CN111979309A - 用于三体综合征检测的组合套装 - Google Patents

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CN111979309A CN201910422607.1A CN201910422607A CN111979309A CN 111979309 A CN111979309 A CN 111979309A CN 201910422607 A CN201910422607 A CN 201910422607A CN 111979309 A CN111979309 A CN 111979309A
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Abstract

本发明提供了一种用于检测三体综合征的组合套装，所述套装包含用于检测目标基因、参照基因及其片段至少一个区域内甲基化或去甲基化状态和数量的核酸。其中，所述目标基因包括：HLCS或DSCR8基因及其片段、SERPINB5或NFATC1基因及其片段、FLT1、SUGT1L1或COL4A1基因及其片段；所述参照基因包括：RUNX3基因及其片段或PPT2基因及其片段。本发明所述组合套装实现了无创的、快速准确的产前21‑、18‑、13‑三体综合征的检查。

Description

用于三体综合征检测的组合套装
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种用于三体综合征检测的组合套装，具体涉及一种体外检测21-、18-、13-三体综合征的组合套装。
背景技术
染色体三体综合征(简称“三体综合征”)是染色体异常导致的一类疾病，主要包括：21-三体综合征(Down综合征)、18-三体综合征(Edwards综合征)、和13-三体综合征(Patau综合征)。三体综合征是高龄孕妇胎儿的常见染色体疾病；其主要特征有外貌异常、发育迟缓、智能障碍、多发畸形等。三体综合征严重影响胎儿出生前的正常发育和出生后的生存、健康成长。由于三体综合征目前尚无有效治疗方法，生产前终止妊娠是怀有三体综合征患儿的孕妇的主要选择。因此，怀孕早期的三体综合征筛查和诊断是产前诊断的重要组成部分。
目前三体综合征的筛查是结合孕妇血清绒毛膜促性腺激素(HCG)、甲胎蛋白(AFP)、游离雌三醇(FE3)的检测和超声检测，并根据孕妇年龄和体重来推算怀有综合征患儿的风险率；进一步根据风险率的高低进行确诊检查。三体综合征的确诊方法为羊水细胞染色体核型分析。三体综合征血清学检查方法的检测准确性低。低检测准确性会导致患有三体综合征胎儿的漏检，错过生产前终止妊娠的最佳阶段。另一方面，低检测准确性还会产生正常胎儿假阳性检测结果，导致后续不必要的羊水细胞检查。由于羊水细胞的采集需要穿刺操作，而穿刺操作所带来的流产风险是难以避免的。因此，提高羊水细胞染色体核型分析前的三体综合征微创筛查的准确性对于提高三体综合征筛查的有效性具有重要临床价值和意义。
“液体活检”概念的提出是体外诊断技术的重大里程碑。“液体活检”在三体综合征检测的应用是“液体活检”对临床检测领域的一项重要贡献。三体综合征“液体活检”的原理是：在怀孕过程中，孕妇体内胎儿的胎盘组织释放的胎源DNA进入孕妇外周血中；通过检测和分析孕妇外周血中的游离DNA，可以检测到胎儿基因组DNA，从而可以应用于检测胎儿染色体异常。孕妇外周血游离DNA中的主要部分来源于孕妇外周血白细胞基因组DNA，胎源DNA在孕妇外周血游离DNA中所占比例很低。因此，在大量孕妇正常外周血白细胞基因组DNA的背景下，由胎儿三体综合征导致的21、18、13号染色体DNA含量的变化被稀释和掩盖。以21号染色体三体综合征为例：21-三体综合征胎儿的基因组DNA中，21号染色体DNA拷贝数是其他正常染色体的1.5倍；然而在孕妇外周血游离DNA中，由于孕妇外周血白细胞基因组DNA的稀释(假设胎源DNA占孕妇外周血游离DNA的10％)，孕妇外周血游离DNA中21号染色体DNA拷贝数只有其他正常染色体的1.05倍。在这种情况下，三体综合征的“液体活检”对检测技术的灵敏性和准确性提出了极大挑战。
为解决这一技术问题，近二十年间基于不同技术路线的三体综合征产前无创检测技术(NIPT)不断出现。在所有技术路线中，基于二代测序技术(NGS)的NIPT逐步发展成为一种广泛应用的产前检测项目。这一技术路线是基于NGS高通量的技术特性，通过对与三体综合征相关的21、18、13号染色体和其他正常参照染色体上大量位点的检测和复杂的分析算法来判断21、18、13号染色体非整倍体异常。
基于NGS的NIPT具有高度准确性，但检测成本高、检测周期长、操作复杂是这一技术固有的缺陷。基于NGS的NIPT技术之外，近年来还出现了基于不同生物学原理开发的三体综合征NIPT技术，例如：1)利用21、18、13号染色体上的SNP开发的三体综合征NIPT技术；2)利用21、18、13号染色体上胎盘组织特异表达的mRNA开发的三体综合征NIPT技术；3)利用21、18、13号染色体上胎盘组织特异性甲基化或去甲基化位点的检测。
然而由于各种限制因素，这些技术路线目前尚未能够实现21-、18-、13-三体综合征的准确检测和广泛应用，例如：
1)21、18、13号染色体上SNP的检测需要对大量SNP的检测才有可能实现全部人群的覆盖；
2)21、18、13号染色体上胎盘组织特异表达的mRNA的检测缺乏适当的目标基因，且mRNA的稳定性差，不便于临床应用；
3)21、18、13号染色体上胎盘组织特异性甲基化或去甲基化位点的检测缺乏可靠的目标位点。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供一种用于检测三体综合症的组合套装，本发明通过组合套装可以对胎儿胎盘组织DNA和正常、未怀孕的育龄女性外周血白细胞(WBC)基因组DNA的甲基化谱差异分析，并对位于21、18、13号染色体上胎盘组织特异性的DNA甲基化或去甲基化位点进行检测，并进行相同数量计算统计，进而计算染色体数量，从而实现三体综合征筛查。
本发明用于检测三体综合症的组合套装是基于胎儿胎盘组织基因组DNA和正常、未怀孕的育龄妇女外周血白细胞基因组DNA中存在甲基化、去甲基化修饰显著差异的序列(SEQ ID NO：1-9)，包括：位于21号染色体的HLCS和DSCR8基因、位于18号染色体的SERPINB5和NFATC1基因、位于13号染色体的FLT1、SUGT1L1和COL4A1基因的目标基因序列、以及未发生染色体异常的正常染色体的位于1号染色体的RUNX3基因、位于6号染色体的PPT2基因的参照基因序列。
在胎儿胎盘组织中，位于21号染色体的HLCS和DSCR8基因、位于18号染色体的SERPINB5和NFATC1基因、位于13号染色体的FLT1、SUGT1L1和COL4A1基因、位于1号染色体的RUNX3基因、位于6号染色体的PPT2基因，发生去甲基化(demethylation)，而孕龄妇女的外周血白细胞中，位于21号染色体的HLCS和DSCR8基因、位于18号染色体的SERPINB5和NFATC1基因、位于13号染色体的FLT1、SUGT1L1和COL4A1基因、位于1号染色体的RUNX3基因、位于6号染色体的PPT2基因发生甲基化(methylation)。
人体外周血游离DNA的主要部分来源于人体外周血白细胞所释放的基因组DNA；孕妇外周血游离DNA中来源于胎儿胎盘组织基因组DNA的比例很低。通过检测胎盘组织基因组DNA与外周血白细胞基因组DNA中存在显著甲基化或去甲基化修饰差异的基因及其片段，可以有效避免孕妇外周血白细胞基因组DNA对检测胎盘组织基因组DNA的干扰。
通过利用数字PCR检测、分析胎盘组织基因组DNA与外周血白细胞基因组DNA中存在显著甲基化或去甲基化修饰差异的目标基因、参照基因及其片段，能方便、准确地实现胎源目标基因、参照基因及其片段的定量检测。通过计算胎源目标基因和参照基因数量的比值，可以快速、便捷地判断样本是否呈阳性，即：胎儿是否患有21-、18-、或13-三体综合征。
本发明用于筛查三体综合症的组合套装，其包含具有检测：
去甲基化的目标基因：21号染色体上的HLCS基因或其片段、21号染色体上的DSCR8基因或其片段、18号染色体上的SERPINB5或其片段、18号染色体上的NFATC1或其片段、13号染色体上的FLT1基因或其片段、13号染色体上的SUGT1L1基因或其片段、13号染色体上的COL4A1基因或其片段，或它们中的两种或两种以上基因或基因片段的组合中的去甲基化DNA片段数量；
和，
去甲基化的参照基因：1号染色体上的RUNX3基因或其片段、6号染色体上的PPT2基因或其片段，或1号染色体上的RUNX3基因或其片段和6号染色体上的PPT2基因及其片段中的去甲基化DNA片段数量的
检测单元。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元，包括但不限于采用数字PCR、实时荧光定量PCR、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化基因芯片、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)。
作为本发明实施方案之一，检测单元优选数字PCR。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元中的目标基因和参照基因为含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的选自SEQ ID NO：1-27的序列：
SEQ ID NO：1为HLCS基因的目标序列；
SEQ ID NO：2为DSCR8基因的目标序列；
SEQ ID NO：3为SERPINB5基因的目标序列；
SEQ ID NO：4为NFATC1基因的目标序列；
SEQ ID NO：5为FLT1基因的目标序列；
SEQ ID NO：6为SUGT1L1基因的目标序列；
SEQ ID NO：7为COL4A1基因的目标序列；
SEQ ID NO：8为RUNX3基因的目标序列；
SEQ ID NO：9为PPT2基因的目标序列。
SEQ ID NO：10为去甲基化的HLCS基因转化的序列；
SEQ ID NO：11为去甲基化DSCR8基因转化的序列；
SEQ ID NO：12为去甲基化SERPINB5基因转化的序列；
SEQ ID NO：13为去甲基化NFATC1基因转化的序列；
SEQ ID NO：14为去甲基化FLT1基因转化的序列；
SEQ ID NO：15为去甲基化SUGT1L1基因转化的序列；
SEQ ID NO：16为去甲基化COL4A1基因转化的序列；
SEQ ID NO：17为去甲基化RUNX3基因转化的序列；
SEQ ID NO：18为去甲基化PPT2基因转化的序列。
SEQ ID NO：19为去甲基化HLCS基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：20为去甲基化DSCR8基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：21为去甲基化SERPINB5基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：22为去甲基化NFATC1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：23为去甲基化FLT1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：24为去甲基化SUGT1L1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：25去甲基化COL4A1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：26为去甲基化RUNX3基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：27为去甲基化PPT2基因互补序列转化后的序列。
作为本发明实施方案之一，所述目标基因序列为选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25序列，或它们中的两种或两种以上组合物，其中所述
SEQ ID NO：1为HLCS基因的目标序列；
SEQ ID NO：2为DSCR8基因的目标序列；
SEQ ID NO：3为SERPINB5基因的目标序列；
SEQ ID NO：4为NFATC1基因的目标序列；
SEQ ID NO：5为FLT1基因的目标序列；
SEQ ID NO：6为SUGT1L1基因的目标序列；
SEQ ID NO：7为COL4A1基因的目标序列；
SEQ ID NO：10为去甲基化的HLCS基因转化的序列；
SEQ ID NO：11为去甲基化DSCR8基因转化的序列；
SEQ ID NO：12为去甲基化SERPINB5基因转化的序列；
SEQ ID NO：13为去甲基化NFATC1基因转化的序列；
SEQ ID NO：14为去甲基化FLT1基因转化的序列；
SEQ ID NO：15为去甲基化SUGT1L1基因转化的序列；
SEQ ID NO：16为去甲基化COL4A1基因转化的序列；
SEQ ID NO：19为去甲基化HLCS基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：20为去甲基化DSCR8基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：21为去甲基化SERPINB5基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：22为去甲基化NFATC1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：23为去甲基化FLT1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：24为去甲基化SUGT1L1基因互补序列转化后的序列；或
SEQ ID NO：25为去甲基化COL4A1基因互补序列转化后的序列。
作为本发明实施方案之一，所述参照基因序列选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQID NO：26，或SEQ ID NO：27序列，或它们中两种或两种以上的组合；其中所述
SEQ ID NO：8为RUNX3基因的目标序列；
SEQ ID NO：9为PPT2基因的目标序列；
SEQ ID NO：17为去甲基化RUNX3基因转化的序列；
SEQ ID NO：18为去甲基化PPT2基因转化的序列；
SEQ ID NO：26为去甲基化RUNX3基因互补序列转化后的序列；或
SEQ ID NO：27为去甲基化PPT2基因互补序列转化后的序列。
本发明方法中本领域技术人员可以对SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21，SEQID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27序列SEQ ID NO：1-27中的进行简单替换或减少核苷酸长度，在不影响实现本发明目的的情况下，都属于本发明的范围内。
作为本发明实施方案之一，所述目标基因选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ IDNO：24，或SEQ ID NO：25序列SEQ ID NO：1-27的序列中至少9个、优选至少15个核苷酸长度的核酸。
作为本发明实施方案之一，所述参照基因序列选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQID NO：26，或SEQ ID NO：27序列中至少9个、优选至少15个核苷酸长度的核酸序列。
作为本发明实施方案之一，所述核目标基因或参照基因的核苷酸序列中包含至少一个CpG二核苷酸序列。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元进一步包括引物，所述目标基因的引物为：
HLCS引物F:SEQ ID NO：28，HLCS引物R:SEQ ID NO：29；
DSCR引物F:SEQ ID NO：31，DSCR引物R:SEQ ID NO：32；
SERPINB5引物F:SEQ ID NO：34，SERPINB5引物R:SEQ ID NO：35；
NFATC1引物F:SEQ ID NO：37，NFATC1引物R:SEQ ID NO：38；
FLT1引物F:SEQ ID NO：40，FLT1引物R:SEQ ID NO：41；
SUGT1L1引物F:SEQ ID NO：43，SUGT1L1引物R:SEQ ID NO：44；或
COL4A1引物F:SEQ ID NO：46，COL4A1引物R:SEQ ID NO：47；或它们中两对或两对以上组合物；
和
参照基因的引物
RUNX3引物F:SEQ ID NO：49，RUNX3引物R:SEQ ID NO：50；或
PPT2引物F:SEQ ID NO：52，PPT2引物R:SEQ ID NO：53，或它们两对的组合。
作为实施方案之一，所述检测单元优选进一步包括引物：
HLCS引物F:SEQ ID NO：28，HLCS引物R:SEQ ID NO：29；
DSCR引物F:SEQ ID NO：31，DSCR引物R:SEQ ID NO：32；
SERPINB5引物F:SEQ ID NO：34，SERPINB5引物R:SEQ ID NO：35；
NFATC1引物F:SEQ ID NO：37，NFATC1引物R:SEQ ID NO：38；
FLT1引物F:SEQ ID NO：40，FLT1引物R:SEQ ID NO：41；
SUGT1L1引物F:SEQ ID NO：43，SUGT1L1引物R:SEQ ID NO：44；和
COL4A1引物F:SEQ ID NO：46，COL4A1引物R:SEQ ID NO：47；和
RUNX3引物F:SEQ ID NO：49，RUNX3引物R:SEQ ID NO：50；和PPT2引物F:SEQ IDNO：52，PPT2引物R:SEQ ID NO：53。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元还包括探针，所述探针为：
HLCS探针:SEQ ID NO：30；
DSCR探针:SEQ ID NO：33；
SERPINB5探针:SEQ ID NO：36；
NFATC1探针:SEQ ID NO：39；
FLT1探针:SEQ ID NO：42；
SUGT1L1探针:SEQ ID NO：45；或
COL4A1探针:SEQ ID NO：48，或它们中两种或两种以上的组合物；和
RUNX3探针:SEQ ID NO：51；或
PPT2探针:SEQ ID NO：54，或其两种的组合。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元进一步包括探针：
HLCS探针:SEQ ID NO：30；
DSCR探针:SEQ ID NO：33，
SERPINB5探针:SEQ ID NO：36；
NFATC1探针:SEQ ID NO：39；
FLT1探针:SEQ ID NO：42；
SUGT1L1探针:SEQ ID NO：45；和
COL4A1探针:SEQ ID NO：48，和，
RUNX3探针:SEQ ID NO：51；和
PPT2探针:SEQ ID NO：54。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元包括：400-900nM引物、250-400nM探针、0.1-1U Taq聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1-10mM的镁离子和1×PCR缓冲液。
PCR反应条件为：在85至99℃持续10-60分钟；紧接着进行40-50个循环的1)在50至72℃退火和延伸10至90秒，和2)在85至90℃下变性10至90秒。
作为本发明实施方案之一，所述组合套装可选择地还包括提取单元，所述提取单元提取、分离患者离体样品中的，
21号染色体上的HLCS基因或其片段、21号染色体上的DSCR8基因或其片段、18号染色体上的SERPINB5或其片段、18号染色体上的NFATC1或其片段、13号染色体上的FLT1基因或其片段、13号染色体上的SUGT1L1基因或其片段、13号染色体上的COL4A1基因或其片段，或它们中的两种或两种以上基因或基因片段的组合；
和
1号染色体上的RUNX3基因或其片段、6号染色体上的PPT2基因或其片段，或1号染色体上的RUNX3基因或其片段和6号染色体上的PPT2基因或其片段的组合。
作为实施方案之一，本发明所述提取单元包括：1)裂解/结合液：促进游离DNA从与其结合的蛋白脱离出来，并与吸附用固相(如：磁珠)的表面结合，包含：6M盐酸胍，10mMTris-HCl，1mM EDTA、1：3异丙醇，0.1％SDS，0.5％Triton-100，0.5％β-巯基乙醇，0.8M氯化钠，0.2M柠檬酸钠，pH＝6；2)磁珠：直径约1uM、含磁量>95％、表面积16-22M2/mg；3)洗液：冲洗吸附用固相，去除游离DNA外的其他生物大分子和盐，包含：0.8M LiCl，50mM MOPS，0.1M氯化钠，60％乙醇，pH＝7.0；4)洗脱液：促进游离DNA脱离吸附用固相的表面结合，从而实现游离DNA的回收，包含：0.5mM EDTA，10mM Tris-HCl，pH＝8.0。
作为实施方案之一，本发明所述组合套装适用的样品类型包括但不限于患者的血浆、血清、全血、羊水或羊水细胞；优选血浆。
作为本发明实施方案之一，所述组合套装可选择还包括转化单元，所述转化单元可以将所述目标基因或其片段，参照基因或其片段中的基因的未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基。由于5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶有相同的碱基配对行为，因此5-甲基胞嘧啶不能通过基于DNA杂交的方法来鉴定。最常用于分析DNA中5-甲基胞嘧啶存在的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特异生物化学反应，在随后的碱性水解中，胞嘧啶被转变为在配对行为上对应胸腺嘧啶的尿嘧啶。非常重要的是，在这些条件下5-甲基胞嘧啶保持不被修饰。
因此，原始的DNA经此方式被转变后，其原来在其杂交行为上不能区分开的甲基胞嘧啶和无甲基化胞嘧啶现在变为杂交行为上存在差异的胞嘧啶和尿嘧啶，从而可以被常规的分子生物学技术检测到，例如通过扩增和杂交。
典型地，本申请提供了亚硫酸氢盐技术与一种或多种甲基化或去甲基化测定的联合使用，用于确定目标基因、参照基因及其片段序列内的CpG二核苷酸序列的甲基化或去甲基化状态。
作为本发明实施方案之一，所述转化单元中的转化剂包括但不限于亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐(disulfite)、或其组合，优选包括亚硫酸氢盐。
作为本发明实施方案之一，所述转化单元在进行转化的温度包括但不限于50℃-70℃，作为示例性的说明，例如可以为50℃、55℃、60℃、65℃、或70℃。
作为本发明实施方案之一，所述检测单元进一步包括计算目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值，并将,
当目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值时≥1.3时定义为阳性，即为三体综合征；
当目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值≤1.2定义为阴性，即为正常；或
当目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值介于1.2和1.3之间定义为无效检测。
本发明中，位于21号染色体的HLCS基因的目标序列：
SEQ ID NO：1：
cgcccacgctgcctgggaggcgcgcttctgccgccttcttgccgcgctcgctctagcctcgcccactcctgcggccttacagggccgaacctcaccctgccctgcggaaggcaggcctacaccttccctccgcgccttcctccctgaccggcaccaaacaccacgttgccctttccagcatcgacg
位于21号染色体的DSCR8基因的目标序列：
SEQ ID NO：2：
cggaaagtttaataggcggaagaaaagagtgaggagaccagctctcagacatccttaagggaaaggctggcccgtgactgacggcagcaggttttacgggcaggcttgaggaggcggtgtctgatttacgtggagcccagagattggttcgaccaggggtgacgtttacgtagcgcg
位于18号染色体的SERPINB5基因的目标序列：
SEQ ID NO：3：
cggctcagtgcttcccccaggcgtctccctcgtcggactcctcgtccctcccttaaaattgccggtgagtcgtcttccttgctggaaaagaattagggttatgatgattttgagggcaaatcagtgactttgtccccctccccagtggatatatttataattgcatctggagggacccg
位于18号染色体的NFATC1基因的目标序列：
SEQ ID NO：4：
cggccccagggggaagaacaggatggcagcgtcttcacttggggccgctccagccccgaggcgcacagccgtggaaagccggtgacagcacagaccgtggaggagctgggctctgttgaaaaccccatcccaggatgcagtccg
位于13号染色体的FLT1基因的目标序列：
SEQ ID NO：5：
cgatgtcatgaaagttatctgagctgcctagggcaaaggtcaagatctggttgacagggcacgagacataactcgtaaaatactcggtagagaagtctggtagaccttcgtctggttatgcaaatggacacgaacagagaaaacactctttacaccctaaaaatgcatacaggaacg
位于13号染色体的SUGT1L1基因的目标序列：
SEQ ID NO：6：
cgcgcccacgtccgcgggcactccgaccgagcctccaggagtagtagctcagaagcacttttgtaacatactgttatccctcaagaacgtgtacgcgcaggggcgtttccttgtccgttaataacacaagctacaggccgagcgtggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccgagacgggtggatcacg
位于13号染色体的COL4A1基因的目标序列：
SEQ ID NO：7：
cgttggaaaggaagaaaaatatgatgatgatctttttccaaaggcttgtgaacctgctcagtcagattccacgtgtgcctgcgctcaggcagcgcgtctgtcatcaacagcttaattccgttttcgcatcaaaccacaccagcagacagtgcgttctctggaaacacttgtattttcctggctccg
位于1号染色体的RUNX3基因的目标序列：
SEQ ID NO：8：
cgcggcgtcgttcttcgttgtggcggcctgtggctctttgaaaaacacgacgaggcctgcaaaatgcgtttttctttttttcctttacgcatgtaaccacggtcctgcatcgtgaaacggtacgcgcgtcggtggcaaaagaaaaacagcagtggctgcaaagctaagggccctcgctttcagaggagagaattttctttctccatgcgggtggaaagtggcctctgcgggtccaaccccacttcttcttgggcccgtgcgctccggctgcgccgcagggaccgcggacagcttcgccaaggcactgcctgcccgcccggctccgggtccccgctcccactcccagccgcgtggcccaacctctcctgggcttcactgcaaatcaccccttcctctcccgcctcctaagtctgtcgagcagacctaggggccggctacagttgggagggcaacgggaaagatcaagccacaatcattccgaattatcgccccagacacctccctagactctggggaacgaacgcgtgctgagcctccccgccgctttggagacggggctagattttcgttgcctccggctctcgacaggtgcaaaacaatgaattccaagcctcggaagcaaagaagcttaggatccgacggtggccgcaagatctcatcatggatctgacccctgctcagcgcgcgccatttcgtcgttgccaaacgaaatcaagccccgcgtgcgctccaggggcgaaggactctggactcaccccgaccaccgggagagctggcccctacccacctcgggacctcacagcacgccctcaggccgtgtcgaaaggaaggacggcaaaggtcccttactgaaccttttaagagagcctgcgcctggcagttgtcgattgcggacccaggcccgcgcgccctcggacgcgctggcacgagcagcagaactagaggaaagcgagtgatccagcctgggcgctcccacctccg
位于6号染色体的PPT2基因的目标序列：
SEQ ID NO：9：
cgctctcccggctgcgtcccttttcgtccatgtcctagcagagactacagagcagtacagaggctctcgctgaaaccagtcccaggctccacagagtcagatcacggcttcacaccagtcgttctggtcacttaggcgttcgcgtgagcgctcaaccccttaccgccacctcatcgtcactctacaccattctgagcgcaaaaatgttttgattgagacaaatttagaccaagcaatgaccttgtaaacagagagaggggctcagacatgctgagaaatccttatctctagagaaacgtctttaaatgctaagtaaaagccctagcaagtaaaagccctgaggcactagggtgtcggttaggggtcacaggcggagaggtggggcgcctgggggtttcggtagggagccacccacagataactcagacagccagattctgggggtcgttcaggttgaaagactggtcgaaattacgcgggcatgagtcagcgcatccctacgcgccctccg
位于21号染色体的去甲基化HLCS基因亚硫酸氢盐转化后的目标序列：
SEQ ID NO：10：
tgtttatgttgtttgggaggtgtgtttttgttgtttttttgttgtgtttgttttagttttgtttatttttgtggttttatagggttgaattttattttgttttgtggaaggtaggtttatattttttttttgtgtttttttttttgattggtattaaatattatgttgttttttttagtattgatg
位于21号染色体的去甲基化DSCR8基因亚硫酸氢盐转化后的目标序列：
SEQ ID NO：11：
tggaaagtttaataggtggaagaaaagagtgaggagattagtttttagatatttttaagggaaaggttggtttgtgattgatggtagtaggttttatgggtaggtttgaggaggtggtgtttgatttatgtggagtttagagattggtttgattaggggtgatgtttatgtagtgtg
位于18号染色体的去甲基化SERPINB5基因亚硫酸氢盐转化后的目标序列：
SEQ ID NO：12：
tggtttagtgttttttttaggtgttttttttgttggattttttgttttttttttaaaattgttggtgagttgttttttttgttggaaaagaattagggttatgatgattttgagggtaaattagtgattttgtttttttttttagtggatatatttataattgtatttggagggatttg
位于18号染色体的去甲基化NFATC1基因亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：13：
tggttttagggggaagaataggatggtagtgtttttatttggggttgttttagttttgaggtgtatagttgtggaaagttggtgatagtatagattgtggaggagttgggttttgttgaaaattttattttaggatgtagtttg
位于13号染色体的去甲基化FLT1基因亚硫酸氢盐转化的目标序列：SEQ ID NO：14：
tgatgttatgaaagttatttgagttgtttagggtaaaggttaagatttggttgatagggtatgagatataatttgtaaaatatttggtagagaagtttggtagatttttgtttggttatgtaaatggatatgaatagagaaaatattttttatattttaaaaatgtatataggaatg
位于13号染色体的去甲基化SUGT1L1基因亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：15：
tgtgtttatgtttgtgggtattttgattgagtttttaggagtagtagtttagaagtatttttgtaatatattgttattttttaagaatgtgtatgtgtaggggtgtttttttgtttgttaataatataagttataggttgagtgtggtggtttatatttgtaattttagtattttgggaggttgagatgggtggattatg
位于13号染色体的去甲基化COL4A1基因亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：16：
tgttggaaaggaagaaaaatatgatgatgatttttttttaaaggtttgtgaatttgtttagttagattttatgtgtgtttgtgtttaggtagtgtgtttgttattaatagtttaattttgtttttgtattaaattatattagtagatagtgtgttttttggaaatatttgtatttttttggttttg
位于1号染色体的去甲基化RUNX3基因亚硫酸氢盐转化的目标序列：SEQ ID NO：17：
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
位于6号染色体的去甲基化PPT2基因亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：18：
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
位于21号染色体的去甲基化HLCS基因互补序列亚硫酸氢盐转化后的目标序列：
SEQ ID NO：19：
tgttgatgttggaaagggtaatgtggtgtttggtgttggttagggaggaaggtgtggagggaaggtgtaggtttgttttttgtagggtagggtgaggtttggttttgtaaggttgtaggagtgggtgaggttagagtgagtgtggtaagaaggtggtagaagtgtgttttttaggtagtgtgggtg
位于21号染色体的去甲基化DSCR8基因互补序列亚硫酸氢盐转化后的目标序列：
SEQ ID NO：20：
tgtgttatgtaaatgttatttttggttgaattaatttttgggttttatgtaaattagatattgtttttttaagtttgtttgtaaaatttgttgttgttagttatgggttagttttttttttaaggatgtttgagagttggtttttttattttttttttttgtttattaaattttttg
位于18号染色体的去甲基化SERPINB5基因互补序列亚硫酸氢盐转化后的目标序列：
SEQ ID NO：21：
tgggtttttttagatgtaattataaatatatttattggggagggggataaagttattgatttgtttttaaaattattataattttaatttttttttagtaaggaagatgatttattggtaattttaagggagggatgaggagtttgatgagggagatgtttgggggaagtattgagttg
位于18号染色体的去甲基化NFATC1基因互补序列亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：22：
tggattgtattttgggatggggtttttaatagagtttagtttttttatggtttgtgttgttattggttttttatggttgtgtgttttggggttggagtggttttaagtgaagatgttgttattttgtttttttttttggggttg
位于13号染色体的去甲基化FLT1基因互补序列亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：23：
tgtttttgtatgtatttttagggtgtaaagagtgttttttttgtttgtgtttatttgtataattagatgaaggtttattagatttttttattgagtattttatgagttatgttttgtgttttgttaattagattttgatttttgttttaggtagtttagataatttttatgatattg
位于13号染色体的去甲基化SUGT1L1基因互补序列亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：24：
tgtgatttatttgttttggttttttaaagtgttgggattataggtgtgagttattatgtttggtttgtagtttgtgttattaatggataaggaaatgtttttgtgtgtatatgtttttgagggataatagtatgttataaaagtgtttttgagttattatttttggaggtttggttggagtgtttgtggatgtgggtgtg
位于13号染色体的去甲基化COL4A1基因互补序列亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：25：
tggagttaggaaaatataagtgtttttagagaatgtattgtttgttggtgtggtttgatgtgaaaatggaattaagttgttgatgatagatgtgttgtttgagtgtaggtatatgtggaatttgattgagtaggtttataagtttttggaaaaagattattattatatttttttttttttttaatg
位于1号染色体的去甲基化RUNX3基因互补序列亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：26：
tggaggtgggagtgtttaggttggattatttgtttttttttagttttgttgtttgtgttagtgtgtttgagggtgtgtgggtttgggtttgtaattgataattgttaggtgtaggtttttttaaaaggtttagtaagggatttttgttgtttttttttttgatatggtttgagggtgtgttgtgaggttttgaggtgggtaggggttagtttttttggtggttggggtgagtttagagttttttgtttttggagtgtatgtggggtttgattttgtttggtaatgatgaaatggtgtgtgttgagtaggggttagatttatgatgagattttgtggttattgttggattttaagtttttttgtttttgaggtttggaatttattgttttgtatttgttgagagttggaggtaatgaaaatttagttttgtttttaaagtggtggggaggtttagtatgtgtttgttttttagagtttagggaggtgtttggggtgataatttggaatgattgtggtttgattttttttgttgtttttttaattgtagttggtttttaggtttgtttgatagatttaggaggtgggagaggaaggggtgatttgtagtgaagtttaggagaggttgggttatgtggttgggagtgggagtggggatttggagttgggtgggtaggtagtgttttggtgaagttgtttgtggtttttgtggtgtagttggagtgtatgggtttaagaagaagtggggttggatttgtagaggttattttttatttgtatggagaaagaaaatttttttttttgaaagtgagggtttttagttttgtagttattgttgttttttttttgttattgatgtgtgtattgttttatgatgtaggattgtggttatatgtgtaaaggaaaaaaagaaaaatgtattttgtaggttttgttgtgttttttaaagagttataggttgttataatgaagaatgatgttgtg
位于6号染色体的去甲基化PPT2基因互补序列亚硫酸氢盐转化的目标序列：
SEQ ID NO：27：
tggagggtgtgtagggatgtgttgatttatgtttgtgtaattttgattagttttttaatttgaatgatttttagaatttggttgtttgagttatttgtgggtggttttttattgaaatttttaggtgttttatttttttgtttgtgatttttaattgatattttagtgttttagggtttttatttgttagggtttttatttagtatttaaagatgtttttttagagataaggattttttagtatgtttgagtttttttttttgtttataaggttattgtttggtttaaatttgttttaattaaaatatttttgtgtttagaatggtgtagagtgatgatgaggtggtggtaaggggttgagtgtttatgtgaatgtttaagtgattagaatgattggtgtgaagttgtgatttgattttgtggagtttgggattggttttagtgagagtttttgtattgttttgtagtttttgttaggatatggatgaaaagggatgtagttgggagagtg
本发明组合套装的实施方式不受任何限制，作为示例性的说明，作为实施方案之一，本发明组合套装中可以仅由检测单元组成，或由转化单元和检测单元组成，或者由提取单元、转化单元和检测单元组成。其中提取单元、转化单元和检测单元可以是分别单独成模块化，各自分别使用，也可以是一体化的，本发明不受限于各单元间的结合方式。无论采用任何结合方式实施本发明组合套装，均在本发明的所保护范围内容。
本发明组合套装的形式包括但不限于试剂盒的形式，还可为本领域常用的其他产品形式。
本发明组合套装实施或施用方法具体包括：
第一步，使用所述提取单元进行提取、分离目标基因、参照基因或其片段；
第二步，使用转化单元对目标基因、参照基因及其片段进行转化处理，使未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；
第三步，使用检测单元对转化后的目标基因和参照基因进行检测。
典型地，将转化单元转化处理后的目标基因和参照基因及其片段在检测单元中与扩增酶和引物接触，使得所述经处理的基因或片段被扩增以产生扩增产物或不被扩增；并用探针检测扩增产物。基于所述扩增物是否存在，确定目标基因、参照基因及其片段的至少一个CpG二核苷酸的甲基化或去甲基化状态；
并且，典型地，所述接触或扩增包括适用至少一种选自如下的方法：使用耐热DNA聚合酶作为所述扩增酶；使用缺乏5’-3’外切酶活性的聚合酶；使用聚合酶链式反应(PCR)；产生带有可检测标记的扩增产物核酸分子。
用基于PCR的方式来测定甲基化或去甲基化状态和数量，诸如数字PCR、荧光实时定量PCR、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸反应(Ms-SNuPE)、甲基化特异性PCR(MSP)、和甲基化CpG岛扩增(MCA)等测定方法来测定目标基因、参照基因及其片段的至少一个CpG二核苷酸的甲基化或去甲基化状态和数量。
其中，数字PCR测定为高灵敏度和高精密度的定量测定技术，为本发明的优选方法。
本申请还公开了用于检测目标基因、参照基因及其片段至少一个区域内甲基化或去甲基化状态和数量的引物和探针序列。
优选地，所述扩增产物的长度为60至150个碱基对。进行所述扩增反应的特异性引物为：
HLCS引物F:
SEQ ID NO：28：gtgaggtttggttttgtaaggtt
HLCS引物R:
SEQ ID NO：29：acttctaccaccttcttacca
DSCR引物F:
SEQ ID NO：31：gatatttttaagggaaaggttggttt
DSCR引物R:
SEQ ID NO：32：aaagtccacataaatcaaacacca
SERPINB5引物F:
SEQ ID NO：34：ttagtaaggaagatgatttatt
SERPINB5引物R:
SEQ ID NO：35：aactcaatacttcccccaaaca
NFATC1引物F:
SEQ ID NO：37：tggtagtgtttttatttggggtt
NFATC1引物R:
SEQ ID NO：38：ctccacaatctatactatcacca
FLT1引物F:
SEQ ID NO：40：gttaagatttggttgatagggtat
FLT1引物R:
SEQ ID NO：41：attcatatccatttacataaccaaaca
SUGT1L1引物F:
SEQ ID NO：43：gtaatatattgttattttttaagaat
SUGT1L1引物R:
SEQ ID NO：44：actcaacctataacttatattattaaca
COL4A1引物F:
SEQ ID NO：46：gtttgtgaatttgtttagttagattttat
COL4A1引物R:
SEQ ID NO：47：ctatctactaatataatttaatacaaaaaca
RUNX3引物F:
SEQ ID NO：49：ttagtaaggaagatgatttatt
RUNX3引物R:
SEQ ID NO：50：aactcaatacttcccccaaaca
PPT2引物F:
SEQ ID NO：52：gtgtagagtgatgatgaggtggt
PPT2引物R:
SEQ ID NO：53：caaaatcaaatcacaacttcacaccaatca
在本发明中，分析所获得的扩增产物，以便确定处理之前CpG二核苷酸的甲基化或去甲基化状态和数量。通过扩增获得的片段可通过荧光染料法，也可以通过具有基因和甲基化或去甲基化状态特异的探针法检测。优选地，采用荧光探针法，所使用探针的序列如下：
HLCS探针:
SEQ ID NO：30：agtgggtgaggttagagtgagtg
DSCR探针:
SEQ ID NO：33：ttgatggtagtaggttttatgggtagg
SERPINB5探针:
SEQ ID NO：36：agggatgaggagtttgatgaggg
NFATC1探针:
SEQ ID NO：39：agttttgaggtgtatagttgtggaaag
FLT1探针:
SEQ ID NO：42：ccaaacttctctaccaaatattttacaaattatatc
SUGT1L1探针:
SEQ ID NO：45：caaaaaaacacccctacacatacac
COL4A1探针:
SEQ ID NO：48：tgtgtttgtgtttaggtagtgtgtttgttat
RUNX3探针:
SEQ ID NO：51：agggatgaggagtttgatgaggg
PPT2探针:
SEQ ID NO：54：cacttaaacattcacataaacactcaacc
在本发明中，可以在各种商业用数字PCR仪器设备上根据现有技术的标准操作进行数字PCR的检测。
作为实施方式之一，采用北京达微生物科技有限公司的GO1型数字PCR仪上进行数字PCR的检测。
在本发明中，通过对目标基因和参照基因绝对定量检测结果的比值确定所述样本的最终分析结果是正常、还是21-、18-、或13-三体综合征。
本发明通过以上所述的组合套装(例如试剂盒)、核酸序列其用途，以及上述检测方法，通过联合利用分别用于检测特定甲基化或去甲基化状态的目标基因、参照基因及其片段的核酸序列和数字PCR，实现了利用胎盘组织特异的甲基化或去甲基化目标基因和参考基因的检测对21-、18-、13-三体综合征进行体外检测。
具体实施方式
尽管在此公开了本发明的各个方面和实施例，但在此公开的各个方面和实施例仅用于说明目的，不以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1：
(一)样品
4例女性志愿者外周血白细胞样本，通过实时荧光定量PCR检测甲基化和去甲基化处理的人体基因组DNA中的目标基因、参照基因或其片段；其中，所述目标基因包括：1)位于21号染色体的HLCS或DSCR8基因及其片段；)位于18号染色体的SERPINB5或NFATC1基因及其片段；和3)位于13号染色体的FLT1、SUGT1L1或COL4A1基因及其片段；和
所述对照基因包括：1)位于1号染色体的RUNX3基因及其片段；或2)位于6号染色体的PPT2基因及其片段。
所述目标基因序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，和SEQ ID NO：25序列。
所述参照基因序列为SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：26，和SEQ ID NO：27序列。
(二)具体的组合套装结构和操作
1)提取单元对样品的提取，
首先在15mL试管中加入1-5mL血浆，然后加入1.25倍体积的裂解结合液，充分混匀；然后添加适量磁珠(20uL磁珠/mL血浆)，室温下持续颠倒震荡10分钟；然后将试管置于磁力架上5分钟，分离磁珠和液相，小心吸取、去除上清；然后在试管中添加1mL洗液，保持颠倒震荡1分钟，之后将试管置于磁力架上1分钟，分离磁珠和液相，小心吸取、去除上清；重复上一步骤，再次使用等量洗液进行洗涤；然后在试管中添加1mL 80％的乙醇，保持颠倒震荡1分钟，之后将试管置于磁力架上1分钟，分离磁珠和液相，小心吸取、去除上清；重复上一步骤，再次使用等量80％的乙醇进行洗涤；最后在试管中加入20-50uL洗脱液，保持震荡重悬磁珠1分钟，之后将试管置于磁力架上1分钟，分离磁珠和液相，小心吸取上清，并在-20℃保存。
2)阴、阳性参考品的制备
阴性参考品是指通过DNA甲基转移酶处理、全部CpG二核苷酸中的胞嘧啶为甲基化胞嘧啶的DNA样本；阳性性参考品是指通过全基因组扩增试剂盒处理、全部CpG二核苷酸中的胞嘧啶为去甲基化胞嘧啶的DNA样本。
阴性参考品的制备为：使用纽英伦生物技术(北京)有限公司的CpG甲基转移酶(M.SssI)试剂盒对所述提取试剂盒提取的DNA进行甲基转移处理；反应体系为：5ul 10xNEBuffer 2、15ul 10ng/ul的所述提取试剂盒提取的DNA、1ul甲基转移酶、5ul SAM、适量ddH2O至反应总体积50ul。反应条件为：37℃反应1小时。
阳性参考品的制备为：使用近岸蛋白质科技有限公司的NovoAmp全基因组扩增试剂盒(产品目录号：E129)对所述提取试剂盒提取的DNA进行全基因组扩增；反应体系为：5ul10x NovoAmp反应缓冲液、1.5ul Primer混合液(1mM)、1ul 10ng/ul的所述提取试剂盒提取的DNA、适量ddH2O至反应总体积50ul。反应条件为：30℃反应3小时。
3)转化单元对阴、阳性参考品的转化，
转化单元含有亚硫酸氢盐作为DNA转化剂，首先在1.5mL试管中加入130uL转化剂和20uL转化后的(阴、阳性参考品)DNA溶液，混匀；加热至98℃并保持10分钟进行DNA变性，然后将温度降至60℃，保持2.5小时进行DNA转化；在过滤柱中加入600uL结合液，然后将转化后的DNA溶液转移至过滤柱中，12，000rpm离心30秒，弃滤液；然后加入100uL洗液至过滤柱中，12，000rpm离心30秒，弃滤液；然后加入200uL脱磺酸基缓冲液至过滤柱中，室温放置15-20分钟，12，000rpm离心30秒，弃滤液；然后加入100uL洗液至过滤柱中，12，000rpm离心30秒，弃滤液，并再重复一次；最后加入10uL洗脱液至过滤柱中，室温放置1分钟后12，000rpm离心30秒，收集滤液。
4)检测单元对转化后的阴、阳性参考品的检测
采用检测单元，
本实验例中采取的PCR反应体系为：经亚硫酸氢盐转化的DNA模板10ng、400nM引物、250nM探针、1UTaq聚合酶、400uM的各个dNTP、10mM的MgCl2和1×PCR缓冲液。
本实施例中使用的引物和探针是由通用生物系统(安徽)有限公司合成的，其序列为：
HLCS引物F:
SEQ ID NO：28：GTGAGGTTtGGtttTGTAAGGtt
HLCS引物R:
SEQ ID NO：29：aCTTCTaCCaCCTTCTTaCCa
HLCS探针:
SEQ ID NO：30：AGTGGGtGAGGtTAGAGtGAGtG
DSCR引物F:
SEQ ID NO：31：GAtATttTTAAGGGAAAGGtTGGttt
DSCR引物R:
SEQ ID NO：32：aaaGTCCACaTAAATCAaACACCa
DSCR探针:
SEQ ID NO：33：tTGAtGGtAGtAGGTTTTAtGGGtAGG
SERPINB5引物F:
SEQ ID NO：34：ttAGtAAGGAAGAtGAtTtAtt
SERPINB5引物R:
SEQ ID NO：35：aaCTCAaTaCTTCCCCCAaaCa
SERPINB5探针:
SEQ ID NO：36：AGGGAtGAGGAGTttGAtGAGGG
NFATC1引物F:
SEQ ID NO：37：TGGtAGtGTtTTtAtTTGGGGtt
NFATC1引物R:
SEQ ID NO：38：CTCCACaaTCTaTaCTaTCACCa
NFATC1探针:
SEQ ID NO：39：AGttttGAGGtGtAtAGttGTGGAAAG
FLT1引物F:
SEQ ID NO：40：GTtAAGATtTGGTTGAtAGGGtAt
FLT1引物R:
SEQ ID NO：41：aTTCaTaTCCATTTaCATAACCAaACa
FLT1探针:
SEQ ID NO：42：CCAaACTTCTCTACCaAaTATTTTACaAaTTATaTCSUGT1L1引物F:
SEQ ID NO：43：GTAAtATAtTGTTATtttTtAAGAAt
SUGT1L1引物R:
SEQ ID NO：44：aCTCaaCCTaTAaCTTaTaTTATTAACa
SUGT1L1探针:
SEQ ID NO：45：CAAaaAAACaCCCCTaCaCaTACAC
COL4A1引物F:
SEQ ID NO：46：GtTTGTGAAttTGtTtAGTtAGATTttAt
COL4A1引物R:
SEQ ID NO：47：CTaTCTaCTaaTaTaaTTTaATaCaAAAACa
COL4A1探针:
SEQ ID NO：48：TGTGttTGtGtTtAGGtAGtGtGTtTGTtAT
RUNX3引物F:
SEQ ID NO：49：ttAGtAAGGAAGAtGAtTtAtt
RUNX3引物R:
SEQ ID NO：50：aaCTCAaTaCTTCCCCCAaaCa
RUNX3探针:
SEQ ID NO：51：AGGGAtGAGGAGTttGAtGAGGG
PPT2引物F:
SEQ ID NO：52：GTGTAGAGTGAtGATGAGGTGGt
PPT2引物R:
SEQ ID NO：53：CAaAaTCAaATCACaaCTTCACACCAaTCa
PPT2探针:
SEQ ID NO：54：CACTTAaaCaTTCaCaTaAaCaCTCAACC
通过荧光实时定量PCR对阴、阳性参考品中的目标基因、参照基因及其片段的甲基化状态进行检测。在本实施例中，实时定量荧光PCR检测是在Life Technologies仪器(7500)实时定量荧光PCR仪上实现的。
PCR反应条件为：在94℃持续10分钟；紧接着进行40个循环的1)在55℃退火和延伸20秒，和2)94℃下变性15秒。
通过荧光实时定量PCR对阴、阳性参考品中目标基因、参照基因及其片段的甲基化状态进行检测。
(三)检测结果
荧光实时定量PCR对阴、阳性参考品中目标基因、参照基因及其片段的甲基化状态进行检测的结果如表1
表1
Figure BDA0002066486240000261
Figure BDA0002066486240000271
(四)结论
上述实验结果表明了上述引物探针能够特异性的检测阳性参考品中的去甲基化状态的目标基因和参照基因(表1)。数据显示：使用所述引物探针能够特异性扩增阳性参考品，即：去甲基化状态的目标基因和参照基因及片段；使用所述引物探针能够不扩增阴性参考品，即：甲基化状态的目标基因和参照基因及片段。
实施例2：
(一)样品：
10例孕妇和10例育龄女性(未怀孕)外周血样本，5-10mL/例检测孕妇外周血游离DNA中的目标基因、参照基因及其片段的甲基化或去甲基化状态和数量。所述目标基因包括：1)位于21号染色体的HLCS或DSCR8基因及其片段；2)位于18号染色体的SERPINB5或NFATC1基因及其片段；和3)位于13号染色体的FLT1、SUGT1L1或COL4A1基因及其片段；所述参照基因包括：1)位于1号染色体的RUNX3基因及其片段；或2)位于6号染色体的PPT2基因及其片段。
所述目标基因序列为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ IDNO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，和SEQ ID NO：25序列。
所述参照基因序列为SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：26，和SEQ ID NO：27序列。
(二)具体的组合套装结构和操作
1)提取单元对样品的提取
采用提取单元，
首先在15mL试管中加入1-5mL血浆，然后加入1.25倍体积的裂解结合液，充分混匀；然后添加适量磁珠(20uL磁珠/mL血浆)，室温下持续颠倒震荡10分钟；然后将试管置于磁力架上5分钟，分离磁珠和液相，小心吸取、去除上清；然后在试管中添加1mL洗液，保持颠倒震荡1分钟，之后将试管置于磁力架上1分钟，分离磁珠和液相，小心吸取、去除上清；重复上一步骤，再次使用等量洗液进行洗涤；然后在试管中添加1mL 80％的乙醇，保持颠倒震荡1分钟，之后将试管置于磁力架上1分钟，分离磁珠和液相，小心吸取、去除上清；重复上一步骤，再次使用等量80％的乙醇进行洗涤；最后在试管中加入20-50uL洗脱液，保持震荡重悬磁珠1分钟，之后将试管置于磁力架上1分钟，分离磁珠和液相，小心吸取上清，并在-20℃保存。
2)转化单元对样本DNA的转化，
转化单元含有亚硫酸氢盐作为DNA转化剂，首先在1.5mL试管中加入130uL转化剂和20uL转化后的(阴、阳性参考品)DNA溶液，混匀；加热至98℃并保持10分钟进行DNA变性，然后将温度降至60℃，保持2.5小时进行DNA转化；在过滤柱中加入600uL结合液，然后将转化后的DNA溶液转移至过滤柱中，12000rpm离心30秒，弃滤液；然后加入100uL洗液至过滤柱中，12,000rpm离心30秒，弃滤液；然后加入200uL脱磺酸基缓冲液至过滤柱中，室温放置15-20分钟，12,000rpm离心30秒，弃滤液；然后加入100uL洗液至过滤柱中，12,000rpm离心30秒，弃滤液，并再重复一次；最后加入10uL洗脱液至过滤柱中，室温放置1分钟后12,000rpm离心30秒，收集滤液。
3)检测单元对转化后的样本DNA的检测，
本实验例中采取的PCR反应体系为：经亚硫酸氢盐转化的DNA模板10ng、900nM引物、400nM探针、1UTaq聚合酶、400uM的各个dNTP、10mM的MgCl2和1×PCR缓冲液。
本实施例中使用的引物和探针是由通用生物系统(安徽)有限公司合成的，其序列为：
HLCS引物F:
SEQ ID NO：28：GTGAGGTTtGGtttTGTAAGGtt
HLCS引物R:
SEQ ID NO：29：aCTTCTaCCaCCTTCTTaCCa
HLCS探针:
SEQ ID NO：30：AGTGGGtGAGGtTAGAGtGAGtG
DSCR引物F:
SEQ ID NO：31：GAtATttTTAAGGGAAAGGtTGGttt
DSCR引物R:
SEQ ID NO：32：aaaGTCCACaTAAATCAaACACCa
DSCR探针:
SEQ ID NO：33：tTGAtGGtAGtAGGTTTTAtGGGtAGG
SERPINB5引物F:
SEQ ID NO：34：ttAGtAAGGAAGAtGAtTtAtt
SERPINB5引物R:
SEQ ID NO：35：aaCTCAaTaCTTCCCCCAaaCa
SERPINB5探针:
SEQ ID NO：36：AGGGAtGAGGAGTttGAtGAGGG
NFATC1引物F:
SEQ ID NO：37：TGGtAGtGTtTTtAtTTGGGGtt
NFATC1引物R:
SEQ ID NO：38：CTCCACaaTCTaTaCTaTCACCa
NFATC1探针:
SEQ ID NO：39：AGttttGAGGtGtAtAGttGTGGAAAG
FLT1引物F:
SEQ ID NO：40：GTtAAGATtTGGTTGAtAGGGtAt
FLT1引物R:
SEQ ID NO：41：aTTCaTaTCCATTTaCATAACCAaACa
FLT1探针:
SEQ ID NO：42：CCAaACTTCTCTACCaAaTATTTTACaAaTTATaTCSUGT1L1引物F:
SEQ ID NO：43：GTAAtATAtTGTTATtttTtAAGAAt
SUGT1L1引物R:
SEQ ID NO：44：aCTCaaCCTaTAaCTTaTaTTATTAACa
SUGT1L1探针:
SEQ ID NO：45：CAAaaAAACaCCCCTaCaCaTACAC
COL4A1引物F:
SEQ ID NO：46：GtTTGTGAAttTGtTtAGTtAGATTttAt
COL4A1引物R:
SEQ ID NO：47：CTaTCTaCTaaTaTaaTTTaATaCaAAAACa
COL4A1探针:
SEQ ID NO：48：TGTGttTGtGtTtAGGtAGtGtGTtTGTtAT
RUNX3引物F:
SEQ ID NO：49：ttAGtAAGGAAGAtGAtTtAtt
RUNX3引物R:
SEQ ID NO：50：aaCTCAaTaCTTCCCCCAaaCa
RUNX3探针:
SEQ ID NO：51：AGGGAtGAGGAGTttGAtGAGGG
PPT2引物F:
SEQ ID NO：52：GTGTAGAGTGAtGATGAGGTGGt
PPT2引物R:
SEQ ID NO：53：CAaAaTCAaATCACaaCTTCACACCAaTCa
PPT2探针:
SEQ ID NO：54：CACTTAaaCaTTCaCaTaAaCaCTCAACC
通过数字PCR对样本中的目标基因、参照基因及其片段的甲基化状态和数量进行检测。数字PCR检测是在北京达微生物科技有限公司的GO1型液滴数字PCR仪上完成的。
PCR反应条件为：在94℃持续10分钟；紧接着进行40个循环的1)在55℃退火和延伸20秒，和2)94℃下变性15秒。
(三)检测结果
数字PCR对样本中去甲基化状态的目标基因、参照基因及其片段的分子拷贝数量进行检测的结果如下：
表2
Figure BDA0002066486240000311
Figure BDA0002066486240000321
数字PCR对孕妇样本中去甲基化状态的目标基因拷贝数和参照基因拷贝数的比值如下：
表3
Figure BDA0002066486240000322
Figure BDA0002066486240000331
Figure BDA0002066486240000341
(四)结论
通过计算上述数字PCR检测得到的与21-、18-、13-三体综合征相关染色体的目标基因的去甲基化DNA片段数量和与21-、18-、13-三体综合征不相关的正常染色体的参照基因的去甲基化DNA片段数量的比值，可以进行21-、18-、13-三体综合征的判断。
正常育龄女性(未怀孕)外周血中不含有胎盘组织释放的游离DNA，因此对目标基因和参照基因的去甲基化DNA片段数量均等于或接近0；正常孕妇外周血中含有等量的由胎盘组织释放的目标基因和参照基因的去甲基化DNA片段，因此对目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段比值为1；21-、18-、13-三体综合征孕妇外周血中含有由胎盘组织释放的3倍的目标基因和2倍的参考基因的去甲基化DNA片段，因此对目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值为1.5。
在本实施例中，目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值≥1.3为阳性(三体综合征)；目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值≤1.2为阴性(正常)；目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值介于1.2和1.3之间为无效检测。
结果显示：
10例正常育龄女性(未怀孕)目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值接近于0；10例正常孕妇目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值小于1.2、接近1.0；三例21-、18-、13-三体综合征孕妇目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值大于1.2、接近1.5。
上述实验结果表明使用上述组合套装能够通过数字PCR准确地检测外周血中胎源的去甲基化状态的目标基因和参照基因，并可用于21-、18-、13-三体综合征的无创体外检测。
序列表
<110> 北京达微生物科技有限公司
<120> 用于三体综合征检测的组合套装
<130> LAC190310P
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 186
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 1
cgcccacgct gcctgggagg cgcgcttctg ccgccttctt gccgcgctcg ctctagcctc 60
gcccactcct gcggccttac agggccgaac ctcaccctgc cctgcggaag gcaggcctac 120
accttccctc cgcgccttcc tccctgaccg gcaccaaaca ccacgttgcc ctttccagca 180
tcgacg 186
<210> 2
<211> 177
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 2
cggaaagttt aataggcgga agaaaagagt gaggagacca gctctcagac atccttaagg 60
gaaaggctgg cccgtgactg acggcagcag gttttacggg caggcttgag gaggcggtgt 120
ctgatttacg tggagcccag agattggttc gaccaggggt gacgtttacg tagcgcg 177
<210> 3
<211> 179
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 3
cggctcagtg cttcccccag gcgtctccct cgtcggactc ctcgtccctc ccttaaaatt 60
gccggtgagt cgtcttcctt gctggaaaag aattagggtt atgatgattt tgagggcaaa 120
tcagtgactt tgtccccctc cccagtggat atatttataa ttgcatctgg agggacccg 179
<210> 4
<211> 144
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 4
cggccccagg gggaagaaca ggatggcagc gtcttcactt ggggccgctc cagccccgag 60
gcgcacagcc gtggaaagcc ggtgacagca cagaccgtgg aggagctggg ctctgttgaa 120
aaccccatcc caggatgcag tccg 144
<210> 5
<211> 177
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 5
cgatgtcatg aaagttatct gagctgccta gggcaaaggt caagatctgg ttgacagggc 60
acgagacata actcgtaaaa tactcggtag agaagtctgg tagaccttcg tctggttatg 120
caaatggaca cgaacagaga aaacactctt tacaccctaa aaatgcatac aggaacg 177
<210> 6
<211> 200
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 6
cgcgcccacg tccgcgggca ctccgaccga gcctccagga gtagtagctc agaagcactt 60
ttgtaacata ctgttatccc tcaagaacgt gtacgcgcag gggcgtttcc ttgtccgtta 120
ataacacaag ctacaggccg agcgtggtgg ctcacacctg taatcccagc actttgggag 180
gccgagacgg gtggatcacg 200
<210> 7
<211> 186
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 7
cgttggaaag gaagaaaaat atgatgatga tctttttcca aaggcttgtg aacctgctca 60
gtcagattcc acgtgtgcct gcgctcaggc agcgcgtctg tcatcaacag cttaattccg 120
ttttcgcatc aaaccacacc agcagacagt gcgttctctg gaaacacttg tattttcctg 180
gctccg 186
<210> 8
<211> 981
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 8
cgcggcgtcg ttcttcgttg tggcggcctg tggctctttg aaaaacacga cgaggcctgc 60
aaaatgcgtt tttctttttt tcctttacgc atgtaaccac ggtcctgcat cgtgaaacgg 120
tacgcgcgtc ggtggcaaaa gaaaaacagc agtggctgca aagctaaggg ccctcgcttt 180
cagaggagag aattttcttt ctccatgcgg gtggaaagtg gcctctgcgg gtccaacccc 240
acttcttctt gggcccgtgc gctccggctg cgccgcaggg accgcggaca gcttcgccaa 300
ggcactgcct gcccgcccgg ctccgggtcc ccgctcccac tcccagccgc gtggcccaac 360
ctctcctggg cttcactgca aatcacccct tcctctcccg cctcctaagt ctgtcgagca 420
gacctagggg ccggctacag ttgggagggc aacgggaaag atcaagccac aatcattccg 480
aattatcgcc ccagacacct ccctagactc tggggaacga acgcgtgctg agcctccccg 540
ccgctttgga gacggggcta gattttcgtt gcctccggct ctcgacaggt gcaaaacaat 600
gaattccaag cctcggaagc aaagaagctt aggatccgac ggtggccgca agatctcatc 660
atggatctga cccctgctca gcgcgcgcca tttcgtcgtt gccaaacgaa atcaagcccc 720
gcgtgcgctc caggggcgaa ggactctgga ctcaccccga ccaccgggag agctggcccc 780
tacccacctc gggacctcac agcacgccct caggccgtgt cgaaaggaag gacggcaaag 840
gtcccttact gaacctttta agagagcctg cgcctggcag ttgtcgattg cggacccagg 900
cccgcgcgcc ctcggacgcg ctggcacgag cagcagaact agaggaaagc gagtgatcca 960
gcctgggcgc tcccacctcc g 981
<210> 9
<211> 511
<212> DNA
<213> 人(Homo sapiens)
<400> 9
cgctctcccg gctgcgtccc ttttcgtcca tgtcctagca gagactacag agcagtacag 60
aggctctcgc tgaaaccagt cccaggctcc acagagtcag atcacggctt cacaccagtc 120
gttctggtca cttaggcgtt cgcgtgagcg ctcaacccct taccgccacc tcatcgtcac 180
tctacaccat tctgagcgca aaaatgtttt gattgagaca aatttagacc aagcaatgac 240
cttgtaaaca gagagagggg ctcagacatg ctgagaaatc cttatctcta gagaaacgtc 300
tttaaatgct aagtaaaagc cctagcaagt aaaagccctg aggcactagg gtgtcggtta 360
ggggtcacag gcggagaggt ggggcgcctg ggggtttcgg tagggagcca cccacagata 420
actcagacag ccagattctg ggggtcgttc aggttgaaag actggtcgaa attacgcggg 480
catgagtcag cgcatcccta cgcgccctcc g 511
<210> 10
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgtttatgtt gtttgggagg tgtgtttttg ttgttttttt gttgtgtttg ttttagtttt 60
gtttattttt gtggttttat agggttgaat tttattttgt tttgtggaag gtaggtttat 120
attttttttt tgtgtttttt tttttgattg gtattaaata ttatgttgtt ttttttagta 180
ttgatg 186
<210> 11
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tggaaagttt aataggtgga agaaaagagt gaggagatta gtttttagat atttttaagg 60
gaaaggttgg tttgtgattg atggtagtag gttttatggg taggtttgag gaggtggtgt 120
ttgatttatg tggagtttag agattggttt gattaggggt gatgtttatg tagtgtg 177
<210> 12
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tggtttagtg ttttttttag gtgttttttt tgttggattt tttgtttttt ttttaaaatt 60
gttggtgagt tgtttttttt gttggaaaag aattagggtt atgatgattt tgagggtaaa 120
ttagtgattt tgtttttttt tttagtggat atatttataa ttgtatttgg agggatttg 179
<210> 13
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tggttttagg gggaagaata ggatggtagt gtttttattt ggggttgttt tagttttgag 60
gtgtatagtt gtggaaagtt ggtgatagta tagattgtgg aggagttggg ttttgttgaa 120
aattttattt taggatgtag tttg 144
<210> 14
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tgatgttatg aaagttattt gagttgttta gggtaaaggt taagatttgg ttgatagggt 60
atgagatata atttgtaaaa tatttggtag agaagtttgg tagatttttg tttggttatg 120
taaatggata tgaatagaga aaatattttt tatattttaa aaatgtatat aggaatg 177
<210> 15
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgtgtttatg tttgtgggta ttttgattga gtttttagga gtagtagttt agaagtattt 60
ttgtaatata ttgttatttt ttaagaatgt gtatgtgtag gggtgttttt ttgtttgtta 120
ataatataag ttataggttg agtgtggtgg tttatatttg taattttagt attttgggag 180
gttgagatgg gtggattatg 200
<210> 16
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tgttggaaag gaagaaaaat atgatgatga ttttttttta aaggtttgtg aatttgttta 60
gttagatttt atgtgtgttt gtgtttaggt agtgtgtttg ttattaatag tttaattttg 120
tttttgtatt aaattatatt agtagatagt gtgttttttg gaaatatttg tatttttttg 180
gttttg 186
<210> 17
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgtggtgttg ttttttgttg tggtggtttg tggttttttg aaaaatatga tgaggtttgt 60
aaaatgtgtt tttttttttt ttttttatgt atgtaattat ggttttgtat tgtgaaatgg 120
tatgtgtgtt ggtggtaaaa gaaaaatagt agtggttgta aagttaaggg tttttgtttt 180
tagaggagag aatttttttt ttttatgtgg gtggaaagtg gtttttgtgg gtttaatttt 240
attttttttt gggtttgtgt gttttggttg tgttgtaggg attgtggata gttttgttaa 300
ggtattgttt gtttgtttgg ttttgggttt ttgtttttat ttttagttgt gtggtttaat 360
tttttttggg ttttattgta aattattttt tttttttttg ttttttaagt ttgttgagta 420
gatttagggg ttggttatag ttgggagggt aatgggaaag attaagttat aattattttg 480
aattattgtt ttagatattt ttttagattt tggggaatga atgtgtgttg agtttttttg 540
ttgttttgga gatggggtta gatttttgtt gtttttggtt tttgataggt gtaaaataat 600
gaattttaag ttttggaagt aaagaagttt aggatttgat ggtggttgta agattttatt 660
atggatttga tttttgttta gtgtgtgtta ttttgttgtt gttaaatgaa attaagtttt 720
gtgtgtgttt taggggtgaa ggattttgga tttattttga ttattgggag agttggtttt 780
tatttatttt gggattttat agtatgtttt taggttgtgt tgaaaggaag gatggtaaag 840
gttttttatt gaatttttta agagagtttg tgtttggtag ttgttgattg tggatttagg 900
tttgtgtgtt tttggatgtg ttggtatgag tagtagaatt agaggaaagt gagtgattta 960
gtttgggtgt ttttattttt g 981
<210> 18
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tgtttttttg gttgtgtttt tttttgttta tgttttagta gagattatag agtagtatag 60
aggtttttgt tgaaattagt tttaggtttt atagagttag attatggttt tatattagtt 120
gttttggtta tttaggtgtt tgtgtgagtg tttaattttt tattgttatt ttattgttat 180
tttatattat tttgagtgta aaaatgtttt gattgagata aatttagatt aagtaatgat 240
tttgtaaata gagagagggg tttagatatg ttgagaaatt tttattttta gagaaatgtt 300
tttaaatgtt aagtaaaagt tttagtaagt aaaagttttg aggtattagg gtgttggtta 360
ggggttatag gtggagaggt ggggtgtttg ggggttttgg tagggagtta tttatagata 420
atttagatag ttagattttg ggggttgttt aggttgaaag attggttgaa attatgtggg 480
tatgagttag tgtattttta tgtgtttttt g 511
<210> 19
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tgttgatgtt ggaaagggta atgtggtgtt tggtgttggt tagggaggaa ggtgtggagg 60
gaaggtgtag gtttgttttt tgtagggtag ggtgaggttt ggttttgtaa ggttgtagga 120
gtgggtgagg ttagagtgag tgtggtaaga aggtggtaga agtgtgtttt ttaggtagtg 180
tgggtg 186
<210> 20
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tgtgttatgt aaatgttatt tttggttgaa ttaatttttg ggttttatgt aaattagata 60
ttgttttttt aagtttgttt gtaaaatttg ttgttgttag ttatgggtta gttttttttt 120
taaggatgtt tgagagttgg tttttttatt tttttttttt gtttattaaa ttttttg 177
<210> 21
<211> 179
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgggtttttt tagatgtaat tataaatata tttattgggg agggggataa agttattgat 60
ttgtttttaa aattattata attttaattt ttttttagta aggaagatga tttattggta 120
attttaaggg agggatgagg agtttgatga gggagatgtt tgggggaagt attgagttg 179
<210> 22
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tggattgtat tttgggatgg ggtttttaat agagtttagt ttttttatgg tttgtgttgt 60
tattggtttt ttatggttgt gtgttttggg gttggagtgg ttttaagtga agatgttgtt 120
attttgtttt tttttttggg gttg 144
<210> 23
<211> 177
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tgtttttgta tgtattttta gggtgtaaag agtgtttttt ttgtttgtgt ttatttgtat 60
aattagatga aggtttatta gattttttta ttgagtattt tatgagttat gttttgtgtt 120
ttgttaatta gattttgatt tttgttttag gtagtttaga taatttttat gatattg 177
<210> 24
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgtgatttat ttgttttggt tttttaaagt gttgggatta taggtgtgag ttattatgtt 60
tggtttgtag tttgtgttat taatggataa ggaaatgttt ttgtgtgtat atgtttttga 120
gggataatag tatgttataa aagtgttttt gagttattat ttttggaggt ttggttggag 180
tgtttgtgga tgtgggtgtg 200
<210> 25
<211> 186
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggagttagg aaaatataag tgtttttaga gaatgtattg tttgttggtg tggtttgatg 60
tgaaaatgga attaagttgt tgatgataga tgtgttgttt gagtgtaggt atatgtggaa 120
tttgattgag taggtttata agtttttgga aaaagattat tattatattt tttttttttt 180
ttaatg 186
<210> 26
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tggaggtggg agtgtttagg ttggattatt tgtttttttt tagttttgtt gtttgtgtta 60
gtgtgtttga gggtgtgtgg gtttgggttt gtaattgata attgttaggt gtaggttttt 120
ttaaaaggtt tagtaaggga tttttgttgt tttttttttt gatatggttt gagggtgtgt 180
tgtgaggttt tgaggtgggt aggggttagt ttttttggtg gttggggtga gtttagagtt 240
ttttgttttt ggagtgtatg tggggtttga ttttgtttgg taatgatgaa atggtgtgtg 300
ttgagtaggg gttagattta tgatgagatt ttgtggttat tgttggattt taagtttttt 360
tgtttttgag gtttggaatt tattgttttg tatttgttga gagttggagg taatgaaaat 420
ttagttttgt ttttaaagtg gtggggaggt ttagtatgtg tttgtttttt agagtttagg 480
gaggtgtttg gggtgataat ttggaatgat tgtggtttga ttttttttgt tgttttttta 540
attgtagttg gtttttaggt ttgtttgata gatttaggag gtgggagagg aaggggtgat 600
ttgtagtgaa gtttaggaga ggttgggtta tgtggttggg agtgggagtg gggatttgga 660
gttgggtggg taggtagtgt tttggtgaag ttgtttgtgg tttttgtggt gtagttggag 720
tgtatgggtt taagaagaag tggggttgga tttgtagagg ttatttttta tttgtatgga 780
gaaagaaaat tttttttttt gaaagtgagg gtttttagtt ttgtagttat tgttgttttt 840
tttttgttat tgatgtgtgt attgttttat gatgtaggat tgtggttata tgtgtaaagg 900
aaaaaaagaa aaatgtattt tgtaggtttt gttgtgtttt ttaaagagtt ataggttgtt 960
ataatgaaga atgatgttgt g 981
<210> 27
<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggagggtgt gtagggatgt gttgatttat gtttgtgtaa ttttgattag ttttttaatt 60
tgaatgattt ttagaatttg gttgtttgag ttatttgtgg gtggtttttt attgaaattt 120
ttaggtgttt tatttttttg tttgtgattt ttaattgata ttttagtgtt ttagggtttt 180
tatttgttag ggtttttatt tagtatttaa agatgttttt ttagagataa ggatttttta 240
gtatgtttga gttttttttt ttgtttataa ggttattgtt tggtttaaat ttgttttaat 300
taaaatattt ttgtgtttag aatggtgtag agtgatgatg aggtggtggt aaggggttga 360
gtgtttatgt gaatgtttaa gtgattagaa tgattggtgt gaagttgtga tttgattttg 420
tggagtttgg gattggtttt agtgagagtt tttgtattgt tttgtagttt ttgttaggat 480
atggatgaaa agggatgtag ttgggagagt g 511
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtgaggtttg gttttgtaag gtt 23
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
acttctacca ccttcttacc a 21
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
agtgggtgag gttagagtga gtg 23
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gatattttta agggaaaggt tggttt 26
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaagtccaca taaatcaaac acca 24
<210> 33
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ttgatggtag taggttttat gggtagg 27
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttagtaagga agatgattta tt 22
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
aactcaatac ttcccccaaa ca 22
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
agggatgagg agtttgatga ggg 23
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tggtagtgtt tttatttggg gtt 23
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ctccacaatc tatactatca cca 23
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agttttgagg tgtatagttg tggaaag 27
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttaagattt ggttgatagg gtat 24
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
attcatatcc atttacataa ccaaaca 27
<210> 42
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccaaacttct ctaccaaata ttttacaaat tatatc 36
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gtaatatatt gttatttttt aagaat 26
<210> 44
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
actcaaccta taacttatat tattaaca 28
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
caaaaaaaca cccctacaca tacac 25
<210> 46
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gtttgtgaat ttgtttagtt agattttat 29
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctatctacta atataattta atacaaaaac a 31
<210> 48
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgtgtttgtg tttaggtagt gtgtttgtta t 31
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ttagtaagga agatgattta tt 22
<210> 50
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aactcaatac ttcccccaaa ca 22
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agggatgagg agtttgatga ggg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtgtagagtg atgatgaggt ggt 23
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caaaatcaaa tcacaacttc acaccaatca 30
<210> 54
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cacttaaaca ttcacataaa cactcaacc 29

Claims (16)

1.一种用于筛查三体综合症的组合套装，其特征在于，其包括具有检测：
去甲基化的目标基因：21号染色体上的HLCS基因或其片段、21号染色体上的DSCR8基因或其片段、18号染色体上的SERPINB5或其片段、18号染色体上的NFATC1或其片段、13号染色体上的FLT1基因或其片段、13号染色体上的SUGT1L1基因或其片段、13号染色体上的COL4A1基因或其片段，或它们中的两种或两种以上基因或基因片段的组合中的去甲基化DNA片段数量；
和
去甲基化的参照基因：1号染色体上的RUNX3基因或其片段、6号染色体上的PPT2基因或其片段，或1号染色体上的RUNX3基因或其片段或和6号染色体上的PPT2基因及其片段中的去甲基化DNA片段数量的，
检测单元。
2.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，其进一步包括具有提取、分离患者离体样品中的，
21号染色体上的HLCS基因或其片段、21号染色体上的DSCR8基因或其片段、18号染色体上的SERPINB5或其片段、18号染色体上的NFATC1或其片段、13号染色体上的FLT1基因或其片段、13号染色体上的SUGT1L1基因或其片段、13号染色体上的COL4A1基因或其片段，或它们中的两种或两种以上基因或其片段的组合；
和
1号染色体上的RUNX3基因或其片段、6号染色体上的PPT2基因或其片段，或1号染色体上的RUNX3基因或其片段和6号染色体上的PPT2基因或其片段的组合的，
提取单元。
3.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，其进一步包括：具有将所述目标基因或其片段，对照基因或其片段中的未甲基化的CpG二核苷酸中的胞嘧啶转化为尿嘧啶或在杂交性能方面可检测地不同于胞嘧啶的其他碱基的，
转化单元。
4.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述目标基因序列选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25序列，或它们中的两种或两种以上组合，其中所述
SEQ ID NO：1为HLCS基因的目标序列；
SEQ ID NO：2为DSCR8基因的目标序列；
SEQ ID NO：3为SERPINB5基因的目标序列；
SEQ ID NO：4为NFATC1基因的目标序列；
SEQ ID NO：5为FLT1基因的目标序列；
SEQ ID NO：6为SUGT1L1基因的目标序列；
SEQ ID NO：7为COL4A1基因的目标序列；
SEQ ID NO：10为去甲基化的HLCS基因转化的序列；
SEQ ID NO：11为去甲基化DSCR8基因转化的序列；
SEQ ID NO：12为去甲基化SERPINB5基因转化的序列；
SEQ ID NO：13为去甲基化NFATC1基因转化的序列；
SEQ ID NO：14为去甲基化FLT1基因转化的序列；
SEQ ID NO：15为去甲基化SUGT1L1基因转化的序列；
SEQ ID NO：16为去甲基化COL4A1基因转化的序列；
SEQ ID NO：19为去甲基化HLCS基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：20为去甲基化DSCR8基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：21为去甲基化SERPINB5基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：22为去甲基化NFATC1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：23为去甲基化FLT1基因互补序列转化后的序列；
SEQ ID NO：24为去甲基化SUGT1L1基因互补序列转化后的序列；或
SEQ ID NO：25为去甲基化COL4A1基因互补序列转化后的序列。
5.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述参照基因序列选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，SEQID NO：18，SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27序列，或它们中的两种或两种以上组合；其中所述
SEQ ID NO：8为RUNX3基因的目标序列；
SEQ ID NO：9为PPT2基因的目标序列；
SEQ ID NO：17为去甲基化RUNX3基因转化的序列；
SEQ ID NO：18为去甲基化PPT2基因转化的序列；
SEQ ID NO：26为去甲基化RUNX3基因互补序列转化后的序列；或
SEQ ID NO：27为去甲基化PPT2基因互补序列转化后的序列。
6.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述目标基因选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：19，SEQ IDNO：20，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：25序列SEQ ID NO：1-27的序列中至少9个、优选至少15个核苷酸长度的核酸。
7.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述参照基因选自含有等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交的SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：18，SEQ ID NO：26，或SEQ ID NO：27序列中至少9个、优选至少15个核苷酸长度的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述核目标基因或参照基因的核苷酸序列中包含至少一个CpG二核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述检测单元进一步包括：400-900nM引物、250-400nM探针、0.1-1 U DNA聚合酶、50-400uM的各个dNTP、1-10mM的镁离子和1×PCR缓冲液。
10.根据权利要求2所述的组合套装，其特征在于，所述提取单元的中样品为血浆、血清、全血、羊水或羊水细胞；优选血浆。
11.根据权利要求3所述的组合套装，其特征在于，所述转化单元进一步包括亚硫酸氢盐、焦亚硫酸盐(disulfite)、或其组合；优选亚硫酸氢盐。
12.根据权利要求9所述的组合套装，其特征在于，所述检测单元进一步包括引物：
HLCS引物F:SEQ ID NO：28，HLCS引物R:SEQ ID NO：29；
DSCR引物F:SEQ ID NO：31，DSCR引物R:SEQ ID NO：32；
SERPINB5引物F:SEQ ID NO：34，SERPINB5引物R:SEQ ID NO：35；
NFATC1引物F:SEQ ID NO：37，NFATC1引物R:SEQ ID NO：38；
FLT1引物F:SEQ ID NO：40，FLT1引物R:SEQ ID NO：41；
SUGT1L1引物F:SEQ ID NO：43，SUGT1L1引物R:SEQ ID NO：44；或
COL4A1引物F:SEQ ID NO：46，COL4A1引物R:SEQ ID NO：47；或它们中两对或两对以上组合，和
RUNX3引物F:SEQ ID NO：49，RUNX3引物R:SEQ ID NO：50；或
PPT2引物F:SEQ ID NO：52，PPT2引物R:SEQ ID NO：53，或它们两对的组合。
13.根据权利要求12所述的组合套装，其特征在于，所述检测单元进一步包括引物：
HLCS引物F:SEQ ID NO：28，HLCS引物R:SEQ ID NO：29；
DSCR引物F:SEQ ID NO：31，DSCR引物R:SEQ ID NO：32；
SERPINB5引物F:SEQ ID NO：34，SERPINB5引物R:SEQ ID NO：35；
NFATC1引物F:SEQ ID NO：37，NFATC1引物R:SEQ ID NO：38；
FLT1引物F:SEQ ID NO：40，FLT1引物R:SEQ ID NO：41；
SUGT1L1引物F:SEQ ID NO：43，SUGT1L1引物R:SEQ ID NO：44；和
COL4A1引物F:SEQ ID NO：46，COL4A1引物R:SEQ ID NO：47；和
RUNX3引物F:SEQ ID NO：49，RUNX3引物R:SEQ ID NO：50；和PPT2引物F:SEQ ID NO：52，PPT2引物R:SEQ ID NO：53。
14.根据权利要求9所述核酸的组合套装，其特征在于，所述检测单元进一步包括探针为：
HLCS探针:SEQ ID NO：30；
DSCR探针:SEQ ID NO：33，
SERPINB5探针:SEQ ID NO：36；
NFATC1探针:SEQ ID NO：39；
FLT1探针:SEQ ID NO：42；
SUGT1L1探针:SEQ ID NO：45；或
COL4A1探针:SEQ ID NO：48，或它们中两种或两种以上的组合物；和
RUNX3探针:SEQ ID NO：51；或
PPT2探针:SEQ ID NO：54，或其两种的组合。
15.根据权利要求14所述核酸的组合套装，其特征在于，所述检测单元进一步包括探针为：
HLCS探针:SEQ ID NO：30；
DSCR探针:SEQ ID NO：33，
SERPINB5探针:SEQ ID NO：36；
NFATC1探针:SEQ ID NO：39；
FLT1探针:SEQ ID NO：42；
SUGT1L1探针:SEQ ID NO：45；和
COL4A1探针:SEQ ID NO：48，和，
RUNX3探针:SEQ ID NO：51；和
PPT2探针:SEQ ID NO：54。
16.根据权利要求1所述的组合套装，其特征在于，所述检测单元进一步包括计算目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值，
并,
当目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值时≥1.3时定义为阳性，即为三体综合征；
当目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值≤1.2定义为阴性，即为正常；
或
当目标基因和参考基因的去甲基化DNA片段数量的比值介于1.2和1.3之间定义为无效检测。
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