一个相同的参考染色体上，例如，所述参考DMR中的一种和所述OR中的一种两者均可以位于人5号染色体或人12号染色体。在其他实施方式中，所述OR位于与染色体非整倍性有关的染色体上。
如果在本发明中使用，(非如此差异甲基化的)OR与在本发明中使用的(例如，参考)DMR中的一个或多个可以是不相重叠的。例如，OR可以位于远离所述(例如，参考)DMR中的一种(或全部)的大于约10bp、20bp、50bp，或者大于100bp、500bp、1kb或10kb的位置，如位于所述(例如，参考)DMR的上游或下游约20bp至约20kb之间(包括，位于和所述(例如，参考)DMR相同的基因内的实施方式)。特别是如果在本发明中使用，所述OR的基因组位置通常可以位于基因组的相同部分中，如本文所使用的(例如，参考)DMR中至少一种的基因组位置的上游或下游约20bp至约20kb之间(包括，位于与(例如，参考)DMR中至少一种相同的基因内的实施方式)。特别是在cfDNA的胎儿部分的背景中，如果OR位于和参考DMR中的一种相同的基因组部分中，则将提高这种DNA物质的检测(和特别是定量)(例如，在灵敏度、准确度和/或精度的方面)。不受理论束缚，据信通过这种类似定位的DMR和OR，特别是当在该背景中使用时，在整个基因组中，染色质/核小体包装中的改变的影响-以及因此的基因组DNA不同区的稳定性/降解将减轻，从而与OR(检测总DNA)相比，(例如，参考)DMR(例如，检测胎儿DNA的参考染色体物质)的稳定性/降解中的任何差异将较小，并因此可以在该DMR和OR之间，跨基因组中，在没有由(显著)差异的染色质/核小体包装所导致的定量差异所造成的(显著)干扰的情况下，进行相对(和绝对)定量。
本发明包括在可选的步骤(f)中可选使用一个OR以提供对混合物中总DNA的量的检测。然而，本发明还涵盖了使用不止一种OR的实施方式。例如，本发明包括其中在步骤(f)中的所述检测包括使用至少两个所述OR，如2、3或4个所述OR的这些实施方式。在本发明所有方面的具体实施方式中，在可选的步骤(f)中使用的所述OR的数目与在步骤(d)中使用的参考DMR的数目相同。例如，如果使用两个参考DMR，则在该实施方式中使用两个其他区域，并且如果使用三个参考DMR，在使用三个其他区域(如图1中所示)。
如在本文其他地方所述的，本发明包括其中可选的OR通常位于基因组的相同部分，如本文所使用的DMR(例如，参考DMR)中至少一种的基因组位置的上游或下游约20bp至约20kb之间的实施方式(包括，位于与所述DMR中至少一种相同的基因内的实施方式)。还如在本文其他地方所述的，本发明的某些实施方式包括其中OR通常位于基因组的相同部分，如本文所使用的DMR(如，目标DMR)中至少一种的基因组位置的上游或下游约20bp至约20kb之间(包括位于与DMR中至少一种相同的基因内的实施方式)。在某些实施方式中，OR不与该DMR重叠。因此，如果在本发明中使用多个OR，则包括其中这些OR中的两个或更多个与所述两个或更多个DMR(如参考DMR)类似地位于基因组中的实施方式。例如，所述OR中的一种可以位于在步骤(d)中使用的参考DMR的上游或下游约20bp至约20kb之间(包括与参考DMR相同的基因内的实施方式)，并且所述OR彼此(例如，第二OR)位于所述(例如，不相重叠的)DMR中另一个(例如，第二参考DMR)的上游或下游约20bp至约20kb之间(包括与DMR相同的基因内的实施方式)。在某些实施方式中，其他OR可以与DMR(如参考DMR)重叠。
当一般位于和DMR(如参考DMR)相同的基因组部分中时，在本发明中使用的OR可以位于所述DMR中的一种的上游或下游的选自由以下各项组成的组的距离内：约16kb至20bp、14kb至20bp、12kb至20bp、10kb至20bp、8kb至20bp、6kb至20bp、5kb至20bp、4kb至20bp、3kb至2bp、16kb至20bp、1kb至20bp、500bp至20bp、200bp至20bp、20kb至15kb、15kb至10kb、12kb至8kb、10kb至8kb、11kb至7kb、11kb至10kb、9kb至8kb、8kb至6kb、6kb至4kb、4kb至2kb、2kb至500bp、1kb至100bp、500bp至50bp、400bp至200bp和500bp至100bp和500bp至300bp。在具体的实施方式中，在本发明中使用的每个OR通常位于所使用的DMR(如参考DMR)不同的位置。
如果使用多个OR，则本发明包括其中对每个所述OR使用相同的可检测标记物进行可选的步骤(f)中的检测和/或所述检测包括使用至少两个经标记的探针(每个所述经标记的探针对所述OR中的一种特异)的多路实时定量PCR的实施方式。
在本发明方法的某些实施方式中，如果进行，则步骤(f)中的检测包括使用至少两个所述OR。在具体的这些实施方式中，所述OR的数目可以与步骤(d)中使用的参考DMR的数目相同。在其他这些实施方式中，所述参考DMR中的一种和所述OR中的一种两者均可以位于一个参考染色体(例如，人5号染色体)上，并且第二参考DMR和第二所述OR两者均可以位于另一个参考染色体(例如，人12号染色体)上。在某些这些其他实施方式中，所述OR中的一种位于步骤(d)中使用的参考DMR的上游或下游约20bp至约20kb之间，并且所述OR彼此位于所述参考DMR中另一个的上游或下游约20bp至约20kb之间。
在本发明的实施方式中，可以在简化方法中进行不同DNA区域即DMR(和OR，如果包含的话)的检测。相应地，本发明的一个特征在于可以在简化方法中进行不同DNA区域即DMR(和OR，如果包含的话)的检测。例如，使用来自样品的单一DNA部分，可以在单一容器中检测这些DNA区域。这种特征可以简化方法，并且可以提供更有效和准确的检测(特别是在当检测是定量的那些实施方式中)。术语“容器”将是本领域所承认的，并且包括其中发生包含在方法中的过程或程序(如本发明方法的反应和/或检测过程或步骤)的容器(如管、微量滴定板的孔、纳米孔、毛细管反应容器等)的实施方式。其他这些容器可以包括油/水乳液中的液滴、纳米颗粒或杂交室(hybridisation chamber)；视所使用的检测技术而定。在本发明的某些实施方式中，对于每个目标DMR，所使用的可检测标记物可以是不同的，和/或对于每个参考DMR，可以是相同的，和/或对于每个OR(如果包含)可以是相同的，只要当基本同时检测时，用于所述目标DMR的标记物与用于所述参考DMR(和用于所述OR，如果使用)的标记物不同(即，可以单独检测)。可替代地，在本发明的某些实施方式中，所使用的可检测标记物对于每个DMR可以是不同的(例如，不相同)和/或对于每个OR(如果包含)可以是不同的(例如，不相同)。在本发明所述的方法中使用的可检测标记物对于每个参考DMR可以是相同的，并且在某些实施方式中，对于每个OR(如果包含)可以是相同的，只要用于所述目标DMR的标记物与用于所述参考DMR的标记物是不同的(即可以单独检测)。并且与用于OR(如果使用)的标记物不同。由于通过所使用的检测技术不可以明显区分它们，因此“相同的”可检测标记物还可以包括尽管在结构上不同，但在功能上(基本)类似的标记物。例如，在结构上不同的荧光染料可以认为是“相同的”，如果它们的激发和发射光谱是(大体上或基本上)类似的，或者重叠至它们能够以相同波长同时被激发和检测的程度。在本文其他处还描述了适合的标记物(和检测方式)。优选地，可以有效地同时进行DMR和OR(如果包含)的检测。例如，在相同(反应/检测)容器内，可以在小于约5s、1s、0.5s、100ms、10ms、1ms、100us、10us或1us或其他时间(特别是小于约0.5s，并且更具体地小于约100ms或其他时间)内，并且例如，在不将所述容器或反应/混合物转移至任何后续容器、测定或设备中的情况下，或者例如，在未单独对DMR或OR(中的任何/任一个)调整或再校准检测过程的情况下，检测所有这些区域(以及因此的所述DNA物质和总DNA)。可检测标记物-例如，用于所述第一目标DMR的至少一种和用于参考DMR的至少一种-的使用利用非天然的成分、方法和/或步骤。例如，两种特异性标记物与特异性DNA区域的组合物(通常)是在自然界中不存在的。特别是在基于探针的定量PCR中使用的短探针尽管可以包含作为天然基因组中存在的片段的DNA序列，但是当连接至一个或多个标记物(如荧光染料)时，将形成非天然的特异性标记片段。
通过图示说明，在图6中显示了如对于本发明的一个实施方式所使用的，第一目标DMR、参考DMR、OR(如果使用)和可检测标记物的常规安排的示意图。(1a)使用可检测标记物检测位于与染色体非整倍性有关的染色体上的一个第一目标DMR(DMR1)处的DNA中甲基化的存在；(1b)使用不同的可检测标记物检测位于与染色体非整倍性有关的相同染色体上的第二第一目标DMR(DMR2)处的DNA中甲基化的存在；(1’)使用相同可检测标记物(但与用于检测第一目标DMR的那些不同)检测两种参考DMR处的DNA中甲基化的存在；(3’)在两种可选的其他区域(“OR1”和“OR2”)的背景中，可以使用相同可检测标记物(但与用于检测DMR的那些不同)检测参考DMR的检测；(2)这些OR中的一个或多个可以位于和参考DMR相同的染色体上；特别是(4)OR可以位于参考DMR的基因组的相同部分中(例如，上游或下游约20bp至约20kb之间)。
在本发明的背景中，可以在至少一种OR的背景中检测在本发明方法中使用的任何特定DMR(如第一目标DMR或参考DMR)处的甲基化。通过图示说明，在图1(a)中显示了如对于这种DMR检测的一个实施方式所使用的，该DMR、OR和可检测标记物的一种可能的常规安排的示意图。(1)在位于DMR1基因组的相同部分(例如，上游或下游约20bp至约20kb之间)内的其他区域(“OR1”)的背景中，检测DMR1处DNA甲基化的存在。(2)可选地，可以检测其他DMR和/或OR(如DMR2和/或OR2，并且多至DMRn和ORn)，并且该其他DMR和OR对可以分别共定位在彼此的基因组的相同部分中(例如，上游或下游约20bp至约20kb之间)。可选地，(3)使用相同可检测标记物在多个DMR处-当位于相同目标染色体或者位于一个或多个参考染色体上时-检测DNA中甲基化的存在和/或(4)使用与用于检测DMR处甲基化的那些不同的可检测标记物检测使用至少一种OR(OR1，和可选地OR2或多至ORn)检测的总DNA的量(可选地，当位于相同目标染色体或者位于一个或多个参考染色体上时，所使用的可检测标记物对所有OR相同)。
还在本发明的背景中，当位于相同目标染色体上或者位于一个或多个参考染色体上时，可以使用相同的可检测标记物检测在所使用的两个或更多个DMR(如第一目标DMR或参考DMR)处的甲基化。通过图示说明，在图1(b)中显示了如对于这种DMR检测的一个实施方式所使用的，该DMR、OR(如果使用)和可检测标记物的常规安排的示意图。(1)在每种情况下，使用相同的可检测标记物检测在两个或更多个DMR、DMR1和DMR2(和可选地多至DMRn)处DNA中甲基化的存在-当位于相同目标染色体或者位于一个或多个参考染色体上时。(2)可选地，其他区域(“OR”)可以位于DMR中的一种的基因组的相同部分内(例如，上游或下游约20bp至约20kb之间)。(3)使用与用于检测DMR处甲基化的那些不同的可检测标记物(可选地，当位于相同目标染色体或位于一个或多个参考染色体上时，所使用的可检测标记物对全部OR相同)检测使用至少一种OR(OR1，和可选地OR2或者多至ORn)检测的总DNA的量。(4)可选地，这样检测大于两个DMR处的甲基化，和/或在不止一个OR处检测总DNA的量。
本发明中这种特征组合的使用提供了结局的效率改善和/或协同提高的机会。例如，可以通过使用这种组合获得所述(胎儿)DNA物质、特别是参考染色体的检测(例如，定量检测)的改善的灵敏度和/或准确度和/或特异性和/或精度；与单独使用每个特征相比，其改善程度可以是协同的；例如，通过使用组合特征所获得的提高大于通过单独使用每个特征所获得的每种提高的总和。在本发明的某些实施方式中，测定或测试提供了如对于该测试所期望的整体灵敏度(真阳性率)、特异性(真阴性率)和/或非可报告率；例如：100％、几乎100％、大于97％(特别是大于97.5％)或者大于95％的灵敏度；大于95％，具体地大于96％的特异性；和/或小于10％(特别是小于7％)，如小于6％或5％的非可报告率。在具体的实施方式中，本发明所述的测定或测试可以提供大于95％的灵敏度、大于90％的特异性和小于10％的非可报告率，并且更特别是它可以提供大于97％的灵敏度、大于95％的特异性和小于7％的非可报告率。
现在，如根据本发明的公开内容对于常规技术人员将显而易见的，可以在方法中进行与步骤(c)类似的和其他的步骤以检测甲基化，并因此确定/定量/比较第二目标染色体的量(例如，相对于参考染色体)，其中该第二目标染色体也是与(例如不同的)染色体非整倍性有关的(例如不同的)染色体。能够检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中两种(或更多种)不同的染色体非整倍性的存在的这种方法在成本、速度和方便性方面具有特别的优势。
因此，在本发明的某些实施方式中，方法还包括以下步骤：
(c)’通过检测所述样品中位于与所述不同的染色体非整倍性相关的染色体上的两个或更多个第二目标DMR处甲基化的存在，确定所述样品中作为与不同的染色体非整倍性相关的染色体的第二目标DNA物质的量，所述第二目标DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对第二目标DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述第二目标DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中所述第二目标DNA物质的量；和
(e)′确定根据步骤(c)′所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的相对量优选的比值，其中一个或多个所述相对量表示所述胎儿中不同的染色体非整倍性的存在或不存在，
优选地其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述第二目标DMR和所述参考DMR，进行步骤(c)和步骤(c)′和步骤(d)和可选的步骤(f)中的所述检测，并且：(x)对于至少两个(优选地每个)所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和/或(y)对于至少两个(优选地每个)所述第一目标DMR和对于至少两个(优选地每个)所述第二目标DMR和对于可选的OR，使用不同的可检测标记物。
在第二目标DMR的背景中，用于该第二目标DMR的可检测标记物的多种可能的安排可以如对于所述第一目标DMR所描述的那样，然而在某些实施方式中，条件是将用于该第一目标DMR的不同的可检测标记物用于该第二目标DMR并且如对于参考DMR所使用的，并且如果在所述方法中使用OR，则如对于该OR所使用的。
在本发明的这种实施方式的背景中，当实践所述方法以寻求检测怀孕女性所携带的胎儿中两种或更多种染色体非整倍性时，与不同的染色体非整倍性有关的染色体可以是选自由以下各项组成的列表的人染色体：21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体，具体地其中该染色体不同于所述第一目标染色体。例如，与不同的染色体非整倍性有关的染色体可以是人18号染色体或13号染色体，具体地人18号染色体：其中所述不同的染色体非整倍性是所述不同的染色体的非整倍性，如所述不同的染色体的三体性。
在具体的这些实施方式中，当实践所述方法以寻求检测怀孕女性所携带的胎儿中两种或更多种染色体非整倍性时，与染色体非整倍性有关的所述染色体和与不同的染色体非整倍性有关的所述不同的染色体可以是一对人染色体，其选自：人21号染色体和18号染色体、人21号染色体和13号染色体、人18号染色体和13号染色体；其中所述染色体非整倍性和所述不同的染色体非整倍性为各个染色体的非整倍性，优选地各个染色体的三体性。
在更具体的这些实施方式中，当实践所述方法以寻求检测怀孕女性所携带的胎儿中两种或更多种染色体非整倍性时，每个所述第一目标DMR可以位于人21号染色体上，人18号染色体上或者人13号染色体上，优选地人21号染色体上；并且可选地，如果存在，每个所述第二目标DMR可以位于人18号染色体上或人13号染色体上。
本发明还涵盖了当实践与步骤(c)(和步骤(e))类似的其他另外步骤时，每个其他类似的另外步骤使用其他目标DMR以表示胎儿中是否存在不同的染色体非整倍性(如2、3、4或4个以上的染色体非整倍性)。例如，可以配置一个步骤(c)(和步骤(e))以检测人21号染色体的非整倍性，可以配置第一另外步骤(c)(和步骤(e))以检测人18号染色体的非整倍性并且可以配置第二另外步骤(c)(和步骤(e))以检测人13号染色体的非整倍性。
本文所描述的适用于步骤(c)(或步骤(e))的任何可能的实施方式同样可以适用于任何这些类似的另外步骤(c)(或步骤(e))，如步骤(c)′(或者步骤(e)′)。例如，在本发明具有步骤(e)′的具体的这些实施方式中，方法还可以包括其中在步骤(e)′中，将所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中一个或多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表示胎儿中存在不同的染色体非整倍性。
在某些实施方式中，在作为本发明任何方法的步骤(c)和/或步骤(d)和/或可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)的一部分的检测之前或作为其一部分，分别扩增包含所述DMR和/或所述可选的OR的每个DNA区域。可以使用任何适合的复制方法进行DNA扩增，并且在具体的这些实施方式中，使用对每个DMR和/或OR适合设计的引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增每个DMR和/或可选的OR。常规技术人员将容易地能够设计用于在本发明所述的方法中使用的这些PCR引物，例如，通过使用引物设计算法和程序，如Clone ManagerProfessional 9(Sci-Ed软件)、Vector NTI(Life Technologies)或基于网络的工具，如从www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/或者molbiol-tools.ca/PCR.htm所发现的那些。包含PCR扩增的本发明的那些实施方式还可以包含与PCR实践有关的具体步骤，如本文所描述的任何那些，或特别是以下步骤：(A)提供反应混合物，其包含双链靶标DNA、设计以扩增该DNA区域(如本文所描述的单丝DMR或可选的OR)的引物对(例如，本文所公开的引物对)，其中第一引物与靶标DNA第一链上的序列互补并且第二引物与靶标DNA的第二链上的序列互补、Taq聚合酶和多种游离的核苷酸，包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤；(B)将反应混合物加热至第一预定温度并保持第一预定时间以使得所靶标DNA的链彼此分离；(C)在允许第一和第二引物与靶标DNA的第一和第二链上它们的互补序列杂交并且允许Taq聚合酶使引物延伸的条件下，将反应混合物冷却至第二预定温度并保持第二预定时间；和(D)重复步骤(B)和(C)至少20次。
术语“基于探针的”定量PCR是本领域承认的，并且涵盖了以不同商标名(如Roche的“TaqMan”PCR)描述和上市的多种实施方式，并且使用了对给定扩增子(例如，DMR或另一个区域)检测特异的(例如荧光)报告探针。基于探针的定量PCR不同于使用双链DNA结合染料(例如SYBR绿)作为报告子的定量PCR，因为这类双链DNA结合染料非特异性结合至任何双链扩增子并且(例如)不可以用于将DMR(即所述DNA物质)的检测与另一个区域的检测(即总DNA的检测)相区分。如常规技术人员将理解的，可以使用单一探针或者通过对扩增子使用多个探针(如两个或三个探针)来检测特异性PCR扩增子。特别是基于探针的定量PCR可以包括其中已引入了使用标记的寡核苷酸检测目标核酸的方法的扩增反应，所述引入的方法使用核酸聚合酶的5′至3′核酸酶活性，从而从杂交的双螺旋上切割退火的标记的寡核苷酸(例如探针)并释放用于检测的标记的寡核苷酸片段。这些方法和过程在本领域中是已知的并且由Gelfand等人(US5804375、EP0543942和相关子专利(family members))和/或Livak等人(US6258569、EP0792374和相关子专利)更一般地描述，并且其包括其中所述探针包括可检测标记物以及当结合时使标记物检测限猝灭的猝灭剂分子，从而在将所述可检测标记物释放至反应混合物(猝灭剂的方式)并因此可以检测之前，需要5′至3′核酸酶(和因此的扩增)。此外，可替代地或另外地，可以通过使用包含寡核苷酸-荧光团-猝灭剂-小沟结合剂缀合物的探针提高“基于探针的”定量PCR方法，如通过Reed等人所述(US6727356、EP1235938和相关子专利)。示例性猝灭剂分子包括BHQ1、BHQ3、Eclipse、BHQ2、BBQ650。
可以使用其中测量信号(例如随时间)的强度并将其用于定量确定检测的机器，如LightCycler，以类似的方式进行这种基于探针的定量PCR。通过Woudenberg等人(US6929907、EP0706649和相关子专利)和/或Higuchi(US5994056、EP0512334和相关子专利)描述了用于这种检测的系统和方法。可替代地，数字PCR(dPCR)，即在多个事件中进行PCR以确定扩增事件的数目，从而作为定量所检测的DNA的量的方法。例如，在纳米孔或液滴(ddPCR)中进行dPCR。ddPCR技术可商购的供应商包括Bio-Rad和Rain Dance。
例如，通过使用如在本文其他地方所述的引物/探针设计软件，常规技术人员将能够设计适合于DMR和/或OR的基于探针的定量PCR检测的引物和探针(并且具有适合的标记物，例如染料)。如将已知的，PCR引物可以与对于在所述方法中使用的甲基化特异性修饰试剂特异的甲基化位点重叠，特别是当所述试剂包含一种或多种甲基化敏感性限制性内切酶，如本文所公开的限制性内切酶(或其组合)。在具体的这种实施方式中，对于给定DMR，一种或其他(或者当将两者一同考虑时)PCR引物可以与两个或三个这些甲基化位点重叠(如甲基化敏感的限制性内切酶的两个或三个限制酶切位点，每个所述位点可以包含甲基化位点)。作为另外一种选择或另外，可以设计用于DMR的引物以侧接1、2、3个或更多个这类甲基化位点，如多至10、15、20、25或50个这类甲基化位点，特别是为1、2、3个或更多个这类甲基化位点(更特别是2至4个这类甲基化位点之间)侧接限制酶切位点，如多至10、15、20、25或50个甲基化敏感的限制性内切酶，每个位点可以包含甲基化位点。
在其他实施方式中，在本发明的方法的步骤(c)和/或步骤(d)和/或可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)中使用的可检测标记物独立地选自由以下各项组成的组：荧光、蛋白质、小分子或者放射性标记物。例如，相同的荧光标记物(包括，通过具有类似或重叠的激发和/或发射光谱)可以用于DMR，并且具有激发和/或发射光谱(特别是不同的发射光谱)的荧光标记物可以用于可选的OR的检测。常规技术人员将能够从(例如)由FAM、TET、JOE、VIC、HEX、NED、PET、ROX、TAMRA、Quasar和德克萨斯红和LCCyan500、6FAM、Cy5和LCRed610和LCRed640组成的组中选择用于在本发明中使用的适合的这类荧光标记物。可以使用具有相应猝灭剂部分的荧光标记物；这类标记物-猝灭剂对的选择在本领域中是熟知的，并且可以包括选自：LCCyan500/BHQ1、Cy5/BHQ3、6FAM/Eclipse、LCRed610/BBQ650和LCRed640/BHQ3的标记物-猝灭剂对。
在其他实施方式中，可检测标记物可以是蛋白质或小分子标签，例如，可以使用特异抗体和ELISA-型检测方法检测的标签。对于在本发明中使用的可检测标记物，还可以使用适合于相同或不同的标记物和多种DMR和/或可选的OR的适当检测的相同的蛋白质或小分子或者可检测地不同的蛋白质或小分子。可以通过它们的发射能、穿透/激发特征和颗粒-类型(例如，通过α和β粒子之间的区别)来区分不同的放射性标记物。还可以在本发明中使用其他可检测标记物(如核酸编码的标签)。
在本发明具体的实施方式中，实例方法的步骤(c)和/或步骤(c)′中的检测包括基于探针的实时定量PCR，例如，通过使用对第一目标DMR和/或可选的第二目标DMR中的一种特异的至少一种经标记的探针。在其中在相同反应中进行多个DMR和/或可选的OR的PCR扩增的那些实施方式中，可以将这种PCR认为是“多路”的(或者如果仅这样扩增两个DMR和/或OR，则是“双路”的)。同样地，另外或者可替代地，本发明所述方法的步骤(d)中的检测包括基于探针的实时定量PCR，如通过使用对所述参考DMR中的一种特异的至少一种经标记的探针。还同样地，另外或者可替代地，本发明所述方法的可选的步骤(f)中的检测包括基于探针的实时定量PCR，如通过使用对所述OR中的一种特异的至少一种经标记的探针。
可以配置或设计在本发明方法中使用的引物和/或探针，从而在(例如)甲基化CpGs的亚硫酸氢盐转化为尿嘧啶后，通过序列特异性检测来检测一个或多个DMR处的甲基化。通过非限制性实例，可以通过如在本文其他地方所述的MSP或MethylLight发生这种检测。
在本发明具体的实施方式中，本发明所述方法的步骤(c)中的检测包括(例如)通过使用至少两种经标记的探针的基于探针的实时定量PCR，每种所述探针对所述两种或更多种第一目标DMR中的一种特异；和/或步骤(d)中的所述检测包括使用至少两种经标记的探针的基于探针的多路实时定量基于探针的PCR，每种所述探针对所述参考DMR中的一种特异。
在本发明的其他实施方式中，步骤(f)中的所述检测包括使用对所述OR中的一种特异的至少一种经标记的探针的实时定量PCR。
当使用两个或更多个所述OR时，本发明包括其中使用以下进行可选的步骤(f)中的检测的实施方式：(x)对于每个所述OR，使用相同的可检测标记物；和/或其中步骤(f)中的所述检测包括使用至少两种经标记的探针的基于探针的多路实时定量PCR，每种所述探针对所述OR中的一种特异。
在具体的实施方式中，在一个过程步骤或反应中，使用基于探针的多路定量(例如TaqMan)PCR，以有效率和有效果的方式进行一个或多个(优选地，全部)检测步骤(即，对于DMR和OR所需的那些)。例如，在本发明具体的实施方式中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同的反应/检测容器中，并且同时互相有效地，并且使用对所述DMR和可选的OR中的每一个特异的至少一个经标记的探针，通过基于探针的多路实时定量PCR进行所述检测步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)。在具体的这些实施方式中，所述试剂包括一个或多个甲基化敏感性限制性内切酶，如本文所公开的一个限制性内切酶(或其组合)。
本发明还可以包括其他程序，如一个或多个对照程序。例如，本发明可以包括涉及用作修饰步骤的对照(例如，作为限制性内切酶消化的对照)的第三类DNA区域的检测的一个或多个步骤。例如，还可以使用基于探针的多路实时定量PCR进行这些实施方式，其中通过具有用于这类区的其他可检测标记物的其他引物/探针组扩增和检测该对照区。
在本发明中，所述目标和参考DNA物质来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞，并且所述样品来自于怀孕雌性动物。在某些实施方式中，可以以无创方式获得样品。例如，所述DNA物质是循环游离DNA，所述DNA已从作为血液或血液部分(如血浆或血清)的样品中检测，所述血液或血液部分通过传统方法，如血液采集管得自怀孕雌性动物。在这些实施方式中，样品可以包含母体来源的DNA；即它来源于怀孕雌性动物的细胞(并因此来源于基因组)。
在本发明的所有方面，存在其中所述样品是组织样品或生物流体样品的实施方式。特别是所述样品是全血或血液部分(例如，如血浆或血清)。在可替代的实施方式中，所述样品是生物流体，其选自：尿、唾液、汗、泪、痰、乳汁、乳腺分泌物。阴道分泌物、阴道洗液和结肠洗液。在更具体的实施方式中，所述样品是来自怀孕雌性动物的血浆或血清样品，或是来自怀孕雌性动物的尿液。在其他实施方式中，所述样品基本上(或基本)不含细胞，和/或不是全血样品。
在本发明所有方面的具体实施方式中，所述来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA物质是循环游离DNA并且所述样品是血液部分，如血浆或血清。
本发明包括其中DMR(如第一目标DMR或第二目标DMR和/或参考DMR)在胎儿DNA中高甲基化而在母体DNA中低甲基化的实施方式。在某些实施方式中，这种DMR可以位于基因的启动子、增强子区或外显子中，如本文所公开的基因或该区域和/或基因上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。可替代地，DMR可以位于该基因的内含子中或者基因组的非编码区中。在本发明所有方面的具体实施方式中，这种基因组和/或基因是人基因组或基因。
本发明具体地包括其中所述DMR包含对所述试剂特异的至少一个、优选地至少两个甲基化位点的实施方式。例如，包含3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上，如约15、20、25、50或50个以上对所述试剂特异的甲基化位点。
在位于与染色体非整倍性有关的染色体上的DMR的背景中，本发明涵盖了位于该染色体上的任何适合的DMR，如在本文其他处所述的那些。
在本发明具体的实施方式中，例如，当配置方法以寻求检测人21号染色体的染色体非整倍性时，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自WO2011/092592中所公开的区域和/或基因中，包括选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因上：WO 2011/092592的EP1、EP2、EP3、EP4、EP5、EP6、EP7、EP8、EP9、EP10、EP11和EP12(WO2011/092592的SEQ ID NO：33-44)，如Lim等人2014，BMC Medical Genomics 7：1中进一步研究的。
在本发明的其他具体的实施方式中，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：AIRE(ENSG00000160224；人自身免疫调节基因；Chr21：44,285,838-44,298,648正向链，GRCh38：CM000683.2)、SIM2(ENSG00000159263；人单意同源物2；Chr21：36,699,133-36,749,917正向链，GRCh38：CM000683.2)和ERG(ENSG00000157554；人ETS相关基因；Chr21：38,380,027-38,661,780反向链，GRCh38：CM000683.2)或该区域和/或基因上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。
在本发明的其他具体实施方式中，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：PDE9A(ENSG00000160191；人磷酸二酯酶9A；Chr21：42,653,636-42,775,509正向链，GRCh38：CM000683.2)、PPP1R2P2(ENSG00000234008；人蛋白质磷酸酶1，调控(抑制剂)亚基2假基因2基因；Chr21：35,887,195-35,887,807正向链，GRCh38：CM000683.2)、CBR1(ENSG00000159228；人羰基还原酶1基因；Chr 21：36,069,941-36,073,166正向链，GRCh38：CM000683.2)、DSCAM(ENSG00000171587；人唐氏综合症细胞粘附分子基因；21号染色体：40,010,999-40,847,139反向链，GRCh38：CM000683.2)、C21orf29(ENSG00000175894；人血小板反应蛋白型层粘连蛋白G结构域和EAR重复基因；21号染色体：44,497,892-44,711,580反向链，GRCh38：CM000683.2)、HLCS(ENSG00000159267；人羧化全酶合成酶基因；21号染色体：36,750,888-36,990,236反向链，GRCh38：CM000683.2)，或上述区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列，在具体的每种情况下，WO 2007/132176中公开的区域；或者选自：与Fem1A(秀丽隐杆线虫(C.elegans))类似的CGI137、CGI009和CGI132，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列，在具体的每种情况下，WO 2007/132176中公开的区域。或者，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于以下区域和/或基因中：C21orf57(ENSG00000182362；ybeY金属肽酶；21号染色体：46,286,337-46,297,751正向链，GRCh38：CM000683.2)或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。或者，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于以下区域和/或基因中：C21orf29(ENSG00000175894；21号染色体：44,497,892-44,711,580反向链，GRCh38：CM000683.2)或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。或者，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于以下区域和/或基因中：CGI149(ENSG00000115561；荷电多囊体蛋白3，CHMP3；HGNC：29865；2号染色体：86,503,431-86,563,479反向链，GRCh38：CM000664.2)或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列(Chim等人；Yin等人，2014；Prenat Diagn 34：63)。在具体的这些实施方式中，至少一种所述第一目标DMR(或者至少一种可选的第二目标DMR)位于DSCAM或C21orf57或C21orf29或CGI149，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中；如其中一个所述第一(或者可选的第二)目标DMR位于DSCAM，而另一个所述第一(或者可选的第二)目标DMR位于C21orf57(或者C21orf29或CGI149)，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中。
在本发明的其他具体的实施方式中，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：WO 2011/034631的SEQ ID No 33、34、35、36、37、38、39、176、179、180、184、188、189、190、191、193、195、198、199、200、201、202、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、221、223、225、226、231、232、233、235、239、241、257、258、259和261，如独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：在WO 2011/034631中公开为相对于母体DNA，在胎儿DNA中为高甲基化的SEQ ID No 37、257、258和259，特别是任何这种区域和/或基因。在本发明的某些这些具体实施方式中，一个所述第一目标DMR位于WO 2011/034631的SEQ ID NO 37(本发明申请的SEQ ID NO：51)所示的区域和/或基因中，另一个所述第一目标DMR位于WO 2011/034631的SEQ ID NO：258(本发明申请的SEQ ID NO：185)所示的区域和/或基因中，或者另一个所述第一目标DMR位于WO 2011/034631的SEQ ID NO：239(本发明申请的SEQ ID NO：182)所示的区域和/或基因中，或者另一个所述第一目标DMR位于WO 2011/034631的SEQ ID NO：39(本发明申请的SEQ ID NO.：125)所示的区域和/或基因中，或者位于该区域和/或基因的上游和/或下游约100bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp内。
在本发明的可替代的实施方式中，例如，当配置方法以寻求检测人18号染色体的染色体非整倍性时，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自下列的区域和/或基因中：VAPA-APCDDI(ENSG00000101558；VAMP(小囊相关膜蛋白)相关蛋白A；18号染色体：9,914,002-9,960,021正向链，GRCh38：CM000680.2)和乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(ENSG00000206075；也称为SERPINB5；丝氨酸蛋白酶抑制剂肽酶抑制剂，进化枝B(卵清蛋白)，成员5；18号染色体：63,476,761-63,505,085正向链，GRCh38：CM000680.2)，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。在具体的这些实施方式中，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR，由于胎儿及其母体之间差异甲基化，分别位于在EP 1 751 307中描述的乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂(也称为“SERPINB5”)基因区中，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中。或者，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于以下区域和/或基因中：激活T细胞的核因子，细胞质1(NFATC1；ENSG00000131196；18号染色体：79,395,856-79,529,325正向链，GRCh38：CM000680.2)，或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。或者，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于以下区域和/或基因中：WO 2011/034631的chr18gr00094，或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。
在本发明的其他替代实施方式中，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：WO 2011/034631的SEQ ID NO 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32(例如，WO 2011/034631的SEQ IDNO：31/本发明申请的SEQ ID NO：17，或WO 2011/034631的SEQ ID NO：23/本发明申请的SEQID NO：9)，特别是在WO 2011/034631中公开的相对于母体DNA在胎儿DNA中高甲基化的任何这种区域和/或基因，或位于该区域和/或基因的上游和/或下游约100bp、50bp、40bp、30bp、20bp或10bp内，特别是位于该区域和/或基因的上游和/或下游小于20bp内，并且更特别是位于该区域和/或基因的上游和/或下游小于10bp内。
在本发明的其他实施方式中，例如，当配置方法以寻求检测人13号染色体的染色体非整倍性时，所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：WO 2011/034631的SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20，特别是在WO 2011/034631中公开的相对于母体DNA在胎儿DNA中高甲基化的任何这种区域和/或基因。
在位于参考染色体上的DMR的背景中，本发明涵盖了位于该染色体上的任何适合的DMR，如在本文其他处所述的那些。
在本发明具体的实施方式中，例如，当配置方法以寻求检测参考染色体时，至少一种所述参考DMR(优选地两种或更多种所述参考DMR)分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：RASSF1A(ENSG00000068028；Ras结合(RalGDS/AF-6)域家族成员1；3号染色体：50,329,782-50,340,980反向链，GRCh38：CM000665.2)、TBX3(ENSG00000135111；T-盒3；12号染色体：114,670,254-114,684,164反向链，GRCh38：CM000674.2)、CDC42EP1(ENSG00000128283；CDC42效应因子蛋白(ρ GTP酶结合)1；22号染色体：37,560,447-37,569,405正向链，GRCh38：CM000684.2)、PCDHGA1(ENSG00000204956；原钙粘附蛋白γ亚家族A，1；5号染色体：141,330,571-141,512,981正向链，GRCh38：CM000667.2)和SPN(ENSG00000197471；唾液素；16号染色体：29,662,979-29,670,876正向链，GRCh38：CM000678.2)；或者选自SOX14(ENSG00000168875；SRY(性别决定区)-盒14；3号染色体：137,764,284-137,766,338正向链，GRCh38：CM000665.2)和ZFY(ENSG00000067646；锌指蛋白，Y-连锁；Y染色体：2,935,281-2,982,506正向链，GRCh38：CM000686.2)，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。或者，位于MGC15523(ENSG00000157637；也称为“SLC38A10”，溶质载体家族A10；17号染色体：81,245,000-81,295,547反向链，GRCh38：CM000679.2)中或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。在具体的这些实施方式中，至少一种所述参考DMR位于TBX3或PCDHGA1，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中；如其中一个所述参考DMR位于TBX3，而另一个所述参考DMR位于PCDHGA1，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中。
在本发明的其他具体实施方式中，所述参考DMR分别位于独立地选自由以下各项组成的列表的区域和/或基因中：WO 2011/034631的SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162和163，如独立地选自：WO 2011/034631的SEQ ID NO 52、118和142，特别是在WO 2011/034631中公开的相对于母体DNA在胎儿DNA中高甲基化的任何这种区域和/或基因。在本发明的某些这些具体实施方式中，一个所述参考DMR位于WO 2011/034631的SEQ ID NO 52(本发明申请的SEQ ID NO：66)所示的区域和/或基因中，而另一个所述参考DMR位于WO 2011/034631的SEQ ID NO：118(本发明申请的SEQ ID NO：102)所示的区域和/或基因中。
表C显示了在WO 2011/034631和WO 2011/092592中使用的序列识别符向在本发明中使用的序列识别符的转换。
表C：序列识别符转换表
如果使用位于相同染色体上的两个DMR，则在本发明所有方面的具体实施方式中，它们不位于所述基因组和/或基因的相同部分中。例如，这些DMR可以相隔大于约20kb，或大于约15kb、10kb、8kb、6kb、4kb、2kb、1kb、500bp或200bp。可替代地，设想当在本发明中使用位于相同染色体上的两个(或更多个)DMR时，在某些实施方式中，它们可以位于相同区或基因(如本文所描述的区或基因)中，并且此外可以彼此重叠。
在本发明具体的实施方式中，当使用两个所述参考DMR(或正在使用大于两个参考DMR)时，至少一个(优选地每个)所述参考DMR位于下列基因组和/或基因(优选地，人基因组和/或基因)的一部分中：RASSF1A和/或TBX3和/或PCDHGA1，或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；和/或至少一种(优选地每种)所述参考DMR位于RASSF1A(NCBI参考序列：NG_023270.1：智人(Homosapiens)Ras结合(RalGDS/AF-6)域家族成员1(RASSF1)，3号染色体上的RefSeqGene；SEQID NO：13)的位置约4,700bp至5,600bp之间；和/或位于TBX3(NCBI参考序列：NG_008315.1：智人(Homo sapiens)T-盒3(TBX3)，12号染色体上的RefSeqGene；SEQ ID NO：14)的位置约1,660bp至2,400bp之间和/或位于NCBI参考序列智人5号染色体，GRCh38.p2 PrimaryAssembly：NC_000005.10 GI：568815593；SEQ ID NO：217的PCDHGA1的141,330,571至141,512,981之间，或者该序列的约141,492,450至141,492,750或141,492,550至141,492,700或141,492,580至141,492,7690之间。在更具体的实施方式中：(i)一个参考DMR包括位于RASSF1A的位置约4,700bp至5,600bp之间的一个DMR，第二参考DMR包括位于TBX3的位置约1,660bp至2,400bp之间的一个DMR：或者(ii)一个参考DMR包括位于PCDHGA1(NCBI参考序列智人5号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000005.10 GI：568815593)的位置约141,492,450至141,492,750或者141,492,550至141,492,700或者141,492,580至141,492,7690之间的一个DMR，第二参考DMR包括位于TBX3的位置约1,660bp至2,400bp之间的一个DMR。
在具体的实施方式中，参考DMR位于RASSF1A的位置约4,900bp至5,500bp、5,000bp至5,400bp或5,100bp至5,300bp之间；和/或位于TBX3(如SEQ ID NO：203)的位置约1,800bp至2,260bp、1,920bp至2,160bp或1,920bp至2,080bp之间；和/或位于DSCAM的位置约40,841,600bp至40,841,900bp、40,841,625bp至40,841,840bp或40,841,650bp至40,841,790bp之间；和/或位于PCDHGA1(NCBI参考序列智人5号染色体，GRCh38.p2 PrimaryAssembly：NC_000005.10 GI：568815593)，如SEQ ID NO：221的位置约141,492,450至141,492,750、141,492,550至141,492,700或141,492,585至141,492,690之间。
在本发明具体的实施方式中，当使用两个所述第一(或第二)目标DMR(或者正在使用大于两个第一目标DMR或第二目标DMR)时，至少一个(优选地每个)所述第一(或第二)目标DMR位于下列基因组和/或基因(优选地，人基因组和/或基因)的一部分中：DSCAM和/或C21orf57，或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；和/或至少一个(优选地每个)所述第一(或第二)目标DMR位于DSCAM(唐氏综合症细胞粘附分子；NCBI参考序列智人21号染色体，GRCh38.p2 PrimaryAssembly：NC_000021.9 GI：568815577，区40,010,999至40,847,113；SEQ ID NO：200)的位置约40,841,584至40,842,020之间；和/或位于C21orf57(YBEY；21号染色体：46,286,337-46,297,751正向链，GRCh38：CM000683.2；该基因包括侧接区上游/下游的250bp，SEQ IDNO：218)的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp内；和/或位于C21orf29(血小板反应蛋白型层粘连蛋白G结构域和EAR重复，TSPEARM；HGNC：1268；21号染色体：44,497,892-44,711,580反向链，GRCh38：CM000683.2)的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp内；和/或位于CGI149(荷电多囊体蛋白3，CHMP3；HGNC：29865；2号染色体：86,503,431-86,563,479反向链，GRCh38：CM000664.2)的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp内。
在具体的实施方式中，第一(或第二)目标DMR位于DSCAM(参考智人21号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000021.9GI：568815577，区)的位置约40,841,600bp至40,841,900bp、40,841,625bp至40,841,840bp或40,841,650bp至40,841,790bp之间，如SEQID NO：201；和/或位于C21orf57上游或下游约200bp、150bp或100bp内，如在21号染色体正向链，GRCh38：CM000683.2的位置约46,297,700至46,297,940、46,297,750至46,297,900或46,297,790至46,297,890之间，如SEQ ID NO：219；和/或位于C21orf29的上游或下游约200bp、150bp或100bp内，如在21号染色体正向链，GRCh38：CM000683.2的位置约44,709,100至44,709,900、44,709,300至44,709,700或44,709,400至44,709,600之间，如SEQ ID NO：231；和/或位于CGI149的上游或下游约200bp、150bp或100bp内，如在21号染色体正向链，GRCh38：CM000683.2的位置约46,667,100至46,667,950、46,667,300至46,667,750或46,667,400至46,667,650之间，如SEQ ID NO：232。
通过一个非限制性实例，在本发明的一个实施方式中：(i)一个所述第一目标DMR位于DSCAM中而另一个所述第一目标DMR位于C21orf57(或C21orf29或CGI149)或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中；和(ii)一个所述参考DMR位于TBX3中而另一个所述参考DMR位于PCDHGA1或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中。在具体的这些实施方式中：(i)一个所述第一目标DMR包括SEQ ID NO：201，另一个所述第一目标DMR包括SEQ ID NO：219(或者SEQ ID NO：231或232)；和(ii)一个所述参考DMR包括SEQ ID NO：203，另一个所述参考DMR包括SEQ ID NO：220。
图2图示显示了实施例1中使用的基于差异甲基化的DNA检测的DMR和其他区域(“OR”)的常规布置：(1a)DMR1存在于RASSF1A的外显子2中而OR1位于RASSF1A的外显子4内，其中DMR1位于RASS1A基因组序列(NCBI参考序列：NC_000003.12智人3号染色体，GRCh38Primary Assembly)的位置50,340,672bp至50,340,784bp之间，而OR1位于RASS1A基因组序列的位置50,331,604bp至50,331,702bp之间，DMR1和OR1之间相隔8,969bp。(1b)DMR2存在于TBX3的启动子区域中，其中DMR2位于TBX3基因组序列(NCBI参考序列：NC_000012.12智人12号染色体，GRCh38 Primary Assembly)的位置114,687,095bp至114,687,189bp之间而OR2位于TBX3基因组序列的位置114,676,384bp至114,676,454bp之间，DMR2和OR2之间相隔10,640bp。(2)使用各自的正向(F)和反向(R)PCR引物和区域特异性探针(每个探针用相同标记物标记(P*))，使用基于探针的定量PCR检测两个DMR处DNA中的甲基化。(3)使用各自的正向(F)和反向(R)PCR引物和区域特异性探针(对于OR，每个探针用不同于用于两个DMR的标记物的相同标记物标记(P**))，使用基于探针的定量PCR检测两个OR处的总DNA。表1中列出了引物和探针序列以及探针标记物的详细信息。
图6图示显示了在本发明的一个非限制性实施方式中使用的DMR和其他区域(“OR”)的常规布置：(1a)一个第一目标DMR(DMR1)存在于(例如)DSCAM(唐氏综合症细胞粘附分子；NCBI参考序列智人21号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000021.9 GI：568815577，区域40,010,999至40,847,113；SEQ ID NO：200)中，如位于SEQ ID NO：51中的一个DMR，和(1b)另一个第一目标DMR(DMR2)存在于(例如)C21orf57(YBEY；21号染色体：46,286,337-46,297,751正向链，GRCh38：CM000683.2；该基因包括侧接区上游/下游250bp，SEQID NO：218)上游或下游不超过250pb的区域中，如位于SEQ ID NO：185中的一个DMR；(1′)第一参考DMR(DMR1′)存在于TBX3的启动子区域中(如位于SEQ ID NO：66中的一个DMR)和OR1′位于TBX3中(人12号染色体(2a′)上)，其中DMR1′位于TBX3基因组序列(NCBI参考序列：NC_000012.12智人12号染色体，GRCh38 Primary Assembly)的位置114,687,093bp至114,687,191bp之间，OR1′位于TBX3基因组序列的位置114,676,384bp至114,676,454之间，DMR1′和OR1′之间相隔约10,600bp至10,810bp之间(4a′)；和第二参考DMR(DMR2′)存在于PCDHGA1中(如位于SEQ ID NO：102中的一个DMR)，并且OR2′位于PCDHGA1中(人5号染色体(2b′)上)，其中DMR2′位于PCDHGA1基因组序列(NCBI参考序列智人5号染色体，GRCh38.p2 PrimaryAssembly：NC_000005.10GI：568815593)的位置141,492,593-141,492,687之间，OR2′位于PCDHGA1基因组序列的位置141,492,918-141,493,009之间；DMR2′和OR2′之间相隔约300pb(4b′)。可替代地，(1a)DMR1s和/或(1b)DMR2s可以存在于：(x)例如，C21orf29(TSPEARM；HGNC：1268；21号染色体：44,497,892-44,711,580反向链，GRCh38：CM000683.2)的上游或下游不超过250pb的区域中；如位于SEQ ID NO：231中的一个；或者(y)例如，CGI149(CHMP3；HGNC：29865；2号染色体：86,503,431-86,563,479反向链，GRCh38：CM000664.2)的上游或下游不超过250pb的区域中，如位于SEQ ID NO：232中的一个。
在图6图示表示的本发明的实施方式中，使用不同的可检测标记物(1a)和(1b)检测两个第一目标DMR中的每一个；使用相同的可检测标记物(1′)检测两个参考DMR(DRM1′和DMR2′)；和使用相同的可检测标记物(3′)检测可选的两个OR(OR1′和OR2′)。
在方法、组合物、试剂盒(或其组分)和/或其计算机程序产品的背景中，本发明的某些实施方式包括使用一种或多种上述DMR、OR、引物和/或探针的序列，特别是表1、表D或表5，或者表E、表8或表10中所列出的那些中的任何一个。在某些这些实施方式中，给定探针包括表1、表D或表5，或者表E、表8或表10中所述的序列，和如表1、表D或表5，或者表E、表8或表10中所列出的标记物和猝灭剂对(可选地，具有小沟结合部分)中的任何一个。特别是，探针可以包括所述序列与如表1、表D或表5，或者表E、表8或表10中对该探针所述的标记物和猝灭剂对(可选地，具有小沟结合部分)的组合。特别是在方法、组合物、试剂盒(或其组分)和/或其计算机程序产品的背景中，本发明的其他实施方式包括两种或更多种(例如，全部)上述DMR、OR、引物和/或探针序列的特定组合的使用，特别是如表1中所列出的引物/探针组合和/或如表5中所述的引物/探针组合，包括表D中的引物或探针；更具体地表E中对测定版本V10.3所述的引物/探针组合。
术语“甲基化位点”将是本领域所承认的，并且具有涵盖下列的含义：例如，短核苷酸序列(例如，长度为4、6、8、10或12bp的核苷酸序列)内的CpG基序，其优选地被甲基化敏感的限制性内切酶所识别，如在本文其他处所公开的。
类似地并且特别是在使用一个或多个OR的本发明那些实施方式的背景中，当位于基因组的特定部分和/或基因中时，所述OR可以位于基因的启动子、增强子区或外显子中，或者可替代地，位于该基因的内含子中或者位于基因组的非编码区中。在本发明所有方面的具体实施方式中，这种基因组和/或基因是人基因组或基因。在具体的实施方式中，当在本发明中使用OR，并且OR位于具有一个或多个DMR(优选地，与本发明中使用的DMR不相重叠的DMR)的基因组和/或基因的相同部分中时，则它位于所述基因组和/或基因的一部分中，如以下基因(例如人，和/或特别是当所述DNA物质为胎儿cfDNA时)：RASSF1A和/或TBX3和/或PCDHGA1或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列，或选自：RASSF1A、TBX3、HLCS、ZFY、CDC42EP1、PCDHGA1、MGC15523、SOX14和SPN和DSCAM和C21orf57和C21orf29和CGI149或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列。当与DMR不共定位时(例如，当使用第二或多个其他区域时)，则在某些实施方式中，这种其他区域可以位于(例如人)看家基因中(如GAPDH、β-肌动蛋白、ALB、APOE或者RNASEP)。类似地并且特别是在使用一个或多个OR的本发明其他实施方式的背景中，OR可以位于基因组的特定部分和/或基因中，并且可以位于基因的启动子、增强子区或外显子中，或者可替代地，位于该基因的内含子中或者位于基因组的非编码区中。在本发明所有方面的具体这些实施方式中，这种基因组和/或基因是人基因组或基因。在具体的实施方式中，在本发明中使用的OR位于(例如人)看家基因(如GAPDH、β-肌动蛋白、ALB、APOE或RNASEP)或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中。可替代地，所述OR可以位于具有一个或多个DMR(如位于RASSF1A、TBX3、HLCS、ZFY、CDC42EP1、PCDHGA1、MGC15523、SOX14或SPN或DSCAM或PCDHGA1或该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中的那些)的基因组和/或基因的相同部分中，并且优选地不与本发明中使用的DMR重叠。
在使用一个或多个OR的本发明的所有方面的具体实施方式中，所述OR包括不具有对所述试剂特异的甲基化位点的基因组部分，并且所述OR位于(例如人)基因RASSF1A或TBX3(分别例如SEQ ID NO：13和14)或者DSCAM(SEQ ID NO：200)或者PCDHGA1(SEQ ID NO：217)或者C21orf57(该基因包括侧接区上游/下游的250bp，SEQ ID NO：218)或者C21orf29或CGI149或者该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中，并且包括更多具体的实施方式，其中在检测步骤(c)中使用两个或更多个所述其他区域，并且所述第一其他区域位于该RASSF1A的位置约14,220bp至13,350bp之间，而第二其他区域位于该TBX3的位置约12,400bp至13,000bp之间。在具体的实施方式中，其他区域位于该RASSF1A的位置约14,230bp至14,340bp、14,230bp至14,330bp、14,230bp至14,320bp或14,230bp至14,310bp之间；和/或位于该TBX3(如SEQ ID NO：204)的位置约12,400bp至12,940bp、12,700bp至12,850bp或12,710bp至12,790bp之间；和/或位于DSCAM(参考智人21号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000021.9 GI：568815577，区)，如SEQ ID NO：202的位置约40,841,150bp至40,841,525bp、40,841,200bp至40,841,475bp或40,841,250bp至40,841,425bp之间；和/或位于PCDHGA1(NCBI参考序列智人5号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000005.10)，如SEQ ID NO：221的位置约141,492,800-141,493,100、141,492,850-141,493,050、141,492,900-141,493,020、141,492,918-141,493,009之间。可替代地，OR可以位于外显子中，如该RASSF1A的位置约13,790bp至13,880bp或14,490bp至14,600bp之间，或该TBX3的位置约8,040bp至8,180bp或6,230bp至6,350bp之间；或者OR可以位于内含子中，如该RASSF1A的位置约10,500bp至11,90bp之间，或该TBX3的位置约10,000bp至11,000bp之间。可替代地，OR可以位于DSCAM，如序列TCCGTGTGCTCCACCCTTTGAATTCAGAACGACATAGTGGATACTCCGTGGGGCTGCTGGAATCTTCCaTTCcCACTGCCTTATCTT(SEQ ID NO：202)中，通过以下探针和引物可以对其进行扩增和检测：
表D：用于DSCAM OR的引物和探针
*仅所列的核苷酸序列，无染料/猝灭剂
**在“[]”括号中显示了用于每个探针的染料/猝灭剂
表E：用于实施例10所显示的测定的引物和探针
*仅所列的核苷酸序列，无染料/猝灭剂
**在“[]”括号中显示了用于每个探针的染料/猝灭剂
现有强有力的证据：存在于怀孕雌性动物的循环系统(例如血浆)中的胎儿cfDNA(和/或总cfDNA)的水平是一种或多种形式的子痫前期的标志物，如早发型子痫前期、轻度和/或重度子痫前期(参见Hahn等人2011，Placenta 32(Supl)：S17)。本发明显示了在存在于怀孕雌性动物的血浆中的胎儿cfDNA的有效率、有效性、灵敏和/或低-差异度的检测/定量中的具体应用，并且本发明在其中具有具体应用。因此，在本发明具体的实施方式中，个体是对经受或发展妊娠相关医学病况敏感的怀孕的(例如人)雌性动物；特别是其中所述妊娠相关医学病况是子痫前期。如本文所使用的，可替代地，可以将对医学病况“敏感”的个体描述为“怀疑”经受或发展医学病况或“认为”对经受或发展医学病况“具有敏感风险”；并且在某些实施方式中，本发明用于筛查和/或诊断个体对医学病况的敏感性，经受或发展医学病况的风险，或经受或发展医学病况。
在可替代的实施方式中，个体是对经受或发展妊娠相关医学病况敏感(或者认为具有敏感风险)的怀孕的(例如人)雌性动物，妊娠相关医学病况选自由以下各项组成的组：早产、胎儿宫内生长迟缓和双胎消失。特别是与实施例1相比，本发明的灵敏度使得通过本发明的方法确定的cfDNA水平和由通过大规模平行测序方法所确定的Y染色体序列计数所确定的cfDNA水平之间的差异可以用于识别先前被认为是单胎妊娠的(混合-性别)双胎妊娠中的一个或多个双胎消失的病例，和/或跟踪一个或其他这种(混合-性别)双胎妊娠中的相对发育和健康。通过考虑与根据cfDNA(例如通过使用平行测序方法)确定的Y染色体序列计数相比胎儿cfDNA的相对值，本发明还可以用于双胎妊娠中的性别确定。在这些方面，应注意由于某些Y染色体短序列与其他染色体的同源性，在所有女性妊娠中，使用母体血液中随机cfDNA的大规模-平行测序的方法通常总是计数极低频率的“Y染色体”序列(如所有序列的约0.003％至0.004％之间，或者所有序列的约0.0015％至0.01％或0.002％至0.005％之间)。因此，约0.005％，或约0.003％、0.004％、0.006％或0.007％之间的“Y染色体”序列计数的截止值可以用于雌性动物样品。
在本发明的所有方面，差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂可以包括亚硫酸氢盐和/或相对于甲基化DNA选择性消化未甲基化的DNA的试剂(例如，这种试剂可以消化未甲基化的DNA，但不能消化甲基化DNA)。在具体的实施方式中，试剂包括：至少一种甲基化敏感的酶；至少一种甲基化敏感的限制性内切酶；和/或选自由以下各项组成的组的试剂：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AgeI-HF、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、PvuI-HF、RsrII、SacII、SalI、SalI-HF、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TspMI和ZraI和Cac8I和PhoI。在具体的实施方式中，所述试剂选自：BstUI、HhaI和HpaII和AciI。
在相关实施方式中，试剂可以包括本文所公开的任何试剂中的两种或更多种。例如，它可以包括2、3、4、5或更多个(例如，多至7、8或10个)甲基化敏感性限制性内切酶，其包括包含两个或三个甲基化敏感性限制性内切酶或基本由其组成的试剂，甲基化敏感性限制性内切酶选自由以下各项组成的组：BstUI、HhaI和HpaII。
亚硫酸氢盐或甲基化敏感的限制性内切酶对于研究差异甲基化的使用将是常规技术人员所熟知的，所述常规技术人员可以应用所发表的方法的标准文本的教导内容或修改形式，如Poon等人(2002)、Nygren等人(2010)或者Yegnasubramanian等人(2006，NucAcid Res 34：e19)。通过说明，本发明人在本文中提供了使用甲基化敏感的限制性内切酶作为差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂的实例。对于使用亚硫酸氢盐作为试剂的进一步描述，对于常规技术人员显而易见的是可以使用(例如)甲基化特异性PCR(如使用选择性结合至所述亚硫酸氢盐-修饰的序列的引物和/或探针)和/或通过限制性内切酶的后续使用(通过这种亚硫酸氢盐-修饰产生了所述限制性内切酶的识别位点)，可以检测亚硫酸氢盐-修饰的DNA甲基化位点。Herman等人(US6200756、EP0954608和相关子专利)描述了甲基化特异性PCR(“MSP”)；并且Laird等人(US6331393、EP1185695和相关子专利)描述了使用基于探针的PCR的MSP的进一步发展。
在本发明所有方面的具体实施方式中，将检测和/或确定所述第一或第二目标DNA物质和/或参考DNA物质(和/或所述总DNA)的定量的量。因此，在这些实施方式中，一个或多个(例如，每个)所述检测和/或确定步骤包括定量检测，并且将所述DNA物质的所述检测的量表示为所述DNA物质对于存在于所述样品中的总DNA的相对浓度。例如，在本发明的某些实施方式中，在每个所述确定步骤中，在所有情况下，将所述第一目标DNA物质和所述可选的第二目标DNA物质的每个所述确定的量表示为所述第一目标DNA物质和所述可选的第二目标DNA物质对于所述样品中的总DNA的相对浓度。在其中检测第三(或第四)目标DNA物质的那些实施方式中，本发明还设想将这种第三(或第四)目标DNA物质的量表示为相对浓度。
如果总DNA的绝对量是已知的，则相应地，可以根据该相对浓度确定任何DNA物质的绝对量(例如，如通过浓度，如g/mL，或者基因组-当量，如Eg/mL所表示的)。对于某些实施方式，通过包括以下进一步的步骤，可以确定样品总DNA的绝对量：使用与步骤(c)中所使用的相同的其他区域，检测和/或确定已知量的DNA标准样品中的总DNA的量；并将从所述DNA标准样品所检测的信号与步骤(c)中所检测的信号相比较。这种DNA标准样品(具有已知的量/浓度)容易地得自商品化来源，并且特别是如果制备并使用稀释液系列分析时，可以容易且有效地用于确定(根据标准曲线通过内插法/估值法)存在于所述样品中总DNA的绝对量。实际上，可以基本如对可选的OR所述(但在单独的标准容器/反应组中)制备和分析该标准曲线，优选地，在与DMR/OR的检测相同的轮次中；并且甚至可以使用相同的反应母液混合物。因此，尽管可以对该标准DNA检测DNA对照的“DMR”，但是不需要该信号产生标准曲线。因此，如果使用来自该标准DNA样品的信号进行比较，则在其中每一个所述检测和/或确定步骤包括定量检测的某些实施方式中，所述DNA物质的所述检测的量可以表示为所述样品中所述DNA物质的绝对量。
因此，在本发明所述方法的一个实施方式中，还包括以下步骤：
·相对于与步骤(c)和/或步骤(d)和/或可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)中所使用的相同的DMR，确定已知量的DNA标准样品中DNA的量；和
·将从所述DNA标准样品所检测的每个信号与在步骤(c)和/或步骤(d)和/或可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)中所检测的各个信号相比较。
在使用DNA标准样品的任何本发明的实施方式中，其包括其中所述DNA标准样品为具有已知浓度的人基因组DNA样品的某些这些实施方式。例如，具有已知浓度的这种人基因组DNA可以来源于(如分离或纯化自)体外培养的人细胞，如已知具有染色体的整倍体或非整倍性(如T21)补体的那些。在本发明的可替代的实施方式中，DNA标准样品为具有已知浓度的合成的或工程设计的DNA样品。
如现将对常规技术人员显而易见的，DNA标准样品可以不是均一的、适当地差异甲基化的(特别是如果分离自人细胞培养)。因此，本发明包括其中不用差异修饰甲基化和未甲基化DNA的试剂(如本文所描述的试剂)处理DNA标准样品的那些实施方式。
在本发明的一个具体的实施方式中，在每个所述确定步骤中，将所述第一目标DNA物质和所述可选的第二目标DNA物质和参考DNA物质的每个所述确定的量表示为所述样品中所述DNA物质的绝对量。然而，由于本发明的一个方面涉及一个或多个(如两个)第一目标DNA物质(即与染色体非整倍性有关的染色体)的确定的量与参考DNA物质(即参考染色体)的确定的量的比较(或者考虑相对量或比值)，可以进行这样的比较并且不需要考虑绝对量。通过解释，由于“信号-总-DNA”(″signal-Total-DNA″)部分的数学消除，“信号-目标-染色体”/“信号-总-DNA”(″signal-Target-Chromosome″/″signal-Total-DNA″)与“信号-参考-染色体”/“信号-总-DNA”(″signal-Reference-Chromosome″/″signal-Total-DNA″)的比值与“信号-目标-染色体”(″signal-Target-Chromosome″)与“信号-参考-染色体”(″signal-Reference-Chromosome″)的比值相同。因此，本发明还包括其中在不知道或不考虑存在于样品中的总DNA的量的情况下，在步骤(e)中进行存在于胎儿中的染色体非整倍性的存在(或不存在)的识别的实施方式。例如，由于与所定量的DNA物质的初始浓度(量)负相关，因此可以直接从根据qPCR所产生的Ct(或Cp)数进行步骤(e)中的确定。
在本发明的某些实施方式中，对步骤(c)和/或步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)进行多组确定，其中使用所述样品的不同的DNA等份进行每组所述确定，例如，在不同的容器中，并且有效地同时与所述多组确定的每个其他成员一起。可以将所述多个的每个成员认为是对于相同样品(例如，采集自相同的怀孕雌性动物的样品)的测定“重复”。通过(例如)在不同的容器，如相同(或不同的)微量滴定板(如在本发明的qPCR实施方式中使用的微量滴定板)上的不同的孔，配置要实践的这种重复测定，可以将重复有效地引入到所述测定方法中。
在使用样品重复的本发明的那些实施方式中，所述样品的所述重复数目(多组确定)可以在2至约50(组)之间，如2至约20组之间，2至约10组之间或者约5至约15(组)之间；优选地其中所述重复数目(多组确定)选自由以下各项组成的组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12(组所述确定)；具体地在约3至10组所述确定之间，更具体地约6组所述确定。例如，对于使用微量滴定板的测定的那些实施方式，重复数目可以表示为在该微量滴定板的n个该数目的(不同的)孔中进行的对相同样品等份所实践的本发明所述的方法。
在所述方法和可选地它们的分析中包含重复可以为(例如)所述方法的稳健性、误差或其他差异度提供另外的信息，并因此可以从中确定一个或多个DNA的量。事实上，在使用这种重复的本发明的某些实施方式中，根据对步骤(c)和/或步骤(d)，和/或可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)进行的所述多组确定来确定在步骤(e)和/或可选的步骤(e)′中确定的相对量或比值。在这些实施方式中，可以通过使用对每组(重复)所确定的DNA的平均量，如对每组(重复)所确定的DNA的平均量、中值量或模式量，优选地对每组(重复)所确定的DNA的平均量确定这种量。
可替代地或另外地，可以对分别采集自不同的怀孕的(例如人)雌性生物的多种不同的样品实践本发明方法(有或者没有重复)。在这些实施方式中，特别是当在不存在任何分子标签方法的情况下，对分别采集自不同的怀孕雌性动物的多个样品实施所述方法，每个方法在单独的容器中并且有效地同时对所述多个样品的每个成员进行所述方法。如常规技术人员现将理解的，可以在(例如)微量滴定板的不同的孔中对每个样品实践所述方法。
当对采集自不同的怀孕雌性动物的多个样品实践本发明方法时，可以对一些(多个)这些不同的样品实践所述方法，所述样品的数目为2至约500(或大于500)个样品，如2至约200，2至约100或者约5至约150个样品之间；优选地其中所述多个样品选自约：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120和140个样品(或大于150个样品)；特别是约60个样品，其分别采集自不同的怀孕雌性动物。
特别是根据本发明的公开内容，现在对于常规技术人员来说，对采集自多胎妊娠的(例如人)雌性生物的多个样品实践所述方法将是可能的；例如，通过使用基于微量滴定板的qPCR系统，如来自Roche的LightCycler。这些多个样品可以位于相同微量滴定板的不同孔中，或者可以位于不同的微量滴定板中。特别是如果结合对于每个样品的多个重复，这些多个样品的包含和分析可以使得能够以更大的确定性或置信度做出染色体非整倍性的存在(或不存在)的识别。例如，与对全部(不同的)样品所确定的量的相对变化幅度相比，对于多个重复，给定样品的确定的量的相对变化幅度(例如，标准偏差)可以在步骤(e)或可选的步骤(e)′中为染色体非整倍性的检测提供另外信息。例如，重复之间具有较大量的差异和较小相对变化将提供与另一个样品存在差异的更大置信度。
在单一轮次(例如，微量滴定板)中包含多个样品(和/或重复)还可以提供使得能够将一个轮次与另一个轮次相比较的优势；每个轮次包含至少一些不同的样品。还可以通过使用对不同轮次通用的对照或标准样品辅助轮次之间的比较，其可以使得能够对轮次间或整个轮次所测量或计算的量进行归一化。然而，通过在每个轮次中的一些不同的样品(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、130、140、150或大于150)；特别是每个轮次中约60个不同的样品，可以通过如常规技术人员已知的或者如在本文其他地方所述的那些的归一化方法，将根据一个轮次所确定的量与其他轮次相比较。
本发明的某些实施方式的一个特征是使用两个(或更多个)位于该染色体上的第一(或第二)目标DMR估计或确定与染色体非整倍性有关的染色体的量。对根据所述两个(或更多个)DMR中的每一个所确定的量的使用和/或考虑可以为存在(或不存在)于胎儿中的染色体非整倍性的指示提供另外的确定性或置信度。例如，如果仅相对于一个目标DMR所确定的量表示存在染色体非整倍性，则可以认为与其中相对于两个(或更多个)目标DMR所确定的量指示存在染色体非整倍性的结果相比，确定性或置信度较低。
因此，本发明包括其中根据在所述第一目标DMR中的一种所检测的甲基化的量确定所述第一目标DNA物质的量，和根据在另一个所述第一目标DMR所检测的甲基化的量确定所述第一目标DNA物质的量的那些实施方式。如现将显而易见的，类似的实施方式可以用于根据两个(或更多个)所述可选的第二目标DMR确定的量。
在具体的这些实施方式中，对于第一目标DNA物质的两个或更多个量，可以分别相对于一个或多个所述第一目标DMR，在步骤(e)(和/或可选的步骤(e)′)中确定两个或更多个相对量，优选地比值。
在某些实施方式中，可以考虑这两个(或更多个)量的组合分析，如这两个或更多个量的平均值或中值。可替代地，如本文所描述的，在具体的实施方式中，在步骤(e)(和/或可选的步骤(e)′)中确定的两个或更多个(优选地每个)相对量或比值可以独立或单独用于考虑、确定或表示胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在。使用如图7中所示的散点图，可以表示或显示这种“二维”考虑或分析；和/或追踪大量不同样品和重复的使用(可选地，在轮次间具有归一化)，如图8所示。如现将显而易见的，大于两个(如第三)DMR作为目标DMR的使用将为分析提供进一步的确定性或置信度，并且本发明具体地设想了其他目标DMR的使用以(例如)提供“三维”分析，从而进一步辅助识别染色体非整倍性。
可以相对于量的阈值或参考分布考虑根据第一(或第二)目标DMR确定的每个目标染色体的量。特别是本发明的某些实施方式为当在步骤(e)中，可以将两个或更多个(优选地每个)所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中两个或更多个(优选地每个)所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在染色体非整倍性。
如本文所描述的，可以根据外部记录或信息识别或提供阈值和/或参考分布量，或者可以根据所分析的多个样品的使用、考虑和/或分析和根据本发明方法确定的量来确定所述阈值和/或参考分布量。因此，在具体实施方式中，可以从多个样品确定阈值和/或参考分布，每个样品采集自不同的怀孕雌性动物，如通过对这些样品实践如上所述的方法；可选地，其中如通过实践如本文所描述的方法，对每种样品，对步骤(c)和/或步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)进行重复(多组)确定。
当在本发明所述的方法中分析多个样品和/或重复时，可以将所述样品(和/或重复)布置在不同的组或轮次中(如qPCR实验中不同的微量滴定板中)。在这些实施方式中，可以在每组逐一进行的基础上分析这些多个样品/重复的两组或更多组，如在单独的轮次、测定或微量滴定板中分析每个组，并通过根据每组样品确定的量或比值的归一化确定阈值和/或参考分布。可以将“归一化”认为是使得根据一组样品/重复所确定的结果(例如量)能够与另一组的那些相比/可比的任何适合的方法。例如，为了能够将对一个轮次(或微量滴定板)所进行的分析与另一个轮次(或微量滴定板)的那些进行比较。多种归一化方法对于常规技术人员将是可用的，其包括其中通过考虑样品特异的量或比值(如对该样品所进行的确定组的平均值)和对于与所述特异样品相同的组中的所有样品所确定的量或比值的平均值(如中值)之间的差异，可以进行样品组间的所述归一化；特别是如实施例4中所述和图8中所示。
考虑到这些数目的样品特异的量，对于该胎儿，可以由通过与相对于一个或多个(优选地，两个或每个)第一目标DMR所确定的量或比值的阈值和/或参考分布相比为离群值的样品特异的量或比值来表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在。在具体的这些实施方式中，可以相对于该胎儿，通过位于下列中的数值聚类内的样品特异的量或比值来表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在：(a)相对于(假设)为整倍体的多个其他胎儿，位于样品特异的量或比值的聚类之外；和/或(b)相对于表示胎儿具有染色体非整倍性的多个其他样品，位于样品特异的量或比值的聚类内；优选地其中表示胎儿的所述多个其他样品选自由约：2-10、12-15、16-25、26-30、32-40、42-50、52-75、78-100、105-125、130-150、155-175、180-200、205-250、255-300、305-350、355-400、405-450、455-500和大于500个其他这些样品所组成的组。在相关实施方式中，可以通过在所述量的散点图中所观察到的圆形或椭圆形来限定所述聚类，其中可以根据所述方法中分析的样品预先确定或计算这种圆形或椭圆形的坐标。可以与参考染色体相比，相对于这些坐标考虑在两个或更多个目标DMR所确定的目标染色体的量，其中具有存在于该边界内的量的样品指示从中采集样品的怀孕雌性动物所携带的胎儿中存在染色体非整倍性。如将显而易见的，可以设置不同的边界，从而以不同程度的确定性或置信度识别非整倍性样品。例如，可以对接近边界或者在边界外但在第二边界内(所谓的“灰色区域”)的那些进行进一步分析或测试。事实上，作为显著降低在这类现有技术NIPT测定中测试的样品数目的方式，可以作为现有技术NIPT测定(如用于非整倍性的下一代基于测序的NIPT)的预筛查来实践本发明所述的方法。例如，边界的定义(如作为“灰色区域”开始的地方)可以用于识别大量阴性样品，即具有整倍体胎儿的妊娠，然后仅使用现有技术NIPT测定测试远远更小数目的非明确为阴性的样品。即使通过起到这种具有几个百分比的假阳性率的筛查作用的诊断测定，可以提供高效的预筛查；特别是如果这种测定具有低假阴性率。
在其他实施方式中，可以实施这种聚类/圆形/椭圆分析与Z得分分析的组合。例如，可以引入这种聚类/圆形/椭圆分析以识别整倍体样品，并且可以引入Z得分分析(如本文所描述的Z得分分析)以识别非整倍体样品。对于染色体非整倍性识别的更大的确定性将归因于与这些不同的分析技术显示出一致性的样品。
在这种分析之前或者作为这种分析的一部分，对根据所述方法确定的样品、测量、信号和/或量中的一个或多个进行一个或多个质量控制过程或步骤。例如，可以在步骤(b)之前考虑存在于样品中和/或从样品提取的DNA的浓度和/或断裂方式，并且要么所述样品不包含在分析中，要么稀释所述DNA(就高浓度来说)。
在本发明具体的这些实施方式中，在步骤(b)之前，可以(例如)用DNF-474高灵敏度NGS试剂盒(Advances Analytical Technologies，Inc.；Ankeny，USA)，使用片段分析仪(Advances Analytical Technologies，Inc.；Ankeny，USA)测量DNA的浓度。可以确定可以位于尺寸约80至220bp的第一显著峰值和平均165bp的峰值的DNA浓度，所述峰值可以代表无分离的细胞的DNA。在某些实施方式中，将该峰值显示出大于约0.3ng/uL的DNA浓度的样品稀释至约0.3ng/uL。由于与低浓度样品相比，过高的DNA浓度量，这种稀释可以帮助避免样品的假阳性预测。可以适用于该片段分析的另一个QC标准包括检测(并且例如排除)具有游离DNA断裂(例如，通过在小于约100bp的尺寸所出现的锯齿状峰表示)和/或基因组DNA污染的那些样品。
如果以下中的一种或多种为真时，可以引入本发明的任何方面的其他可能的质量控制标准包括其中来自样品的数据仅包含在分析中的那些：
·所提供的产生数据的重复数目大于约4、5、6、7或8个；和/或
·对于所使用的一个或多个DMR或者可选的OR，qPCR通道的平均Cp为小于约26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36；和/或
·对于所使用的一个或多个DMR或可选的OR，qPCR通道的Cp平均值的标准偏差小于约0.5、0.6、0.7、0.9、0.9或1.0，或小于约1.1、1.2、1.3、1.4或1.5；和/或
·在全部所使用的qPCR通道、DMR和可选的OR中，全部重复具有有效值；和/或
·在片段分析中，样品未显示出小于约100bp的锯齿状峰和基因组DNA的污染；和/或
·cfDNA的浓度大于约0.05、0.1、0.15、0.2ng/uL和/或小于约0.3、0.4或0.5ng/uL；和/或
·qPCR通道测量总DNA的平均Cp大于约22、24、25、26、27或28。
在其中确定存在于样品中的总DNA(并因此，例如，cfDNA的胎儿部分)以及识别胎儿中染色体非整倍性的本发明的那些实施方式中，可以将本发明的这种方法应用于检测怀孕雌性动物经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险。
因此，本发明的另一个方面涉及检测怀孕雌性动物经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险的方法；所述方法包括以下步骤：
(i)如上所述，实施本发明所述的方法；
(ii)确定存在于样品中的胎儿DNA的至少一个量，如绝对量或相对量；和
(iii)将确定的胎儿DNA的量与阈值和/或参考分布相比较，
其中所述胎儿DNA的量相对于所述阈值和/或参考分布的增加或离群表示怀孕雌性动物经受或发展所述妊娠相关医学病况的升高的风险。
作为替代或另外，可以通过考虑以下因素来评价这种风险：(i)胎儿cfDNA的升高倍数(例如，1.5、3、3.5或4倍升高)(与阈值量相比，对该女性所确定的)，并将其引入到对于后期妊娠，可以使用胎儿cfDNA较高升高倍数的确定中(Zeybek等人2013，J ObstetGynaecol Res 39：632)；和/或(ii)通过考虑量的参考分布，如根据低风险女性或未经受或发展子痫前期的那些女性所确定的那些量，从该女性所确定的cfDNA的量所落入的百分位分布，例如，如果胎儿cfDNA部分落入该分布的第90百分位，则可以认为该女性具有经受轻度或重度子痫前期的升高的风险(Jakobsen等人2013，Transfusion 53：1956)。在确定适合的阈值量时，可以考虑其他相关因素。例如，由于两种因素，同时经受乳腺癌的怀孕女性可以在存在于她的血浆中的RASSF1A处具有较高的甲基化偏离。
类似地，本发明的这一方面的某些实施方式还包括以下步骤：将所检测的所述DNA物质的量与阈值量和/或量的参考分布相比较，其中相对于所述阈值所述DNA物质的量过量(或者与所述群体相比，不是离群值)表示可以对所述样品，优选地所述样品单独的DNA等份进行存在于所述样品中的所述DNA物质异常的诊断。例如，如果胎儿cfDNA部分大于存在于母体血浆中的总cfDNA的约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.5％(特别是大于约4％，更具体地大于约3％的胎儿cfDNA部分)，则将有足够的部分或胎儿cfDNA以有效进行后续测试以研究胎儿cfDNA的一个或多个特征，例如，研究包含在该胎儿cfDNA内的染色体突变异常的机会或存在(如基于大规模平行测序使用NIPT)。就双胎妊娠来说，本发明人确定可以将用于双胎妊娠的NIPT的cfDNA的最小胎儿部分考虑为8％，或约5％、6％、7％、9％或10％，并且对于具有相同基因型的单绒毛膜双胎妊娠(除少见例外以外，Chen等人，2013，Am J Med Genet A，161A：1817)，4％或约2％、3％或5％的胎儿cfDNA部分将是足够的。
本发明的其他方面涉及某些组合物(例如，用于本发明方法的一部分，在其中使用或者作为其产生的组合物)。组合物可以是不同组分的混合物或其他组合。因此，本发明还涉及组合物，所述本发明的组合物包含两种(或更多种)经标记的探针(例如，核酸探针，如用于qPCR的那些)，每种探针用于检测一种或所述两种或更多种第一目标DMR(如一种探针用于检测位于SEQ ID NO：51中的DMR，另一种探针用于检测位于SEQ ID NO：185中的DMR)。在具体的这些实施方式中，用不同的可检测标记物标记存在于所述组合物中的两种或更多种或者这些探针。所述探针(和标记物)可以用于本文所公开的任何所述第一目标DMR，特别是表1和/或表5和/或表E和/或表8和/或表10中所公开的那些。所述组合物可以包含用于检测2、3、4、5或5个以上第一目标DMR的探针，并且用如本文其他处所述的可检测标记物标记。
在该方面的某些实施方式中，所述组合物还可以包含以下其他组分中的一种或多种：
·两对或更多对PCR引物，每对用于扩增所述两种或更多种第一目标DMR中的一种，例如，用于扩增所述组合物中所述探针用于检测的所述第一目标DMR(如一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：51中的DMR，而另一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：185中的DMR)；和/或
·两个或更多个经标记的探针(例如，核酸探针，如用于qPCR的那些)，每个探针用于检测所述两种或更多种参考DMR中的一种(如一个探针用于检测位于SEQ ID NO：66中的DMR，而另一个探针用于检测位于SEQ ID NO：102中的DMR)。在具体的这些实施方式中，用相同的可检测标记物标记存在于所述组合物中的两种或更多种或者这些探针。所述探针(和标记物)可以用于本文所公开的任何参考DMR，特别是表1和/或表5和/或表E中所公开的那些；和/或
·两对或更多对PCR引物，每对用于扩增所述两种或更多种参考DMR中的一种，例如，用于扩增所述组合物中所述探针用于检测的所述参考DMR(如一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：66中参考DMR，而另一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：102中参考DMR)。
在该方面的替代或其他实施方式中，所述组合物还可以包括以下其他组分中的一种或多种：
·至少另外一对引物(优选地，另外两对引物)，每对用于扩增至少一种OR中的一种；和/或
·至少一种其他经标记的探针(优选地，两种其他经标记的探针)，每种探针用于检测所述OR中的至少一种。在具体的这些实施方式中，用相同的可检测标记物标记存在于所述组合物中的两种或更多种或者这些探针。所述探针(和标记物)可以用于本文所公开的任何OR，特别是表1和/或表D和/或表5和/或表E中所公开的那些。
在该方面的其他替代或其他实施方式中，所述组合物还可以包含用于扩增和/或检测1、2、3个或更多个第二目标DMR的一种或多种其他组分，特别是其中这些第二目标DMR位于与染色体非整倍性有关且不同于所述第一目标DMR的染色体上。
本发明的其他方面涉及试剂盒(例如，单独组分的试剂盒；如储器或容器的试剂盒，所述每种储器或容器保存所述试剂盒的不同组分)，这种试剂盒包含引物和/或探针的组合，其中所述组合如在本发明任何所述组合物的背景中所述的。例如，本发明的试剂盒可以含有(包装或者单独或以混合物含有)两种(或更多种)经标记的探针(例如，核酸探针，如用于qPCR的那些)，每种探针用于检测所述两种或更多种第一目标DMR中的一种(如一个探针用于检测位于SEQ ID NO：51中的DMR，而另一个探针用于检测位于SEQ ID NO：185中的DMR)；例如，其中，用不同的可检测标记物标记存在于所述试剂盒中的两种或更多种或者这些探针。其他探针和/或引物(如在本发明的组合物的背景中所述的那些)可选地可以存在于本发明的试剂盒中(如一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：51中的DMR，而另一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：185中的DMR；和/或如一个探针用于检测位于SEQ ID NO：66中的DMR，而另一个探针用于检测位于SEQ ID NO：102中的DMR；和/或一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：66中的DMR，而另一个引物对用于扩增位于SEQ ID NO：102中的DMR)。
在具体的实施方式中，可以修饰存在于所述试剂盒或组合物中的这些探针和/或引物的序列，从而以序列特异性的方式检测亚硫酸氢盐转化的DNA；例如，可以使用这些序列修饰的引物或探针，或者这些序列修饰的引物或探针对于本发明所述方法的MSP或MethylLight实施方式可以是有用的。
本发明的试剂盒可以用于或适用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中的染色体非整倍性和/或检测怀孕雌性动物经受或发展医学病况的升高的风险。
在其他实施方式中，本发明的试剂盒可以包含其他组分。例如，试剂盒另外包含：(i)包含指令的印制手册或计算机可读存储器以使用所述引物和探针来实践本发明所述的方法和/或生产或使用本发明的组合物；和/或(ii)对于实践本发明所述的方法和/或生产或使用本发明的组合物有用的一种或多种其他项目、成分或试剂，其包括用于这种实践或产生的本文所公开的任何这种项目、成分或试剂。例如，试剂盒还可以包含如上所述差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂、Taq聚合酶和/或反应缓冲液等。
通过其他非限制性实例，本发明的试剂盒另外可以包含以下组分中的一种或多种：
·采集或存储采集自所述怀孕雌性动物的组织样品，如血液的方式，优选地，其中所述方式是血液采集管；和/或
·从采集自所述怀孕雌性动物的样品提取DNA，优选地游离DNA的方式，优选地其中所述方式是游离DNA提取试剂盒；和/或
·包含指令的印制手册或计算机可读存储器，从而在本发明所述方法的背景中识别、获得和/或使用所述方式中的一种或两者。
·本发明的计算机程序产品，或者如何获得访问该计算机程序产品或从中产生结果的说明。
在组合物或试剂盒的具体实施方式中，包含其中的一种或多种引物或探针包含选自表1、表D和/或表5和/或表E和/或表8和/或表10中所示的一种的引物或探针序列(或由其组成)(可选地具有对该探针所述的可检测标记物)。在某些这些实施方式中，对于(x)所述第一目标DMR中的两种；和(y)所述参考DMR中的两种，和可选地具有(z)一个或两个OR中的每一个，所述组合物或所述试剂盒包含表5中所示的对或引物和探针(或者相对于测定版本V10.1、V10.2、V10.3、V10.4、V10.5和V10.6中的每一个，如表E中所示，特别是相对于测定版本V10.3)；特别是所述第一目标DMR的探针是差异标记的，用相同可检测标记物标记两种参考DMR的探针，并且如果存在，用相同可检测标记物标记用于两种OR的探针。
在具体的实施方式中，可以用标记物/猝灭剂(和可选地小沟结合部分)标记所述探针，如对于该探针在各个表中所示的。
在另一个方面，本发明涉及核酸，优选地合成、分离和/或纯化的核酸，其由(或者包含)任何本文所定义的引物或探针的序列或者所扩增的DMR的序列组成。在具体的实施方式中，所述引物共价连接至可检测标记物。在具体的实施方式中，可以修饰这些探针和/或引物的序列，从而以序列特异性的方式检测亚硫酸氢盐转化的DNA；例如，这些序列修饰的引物或探针对于本发明所述方法的MSP或MethylLight实施方式可以是有用的。
在替代方面，本发明所述的试剂盒可以包含该类核酸中的一种或多种以及：(i)包含指令的印制手册或计算机可读存储器，从而在所述方法的背景中识别、获得和/或使用所述核酸；和/或(ii)本发明的计算机程序产品或者如何获得访问该计算机程序产品或从中产生结果的说明。这种试剂盒还可以包含其他组分，如对于实践本发明所述的方法和/或生产或使用本发明的组合物有用的一种或多种其他项目、成分或试剂，其包括用于这种实践或产生的本文所公开的任何这种项目、成分或试剂。
本发明的另一个其他方面涉及计算机程序产品，包括：用多种指令所编码的计算机可读介质，所述指令用于控制计算系统以执行和/或管理用于从采集自所述怀孕雌性动物的样品检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的操作，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA，用在本发明所述的方法中进行的差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；所述操作包括以下步骤：
·接收：(i)两种(或更多种)信号，每种信号表示存在于所述样品中的作为与染色体非整倍性有关的染色体的第一目标DNA物质的量，如在本发明所述方法的步骤(c)中所述的；和(ii)一种信号，其表示存在于所述样品中的作为一种或多种参考染色体的参考DNA物质的量，如在本发明所述方法的步骤(d)中所述的；
·与由(ii)中所接收的信号所表示的参考染色体的量相比，基于由(i)中所接收的至少一种信号(优选地两种信号)所表示的与染色体非整倍性有关的染色体的至少一种(优选地至少两种)相对量，确定染色体非整倍性是否可能存在于所述怀孕雌性动物所携带的胎儿中的分类，其中至少一种(优选地至少两种)表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在。
在本发明所述的计算机程序产品的某些实施方式中，可以根据(i)中所接收的两种(或更多种)信号计算或另外产生所述相对量。例如，平均值、中值和/或z得分。
在所述计算机程序产品的其他某些实施方式中，可以使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR来产生表示在步骤(c)和步骤(d)中确定的所述DNA的量的信号；可选地：(x)对于至少两个(优选地每个)所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个(优选地每个)所述第一目标DMR使用不同的可检测标记物。
通过计算机程序产品控制的操作可以通过与阈值和/或参考分布相比较来实施这种分类，其中一个或多个(优选地，两个或更多个)所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表示胎儿中染色体非整倍性的存在。特别是相对于所述多个样品，通过接收多个信号(i)和(ii)，所述操作根据分别采集自不同怀孕雌性动物的多个样品计算所述阈值和/或参考分布；可选地其中通过本发明的方法在一组或多组样品中分析所述多个样品，并且其中在给定组中在单独的容器中，并且对于该组中所述多个样品的每个成员有效地同时对每个样品实施所述方法。
在所述计算机程序产品的某些实施方式中，所述操作还包括以下步骤中的一个多个：
·基于将所存在的所述胎儿DNA的量与阈值和/或参考分布相比，确定怀孕雌性动物是否具有经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险的分类，其中相对于所述阈值和/或参考分布，所述胎儿DNA的量的增加或离群表示所述怀孕雌性动物经受或发展所述妊娠相关医学病况的升高的风险；和/或
·质量控制(quality-control)计算、过程或步骤，如本发明中所公开的。
在本发明的某些实施方式中，可以在任何确定步骤之前实践质量控制计算、过程或步骤。以这种方式，在任何其他步骤、过程或分析中不包含未通过所要求的QC标准的那些样品/分析。
应理解根据本文所包含的教导内容，本发明的教导内容对具体问题或环境的应用，以及本发明的变化或其他特征(如其他方面和实施方式)的包含将在本领域常规技术人员的能力范围之内。
除非上下文中另外规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何具体方法或实施方式并且同样适用于所描述的所有方面和实施方式。
本文引用的所有参考文献、专利和出版物以其全部内容作为参考并入本文。
现将通过实施例并参考本文所描述的描述、附图和表格来说明本发明的某些方面和实施方式。本发明的所述方法、用途和其他方面的这些实施例仅是代表性的，并且不应视为将本发明的范围仅限制在这些代表性实施例中。
实施例1(对比例)：在多胎妊娠中，包括在双胎消失的病例中，在基于MGS的NIPT之前，基于差异甲基化的DNA检测方法在定量步骤中的使用
样品采集、处理和DNA提取：
出于研究和开发(R&D)的目的并作为常规无创产前检测(NIPT)的实验室程序的一部分，在2012年11月6日至2013年11月16日之间从具有多胎妊娠(单绒毛膜、双绒毛膜和三绒毛膜双胎和三胎妊娠)的怀孕女性采集36个血液样品。一个血液样品来自具有三胎妊娠的怀孕女性，剩余的35个样品来自双胎妊娠。利用Streck游离DNA血液收集管(Streck)，从每位携带多胎妊娠的怀孕女性采集两个样品，每个样品具有7-10ml静脉血。将血液样品运到诊断实验室，其中最长递送时间为4天。类似地，收集本文分析的来自怀孕雌性动物的其他血液样品。
通过离心(4℃下，1600g，10分钟)进行血浆制备，并接着通过第二离心步骤(4℃下，16000g，10分钟)进行血浆分离。根据生产商的规程，通过QIAamp循环核酸试剂盒(Qiagen)，使用3.0-4.0ml血浆以及最终洗脱体积为60ul的AVE缓冲液(Qiagen)，实施总游离DNA(cfDNA)的提取。
DNA定量：
使用基于差异甲基化的DNA检测，相对于总游离DNA(总cfDNA)来检测和定量胎儿游离DNA(胎儿cfDNA)，从而将胎儿cfDNA部分确定为相对浓度和绝对量两者。在使用CutSmartTM缓冲液(New England Biolabs)的22ul反应中，通过CpG-甲基化敏感性酶HhaI(0.4U/ul)、HpaII(0.3U/ul)和BstUI(0.3U/ul)，从洗脱的游离DNA，消化11ul。将所述反应在37℃培育60min，在60℃培育60min。将来自消化反应的10ul用作用于基于探针的定量PCR(反应重复进行两次)的模板DNA，并简要描述如下。
使用2倍浓缩的PCR母液混合物(PCR master mix)(QuantiFast Multiplex PCRKit试剂盒，Qiagen)来进行25ul的PCR反应。跨过在胎儿和母体DNA之间差异甲基化的各个区(作为DMR)的CpG甲基化敏感性限制性内切酶位点的引物与FAM-标记的探针一起用于这些DMR，并且不跨过任何限制性内切酶位点的引物(在胎儿和母体DNA之间未差异甲基化的其他区域)(作为OR)与VIC-标记的探针一起用于这些OR。在表1中描述了在本实施例中使用的引物和经标记的探针的序列，并且在表2中描述了用于定量探针基(TaqMan)PCR的热循环仪谱(LightCycler 480II仪；Roche)。在本实施例中，分别用相同的可检测荧光素酰胺(FAM)荧光部分标记用于检测两个DMR的存在的探针，并且各自具有相同的小结合沟(MGB)非荧光猝灭剂(NFQ)部分，和分别用相同的可检测VIC(life Technologies)荧光部分标记的用于检测两个OR的存在的探针，并且各自具有相同的MGBNFQ部分。
表1：(基于探针的)定量PCR组分
*仅所列的核苷酸序列，无染料/猝灭剂
**在“[]”括号中显示了用于每个探针的染料/猝灭剂
表2：热循环仪谱
在本实施例中使用的基于差异甲基化的DNA检测测定设计基于两个标志物DMR，其被描述为在母体DNA中低甲基化，在胎儿DNA中高甲基化(Nygren等人，2010：Clin Chem 56，1627；Chan等人，2006：Clin Chem 42，2211；Chiu等人，2007：Am J Pathol 170，941)，和两个其他区域(OR)，其在母体和胎儿DNA之间未差异甲基化，并且其各自位于它们的DMR的约20bp至20kb之间。特别是位于RASSF1A的甲基化不敏感基因座位于RASSF1A的甲基化敏感基因座下游8kb至9kb(8.97kb)之间，并且位于TBX3的甲基化不敏感基因座位于TBX3的甲基化敏感基因座下游10kb至11kb(10.64kb)之间。图2显示了在本实施例中使用的两个DMR和两个其他区域的各自的布置和检测方式。
对于模板，使用连续稀释的具有已知浓度的雄性基因组DNA(Promega)作为标准品来进行平行基于探针的定量PCR反应(在相同PCR轮次内的单独反应中)。通过在FAM通道(DMR；即检测胎儿cfDNA)中的信号相对于VIC通道(OR；即检测总cfDNA)中的信号的相对定量来计算胎儿cfDNA部分，并且通过与得自具有已知浓度的标准DNA稀释系列的VIC通道相比，得自所述样品的VIC通道中的信号的绝对定量来计算绝对总cfDNA的量。使用LightCycler 480软件版本1.5.0(Roche)来进行这种相对和绝对定量。
母体血浆DNA测序和数据分析以识别胎儿非整倍性：
使用来自Illumina的NEBNext UltraTM DNA文库Prep试剂盒制备DNA测序文库。根据生产商的规程来制备文库，其是在Hamilton STARplus机器人上自动进行的。使用生物分析仪(Agilent)和Qbit荧光计(Invitrogen)来测量文库质量和数量。基于文库定量稀释，制备了12个样品/混合物的等摩尔混合物。在Illumina HiSeq2000测序仪上，在Illumina v3流通池的一个泳道上，对混合样品测序。根据生产商的规程，通过cBot簇生成系统，使用TruSeq SR Cluster试剂盒v3-cBot-HS产生克隆簇。如先前所描述的，进行生物信息学分析以识别胎儿的染色体非整倍性，其中z得分≥3表示胎儿21三体性的存在(Stumm等人2014，Prenat Diag 34：185)。根据该基于NGS的方法，在胎儿非整倍性的阳性检测结果的情况下，通过侵入性诊断方法来确认所述结果。
结果：
在表3中给出了血液样品的特性、通过本实施例所述的方法所确定的cfDNA的胎儿部分％和通过这种基于NGS的方法所确定的非整倍性测试结果。存在指示胎儿21三体性的两个阳性的基于NGS的检测结果。通过在羊膜穿刺之后的核型分析确认了上述两者；因此，在该基于NGS的研究中假阳性率为0％。一个血液样品代表具有一致核型[47，XY，+21]的单绒毛膜双胎，另一个血液样品则代表具有不一致核型[47，XY，+21和46，XX]的双绒毛膜双胎。在两个样品中，胎儿部分分别高达18.0和24.8％。对于21、18和13三体性，所有其他基于NGS的NIPT结果为阴性。至今，在本研究中包括的妊娠中，没有假阴性NIPT结果的迹象。
表3：所采集的血液样品的特征和NIPT结果
通过现有技术的基于NGS的NIPT，在双胎妊娠中胎儿非整倍性的可靠检测依赖于母体血液中来自每个胚胎的足够高的量的胎儿cfDNA。关于应该如何定义胎儿cfDNA部分的下限以确保每个双胎的贡献高于检测阈值，已发表了不同的数据和观点(Leung等人2013，Prenat Diag 33：675；Qu等人2007，Am J Pathol 170：941；Struble等人2013，Fetal DiagnTher Dec 7 Epub ahead of print)。这对于具有不一致核型的双绒毛膜双胎妊娠是特别重要的。在上述研究中，如果两个胎儿中仅有一个是雄性，则将支持信息用于定义来源于Y染色体表示的双胎妊娠的最小胎儿cfDNA部分。使用本实施例的方法，可以确定总胎儿cfDNA部分，其反映了来源于两个胎儿的胎儿cfDNA的总结。使用来自下一代测序的Y染色体表示，可以确定雄性胚胎的胎儿cfDNA的量(如在Stumm等人2014中所述)。因此，在混合胎儿性别的情况下，可以通过从通过本实施例的方法所测量的胎儿cfDNA部分减去通过Y染色体表示所确定的胎儿cfDNA的量来确定每个胎儿的贡献量。对于已知性别的情况，将通过本实施例的方法所确定的胎儿cfDNA部分与从来自下一代测序的Y染色体读数所获得的值相比较(参见图3)。在雄性特异性cfDNA的量(y轴)和通过本实施例的方法所测量的胎儿cfDNA部分(x轴)之间存在相关性。因此，对于具有雄性/雄性性别的双胎妊娠，大约真实的是：[y＝x]，对于雌性/雄性性别，它是：[y＝0.5x]，并且对于雌性/雌性：[y＝l]。具有类似值的情况的性别是雄性/雄性，并且在具有低Y染色体表示的不同值的情况下，所述性别是雌性/雌性。显示约一半百分比的胎儿部分作为Y染色体表示的中间情况是混合性别。图3中所示的数据表明使用针对双胎妊娠的现有技术基于NGS的NIPT结果，不仅可能确定胎儿性别，而且与Y染色体序列的频率计数相比，通过本实施例的方法所确定的cfDNA的胎儿部分的量的测量是准确的。另一方面，这些数据支持以下假设：双胎妊娠的每个胎儿贡献了总胎儿cfDNA部分的大约一半。这得出了以下结论：对于双胎妊娠，将需要两倍量的胎儿cfDNA，并因此对于双胎妊娠的现有技术基于NGS的NIPT，可以认为cfDNA的推荐的最小胎儿部分为8％。
对于具有一致基因型的单绒毛膜双胎妊娠(除少见例外以外，Chen等人，2013，AmJ Med Genet A，161A：1817)，4％的胎儿cfDNA部分将足以检测胎儿非整倍性，正如对于单胎妊娠一样。然而，对于常规实验室NIPT服务，一个主要问题反对这种不同质量标准用于单和双绒毛膜妊娠的意义：绒毛膜性的确定依赖于孕龄和进行超声检查的医生的实践经验。在多胎妊娠的最初三个月内，绒毛膜性(chorionicity)是清楚地可检测的，但在后期检测变得更加困难(Sperling等人2001，Acta Obstet Gynecol Scand 80：287)。因此，更安全的策略是通常对于双胎妊娠定义最小胎儿cfDNA部分，其适用于单绒毛膜以及双绒毛膜多胎妊娠。
双胎消失的鉴定：
在其中利用本实施例的方法来测量胎儿cfDNA部分的NIPT非整倍性测试的两种情况下，识别了21三体性(z得分分别为13.5和3.4)，但还在通过本实施例的方法所测量的总胎儿cfDNA部分和通过Y染色体表示所测量的cf-胎儿-DNA的量之间观察到显著差异。
对于案例A，血液样品(第一和备份样品)的两个分析估计通过本实施例的方法所测量的总胎儿cfDNA部分分别为20.7％和24.8％，而根据来自下一代测序的Y染色体表示的胎儿cfDNA分别为9.2％和9.3％。据推测，并且报告给医生，妊娠可能是混合性别双胎妊娠，其确认在第10周时，在超声扫描期间已观察到已死的双胎之一。在妊娠的第三个三个月(38+2)所采集的其他血液样品显示对于21三体性为阴性，并且通过Y染色体表示所测量的胎儿cfDNA的量与通过QuantYfeX所测量的胎儿的量(21.7％和21.4％)相关，其匹配通过活的胎儿的核型分析所确定的雄性性别。出生时，在胎盘组织中发现薄纸样胎，从它可以分离足够量的细胞以用于细胞培养和随后的GTG显带，确认是21三体性阳性，雌性核型(47，XX，+21)。
对于案例B，监测到略微升高的Y染色体表示，表明雄性特异性cf-胎儿-DNA分别为3.0％和2.7％。由于通过本实施例的方法所测量的胎儿cfDNA部分的估计值远高于上述值(13.4％和10.0％)，因此我们根据这种差异假设在测得的胎儿部分中，具有不一致性别的两个胎儿贡献了胎儿部分并且雄性胎儿是受21三体性影响的胎儿。这种建议来源于大致3％的Y染色体特异性胎儿cfDNA的量与大概3.0的截止值的升高的z得分之间的相关性。由于明确要求对单胎妊娠进行检查，因此怀疑雄性特异性胎儿cfDNA来自双胎消失-可能是21三体性的携带者，其在NIPT的知情同意书上要么是不认可的要么是不表示的。因此，结果报告为对于21号染色体是非决定性的，并且将矛盾的数据、包括关于潜在双胎消失的通知报告给负责的医生以用于通过超声进一步澄清。负责的医生随后确认妊娠以作为双胎开始，并随后作为单胎妊娠继续。确认存活的并且明显健康的胎儿的性别是雌性，并因此可以明确地将引起21三体性的z得分升高的胎儿cfDNA归因于已死的雄性胎儿。
实施例2(对比例)：使用两个差异甲基化区域并对每个差异甲基化区域使用相同的可检测部分，参考染色体改善的检测灵敏度
本发明人观察到与先前分别在单独的PCR反应中检测单一DMR(和单一OR)的检测反应相比，对于每个所述DMR(以及未差异甲基化的两个其他区域(OR))，使用相同的可检测部分来检测两个DMR的复杂、多路反应对于检测胎儿来源的参考染色体更灵敏(图4)。
在另一个基于差异甲基化的DNA检测方法中，使用相同的DNA等份和反应有效地同时(使用基于探针的定量(TaqMan)PCR)、并且也使用两个OR(存在于RASSF1A和TBX3中的那些，如实施例1中所述)检测(经4次稀释)了两个DMR(存在于RASSF1A和TBX3中的那些，如实施例1中所述)并且分别位于人3号染色体和12号染色体上，对于每个所述DMR使用相同的可检测部分(并且用于所述至少一种OR的可检测部分不同于用于所述DMR的可检测部分)。相比之下，如果在单独的反应中独立检测每个DMR(和相应的OR)，则cfDNA中胎儿来源的参考染色体的检测是不太灵敏的，如通过在较高循环数(Cp)下的检测所示的。区域/标志物、引物/探针和检测方法基本如实施例1中所述，不同之处在于对于单基因座反应，在单一反应中仅同时检测到来自给定基因(RASSF1A或TBX3)的DMR(和相应OR)。
相反，使用不同的可检测部分(例如，用于RASSF1A基因座的FAM以及用于TBX3基因座的VIC)，使用两个DMR的多路反应，将cfDNA中胎儿来源的参考染色体的检测确定为更不灵敏(并且进一步难以通过任何OR同时检测)；不受理论束缚，据信由于颜色补偿的复杂性较高，在相同反应中存在有限数量的来自众多荧光标志物的单独可检测的荧光标志物和/或“漂白”作用。
考虑到定量PCR检测的指数性质，较高的检测灵敏度(即较低的循环数)也将等同于较高的定量准确度，因为与产生自与在较高的循环数下的检测相关的DNA的量(即参考染色体的定量)的误差相比，对标准曲线的校正和在数据点之间的插值的误差较小。
实施例3(对比例)：使用基于差异甲基化的DNA定量方法用于检测怀孕女性经受或发展子痫前期的升高的风险(预测实施例)。
使用对比例的方法，如下所示评价怀孕女性经受或发展子痫前期的风险。首先，从将对其评价这种风险的女性采集血液样品并基本上根据实施例1中所描述的程序从该样品的血浆中提取总cfDNA。其次，使用基本如实施例1中所描述的方法，确定在所述血浆中存在的胎儿cfDNA和总cfDNA的相对和/或绝对量，其中胎儿和/或总cfDNA的绝对量可以表示为基因组等价物(“Eq”)的量。第三，将cfDNA和/或总cfDNA的这种确定的量与阈值量或量的参比分布相比，并且如果胎儿cfDNA或总cfDNA的量超过该阈值和/或在该分布中是离群值，则确定所述女性具有经受或发展子痫前期的升高的风险。
例如，使用所公开的阈值(Papantoniou等人2013，Prenat Diag 33：682)，如果总cfDNA超过约7,500Eg/mL血浆的量或如果胎儿cfDNA部分超过约500Eg/mL血浆的量，则确定所述女性具有这种升高的风险。作为替代或另外，可以通过考虑以下因素来评价这种风险：(i)胎儿cfDNA的升高倍数(例如，1.5、3、3.5或4倍升高)(与阈值量相比，对该女性所确定的)，并将其引入到对于后期妊娠，可以使用胎儿cfDNA较高升高倍数的确定中(Zeybek等人2013，J Obstet Gynaecol Res 39：632)；和/或(ii)通过考虑量的参考分布，如根据低风险女性或未经受或发展子痫前期的那些女性所确定的那些量，从该女性所确定的cfDNA的量所落入的百分位分布，例如，如果胎儿cfDNA部分落入该分布的第90百分位，则可以认为该女性具有经受轻度或重度子痫前期的升高的风险(Jakobsen等人2013，Transfusion 53：1956)。
在本实施例中，使用计算机程序产品进行风险检测，其执行了由图5表示的操作。操作(A)接收信号(1)和(2)，其分别表示通过计算机程序产品使用胎儿和总cfDNA来确定参数(4)，所述参数(4)表示在所述女性的血浆中存在的胎儿(或总)cfDNA的相对和/或绝对量。这种操作可以可选地接收信号(3)，所述信号(3)表示标准DNA的绝对量。第二操作(B)将这种确定的参数(4)与阈值量(5)和/或量的参考群体(6)相比较，以确定和报告(7)，并基于这种比较确定所述女性是否具有经受或发展子痫前期的升高的风险。
实施例4：本发明所述的方法作为检测21三体性的直接且有效的NIPT方法的使用
本发明能够识别得自具有21三体性胎儿的怀孕雌性动物的cfDNA样品。
在本发明方法的单一多路PCR反应中，在两个目标DMR的每一个处确定了得自58位怀孕女性的cfDNA样品中存在的胎儿21号染色体的DNA物质的量，并且通过使用两个参考DMR(参见图6)并相对于每个怀孕雌性动物，确定了在cfDNA样品中存在的胎儿5号染色体和12号染色体(作为参考染色体)的参考DNA物质的量。将胎儿21号染色体物质(如在两个目标DMR的每一个处所估计的)和该胎儿染色体的参考物质(如通过两个参考DMR的两者所估计的)的相对量计算为比值，并将每个比值用于绘制散点图，所述散点图显示了对于每位怀孕女性，两个比值中的每一个的样品特异的平均值(n＝6个重复实验)。该散点图显示了三个“+”点，其分别代表得自已知携带具有21三体性(“T21”)的胎儿的怀孕雌性动物的样品，并且可以容易地将其识别为离群值。该散点图还显示了本发明方法的一个有利特征，其中对于21号染色体上的一个目标DMR，将一个非T21样品观察为离群值，但对另一个未观察为离群值。仅通过使用可以分析这些标志物中至少两个的方法和分析，如本发明的方法，将该样品从非T21群体中正确识别为离群值，而不是识别为T21样品。例如，如果仅考虑x轴所表示的目标DMR，或者如果考虑两个目标DMR的平均值(即将两个目标DMR一起考虑)，则将该样品错误地识别为T21样品。
在单一qPCR轮次中，从采集自58位怀孕女性的全部58个样品产生了图7中所示的数据。然而，随后通过相同的本发明方法，在两个其他qPCR轮次(每个轮次分别分析了来自54和56位怀孕女性的样品)中分析了采集自110位怀孕女性的另外110个样品。通过对从三个不同轮次所产生的数据进行归一化，可以在单一散点图中观察全部168个样品(图8)。全部9个T21样品的群集与非T21样品的分离是显而易见的；例如，如通过所示弯曲边界(用虚线表示)所区分的。通过将每个样品的每个比值的平均值减去来自如下所示单一轮次的全部重复的适用比值的中值，来进行轮次间的归一化。通过加2转换为正值后，使用对数坐标，将所得归一化值作图。
对于轮次1至3中的每一个，通过考虑全部9个T21样品(在该图中通过“o”表示)与非T21样品(在该图中通过“+”表示)的独立于轮次的分离，图8中每个点(按轮次)距曲线分界线中点的距离(在本实施例中，0.5、0.55)，显示了分析多个轮次(在该实施例中，3个轮次)中多个样品(在该实施例中，168个样品)的本发明方法的稳健性(图9)。全部9个样品成功分类，无假阴性或假阳性结果。
通过使用两个目标DMR，确定胎儿21号染色体的DNA物质的量：(i)第一DMR，其位于人21号染色体q22.2上的DSCAM基因(唐氏综合症细胞粘附分子；NCBI参考序列智人21号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000021.9 GI：568815577，区40010999至40847113；SEQ ID NO：200)中；和(ii)第二DMR，其位于人21号染色体q22.3上的C21orf57的上游/下游约250bp内(YBEY；21号染色体：46,286,337-46,297,751正向链，GRCh38：CM000683.2；该基因包括侧接区上游/下游250bp，SEQ ID NO：218)。
通过使用两个参考DMR确定了胎儿参考染色体DNA物质的量：(i)第一该DMR，其存在于人12号染色体q24.21上的TBX3基因(如上所述)中；和(ii)第二该DMR，其存在于5号染色体q31.3上的PCDHGA1基因(原钙粘附蛋白γ亚家族A，1；NCBI参考序列智人5号染色体，GRCh38.p2 Primary Assembly：NC_000005.10 GI：，区141,330,571至141,512,981；SEQ IDNO：217)中。还在每个多个反应中扩增了距TBX3中的DMR(参见上文)约10kb的第一OR和距PCDHGA1中的DMR约300bp的第二OR。表4中描述了所使用的各个DMR(和OR)的序列。
表4：21号染色体、5号染色体和12号染色体的DMR和OR
对甲基化敏感性位点加下划线，通过非大写显示了已知的SNP的位置。
从168位怀孕女性(包括其中9个已知携带了具有T21的胎儿)采集cfDNA样品，制备并使用如实施例1所述的CpG-甲基化敏感酶HhaI、HpaI和BstUI消化。使用如表5中所述的PCR引物和经标记的探针(具有猝灭剂)，并且除了所使用的PCR缓冲液为PerfeCTaMultiPlex qPCR ToughMix(Quanta BioSciences)外，如实施例1中所述，对每个这种样品重复(n＝6)实施表4中所述的4个单独基因座的基于探针的多路定量PCR反应，将样品分成三个轮次，每个轮次分别具有58、54和56个样品，每个轮次由在单个384-孔微量滴定板(Roche)中通过LightCycler 480II(Roche)进行的本发明的这种测定所组成。
表5：引物和探针
*仅所列的核苷酸序列，无染料/猝灭剂
**在“[]”括号中显示了用于每个探针的染料/猝灭剂
该测定的形式通常如图6所示，其中该图的DMR1位于人21号染色体的DSCAM基因中，该图的DMR2位于人21号染色体的C21orf57基因的上游/下游约250bp内，该图的DMR1′位于人12号染色体的TBX3中，该图的DMR2′位于人5号染色体的PCDHGA1基因中。出于计算21号染色体上目标DMR和5号染色体和12号染色体上参考DMR之间的相对量或比值的目的，如用于计算各个染色体的胎儿部分一样，不需要OR，该值将在数学公式中消除。因此，对于胎儿T21-状态的分析，不需要可以从OR的使用估计的总DNA的量，但是它仍可以用于从总DNA计算胎儿cfDNA部分；例如，出于如实施例6和/或7中所述的目的和/或作为可能或其他的质量控制测量(例如，实施例6)，或者出于如实施例7中所述的其他诊断的目的。如将根据表5所观察到的，与位于C21orf57的上游/下游约250bp内的21号染色体的目标DMR的探针相比，差异标记位于DSCAM中的21号染色体的目标DMR的探针；另外，用相同标记物(不同于目标DMR)标记位于TBX3的参考12号染色体的参考DMR和位于PCDHGA1中的5号染色体上的参考DMR。最后，如果需要估计总DNA，用相同标记物标记两个OR，这两个不同于在所述多路测定中使用的另一个标记物。总体上，使用了4个标记物，这使得能够对每个目标DMR独立地估计21号染色体的量并且使得能够更灵敏地检测参考染色体的量(参见实施例2)，例如，通过与得自具有已知浓度的标准DNA的稀释系列的各个DMR(或OR)的信号相比，参考来自所述样品的每个DMR(或OR)的各个信号，如作为测试样品，可以在每个qPCR板(轮次)中所提供的。使用LightCycler 480软件版本1.5.0(Roche)来进行这种相对和绝对定量。对于每个样品，计算每个21号染色体目标DNA物质的胎儿cfDNA％和两个参考染色体参考DNA物质的胎儿cfDNA％的平均[n＝6个重复]样品特异性比值，并且对于每个板，计算所有重复的整体中值。如上所述进行分析。
实施例5：不参考已知的整倍体内标，在NIPT中迭代z得分分析以检测21三体性
在z得分分析中，在平均值和标准偏差的估计中，不参考已知的整倍体样品，通过应用迭代z得分法，本发明人能够从测试样品中识别所有已知的21三体性样品。
如下所示，对实施例4中分析的来自样品每个轮次(qPCR板)的数据再分析。首先，计算样品(n＝6)的每个重复的每个21号染色体目标DMR与参考染色体DMR的平均比值，并且对于该轮次(板)中存在的全部样品，不参考样品是否已知为整倍体或三体性，计算每个比值的总平均值和标准偏差。第二，基于该轮次-特异的平均值和标准偏差，对于存在于所述轮次中的每个样品，计算与每个目标DMR有关的每个比值的(轮次特异的)单独的z得分。第三，对于每个DMR，对这些比值检查等于或大于1.95的那些，并且独立地对于两个目标DMR中的每一个，将由这些离群z得分所表示的任何这些样品从用于任何后续z得分计算因子(轮次特异的平均比值和标准偏差)确定的各个参考样品组中排除。独立地对于每个目标DMR，相对于参考数据组中剩余的样品，对数据计算每个比值的第二平均值和标准偏差，并将其用于对该组中全部样品进行每个比值的第二z得分分析。第四，如以上在第三步中，独立地对于每个目标DMR，检查所得z得分(即在第一迭代消除之后计算的那些)的离群值，并且将与z得分等于或大于1.95有关的那些样品从用于相对于每个DMR计算z得分的参考数据组中排除。然后，独立地对于每个目标DMR，相对于各个参考数据组中剩余的样品，对数据计算每个比值的第三平均值和标准偏差，并将其用于对该组中全部样品进行每个比值的第三z得分分析。将该迭代过程重复20次，并且曾经从各个DMR参考组中排除的样品不再包含在参考数据组中，即使在一次迭代消除后，各个样品的z得分将再次转变为小于1.95。图10中显示了对于每个比值和样品所得的样品z得分，其显示整倍体和T21样品完全分离(对于两个比值中的每一个，通过z得分大于约3.0表示；和/或通过大于约3.0的两个z得分的平均值表示；和/或通过类似于实施例4/图9中所述的聚类或距离方法表示)。通过定义以下规则，排除获得平均z得分为3以上的值的二倍体离群值：对差异程度，控制不一致的结果(标志物1和2)。如果差异大于4.0，则它们是非阳性的/非可报告的。
实施例6：使用本发明所述的方法估计胎儿cfDNA部分
通过使用存在于两个参考染色体上的两个(常规标记的)参考DMR和两个(常规标记的)OR(每个在与它们各自的DMR相同的基因中)，计算所测量的DNA的量的比值，估计分离自所述怀孕雌性动物的总cfDNA中胎儿DNA部分％。有关胎儿cfDNA部分的信息可以用于质量控制目的，包括确定样品中是否存在足够的胎儿DNA以允许后续分析，如实施例1中所描述的基于NGS的分析。
实施例7：使用本发明所述的方法检测怀孕女性经受或发展子痫前期的升高的风险(预测实施例)
除确定通过怀孕雌性动物所携带的胎儿是否为非整倍体外，如下所示，实施例4中所述的本发明测定的形式(即携带至少一个OR以测量总DNA)还用于确定怀孕雌性动物是否处于经受或发展子痫前期的风险。
使用基本如实施例4所述的方法，确定了存在于血浆中的胎儿cfDNA和总cfDNA的相对和/或绝对量，其中胎儿和/或总cfDNA的绝对量可以表示为基因组等价物的量(“Eq”)。第三，将cfDNA和/或总cfDNA的这种确定的量与阈值量或量的参比分布相比，并且如果胎儿cfDNA或总cfDNA的量超过该阈值和/或在该分布中是离群值，则确定所述女性具有经受或发展子痫前期的升高的风险。所公开的值以及其他评价该风险的方法包括实施例3中所述的那些。本发明的这种方法可以用于产生信号以使用实施例3中所述的(和由图5所表示的)计算机程序产品来检测这种风险。
实施例8：本发明的试剂盒的制备和分布(预测实施例)
通过对表5中所列的每个引物和探针形成缓冲溶液来制备本发明的试剂盒。将每个缓冲溶液等份(例如，200ul)置于单独的eppendorf管中，并将这些管在纸板盒中包装。
在替代试剂盒中，制备了单一缓冲溶液，其包含表5中所列的每个引物和探针的混合物。
在其他替代试剂盒中，所述纸板盒还包括用于检测表5中所述的两个第一目标DRM的探针等份。
所述试剂盒的纸板盒还含有印制的说明书手册，其指示用户使用其中的组分(以及其他组分)来实践本发明所述的方法，从而寻求检测胎儿中的染色体非整倍性。
实施例9：使用所采集的样品的试验(预测实施例)
通过本发明的方法(如通过使用如实施例4所述的测定)，但是以盲式方式(即研究人员不知道样品来自哪类怀孕雌性动物)寻求(例如，正确地)识别据信携带有具有染色体非整倍性(例如，21三体性)的胎儿的那些样品，分析了采集自已知携带了非整倍体或整倍体胎儿的多个怀孕雌性动物的一些样品。在进行分析之后，所述样品是非盲的(即它们是否的确携带了三体性胎儿，如通过NGS和/或其他测试所确定的)，并比较该信息以产生本发明方法的灵敏度和特异性的估计或量度。
实施例10：本发明直接和有效的方法用于NIPT以检测21三体性的其他实施方式
在实施例4中显示了使用DMR、OR和荧光标记物/猝灭剂的具体组合的本发明所述方法的应用。然而，本发明人表明该方法不局限于这种具体组合，因为DMR、OR和/或荧光标记物/猝灭剂的其他组合也显示本发明的这种方法可以通过NIPT直接和有效地检测21三体性。表6显示了用于进行该证明的多种取代和/或组合。
表6：本发明所述的方法的其他非限制性实施方式的总结
*探针的第二供应商，对C21orf57探针使用Cy5/BBQ650作为标记物/猝灭剂对
**与实施例4相比，除了对C21orf57探针使用Cy5/BHQ3作为标记物/猝灭剂对
从这些样品的大集合中选择cfDNA样品组，每组得自56或58个怀孕雌性动物，以产生单独的qPCR测试轮次，其中每个测试轮次包含来自已知具有21三体性胎儿(先前通过可商购的下一代基于测序的NIPT方法：PRENATEST，LifeCodexx AG，Constance，Germany确定和确认)的妊娠的2至4个cfDNA样品。
对每个qPCR测试轮次实施如实施例4所述的方法，并且分析来自每个轮次的数据，并且与图8所示的类似地计算、修正和提供DMR比值，除了对于实施例10中测试的多个测定实施方式，使用了标记物(和相应猝灭剂)的不同取代，并且在两种情况下，使用了第二Chr21 DMR。对于每个测定，如表6所示使用DMR/OR。对于第二列中所述的测定，使用了与实施例4中所使用的和表5中所述的相同的引物序列、探针序列和探针-标记物/猝灭剂的组合。对于作为V10.1至V10.4所述的测定，使用了与实施例4和表5中所述的相同的引物序列和探针序列，但使用了表6中所示的探针-标记物(和相应猝灭剂)。对于作为V10.5和V10.6所述的测定，除了替代位于C21orf57中的DMR，使用了替代第二(目标)Chr 21 DMR：V10.5使用C21orf29，V2.6使用CGI149之外，使用了与V10.1/10.4中相同的引物序列、探针序列和探针-标记物/猝灭剂。表7中显示了这两个可替代的第二(目标)Chr 21 DMR中每一个的序列，并且表8中描述了在V10.5和V10.6中使用的相应引物和探针序列以及标记物/猝灭剂。
表7：可替代的21号染色体DMR
对甲基化敏感性位点加下划线，并且通过非大写显示已知的SNP的位置
表8：可替代的染色体DMR的引物和探针
*仅所列的核苷酸序列，无染料/猝灭剂
**在“[]”括号中显示了用于每个探针的染料/猝灭剂
如通过图11至图17所示(其在每种情况下，x轴表示作为一个Chr 21 DMR的DSCAM；并且y轴代表另一个Chr 21 DMR)，每个这些不同的实施方式显示为本发明用于NIPT检测21三体性的直接且有效的方法，如每个轮次中从非T21样品中所区别聚类的。仅在一个测定形式中(V10.1)，通过真阳性样品位于应用于所有测定的相同预限定的圆形截止边界之外，发现发生了“假阴性”；并且在两个假阴性中，通过对于两个标志物具有显著较高的标志物比值，将一个容易地识别为无法确定(anonymous)。在一些测定中发生了少量假阳性，其在测试轮次中定量的真阴性的0％(V10.4和V10.5)至4％(V2.1)之间，但是如技术人员将理解的，在(例如)非整倍性的诊断测试中，与假阳性相比，具有最小假阴性是远远更重要的。在本实施例中使用的预限定的圆形截止边界是先前已定义的，在使用超过700个样品(包括实施例4中所述的测定形式中的15个T21样品)，得自大量随机盲式qPCR测试轮次组的数据分析之后，以提供如对于该测试所期望的整体灵敏度(真阳性率)、特异性(真阴性率)和非可报告率；例如：100％，几乎100％，大于97％(优选地，大于97.5％)或者大于95％的灵敏度；大于95％，优选地大于96％的特异性；和/或小于10％(优选地小于7％)，如小于6％或5％的非可报告率。
实施例11：本发明所述的方法作为检测18三体性的直接且有效的NIPT方法的使用(预测实施例)
如以下简要描述的，将实施例10中所述的一个或多个非整倍性-DMR/标记物的组合用作NIPT检测18三体性(T18)的基础。使用有限数量的来自T18妊娠(少见的非整倍性)的样品，使用实施例4或实施例10(或者类似于V10.3的实施例)中所述的方法，除了(例如)使用一个(或两个)18号染色体DMR代替两个21号染色体DMR。例如，可以在该测定中使用表9中所述的两个18号染色体DMR，并且表10中描述了所使用的相应引物和探针序列和标记物/猝灭剂。
如常规技术人员现将理解的，可以进一步优化可以在该测定中使用的NFATC2和/或chr18-gr00094基因/区域的准确区和相应引物/探针的准确位置/序列(如通过使用在如下所示的那些区和序列的上游和/或下游约350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、50bp、20bp、10bp或5bp内的区；优选地其约350bp至200bp或200bp至5bp之间)。此外，除了实施例10中所述的那些外，可以使用其他甲基化敏感的限制性内切酶，例如，来提高未甲基化的cfDNA的消化。这些其他甲基化敏感的限制性内切酶可以包括AciI、Cac8I和/或PhoI。
表9：18号染色体DMR
对甲基化敏感性位点加下划线，并且通过非大写显示已知的SNP的位置
表10：可替代的染色体DMR的引物和探针
*仅所列的核苷酸序列，无染料/猝灭剂
**在“[]”括号中显示了用于每个探针的染料/猝灭剂
考虑到以上内容，将理解本发明还涉及下列项目：
1.用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供采集自所述怀孕雌性动物的样品，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA；
(b)用差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；
(c)通过检测所述样品中位于所述染色体上的两个或更多个第一目标差异甲基化区域(DMR)处甲基化的存在，确定所述样品中作为与染色体非整倍性相关的染色体的第一目标DNA物质的量，所述第一目标DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对所述第一目标DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述第一目标DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中第一目标DNA物质的所述量；
(d)通过检测所述样品中位于所述参考染色体上的两个或更多个参考DMR处的甲基化的存在，确定所述样品中作为一个或多个参考染色体的参考DNA物质的量，所述参考DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对这些参考DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述参考DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中参考DNA物质的量；和
(e)确定根据步骤(c)所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的相对量，优选的比值，其中一个或多个所述相对量表示胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在，
其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测，并且：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR，使用不同的可检测标记物；优选地：
其中在步骤(e)中，将所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中一个或多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明胎儿中存在染色体非整倍性。
2.根据项目1所述的方法，其中两个或更多个所述参考DMR位于不同的参考染色体上。
3.根据项目1或2所述的方法，还包括以下步骤：
(f)通过检测在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间甲基化无差异的至少一个其他区域(OR)确定所述样品中总DNA的量，通过所述试剂修饰该OR对DNA甲基化不敏感，
其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR和所述其他区域进行步骤(c)和步骤(d)和步骤(f)中的所述检测，并且：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR和对于至少一个所述OR，使用不同的可检测标记物；可选地：
(A)其中所述OR位于一个或多个参考染色体上，优选地，至少一个所述OR位于和至少一个所述参考DMR相同的参考染色体上；和/或
(B)其中所述OR位于与至少一个所述参考DMR相同的基因的上游或下游约20bp至20kb之间，和/或位于所述基因内。
4.根据项目3所述的方法，(A)其中步骤(f)中的所述检测包括使用至少两个所述OR；优选地其中，所述OR的数目与步骤(d)中使用的参考DMR的数目相同；更优选地其中，所述OR中的一种位于和步骤(d)中所使用的参考DMR相同的染色体上，如所述参考DMR上游或下游约20bp至约20kb之间，并且所述OR彼此位于和另一个所述参考DMR相同的染色体上，如所述参考DMR上游或下游约20bp至约20kb之间；和
(B)其中：(x)对于每个所述OR，使用相同的可检测标记物实施步骤(f)中的所述检测。
5.根据项目1至4中任一项所述的方法，其中使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同的反应/检测容器中，并且同时互相有效地，并且使用对所述DMR和可选的OR中的每一个特异的至少一个经标记的探针，通过基于探针的多路实时定量PCR实施所述检测步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(f)。
6.根据项目1至5中任一项所述的方法，其中所述来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA物质是循环游离DNA并且所述样品是血液部分，如血浆或血清。
7.根据项目1至6中任一项所述的方法，其中差异修饰甲基化和非甲基化DNA的所述试剂包括：(A)亚硫酸氢盐；或者(B)相对于甲基化DNA选择性消化未甲基化的DNA的试剂，优选地其中，所述试剂包括：
·至少一种甲基化敏感的酶；
·至少一种甲基化敏感的限制性内切酶；和/或
选自由以下各项组成的组的试剂：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AgeI-HF、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、PvuI-HF、RsrII、SacII、SalI、SalI-HF、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TspMI和ZraI。
8.根据项目1至7中任一项所述的方法，其中一个参考DMR位于人5号染色体上而另一个参考DMR位于人12号染色体上；优选地：
其中所述第一目标DMR中的每一个位于人21号染色体上、人18号染色体上或人13号染色体上，优选地位于人21号染色体上；可选地：
(A)其中所述DMR在胎儿DNA中是高甲基化的而在母体DNA中是低甲基化的；和/或
(B)其中所述DMR包含对所述试剂特异的至少一个、优选地至少两个甲基化位点。
9.根据项目1至8中任一项所述的方法，
(A)其中所述第一目标DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·在WO 2011/092592中公开的那些上，包括在选自由以下各项组成的列表的那些上：WO 2011/092592的EP1、EP2、EP3、EP4、EP5、EP6、EP7、EP8、EP9、EP10、EP11和EP12[SEQ IDNO 33-44]；或者
·由以下各项组成的列表：AIRE、SIM2和ERG或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·由以下各项组成的列表：PDE9A、PPP1R2P2、CBR1、DSCAM、C21orf29和HLCS或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·C21orf57或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO：33、34、35、36、37、38、39、176、179、180、184、188、189、190、191、193、195、198、199、200、201、202、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、221、223、225、226、231、232、233、235、239、241、257、258、259和261；或者
(B)其中所述第一目标DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·VAPA-APCDDI或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32；或者
(C)其中所述第一目标DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
10.根据项目1至9中任一项所述的方法，其中所述参考DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·由以下各项组成的列表：RASSF1A、TBX3、ZFY、CDC42EP1、PCDHGA1、SOX14和SPN或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162和163。
11.根据项目1至10中任一项所述的方法，其中(A)所述第一目标DMR中的一种位于DSCAM中并且所述第一目标DMR中的另一个位于C21orf57或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中；和(B)所述参考DMR中的一种位于TBX3中并且所述参考DMR中的另一个位于PCDHGA1或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列中；优选地其中：(i)所述第一目标DMR中的一种包括SEQ ID NO：201并且所述第一目标DMR中的另一个包括SEQ ID NO：219；和(ii)所述参考DMR中的一种包括SEQ ID NO：203并且所述参考DMR中的另一个包括SEQ ID NO：220。
12.根据项目1至11中任一项所述的方法，
(A)其中对步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(f)实施多组确定，其中使用所述样品的不同的DNA等份，在不同的容器中并且有效地同时对于所述多组确定中的每个成员实施每组所述确定；和
(B)其中根据对于步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(f)所实施的所述多组确定，优选地通过使用对每组所确定的DNA的平均量，如对每组所确定的DNA的平均量、中值量或模式量(mode amount)，优选地对每组所确定的DNA的平均量确定在步骤(e)中所确定的相对量或比值。
13.根据项目1至12中任一项所述的方法，
(A)其中根据在第一目标DMR中的一种处所检测的甲基化的量确定第一目标DNA物质的量，并且根据在另一个第一目标DMR处所检测的甲基化的量确定第一目标DNA物质的量；和
(B)其中分别相对于一个或多个所述第一目标DMR，对于第一目标DNA物质的两个或更多个量，在步骤(e)中确定两个或更多个相对量，优选地比值，
(C)其中两个或更多个所述相对量或比值表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在；优选地：
其中在步骤(e)中，将两个或更多个所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中两个或更多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在染色体非整倍性。
14.根据项目1至13中任一项所述的方法，其中在步骤(e)中，将所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中所述相对量或比值中的一个或多个高于或低于所述阈值和/或参考分布表示胎儿中染色体非整倍性的存在；和其中从多个样品确定阈值和/或参考分布，每个样品采集自不同的怀孕雌性动物，如通过对这些样品实践如项目1至12中任一项所述的方法，其中对采集自不同的怀孕雌性动物的多个样品实施所述方法，在单独的容器中且有效地同时对所述多个样品的每个成员进行每种方法；可选地其中对每个样品，对步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(f)进行多组确定，如通过实践如项目12中所述的方法；可选地：
(A)其中在每组逐一进行的基础上分析这些多个样品的两组或更多组，如在单独的轮次、测定或微量滴定板中分析每个组，并通过根据每组样品确定的量或比值的归一化确定阈值和/或参考分布；优选地：
其中通过考虑样品特异的量或比值(如对该样品所进行的确定组的平均值)和对于与所述特异样品相同的组中的所有样品所确定的量或比值的平均值(如中值)之间的差异，进行样品组间的所述归一化；和/或
(B)其中对于这种胎儿，由通过与相对于一个或多个第一目标DMR所确定的量或比值的阈值和/或参考分布相比是离群值的样品特异的量或比值来表示胎儿中染色体非整倍性的存在；优选地：
其中相对于这种胎儿，通过位于以下各项的数值聚类内的样品特异的量或比值来表示胎儿中染色体非整倍性的存在：(a)相对于(假设)为整倍体的多个其他胎儿，位于样品特异的量或比值的聚类之外；和/或(b)相对于表示胎儿具有染色体非整倍性的多个其他样品，位于样品特异的量或比值的聚类内；优选地其中表示胎儿的所述多个其他样品选自由约：2-10、12-15、16-25、26-30、32-40、42-50、52-75、78-100、105-125、130-150、155-175、180-200、205-250、255-300、305-350、355-400、405-450、455-500和大于500个其他这些样品所组成的组。
15.试剂盒，优选地用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中的染色体非整倍性和/或用于检测怀孕雌性动物经受或发展医学病况的升高的风险，所述试剂盒包括：
·引物和/或探针的组合，其中所述组合包含两种或更多种经标记的探针，可选地每种探针具有不同的可检测标记物，每种探针对所述两种或更多种第一目标DMR中的一种的检测、如通过实时定量PCR的检测特异；可选地，所述组合还包括：
(A)：
·两对或更多对PCR引物，每对用于扩增如项目1至14中任一项所述的两种或更多种第一目标DMR中的一种；和/或
·两种或更多种经标记的探针，可选地每种探针具有相同的可检测标记物，每种探针对检测所述两种或更多种参考DMR中的一种特异，如通过实时定量PCR的检测；和/或
·两对或更多对PCR引物，每对用于扩增如项目1至14中任一项所述的两种或更多种参考DMR中的一种；和/或
(B)：
·至少另外一对引物(优选地，另外两对引物)，每对用于扩增如项目3至14中任一项所述的至少一种OR中的一种；和/或
·至少另外一种经标记的探针(优选地，另外两种经标记的探针)，可选地每种探针具有相同的可检测标记物，每种探针对检测所述OR中的至少一种特异，如通过实时定量PCR的检测；和
·可选地，所述试剂盒还包括：
(i)包含指令的印制手册或计算机可读存储器以使用所述引物和探针来实践项目1至14中任一项所述的方法；和/或
(ii)对于实践项目1至14中任一项所述的方法有用的一种或多种其他项目、成分或试剂，其包括用于这种实践或产生的本文所公开的任何这种项目、成分或试剂。
16.计算机程序产品，包括：用多种指令所编码的计算机可读介质，所述指令用于控制计算系统以执行和/或管理用于从采集自所述怀孕雌性动物的样品检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的操作，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA，用差异修饰如项目1至14中任一项所述的甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；所述操作包括以下步骤：
·接收：(i)两种信号，每种信号表示存在于如根据项目1至14中任一项的步骤(c)中的所述样品中的作为与染色体非整倍性有关的染色体的第一目标DNA物质的量；和(ii)一种信号，其表示存在于如根据项目1至14中任一项的步骤(d)中的所述样品中的作为一种或多种参考染色体的参考DNA物质的量。
·与由(ii)中所接收的信号所表示的参考染色体的量相比，基于由(i)中所接收的至少一种信号所表示的与染色体非整倍性有关的染色体的至少一种相对量，确定染色体非整倍性是否存在于所述怀孕雌性动物所携带的胎儿中的分类，其中至少一种表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在；可选地：
(A)其中使用所述样品的相同的DNA等份，并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR产生了表示步骤(c)和步骤(d)中所确定的所述DNA的量的信号；可选地：(x)对于至少两种所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两种所述第一目标DMR使用不同的可检测标记物；和/或
(B)其中通过与阈值和/或参考分布进行比较，所述操作实施了这种分类，其中一个或多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在染色体非整倍性；优选地：
其中相对于所述多个样品，通过接收多个信号(i)和(ii)，所述操作从分别采集自不同的怀孕雌性动物的多种样品计算了所述阈值和/或参考分布；可选地其中通过根据项目1至14中任一项所述的方法在一组或多组样品中分析所述多个样品，并且其中在单独容器中，在给定组中，并且有效地同时通过该组中多个样品的每个成员，对每个样品实施所述方法；和/或
(C)其中所述操作还包括以下步骤：
·接收(iii)其他信号，所述信号表示如项目3中的所述样品中总DNA的量；和
·通过考虑(iii)中所接收的信号以及(i)和/或(ii)中所接收的至少一种信号，确定存在于所述样品中的胎儿DNA的量，如绝对量或相对量；优选地：
其中所述操作还包括以下步骤：
·基于将所存在的所述胎儿DNA的量与阈值和/或参考分布相比，确定怀孕雌性动物是否具有经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险的分类，其中相对于所述阈值和/或参考分布，所述胎儿DNA的量的增加或离群表示所述怀孕雌性动物经受或发展所述妊娠相关医学病况的升高的风险。

Claims (66)

1.用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供采集自所述怀孕雌性动物的样品，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA；
(b)用差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；
(c)通过检测所述样品中位于所述染色体上的两个或更多个第一目标差异甲基化区域(DMR)处甲基化的存在，确定所述样品中作为与染色体非整倍性相关的染色体的第一目标DNA物质的量，所述第一目标DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对所述第一目标DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述第一目标DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中第一目标DNA物质的量；
(d)通过检测所述样品中位于所述参考染色体上的两个或更多个参考DMR处的甲基化的存在，确定所述样品中作为一个或多个参考染色体的参考DNA物质的量，所述参考DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对这些参考DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述参考DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中参考DNA物质的量；和
(e)确定根据步骤(c)所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的相对量，优选比值，其中一个或多个所述相对量表示胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在，
其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR进行步骤(c)和步骤(d)中的所述检测，并且：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR，使用不同的可检测标记物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(e)中，将所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中一个或多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在染色体非整倍性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中两个或更多个所述参考DMR位于不同的参考染色体上。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
(f)通过检测来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间甲基化无差异的至少一个其他区域(OR)确定所述样品中总DNA的量，通过所述试剂修饰该OR对DNA甲基化不敏感，
其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR和所述其他区域进行步骤(c)和步骤(d)和步骤(f)中的所述检测，并且：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR和对于至少一个所述OR，使用不同的可检测标记物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述OR位于一个或多个参考染色体上，优选地，至少一个所述OR位于和至少一个所述参考DMR相同的参考染色体上。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
(c)′通过检测所述样品中位于与所述不同的染色体非整倍性相关的染色体上的两个或更多个第二目标DMR处甲基化的存在，确定所述样品中作为与不同的染色体非整倍性相关的染色体的第二目标DNA物质的量，所述第二目标DMR在来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA和母体来源的DNA之间差异甲基化，通过所述试剂对所述第二目标DMR的DNA的修饰对DNA甲基化敏感，其中在一个或多个所述第二目标DMR处所检测的甲基化DNA的量表示所述样品中所述第二目标DNA物质的量；和
(e)′确定根据步骤(c)′所确定的量和根据步骤(d)所确定的量的相对量，优选比值，其中一个或多个所述相对量表示所述胎儿中不同的染色体非整倍性的存在或不存在，
其中，使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述第二目标DMR和所述参考DMR进行步骤(c)和步骤(c)′和步骤(d)和可选的步骤(f)中的所述检测，并且：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR和对于至少两个所述第二目标DMR和对于可选的OR，使用不同的可检测标记物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中在步骤(e)′中，将所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中一个或多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在不同的染色体非整倍性。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在步骤(c)和/或步骤(d)和/或在可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)中的所述检测之前或者作为其一部分，扩增包含所述DMR和/或所述可选的OR的每个DNA区域。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中在步骤(c)和/或步骤(d)和/或在可选的步骤(c)′和/或可选的步骤(f)中使用的每个可检测标记物独立地选自由以下各项组成的组：荧光、蛋白质、小分子或者放射性标记物。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中步骤(c)和/或可选的步骤(c)′中的所述检测包括使用对所述第一目标DMR中的一种和/或可选的第二目标DMR特异的至少一种经标记的探针的实时定量PCR。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述步骤(d)中的所述检测包括使用分别对所述参考DMR中的一种特异的至少两个经标记的探针的基于探针的多路实时基于探针的定量PCR。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，当从属于权利要求4时，其中步骤(f)中的所述检测包括使用对所述OR中的一种特异的至少一种经标记的探针的实时定量PCR。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，当从属于权利要求4时，其中所述OR位于和至少一个所述参考DMR相同的基因的上游或下游约20bp至20kb之间和/或在所述基因内。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，当从属于权利要求4时，其中步骤(f)中的所述检测包括使用至少两个所述OR；优选地其中，所述OR的数目与步骤(d)中使用的参考DMR的数目相同；更优选地其中，所述OR中的一种位于和步骤(d)中所使用的参考DMR相同的染色体上，如所述参考DMR上游或下游约20bp至约20kb之间，并且所述OR彼此位于和另一个所述参考DMR相同的染色体上，如所述参考DMR上游或下游约20bp至约20kb之间。
15.根据权利要求14所述的方法，其中：(x)对每个所述OR使用相同的可检测标记物实施步骤(f)中的所述检测。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中步骤(f)中的所述检测包括使用分别对所述OR中的一种特异的至少两个经标记的探针的基于探针的多路实时定量PCR。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同的反应/检测容器中，并且同时互相有效地，并且使用对所述DMR和可选的OR中的每一个特异的至少一个经标记的探针，通过基于探针的多路实时定量PCR实施所述检测步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述样品是选自由以下各项组成的组的生物流体样品：全血、血液部分、尿、唾液、汗、泪、痰、乳汁、乳腺吸出物、阴道分泌物、阴道洗液和结肠洗液；更优选地其中，所述样品为血浆或血清样品。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA物质是循环游离DNA并且所述样品是血液部分，如血浆或血清。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中差异修饰甲基化和非甲基化DNA的所述试剂包括亚硫酸氢盐。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中差异修饰甲基化和非甲基化DNA的所述试剂包括相对于甲基化DNA选择性消化未甲基化的DNA的试剂，优选地其中，所述试剂包括：
·至少一种甲基化敏感的酶；
·至少一种甲基化敏感的限制性内切酶；和/或
选自由以下各项组成的组的试剂：AatII、AciI、AclI、AfeI、AgeI、AgeI-HF、AscI、AsiSI、AvaI、BceAI、BmgBI、BsaAI、BsaHI、BsiEI、BsiWI、BsmBI、BspDI、BsrFI、BssHII、BstBI、BstUI、ClaI、EagI、FauI、FseI、FspI、HaeII、HgaI、HhaI、HinP1I、HpaII、Hpy99I、HpyCH4IV、KasI、MluI、NaeI、NarI、NgoMIV、NotI、NotI-HF、NruI、Nt.BsmAI、Nt.CviPII、PaeR7I、PluTI、PmlI、PvuI、PvuI-HF、RsrII、SacII、SalI、SalI-HF、SfoI、SgrAI、SmaI、SnaBI、TspMI和ZraI。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中与染色体非整倍性有关的所述染色体为选自由以下各项组成的组的人染色体：21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体，优选是21号染色体、18号染色体、13号染色体，最优选是21号染色体；其中所述染色体非整倍性为所述染色体的非整倍性，优选是所述染色体的三体性。
23.根据权利要求22所述的方法，当从属于权利要求6时，其中与不同的染色体非整倍性有关的所述染色体为选自由以下各项组成的组的不同的人染色体：21号染色体、18号染色体、13号染色体、X染色体和Y染色体，优选是18号染色体或13号染色体，最优选是18号染色体；其中所述不同的染色体非整倍性为所述不同的染色体的非整倍性，优选是所述不同的染色体的三体性。
24.根据权利要求23所述的方法，其中与染色体非整倍性有关的所述染色体和与不同的染色体非整倍性有关的所述不同的染色体为选自由以下各项组成的组的一对人染色体：21号染色体和18号染色体、21号染色体和13号染色体、18号染色体和13号染色体；其中所述染色体非整倍性和所述不同的染色体非整倍性为各个染色体的非整倍性，优选是各个染色体的三体性。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中每个参考染色体为独立地选自由以下各项组成的组的列表的人染色体：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12号染色体、14、15、16、17号染色体、19号染色体、20号染色体、22号染色体和人23号染色体，优选是5号染色体或12号染色体。
26.根据权利要求25所述的方法，其中一个参考DMR位于人5号染色体上而另一个参考DMR位于人12号染色体上。
27.根据权利要求26所述的方法，其中每个所述第一目标DMR位于人21号染色体上、人18号染色体上或人13号染色体上，优选地人21号染色体上；并且可选地，如果存在，每个所述第二目标DMR位于人18号染色体上或人13号染色体上。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述DMR在胎儿DNA中是高甲基化的而在母体DNA中是低甲基化的。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述DMR包含至少一个、优选地至少两个对所述试剂特异的甲基化位点。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·在WO 2011/092592中公开的那些，包括选自由以下各项组成的列表的那些：WO2011/092592的EP1、EP2、EP3、EP4、EP5、EP6、EP7、EP8、EP9、EP10、EP11和EP12[SEQ ID NO33-44]；或者
·由以下各项组成的列表：AIRE、SIM2和ERG或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·由以下各项组成的列表：PDE9A、PPP1R2P2、CBR1、DSCAM、C21orf29和HLCS或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·C21orf57或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO 33、34、35、36、37、38、39、176、179、180、184、188、189、190、191、193、195、198、199、200、201、202、203、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、221、223、225、226、231、232、233、235、239、241、257、258、259和261。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·VAPA-APCDDI或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO：21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述第一目标DMR和/或所述可选的第二目标DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述参考DMR分别位于独立地选自以下各项的区域和/或基因中：
·由以下各项组成的列表：RASSF1A、TBX3、ZFY、CDC42EP1、PCDHGA1、SOX14和SPN或者来自该区域和/或基因的上游和/或下游不超过10kbp、5kbp、1kbp、500bp、250bp、150bp、100bp或50bp的DNA序列；或者
·由以下各项组成的列表：WO 2011/034631的SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59和90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162和163。
34.根据权利要求1至33中任一项所述的方法，其中对步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)进行多组确定，其中使用所述样品的不同的DNA等份，在不同的容器中，并且同时有效地通过所述多组确定的相互成员进行每组所述确定。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述多组确定在2至约50组之间，如2至约20组之间，2至约10组之间或者约5至约15组之间；优选地其中所述多组确定选自由以下各项组成的组：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12组所述确定。
36.根据权利要求34或35所述的方法，其中，根据对步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)所做出的所述多组确定，确定在步骤(e)和可选的步骤(e)′中确定的相对量或比值，优选地通过使用对每组所确定的DNA的平均量，如对每组所确定的DNA的平均量、中值量或模式量，优选对每组所确定的DNA的平均量。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中对分别采集自不同的怀孕雌性动物的多个样品实施所述方法，并且在单独的容器中并且有效地同时对于所述多个样品的每个成员实施所述方法。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述多个样品是2至约500个样品之间，如2至约200个样品之间，2至约100个样品之间或约5至约150个样品之间；优选地其中所述多个样品选自由以下各项组成的组：分别采集自不同的怀孕雌性动物的约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120和140个样品。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，当从属于权利要求4时，其中在每个所述确定步骤中，在所有情况下，将所述第一目标DNA物质和所述可选的第二目标DNA物质的所述确定的量中的每一个表示为所述第一目标DNA物质和所述可选的第二目标DNA物质对于所述样品中的总DNA的相对浓度。
40.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，还包括以下步骤：
·相对于与步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)中所使用的相同的DMR，确定已知量的DNA标准样品中DNA的量；和
·将从所述DNA标准样品所检测的每个信号与在步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)中所检测的各个信号相比较。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述DNA标准样品是具有已知浓度的人基因组DNA样品。
42.根据权利要求40或41所述的方法，其中在每个所述确定步骤中，将所述第一目标DNA物质和所述可选的第二目标DNA物质和参考DNA物质的所述确定的量中的每一个表示为所述样品中所述DNA物质的绝对量。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的方法，其中根据在所述第一目标DMR中的一种处所检测的甲基化的量确定所述第一目标DNA物质的量，和根据在另一个所述第一目标DMR处所检测的甲基化的量确定所述第一目标DNA物质的量。
44.根据权利要求43所述的方法，其中分别相对于一个或多个所述第一目标DMR，对于第一目标DNA物质的两个或更多个量，在步骤(e)中确定两个或更多个相对量，优选比值。
45.根据权利要求44所述的方法，其中两个或更多个所述相对量或比值表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在。
46.根据权利要求45所述的方法，当从属于权利要求2时，其中在步骤(e)中，将两个或更多个所述相对量或比值与阈值和/或参考分布相比较，其中两个或更多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在染色体非整倍性。
47.根据权利要求1至46中任一项所述的方法，当从属于权利要求2时，其中从多个样品确定阈值和/或参考分布，每个样品采集自不同的怀孕雌性动物，如通过对这些样品实践权利要求37至38中所列出的方法；可选地，其中如通过实践根据权利要求34至36中任一项所列出的方法，对每种样品，对步骤(c)和步骤(d)和可选的步骤(c)′和可选的步骤(f)进行多组确定。
48.根据权利要求47所述的方法，其中在每组逐一进行的基础上分析这些多个样品的两组或更多组，如在单独的轮次、测定或微量滴定板中分析每个组，并通过根据每组样品确定的量或比值的归一化确定阈值和/或参考分布。
49.根据权利要求48所述的方法，其中通过考虑样品特异的量或比值(如对该样品所进行的确定组的平均值)和对于与所述特定样品相同的组中的所有样品所确定的量或比值的平均值(如中值)之间的差异，进行样品组间的所述归一化。
50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中对于这种胎儿，由通过与相对于一个或多个第一目标DMR所确定的量或比值的阈值和/或参考分布相比为离群值的样品特异的量或比值来表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在。
51.根据权利要求50所述的方法，其中相对于这种胎儿，通过位于下列中的数值聚类内的样品特异的量或比值来表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在：(a)相对于(假设)为整倍体的多个其他胎儿，位于样品特异的量或比值的聚类之外；和/或(b)相对于表示胎儿具有染色体非整倍性的多个其他样品，位于样品特异的量或比值的聚类内；优选地其中表示胎儿的所述多个其他样品选自由约：2-10、12-15、16-25、26-30、32-40、42-50、52-75、78-100、105-125、130-150、155-175、180-200、205-250、255-300、305-350、355-400、405-450、455-500和大于500个其他这些样品所组成的组。
52.根据权利要求1至51中任一项所述的方法，其中在步骤(b)之前，处理采集自所述怀孕雌性动物的所述样品以提取存在于所述样品中的DNA。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述过程提取了所述样品的总游离DNA，或者其中所述过程提取和/或富集了胎儿游离DNA。
54.用于检测怀孕雌性动物经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)当从属于权利要求4时，实施根据权利要求1至53中任一项所述的方法；
(ii)确定存在于所述样品中的胎儿DNA的至少一个量，如绝对量或相对量；和
(iii)将所述确定的胎儿DNA的量与阈值和/或参考分布相比较，
其中所述胎儿DNA的量相对于所述阈值和/或参考分布的增加或离群表示所述怀孕雌性动物经受或发展所述妊娠相关医学病况的升高的风险。
55.一种组合物，其包含：
·如权利要求10中所列出的两种或更多种经标记的探针，每种探针用于检测所述两种或更多种第一目标DMR中的一种。
56.根据权利要求55所述的组合物，还包括：
·两对或更多对PCR引物，每对用于扩增如权利要求1至53中任一项所列出的两种或更多种第一目标DMR中的一种；和/或
·如权利要求11中所列出的两种或更多种经标记的探针，每种探针用于检测所述两种或更多种参考DMR中的一种；和/或
·两对或更多对PCR引物，每对用于扩增如权利要求1至53中任一项所列出的两种或更多种参考DMR中的一种。
57.根据权利要求55或56所述的组合物，还包括：
·至少另外一对引物(优选地，另外两对引物)，每对用于扩增如权利要求4至53中任一项所列出的至少一种OR中的一种；和/或
·如权利要求12中所列出的至少一种其他经标记的探针(优选地，两种其他经标记的探针)，每种探针用于检测所述OR中的至少一种。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的组合物，还包括：
·如权利要求10中所列出的两种或更多种其他经标记的探针，每种探针用于检测所述两种或更多种第二目标DMR中的一种；和/或
·两对或更多对其他PCR引物，每对用于扩增如权利要求6至53中任一项所列出的两种或更多种第二目标DMR中的一种。
59.一种试剂盒，优选地用于检测怀孕雌性动物所携带的胎儿中的染色体非整倍性和/或用于检测怀孕雌性动物经受或发展医学病况的升高的风险，所述试剂盒包括：
·引物和/或探针的组合，其中所述组合是如在根据权利要求55至58中的任一项中所列出的；和
·可选地，还包括：
(i)包含指令的印制手册或计算机可读存储器以使用所述引物和探针来实践根据权利要求1至53中任一项所述的方法和/或以生产或使用根据权利要求55至58中任一项所述的组合物；和/或
(ii)对于实践根据权利要求1至53中任一项所述的方法和/或生产或使用根据权利要求55至58中任一项所述的组合物有用的一种或多种其他权利要求、成分或试剂，其包括用于这种实践或产生的本文所公开的任何这种权利要求、成分或试剂。
60.根据权利要求59所述的试剂盒，还包括以下组分中的一种或多种：
·采集或存储采集自所述怀孕雌性动物的组织样品，如血液的方式，优选地，其中所述方式是血液采集管；和/或
·从采集自所述怀孕雌性动物的样品提取DNA，优选地游离DNA的方式，优选地其中所述方式是游离DNA提取试剂盒；和/或
·包含指令的印制手册或计算机可读存储器，从而在根据权利要求1至53中任一项所述的方法的背景中识别、获得和/或使用所述方式中的一种或两者。
61.一种计算机程序产品，其包括：用多种指令所编码的计算机可读介质，所述指令用于控制计算系统以执行和/或管理用于从采集自怀孕雌性动物的样品检测所述怀孕雌性动物所携带的胎儿中染色体非整倍性的操作，所述样品包含与母体来源的差异甲基化DNA混合的来源于胎儿和/或胎儿胎盘的细胞的DNA，用如根据权利要求1至53中任一项所列出的差异修饰甲基化和非甲基化DNA的试剂处理存在于所述样品中的DNA；所述操作包括以下步骤：
·接收：(i)两种信号，每种信号表示如根据权利要求1至53中任一项的步骤(c)中所列出的存在于所述样品中的作为与染色体非整倍性有关的染色体的第一目标DNA物质的量；和(ii)一种信号，其表示如根据权利要求1至53中任一项的步骤(d)中所列出的存在于所述样品中的作为一种或多种参考染色体的参考DNA物质的量；
·与由(ii)中所接收的信号所表示的参考染色体的量相比，基于由(i)中所接收的至少一种信号所表示的与染色体非整倍性有关的染色体的至少一种相对量，确定染色体非整倍性是否存在于所述怀孕雌性动物所携带的胎儿中的分类，其中至少一种表示所述胎儿中染色体非整倍性的存在或不存在。
62.根据权利要求61所述的计算机程序产品，其中使用所述样品的相同的DNA等份并且在相同容器中，并且有效地同时对于所述第一目标DMR和所述参考DMR来产生表示在步骤(c)和步骤(d)中确定的所述DNA的量的信号；可选地：(x)对于至少两个所述参考DMR使用相同的可检测标记物；和(y)对于至少两个所述第一目标DMR使用不同的可检测标记物。
63.根据权利要求61或62所述的计算机程序产品，其中通过与阈值和/或参考分布进行比较，所述操作实施了这种分类，其中一个或多个所述相对量或比值高于或低于所述阈值和/或参考分布表明所述胎儿中存在染色体非整倍性。
64.根据权利要求63所述的计算机程序产品，其中相对于所述多个样品，通过接收多个信号(i)和(ii)，所述操作从分别采集自不同的怀孕雌性动物的多个样品计算了所述阈值和/或参考分布；可选地其中通过根据权利要求1-53中任一项所述的方法在一组或多组样品中分析所述多个样品，并且其中在单独容器中，在给定组中，并且有效地同时通过该组中多个样品的每个成员，对每个样品实施所述方法。
65.根据权利要求61至64中任一项所述的计算机程序产品，其中所述操作还包括以下步骤：
·接收(iii)表示如权利要求4中所列出的所述样品中总DNA的量的其他信号；和
·通过考虑(iii)中所接收的信号以及(i)和/或(ii)中所接收的至少一种信号，确定存在于所述样品中的胎儿DNA的量，如绝对量或相对量。
66.根据权利要求65所述的计算机程序产品，其中所述操作还包括以下步骤：
·基于将所存在的所述胎儿DNA的量与阈值和/或参考分布相比，确定所述怀孕雌性动物是否具有经受或发展妊娠相关医学病况的升高的风险的分类，其中相对于所述阈值和/或参考分布，所述胎儿DNA的量的增加或离群表示所述怀孕雌性动物经受或发展所述妊娠相关医学病况的升高的风险。
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