ES2965036T3 - Detección de aneuploidías cromosómicas fetales usando regiones de ADN que están metiladas diferencialmente entre el feto y la mujer embarazada - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a métodos para detectar una aneuploidía cromosómica en un feto de una mujer embarazada. Dichos métodos se basan en una o más de configuraciones y/o detecciones y/o análisis particulares de dos o más regiones de ADN, incluidas aquellas que muestran metilación diferencial entre ADN que se origina a partir de células de un feto (y/o de la placenta de un feto) y ADN de origen materno. Dichos métodos utilizan una muestra tomada de dicha mujer embarazada, muestra que comprende ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto en mezcla con ADN de origen materno metilado de manera diferente. Dichos métodos tienen utilidad diagnóstica, pronóstica y/o predictiva; en particular para la detección/diagnóstico de aneuploidía cromosómica, tal como una trisomía, en un feto, y/o para detectar un mayor riesgo de que una mujer embarazada sufra o desarrolle una afección médica asociada al embarazo. La presente invención también se refiere a composiciones, kits, productos de programas informáticos y otros aspectos que pueden usarse, ser útiles o estar relacionados con la práctica de dichos métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Detección de aneuploidías cromosómicas fetales usando regiones de ADN que están metiladas diferencialmente entre el feto y la mujer embarazada
La presente invención se refiere a métodos para detectar una aneuploidía cromosómica en un feto de una mujer embarazada. Dichos métodos se basan en una o más configuraciones y/o detecciones y/o análisis particulares de dos o más regiones de ADN, incluyendo aquellos que muestran metilación diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto (y/o la placenta de un feto) y el ADN de origen materno. Dichos métodos utilizan una muestra tomada de dicha mujer embarazada, cuya muestra comprende ADN que se origina a partir de células de un feto y/o de la placenta de un feto en mezcla con ADN de origen materno metilado de manera diferente. Estos métodos tienen utilidad diagnóstica, pronóstica y/o predictiva; en particular, para la detección/el diagnóstico de aneuploidías cromosómicas, tales como una trisomía, en un feto, y/o para detectar un riesgo aumentado de que una mujer embarazada sufra o desarrolle una afección médica asociada al embarazo.
En la mayoría de los países desarrollados, muchas mujeres embarazadas se someten a pruebas prenatales cuyo objetivo principal es la identificación de aneuploidías cromosómicas en el feto en desarrollo. Hasta hace poco, casi todas las pruebas prenatales fiables eran invasivas, tales como el muestreo de vellosidades coriónicas (CVS) o la amniocentesis, y conllevaba un riesgo no despreciable de aborto espontáneo relacionado con el procedimiento a pesar de que se ha informado que la precisión diagnóstica de dichas pruebas está entre el 97 % y el 99,8 % (para una revisión, véase Norwitz & Levy 2013, Rev Obs Gyn 6:48). Las pruebas prenatales no invasivas convencionales para la aneuploidía cromosómica fetal incluyen la detección mediante ecografía y/o análisis de diversos marcadores bioquímicos del suero materno. Sin embargo, estas pruebas están dirigidas principalmente a la detección del síndrome de Down (trisomía del cromosoma 21 (T21) y, en menor medida, T18). Sin embargo, con tasas de detección informadas de solamente el 75 % al 96 % (dependiendo del método de detección usado) y con tasas de falsos positivos que varían del 5 % al 10 %, tales ecografías y análisis del suero materno se consideran comúnmente solo como procedimientos de detección, requiriendo ambos seguimiento mediante CVS o amniocentesis en casos con resultados positivos para un diagnóstico definitivo de una anomalía cromosómica en el feto (Norwitz y Levy 2013).
El descubrimiento de ADN extracelular circulante (ADNec) en la circulación materna que se origina en el feto (Lo et al 1997, Lancet 350:485) ha proporcionado un enfoque alternativo para el desarrollo de ensayos para pruebas prenatales no invasivas (NIPT, por sus siglas en inglés), incluyendo ensayos para la determinación del sexo fetal (Lo et al 1997), así como pruebas de Rh D fetal en embarazos en los que la madre es Rh D negativa (Lo 1998, N Eng J Med 229:1734). Sin embargo, dado que dicho ADNec fetal existe como una fracción menor del ADNec total aislado del plasma material (Lo et al 1998, Am J Hum Genet 63:768), la detección de aneuploidías cromosómicas fetales usando ADNec fetal del plasma materno sigue siendo un desafío. La aplicación de tecnologías de secuenciación de última generación (NGS, por sus siglas en inglés) de alto rendimiento ha permitido secuenciar las contribuciones tanto fetales como maternas al ADNec en el plasma materno, y solo en los últimos años ha sido posible ofrecer NIPT basada en NGS para el cromosoma 21 y determinadas otras aneuploidías fetales comunes de forma rutinaria en mujeres embarazadas, por ejemplo, con la llegada y la disponibilidad general de pruebas comerciales. Las pruebas disponibles en el mercado pueden usar NGS aleatorios tales como "MATERNIT21" (www.sequenom.com), "PRENATEST" (www.lifecodexx.com), "VERIFI" (www.illumina.com) o IONA (www.premaitha.con) o pueden usarse enfoques direccionados, cuyo objetivo es enriquecer regiones genómicas específicas de interés antes de la secuenciación para reducir el número de etiquetas de secuencia necesarias para realizar un análisis estadístico fiable (por ejemplo, "HARMONY" www.ariosadx.com o "PANORAMA" www.natera.com), análisis de polimorfismo o PCR digital (para una revisión, véase Go et al 2011, Human Reprod Update 17:372).
Hasta la fecha, tales NIPT disponibles en el mercado que siguen un enfoque de secuenciación requieren el uso de equipos complicados y muy costosos tales como secuenciadores masivamente paralelos, y tienen un tiempo de entrega de varios a diez días; impulsado en gran medida por la necesidad de un procesamiento sustancial de muestras antes del análisis. Por ejemplo, NIPT para la aneuploidía fetal mediante NGS requiere la etapa, que requiere mucho tiempo y dinero, que consiste en una llamada "biblioteca de secuenciación" de multimillones de fragmentos individuales de ADNec aislado. Las NIPT alternativas que siguen a la PCR digital requieren el uso de equipos y tecnologías que normalmente no están disponibles excepto en laboratorios de investigación muy especializados y localizados, y a un precio relativamente bajo en todo momento (Hindson et al 2011, Anal Chem 83:8604).
Reconociendo esta importante limitación de la NIPT de ADNec, una serie de investigaciones han tratado de investigar y desarrollar formas alternativas, y en particular más baratas y rápidas, de llevar a cabo NIPT para la aneuploidía fetal. Muchas de estas alternativas para NIPT se han centrado en el uso de características fetales específicas del ADN fetal que se encuentra en el plasma materno (tales como especies específicas o polimorfismos en el ADNec fetal). En particular, la presencia de regiones de ADN que están específicamente metiladas en el ADN fetal en comparación con el ADN materno ha llevado a esfuerzos sustanciales en el uso de dichos marcadores epigenéticos para NIPT de cromosomas fetales de interés.
La primera demostración del uso de un marcador epigenético para identificar específicamente el ADN fetal en el plasma materno se realizó ya en 2002 (Poon et al 2002, Clin Chem 48:35; documento WO 2003/020974), aunque la utilidad del marcador usado se limitó a ciertos pares feto-materno ya que era polimórfico-dependiente. Un marcador epigenético fetal específico de feto aplicable más generalmente fue la forma metilada del gen del miembro 5 del clado B del inhibidor de la serpina peptidasa (también conocido como maspina) ("U-maspina" o "U-SERPINAB5") que se identificó en 2005 siguiendo un enfoque de gen candidato (Chim et al 2005, PNAS 102:14753). El gen maspina está ubicado en el cromosoma 18 humano, y el principio demostró por primera vez que la identificación no invasiva de la trisomía 18 fetal podría realizarse usando dicho marcador epigenético (Tong et al 2006, Clin Chem 52:2194; documento WO 2005/118852).
Con tal demostración en principio, varios grupos se propusieron identificar otros marcadores epigenéticos fetales, en particular aquellos en cromosomas asociados con aneuploidía fetal tales como el cromosoma 21 (por ejemplo, Old et al 2007, Reprod Biomed Online; Chim at al 2008, Clin Chem 54:500; Papageorgiou et al 2009. Am J Pathol 174:1609; documento WO 2007/132166; documento WO 2007/132167; documento WO 2011/034631; y documento WO 2011/092592), con el objetivo de explotar dichos marcadores epigenéticos para NIPT de aneuploidía fetal cuantificando, por ejemplo, una secuencia derivada del cromosoma 21 en ADNec fetal identificado epigenéticamente, con respecto a una secuencia de referencia derivada de otro autosoma o cromosoma sexual (por ejemplo, Old et al 2007).
Algunos de estos marcadores epigenéticos se han investigado como herramientas para NIPT. De hecho, la forma no metilada del gen de la fosfodiesterasa 9A (U-PDE9A) se ha usado en una prueba NIPT para la trisomía 21 fetal (Lim et al 2011, PLoS One 6:e27709). En otro estudio, la forma metilada del gen de la holocarboxilasa sintetasa (M-HLCS) se ha usado como marcador epigenético fetal para comparar la dosis relativa del cromosoma 21 normalizada con las concentraciones de un marcador genético fetal, el gen de la proteína del dedo de cinc ligado a Y (ZFY), en el cromosoma Y. Se demostró que este enfoque epigenético-genético ("EGG", por sus siglas en inglés) es útil para la detección no invasiva de la trisomía 21 fetal (Tong et al 2010, Clin Chem 56:90). Usando un enfoque diferente, Papageorgiou y sus colaboradores describieron el uso de un enfoque de inmunoprecipitación y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) en tiempo real para cuantificar la cantidad relativa de un cromosoma 21 de regiones diferencialmente metiladas (DMR) específicas del feto en comparación con el ADN materno de sangre total, para argumentar que el ligero exceso en la cantidad del cromosoma 21 en los casos de trisomía podría detectarse y diagnosticarse de trisomía 21 fetal (Papageorgiou et al 2011, Nat Med 17:510), y plantearon la hipótesis de que una combinación de DMR y no un solo DMR puede ser capaz de dar una NIPD precisa de casos normales y de trisomía 21. En un estudio posterior, se informó que en un estudio de validación ciego más amplio, este enfoque demostró una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 99,2 (Tsaliki et al 2012, Prenat Diag 21:996). Este enfoque no solo requiere una etapa engorrosa y técnicamente desafiante de inmunoprecipitación del ADN metilado (MeDiP), sino que se han planteado importantes preocupaciones técnicas sobre el uso de este enfoque (Tong et al 2012, Nat Med 18:1327). En particular, que al usar este enfoque no es posible concluir que la observación de un nivel elevado de metilación del ADN fetal de los marcadores del cromosoma 21 en la sangre materna se deba a la presencia de un feto con trisomía 21, en comparación con un feto euploide que libera una gran cantidad de ADN fetal extracelular circulante o una gran cantidad de células fetales en la sangre materna. En su comentario sobre el enfoque MeDiP, Tong y sus colaboradores sugieren que se podría incluir una etapa de normalización para controlar las variaciones en las concentraciones de ADN fetal usando marcadores epigenéticos fetales fuera del cromosoma 21, pero que el estudio publicado anteriormente usando RASSF1, un gen en el cromosoma 3, ha indicado que, en comparación con el enfoque EGG, el efecto de dicha normalización suele ser subóptimo, incluso para los tejidos placentarios, que contienen principalmente ADN fetal (Tong et al 2010).
Sin embargo, en un estudio reciente, comenzando con una etapa para enriquecer el ADN metilado del cebador materno, Lim y sus colaboradores usan qPCR convencional para medir la dosificación relativa del cromosoma 21 (usando M-HLCS) en comparación con el cromosoma 3 de referencia (M-RASSF1A) para informar una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 92,5 % en la detección prenatal no invasiva de trisomía 21 fetal (Lim et al 2014, Clin Chem Lab Med 52:641). A pesar de esta aparente mejora con respecto al trabajo inicial informado por Tong y colaboradores (Tong et al 2010), se ha informado que hay margen de mejora para el enfoque de Lim (Chim 2014, Clin Chem Lab Med 52:585). De hecho, para explorar formas de mejorar el rendimiento del uso de marcadores epigenéticos fetales para NIPT para la trisomía 21 fetal, Chim tabuló las características más destacadas de otros estudios similares a Lim (véase la TABLA A, adaptada de Chim 2014)
TABLA A: Estudios sobre la detección prenatal no invasiva de la trisomía 21 usando marcadores epigenéticos _________________________________fetales (adaptado de Chim 2014)________________________________E s tu d io P re tra ta m ie n to * C a n t. M a rc a d o r M a rc a d o r N a tu ra le z a S e n s ib ilid a d E s p e c if ic id a d d e de l
re fe re n c ia m a rc a d o r fe ta l (C r) d e re fTong et PCR al 2010<MSRE>digitalM-HLCS ZFY Genética
'MSRE: digestión con enzimas de restricción sensibles a la mutilación; MBD: enriquecimiento basado en el dominio de unión de metil-CpG;_______________________________________________________________________________________________
Chim resume que: (a) la PCR digital parece ofrecer mejor sensibilidad y especificidad, en comparación con la cuantitativa convencional y sugieren que al traducir la naturaleza exponencial pero analógica de qPCR en una señal '1' o '0' en PCR digital, las plataformas de recuento digital deberían facilitar una cuantificación más precisa y exacta; y (2) el uso de marcadores genéticos fetales parece dar una mejor sensibilidad y especificidad, que los marcadores epigenéticos fetales, para cuantificar un cromosoma de referencia para el análisis de dosificación relativa de cromosomas. De hecho, presentando de manera similar los resultados obtenidos por Tong y colaboradores (2010) en su estudio comparativo del enfoque EGG en comparación con el enfoque epigenéticoepigenético análogo, Chim describe que la normalización frente a un marcador epigenético fetal, a saber, M-RASSF1A ubicado en el cromosoma 3, Tong y sus colaboradores descubrieron que la dosis relativa del cromosoma 21 en más de la mitad de los estudios de placentas con trisomía 21 se superponía con el intervalo de referencia euploide (normal), lo que daba lugar a una sensibilidad inviable del 25 % (véase la TABLA B).
TABLA B: Datos de Tong et al (2010) sobre la detección prenatal de la trisomía 21 usando marcadores genéticos ____________________ o epigenéticos fetales como referencia (adaptado de Chim 2014)____________________
M a rc a d o r N a tu ra le z a
C a n t. M a rc a d o r d e de l
M u e s tra P re tra ta m ie n to * S e n s ib ilid a d E s p e c if ic id a d M é to d o fe ta l C r21 re fe re n c ia m a rc a d o r
fe ta l (C r) d e re f
Placenta MSRE<PCR>
digitalM-HLCS M-RASSF1AEpigenética 25,0 % 100,0 % Placenta MSRE<PCR>
digitalM-HLCS ZFY Genética 100,0 % 100,0 % Plasma PCR
materno<MSRE>digitalM-HLCS ZFY Genética 100,0 % 95,8 %
Por lo tanto, a pesar de que existe una necesidad desde hace mucho tiempo de mejorar la NIPT para las aneuploidías fetales y, desde 2002, la posibilidad teórica de usar marcadores epigenéticos específicos del feto para hacerlo, hasta la fecha no ha habido un enfoque satisfactorio, fiable, sensible, específico, rentable y/o técnicamente directo para hacerlo. De hecho, incluso en su reciente revisión, Chim sostiene que todavía es necesaria una mejora y concluye que solo el uso de una plataforma de PCR digital y la normalización con un marcador genético fetal mejorarán aún más el rendimiento de dichas pruebas basadas en epigenética. Sin embargo, los enfoques de PCR digital requieren el uso de aparatos técnicamente desafiantes que normalmente no están disponibles excepto en laboratorios de investigación muy especializados y localizados, y el uso de un marcador genético fetal (es decir, uno que sea genéticamente diferente al genoma materno) limita la aplicabilidad de tales pruebas solo a ciertos pares feto-materno donde existe tal diferencia genética (tales como fetos masculinos y el uso de ZFY como el marcador genético) y requiere pruebas genéticas o de sexo adicionales para tal diferencia genética antes de que se pueda interpretar la NIPt para aneuploidía fetal.
En consecuencia existe una necesidad, de una o más de las perspectivas anteriores, de métodos mejorados, y otros aspectos relacionados, para detectar, indicar o diagnosticar la presencia de una aneuploidía cromosómica en un feto en tales métodos particulares que son no invasivos y/o usan procesamiento más convencional, etapas/equipo técnicos y/o de detección y, por lo tanto, pueden llevarse a cabo más rápido, de forma más rentable y/o más ampliamente en el mundo en la comunidad.
En consecuencia, es un objeto de la presente invención proporcionar, medios o métodos alternativos, mejorados, más sencillos, más baratos y/o integrados que aborden uno o más de estos u otros problemas. Un objeto tal subyacente de la presente invención se resuelve mediante la materia objeto como mediante la materia objeto de las reivindicaciones adjuntas.
El documento WO 00/47764 A2 (17 de agosto de 2000) desvela un kit de prueba y un método específico para detectar cualitativa y cuantitativamente ADN en productos alimenticios.
El documento WO 2012/007783 A1 (19 de enero de 2012) se refiere a métodosin vitrooex vivopara determinar un tratamiento contra el cáncer de un sujeto que tiene un tumor.
El documento WO 2011/018600 A1 (17 de febrero de 2011) desvela un método no invasivo para detectar aneuploidía cromosómica analizando una muestra de una mujer embarazada basándose en la proporción entre la cantidad de un marcador de metilación fetal ubicado en un cromosoma relevante a la aneuploidía y la cantidad de un marcador genético fetal ubicado en un cromosoma de referencia.
El documento WO 03/062441 A1 (31 de julio de 2003) se refiere a métodos no invasivos para distinguir ADN fetal del ADN materno y, de esta manera, detectar aneuploidías fetales.
Hahnet al.(Placenta, Vol. 32, pp.S17-S20, 2011) desvelan el uso de ácidos nucleicos extracelulares circulantes en el plasma y el suero maternos como biomarcadores para el diagnóstico temprano de preeclampsia, detectando cambios cuantitativos del ADN fetal extracelular circulante en el plasma materno.
Generalmente, ya modo de descripción breve, los aspectos principales de la presente invención pueden describirse como sigue:
En un primer aspecto, la invención se refiere aun métodopara detectar una aneuploidía cromosómica en un feto en una mujer embarazada, comprendiendo dicho método las etapas:
(a) proporcionar una muestra que se ha tomado de dicha mujer embarazada, cuya muestra comprende ADN que se origina a partir de células de un feto y/o de la placenta de un feto en mezcla con ADN de origen materno metilado de manera diferente;
(b) tratar el ADN presente en dicha muestra con un reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado;
(c) determinar una cantidad de una primera especie de ADN diana, siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más regiones metiladas de forma diferencial (DMR) ubicadas en dicho cromosoma, dichas DMR diana metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de la primera DMR diana por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR diana indica dicha cantidad de primera especie de ADN diana en dicha muestra;
(d) determinar una cantidad de especies de ADN de referencia, siendo uno o más cromosomas de referencia, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más DMR de referencia ubicadas en dicho cromosoma o cromosomas de referencia, dichas DMR de referencia metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de dichas DMR de referencia por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR de referencia indica dicha cantidad de especie de ADN de referencia en dicha muestra; y
(e) determinar cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, de una cantidad determinada de la etapa (c) y una cantidad determinada de la etapa (d), en donde una o más de dicha cantidad o cantidades relativas indica la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto,
en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y/o (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana opcionalmente, en donde en la etapa (e) dicha cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones se comparan con distribución o distribuciones umbral y/o de referencia, en donde una o más de dichas cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones más altas o más baja que dicha distribución o distribuciones umbral y/o de referencia indican la presencia de la aneuploidía cromosómica en el feto.
En algunas realizaciones, un método tal comprende además la etapa:
(f) determinar una cantidad de ADN total en dicha muestra detectando al menos una región distinta (OR) que no está metilada de forma diferencial entre el ADN que se origina de las células de un feto y/o la placenta de un feto y ADN de origen materno, cuya modificación de las OR por dicho reactivo es insensible a la metilación de ADN, en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa (f) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y dicha región o regiones distintas y, usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y/o (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana y para al menos una de dicha o dichas OR.
En algunas realizaciones, la detección de la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), se llevan a cabo usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente de reacción/detección, y de forma eficaz simultáneamente entre sí y por PCR basada en sonda cuantitativa en tiempo real múltiplex usando al menos una sonda marcada específica para cada una de dichas DMR y OR opcional u opcionales.
En algunas realizaciones, se realiza una pluralidad de conjuntos de determinaciones para la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), realizado cada conjunto de dichas determinaciones usando una alícuota diferente de ADN de dicha muestra, en un recipiente diferente y de forma eficaz simultáneamente con cada otro miembro de la pluralidad de conjuntos de determinaciones, opcionalmente, en donde la cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones determinadas en la etapa (e) se determinan a partir de dicha pluralidad de conjuntos de determinaciones hechas para la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), preferentemente usando una cantidad promedio de ADN determinada para cada conjunto, tal como una cantidad media, mediana o moda de ADN determinada para cada conjunto, preferentemente una cantidad media de ADN determinada para cada conjunto.
En algunas realizaciones, dicho método se lleva a cabo en una pluralidad de muestras tomadas cada una de una mujer embarazada diferente, llevando a cabo cada método en un recipiente separado y de forma eficaz simultáneamente con cada miembro distinto de la pluralidad de muestras; opcionalmente, en donde dicha pluralidad de muestras está entre 2 y aproximadamente 500 muestras, tal como entre 2 y aproximadamente 200, entre 2 y aproximadamente 100 o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 muestras; preferentemente en donde dicha pluralidad de muestras se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 y 140 muestras tomadas cada una de una mujer embarazada diferente.
En algunas realizaciones, una cantidad de la primera especie de ADN diana se determina a partir de la cantidad detectada de metilación en una de las DMR diana y una cantidad de la primera especie de ADN diana se determina a partir de la cantidad detectada de metilación en otra de la DMR diana, en donde dos o más cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, se determinan en la etapa (e) para dos o más cantidades de la primera especie de ADN diana, cada una con respecto a una o más de dichas DMR diana, y en donde dos o más de dicha cantidad o cantidades relativas o proporciones indican la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto, opcionalmente, en donde en la etapa (e) dos o más de dicha cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones se comparan con distribución o distribuciones umbral y/o de referencia, en donde dos o más de dichas cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones más altas o más baja que dicha distribución o distribuciones umbral y/o de referencia indican la presencia de la aneuploidía cromosómica en el feto.
En algunas realizaciones, dicha especie de ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto es ADN extracelular circulante y dicha muestra es una fracción de sangre tal como plasma o suero.
En algunas realizaciones, dicho reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado comprende bisulfito.
En algunas realizaciones, dicho reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado comprende un agente que digiere selectivamente ADN no metilado sobre metilado, preferentemente en donde, dicho agente comprende: al menos una enzima sensible a metilación, al menos una enzima de restricción sensible a metilación y/o un agente seleccionado del grupo que consiste en: AatII, Acil, AcII, Afel, Agel, Agel-HF, Asci, AsiSl, Aval, BceAl, BmgBl, BsaAl, BsaHl, BsiEI. BsiWl, BsmBl, BspDl, BsrFl, BssHII, BstBl, BstUI, Clal, Eagl, Faul, Fsel, Fspl, Haell, Hgal, Hhal, HinP1I, Hpall, Hpy99I, HpyCH4IV, Kasl, Mlul, Nael, Narl, NgoMIV, Notl, Notl-HF, Nrul, Nt.BsmAl, Nt.CviPII, PaeR7I, PluTI, Pmll, Pvul, Pvul-HF, Rsrll, Sacll, Sall, Sall-HF, Sfol, SgrAl, Smal, SnaBI, TspMI y Zral.
En algunas realizaciones, dichas DMR comprenden al menos uno, preferentemente al menos dos, sitio o sitios de metilación específicos para dicho reactivo.
En algunas realizaciones, dos o más de dichas DMR de referencia se ubican en diferentes cromosomas de referencia.
En algunas realizaciones, donde el método comprende la etapa opcional (f), dicha o dichas OR se ubican en uno o más del cromosoma o cromosomas de referencia, preferentemente al menos una de dicha o dichas OR estando ubicada en el mismo cromosoma o cromosomas de referencia que al menos una de dicha o dichas DMR de referencia, opcionalmente, dicha OR está ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de una de dichas DMR de referencia.
En algunas realizaciones, donde el método comprende la etapa opcional (f), dicha detección en la etapa (f) comprende usar al menos dos de dichas OR, preferentemente en donde, el número de dichas OR es el mismo que el número de DMR de referencia usadas en la etapa (d), más preferentemente en donde, una de dichas OR se ubica en el mismo cromosoma que, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de, una DMR de referencia usada en la etapa (d) y otra de cada dichas OR está ubicada en el mismo cromosoma que, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de, otra de dichas DMR de referencia.
En algunas realizaciones, dicho cromosoma relevante a la aneuploidía cromosómica es un cromosoma humano seleccionado de la lista que consiste en: cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, cromosoma X y cromosoma Y, preferentemente cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, lo más preferentemente cromosoma 21, en donde dicha aneuploidía cromosómica es una aneuploidía de dicho cromosoma, preferentemente una trisomía de dicho cromosoma.
En algunas realizaciones, dicho cromosoma relevante a la aneuploidía cromosómica es el cromosoma 21 humano, en donde dicha aneuploidía cromosómica es una trisomía del cromosoma 21 humano.
En algunas realizaciones, cada cromosoma de referencia es un cromosoma humano seleccionado independientemente de la lista que consiste en: cromosoma 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, cromosoma 14, 15, 16, 17, cromosoma 19, cromosoma 20, cromosoma 22 y cromosoma 23, preferentemente cromosoma 5 o cromosoma 12.
En algunas realizaciones, una DMR de referencia está ubicada en el cromosoma 5 humano, otra DMR de referencia está ubicada en el cromosoma 12 humano y, opcionalmente, cada una de dichas DMR diana está ubicada en el cromosoma 21 humano, en el cromosoma 18 humano o en el cromosoma 13 humano, preferentemente en el cromosoma 21 humano.
En algunas realizaciones, dichas DMR están hipermetiladas en el ADN fetal e hipometiladas en el ADN materno.
En algunas realizaciones, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de:
(A) una seleccionada de la lista que consiste en: SEQ ID NO. 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 y 199 o la lista que consiste en: AIRE, SIM2 y ERG o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o la lista que consiste en: PDE9A, PPP1R2P2, CBR1, DSCAM, C21orf29 y HLCS o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o C21 orf57 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o la lista que consiste en:
SEQ ID NO. 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161,
162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183,
184, 185, 186 y 187; y/o
(B) VAPA-APCDDI o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o maspina o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o la lista que consiste en: SEQ ID NO. 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45 y 46; y/o C) la lista que consiste en: SEQ ID NO. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 y 34.
En algunas realizaciones, al menos una de dichas DMR diana está ubicada en una parte del genoma y/o un gen que es DSCAM y/o C21 orf57, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o una de dichas DMR diana está ubicada en SEQ ID NO: 51 y otra de dichas DMR diana está ubicada en Se Q ID NO: 185.
En algunas realizaciones, cada una de dichas DMR de referencia está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de: la lista que consiste en: RASSF1A, TBX3, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, SOX14 y SPN o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o la lista que consiste en: SEQ ID NO: 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146 y 147.
En algunas realizaciones, dicho reactivo comprende una enzima de restricción sensible a la metilación.
En algunas realizaciones, dicho reactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en: BstUI, Hha I y Hpall y Acil, dicho reactivo comprende dos, tres, cuatro, cinco o más enzimas de restricción sensibles a la metilación y/o dicho reactivo comprende o consiste esencialmente en dos o tres de las enzimas de restricción sensibles a la metilación seleccionadas del grupo que consiste en: BstUI, Hha I y Hpall.
En algunas realizaciones, la mujer embarazada es un ser humano.
En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para detectar un riesgo aumentado de que una mujer embarazada sufra o desarrolle preeclampsia; comprendiendo dicho método las etapas:
(i) llevar a cabo:
(a) proporcionar una muestra que se ha tomado de dicha mujer embarazada, cuya muestra comprende ADN que se origina a partir de células de un feto y/o de la placenta de un feto en mezcla con ADN de origen materno metilado de manera diferente;
(b) tratar el ADN presente en dicha muestra con un reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado;
(c) determinar una cantidad de una primera especie de ADN diana, siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más DMR diana ubicadas en dicho cromosoma, dichas DMR diana metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de las DMR diana por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR diana indica dicha cantidad de primera especie de ADN diana en dicha muestra;
(d) determinar una cantidad de especies de ADN de referencia, siendo uno o más cromosomas de referencia, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más DMR de referencia ubicadas en dicho cromosoma o cromosomas de referencia, dichas DMR de referencia metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de dichas DMR de referencia por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR de referencia indica dicha cantidad de especie de ADN de referencia en dicha muestra; y (e) determinar cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, de una cantidad determinada de la etapa (c) y una cantidad determinada de la etapa (d), en donde una o más de dicha cantidad o cantidades relativas indica la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto, (f) determinar una cantidad de ADN total en dicha muestra detectando al menos una OR que no está metilada de forma diferencial entre el ADN que se origina de las células de un feto y/o la placenta de un feto y ADN de origen materno, cuya modificación de las OR por dicho reactivo es insensible a la metilación de ADN,
en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa (f) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y dicha o dichas OR y usar: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana y para al menos una de dicha o dichas OR y comprendiendo además las etapas
• determinar una cantidad de ADN en una muestra patrón de ADN de cantidad conocida con respecto a las mismas DMR usadas en la etapa (c) y la etapa (d) y en la etapa (f); y
• comparar cada una de las señales detectadas a partir de dicha muestra patrón de ADN con las señales respectivas detectadas en la etapa (c) y la etapa (d) y en la etapa (f),
en donde la muestra patrón de ADN es una muestra de ADN genómico humano de concentración conocida; y en donde en cada una de dichas etapas de determinación cada una de dichas cantidades determinadas de dicha primera especie de ADN diana y de la especie de ADN de referencia, se expresa como una cantidad absoluta de dicha especie de ADN en dicha muestra,
(ii) determinar una cantidad absoluta de ADN fetal presente en la muestra y
(iii) comparar la cantidad de ADN fetal determinada con un umbral y/o distribución de referencia,
en donde un aumento en o una desviación de, la cantidad de dicho ADN fetal a partir de dicho umbral y/o distribución de referencia indica un riesgo aumentado de que la mujer embarazada sufra o desarrolle preeclampsia.
Las figuras muestran:
La FIGURA 1 representa: (a) una representación esquemática de la región o regiones metiladas de forma diferencial ("DMR") y otra u otras regiones ("OR") usadas en un primer método de detección de ADN basado en metilación diferencial; y (b) una representación esquemática de la región o regiones metiladas de forma diferencial ("DMR") y otra u otras regiones ("OR") usadas en un segundo método de detección de ADN basado en metilación diferencial.
La FIGURA 2 representa una representación esquemática de las regiones metiladas de forma diferencial ("DMR") y otras regiones ("OR") usadas en el Ejemplo 1.
La FIGURA 3 representa la correlación de la cantidad de ADN específico masculino (representación cromosómica Y) con la fracción de ADNec fetal medida mediante un método de detección de ADN basado en metilación diferencial (Ejemplo 1) para casos de gemelos de estudio con géneros fetales conocidos.
La FIGURA 4 representa la sensibilidad mejorada de la detección de cromosomas de referencia usando un método de detección de ADN basado en metilación diferencial múltiplex en comparación con la detección de cromosomas de referencia detectados usando reacciones separadas de una DMR individual. El número de ciclos de PCR (Cp) necesarios para la detección de ADNec fetal derivado de cromosomas de referencia (Ejemplo 2) en una muestra usando RASSF1A o TBX3 solos como una DMR individual o como un múltiplex (usando los mismos marcadores) de RASSF1A y TBX3.
La FIGURA 5 representa una representación esquemática de las operaciones realizadas por un programa de ordenador producto del EJEMPLO 3.
La FIGURA 6 representa una representación esquemática de las regiones metiladas de forma diferencial ("DMR") (y otras regiones opcionales ("OR")) usadas en el EJEMPLO 4 como un método de la presente invención.
La FIGURA 7 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una primera serie de 59 muestras, de la proporción de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por una DMR diana ubicada en el cromosoma 21) a la cantidad de cromosomas de referencia (5 y 12) [eje X] contra la proporción de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por la otra DMR diana ubicada en el cromosoma 21) a la cantidad de cromosomas de referencia [eje Y], en donde tales cantidades se determinan mediante un método de la invención como se describe en el EJEMPLO 4. Los puntos que representan a mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21 (T21) están marcados con "+" y se distinguen de las muestras que no son T21.
La FIGURA 8 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de las tres ejecuciones, totalizando 168 muestras, de la proporción normalizada de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por una DMR diana ubicada en el cromosoma 21) a la cantidad de cromosomas de referencia (5 y 12) [eje X] contra la proporción normalizada de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por la otra DMR diana ubicada en el cromosoma 21) a la cantidad de cromosomas de referencia, en donde tales cantidades se determinan mediante un método de la invención como se describe en el EJEMPLO 4. Los puntos que representan a mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21 (T21) están marcados con "+" y se agrupan de forma distinguible de las muestras que no son T21, por ejemplo, como se demarca por el límite de puntos que se muestra. Obsérvese que la muestra periférica que no es T21 a la que se hace referencia en el Ejemplo 4 se encuentra fuera del intervalo del eje X (pero no dentro del grupo T21)
La FIGURA 9 representa un diagrama de dispersión de la distancia de cada punto desde la FIGURA 8 desde el punto central de la línea de demarcación curva (0,5, 0,55) frente al número de ejecución. Se muestra una separación clara, en todas las ejecuciones, entre las nueve muestras T21 (en esta figura representadas por "o") de las muestras que no son T21 (en esta figura representadas por "+").
La FIGURA 10 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de las tres ejecuciones, totalizando 168 muestras, de la puntuación z para la proporción de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por una DMR diana ubicada en el cromosoma 21) a la cantidad de cromosomas de referencia (5 y 12) [eje X] contra la puntuación z para la proporción de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por la otra DMR diana ubicada en el cromosoma 21) a la cantidad de cromosomas de referencia, en donde tales cantidades se determinan mediante un método de la invención como se describe en el EJEMPLO 4. Los puntos que representan a mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21 (T21) están marcados con "+" y se agrupan de forma distinguible de las muestras que no son T21. Obsérvese que la muestra periférica que no es T21 a la que se hace referencia en el Ejemplo 4 se encuentra fuera del intervalo del eje X (pero no dentro del grupo T21).
La FIGURA 11 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, con un total de 58 muestras (incluyendo 3 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), de la proporción normalizada de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por una DMR diana ubicada en el cromosoma 21: C21orf57) a la cantidad de cromosomas de referencia (5 y 12) [eje y] frente a la proporción normalizada de la cantidad de cromosoma 21 (según lo determinado por la otra DMR diana ubicada en el cromosoma 21: DSCAM [eje x]) a la cantidad de cromosomas de referencia, en donde tales cantidades se determinan mediante un método de la invención como se describe mediante el ensayo descrito en el EJEMPLO 4 (excepto como se describe en la TABLA 6). Los puntos que representan a mujeres con un feto con trisomía 21 (T21) están marcados con un cuadrado abierto y se agrupan de forma distinguible de las muestras que no son T21 marcadas con un cuadrado negro. Los falsos positivos se marcan con "+" y los falsos negativos con "X".
La FIGURA 12 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, totalizando 56 muestras (incluyendo 4 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), descritas mediante el ensayo V10.1 como se describe en el EJEMPLO 10. Los puntos se definen como en la FIGURA 11. Como en la FIGURA 11, la DMR del cromosoma 21 del eje y es C21orf57 y la DMR del cromosoma 21 del eje x es DSCAM.
La FIGURA 13 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, totalizando 58 muestras (incluyendo 3 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), descritas mediante el ensayo V10.2 como se describe en el EJEMPLO 10. Los puntos se definen como en la FIGURA 11. Como en la FIGURA 11, la DMR del cromosoma 21 del eje y es C21orf57 y la DMR del cromosoma 21 del eje x es DSCAM.
La FIGURA 14 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, totalizando 58 muestras (incluyendo 2 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), descritas mediante el ensayo V10.3 como se describe en el EJEMPLO 10. Los puntos se definen como en la FIGURA 11. Como en la FIGURA 11, la DMR del cromosoma 21 del eje y es C21orf57 y la DMR del cromosoma 21 del eje x es DSCAM.
La FIGURA 15 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, totalizando 58 muestras (incluyendo 3 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), descritas mediante el ensayo V10.4 como se describe en el EJEMPLO 10. Los puntos se definen como en la FIGURA 11. Como en la FIGURA 11, la DMR del cromosoma 21 del eje y es C21orf57 y la DMR del cromosoma 21 del eje x es DSCAM.
La FIGURA 16 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, totalizando 58 muestras (incluyendo 2 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), descritas mediante el ensayo V10.5 como se describe en el EJEMPLO 10. Los puntos se definen como en la FIGURA 11. En este ensayo, la DMR del cromosoma 21 del eje y es C21orf29 y la DMR del cromosoma 21 del eje x es DSCAM. La FIGURA 17 muestra un diagrama de dispersión, para cada muestra de una ejecución de qPCR, totalizando 58 muestras (incluyendo 2 muestras de mujeres embarazadas de un feto con trisomía 21), descritas mediante el ensayo V10.6 como se describe en el EJEMPLO 10. Los puntos se definen como en la FIGURA 11. En este ensayo, la DMR del cromosoma 21 del eje y es CGI149 y la DMR del cromosoma 21 del eje x es DSCAM.
La presente invención, puede describirse con más detalle de la siguiente manera:
Como se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere generalmente aun métodopara detectar una aneuploidía cromosómica en un feto en una mujer embarazada,
Los términos establecidos en el presente documento han de entenderse generalmente según su significado común, a menos que se indique lo contrario. Cuando la expresión "comprende" o "que comprende" se usa en el presente documento, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente invención, la expresión "que consiste en" se considera ser realización particular de la expresión "que comprende". Si en lo sucesivo en el presente documento se define un grupo que comprende al menos un cierto número de realizaciones, esto también debe entenderse que desvela un grupo que consiste en todas y/o solo estas realizaciones. Donde se usa en el presente documento, "y/o" debe tomarse como divulgación específica de cada uno de los dos rasgos o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" ha de interpretarse como la divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno de ellos se estableciera individualmente en el presente documento. En el contexto de la presente invención, los términos "aproximadamente" y "de forma aproximada" denotan un intervalo de precisión que el experto en la materia entenderá para garantizar el efecto técnico de la característica en cuestión. El término normalmente indica una desviación del valor numérico indicado en ±20 %, ±15%, ±10 % y, por ejemplo, ±5 %. Como apreciará una persona experta en la materia, la desviación específica de un valor numérico para un efecto técnico determinado dependerá de la naturaleza del efecto técnico. Por ejemplo, un efecto técnico natural o biológico puede tener generalmente una desviación mayor que la de un efecto técnico hecho por el hombre o de ingeniería. En los casos en los que se usa un artículo indefinido o definido cuando se hace referencia a un sustantivo en singular, por ejemplo, "un/uno", "una" o "el/la", este incluye un plural de ese sustantivo, a menos que se indique específicamente lo contrario.
En determinadas realizaciones de la presente invención, la mujer embarazada es un ser humano o un animal no humano, donde dicho animal no humano puede, en realizaciones particulares, seleccionarse del grupo que consiste en: caballo, oveja, vaca, cerdo, pollo, ratón y rata. Puede sospecharse que la mujer embarazada tiene un riesgo aumentado de desarrollar o sufrir (o padecer) una afección médica, tal como una o más de las afecciones médicas desveladas en el presente documento. Un método tal de la presente invención no pretende a ser practicado en el cuerpo humano o animal; por ejemplo, está previsto que se practique de manerain vitro.
En determinadas realizaciones de la presente invención, dicha especie de ADN y/o dicho ADN metilado de forma diferente es/son ADN extracelular circulante y, en particular, de tales realizaciones es/son ADN extracelular circulante en circulación. En una realización particular, dichas especies de ADN y el ADN metilado de forma diferente mezclado con ellas son ADN extracelular circulante en circulación. La expresión "ADN extracelular circulante" (o "ADNec") está reconocida en la técnica e incluye el significado de ADN que se encuentra fuera de una célula, tal como en un fluido biológico (por ejemplo, sangre o una fracción de sangre) de un individuo. "Circulante" también es un término reconocido en la técnica e incluye el significado de que una entidad o sustancia (por ejemplo, ADNec) está presente en, detectado o identificado en, o aislado de, un sistema circulatorio del individuo, tal como el sistema sanguíneo o el sistema linfático. En particular, cuando el ADNec es "circulante", no se encuentra en una célula y, por lo tanto, puede estar presente en el plasma o el suero de la sangre, o puede estar presente en la linfa del líquido linfático.
La expresión "región metilada de forma diferencial" o "DMR" será reconocida por el experto en la materia y también pretende referirse a una región en el ADN cromosómico que está metilada de forma diferencial (por ejemplo, en un motivo CpG) entre dicha especie de ADN (fetal) y el otro ADN (materno) con el que se mezcla en la muestra. Por ejemplo, las DMR usadas en la presente invención están metiladas de forma diferencial entre el ADN fetal y materno. En realizaciones particulares de la presente invención, las DMR están hipermetiladas en el ADN fetal e hipometiladas en el ADN materno. Esto es, en tales regiones exhiben un mayor grado de (es decir, más) metilación en dicha especie de ADN (fetal) en comparación con el otro ADN (materno), tal como aproximadamente el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 100 % de, o más de, los sitios disponibles para la metilación en una DMR determinada están metilados en dicha especie de ADN (fetal) en comparación con los mismos sitios en el otro ADN (materno). En realizaciones particulares, la región está menos de aproximadamente el 10 % metilada en el ADN materno y más de aproximadamente el 30 % (tal como más de aproximadamente el 50 %) metilada en el ADN fetal.
Como entenderá una persona experta en la materia, la expresión "una cantidad" puede representar variables tales como una concentración, un equivalente genómico, un número molar o una masa, así como un valor que es un sustituto de cualquiera de dichas variables. Por ejemplo, una señal o medición (cuantitativa), tal como una generada mediante técnicas de cuantificación analógicas o digitales (recuento), también puede considerarse una "cantidad". En particular, para aquellas realizaciones de los métodos de la presente invención que usan PCR cuantitativa, la cantidad puede representarse mediante una medición recogida por el aparato qPCR, tal como un Ct (ciclo de umbral) [también llamado Cp, Ciclo de punto cruzado, para terminología LightCycler]: el número de ciclo en donde la señal (fluorescencia) de qPCR cruza un umbral. Como entenderá una persona experta en la materia, dichos números de Ct (o Cp) se correlacionan inversamente con las concentraciones (cantidades) iniciales del molde de ADN que se está cuantificando (por ejemplo, la especie de ADN que está metilada de forma diferencial).
En la etapa (e) del método de la presente invención, la cantidad o cantidades relativas de una cantidad determinada en la etapa (c) y una cantidad determinada en la etapa (d) es indicativa de la presencia o ausencia de aneuploidía cromosómica en el feto. Por ejemplo, un exceso o aumento de la cantidad de la (primera) especie de ADN diana (siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica) en comparación con la que se esperaría para una muestra euploide (por ejemplo, en comparación con la cantidad de especie de ADN de referencia, siendo uno o más cromosomas de referencia) representa que una cantidad excesiva de la especie de ADN diana está presente e indica que una copia adicional parcial o completa del cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica está presente en el feto. En particular, un exceso tal de una cantidad de especies de ADN diana puede indicar una trisomía cromosómica parcial o completa, tal como la trisomía 21 (T21) humana. En un ejemplo contrastante, una deficiencia o una reducción de la cantidad de la (primera) especie de ADN diana (siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica) en comparación con la que se esperaría para una muestra euploide (por ejemplo, en comparación con la cantidad de especie de ADN de referencia, siendo uno o más cromosomas de referencia) representa que una cantidad reducida de la especie de ADN diana está presente e indica que toda o parte de al menos una copia del cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica está ausente en el feto. En particular, una cantidad tan reducida de especie de ADN diana puede indicar una pérdida cromosómica parcial o completa (por ejemplo, una monosomía), tal como el síndrome de Turner (45,X).
Las cantidades determinadas de la etapa (c) y una cantidad determinada en la etapa (d) pueden compararse desde una perspectiva teórica. Por ejemplo, para una trisomía humana (tales como T21, T18 y/o T13), la cantidad de la (primera) especie de ADN diana (siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica) debería tener teóricamente una proporción de cantidades equivalente a 3:2 en comparación a la cantidad de especie de ADN de referencia (siendo uno o más cromosomas de referencia). Sin embargo, con diferencias en las sensibilidades de detección y cuantificación para diferentes regiones de los cromosomas diana y/o de referencia (y/o DMR), tales proporciones teóricas pueden no ser alcanzables en la práctica. En consecuencia, la presencia de aneuploidía cromosómica en el feto puede indicarse cuando una cantidad determinada de la etapa (c) no es equivalente a una cantidad determinada de la etapa (d), donde la equivalencia de las cantidades no significa que tengan el mismo valor. De hecho, la presencia de aneuploidía cromosómica en el feto puede estar indicada por una diferencia en, una distorsión o de otro modo un sesgo en la cantidad determinada de la etapa (c) en comparación con la esperada para un feto euploide, tal como a partir de la cantidad determinada de la etapa (d).
Como apreciará una persona experta en la materia, una indicación definitiva de la presencia (o ausencia) de la aneuploidía cromosómica en el feto puede no ser posible en todas las circunstancias o muestras. En consecuencia, la presente invención también abarca métodos mediante los cuales en la etapa (e) la indicación de la presencia (o ausencia) de la aneuploidía cromosómica en el feto se representa como una presencia (o ausencia) probable o posible en lugar de una indicación definitiva. Dichos métodos incluyen realizaciones en donde dicho método incluye una etapa adicional de señalar o marcar que se realiza una prueba de diagnóstico adicional para proporcionar más certeza, confianza o un diagnóstico definitivo. Dicha prueba posterior puede incluir una NlPT diferente para la detección de aneuploidía fetal (tal como NIPT basada en NGS como se describe en el EJEMPLO 1) y/o puede incluir CVS o amniocentesis.
En determinadas realizaciones de la presente invención, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) se realizan usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana; y, en particular, de tales realizaciones, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) se realizan usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para cada una de dichas al menos dos DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para cada una de dichas al menos dos primeras DMR diana.
Como se desvela también en el presente documento, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) pueden realizarse usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR diana; y/o (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR de referencia; y, en particular, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) pueden realizarse usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para cada una de dichas al menos dos DMR diana; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para cada una de dichas al menos dos DMR de referencia.
Como se desvela también en el presente documento,
dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) pueden realizarse usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia; y (y) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR diana, en donde el marcador o marcadores detectables usados para (x) son diferentes del marcador o marcadores detectables usados para (y).
Como se desvela también en el presente documento, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) pueden realizarse usando: (x) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR diana; y/o (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia.
En particular, en determinadas realizaciones se usa/usan diferentes marcador o marcadores para dichas DMR diana y se usa/usan para las DMR de referencia y, si se usa o usan OR en el método, tal como se usa/usan para dicha o dichas OR.
En determinadas realizaciones de la presente invención, en la etapa (c) pueden usarse más de dos DMR diana. Por ejemplo, pueden usarse tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más de nueve DMR diana (tal como aproximadamente 10, 15, 20, 30, 50 o más de 50 de dichas DMR diana). En aquellas realizaciones de la invención donde se usa un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana, entonces una o más (preferentemente dos, tres, cuatro, cinco o más de cinco) de las otras DMR diana pueden detectarse usando un marcador o marcadores diferentes detectables adicionales. Como alternativa, se usa/usan un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana y una o más (preferentemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más de ocho) de las otras DMR diana pueden tener el mismo marcador o marcadores detectables usados para una de dichas dos DMR diana. Por ejemplo, dos DMR diana pueden tener el mismo marcador o marcadores detectables y dos DMR diana adicionales pueden tener un marcador o marcadores detectables diferentes. Tales realizaciones pueden proporcionar ventajas adicionales a la presente invención, tales como proporcionar una sensibilidad de especificidad aún mayor sin tener que recurrir a marcadores detectables adicionales; cuyo número puede estar prácticamente limitado dados los gastos y las exigencias técnicas de los equipos de detección multicanal y, por ejemplo, para los marcadores fluorescentes, la superposición de los espectros de detección y el blanqueamiento del color.
En la presente invención se usa un reactivo que modifica diferencialmente (por ejemplo, selectivamente) el ADN metilado en comparación con el ADN no metilado. Por ejemplo, el tratamiento del ADN con un reactivo que comprende bisulfito (bisulfito) convierte los restos de citosina en uracilo, pero no afecta a restos de 5-metilcitosina. Por lo tanto, el tratamiento con bisulfito introduce cambios específicos en la secuencia de ADN que dependen del estado de metilación de restos de citosina individuales, proporcionando información de resolución de un nucleótido individual sobre el estado de metilación de un segmento de ADN. Pueden realizarse diversos análisis sobre la secuencia alterada para recuperar esta información, incluyendo el uso de cebadores y/o sondas de PCR que puedan distinguir entre dichos cambios de un nucleótido individual.
Un reactivo tal puede comprender alternativamente (o además) una enzima de restricción que sea sensible a los estados de metilación del ADN. La escisión de la secuencia de reconocimiento de dicha enzima de restricción puede bloquearse o alterarse, cuando se modifica una base particular en el sitio de reconocimiento de la enzima, por ejemplo metilado. En realizaciones particulares de todos los aspectos de la invención, el reactivo comprende una enzima de restricción sensible a la metilación, tal como una enzima de restricción sensible a la metilación desvelada en el presente documento; incluyendo tales realizaciones que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o más de tales enzimas de restricción sensibles a la metilación,
Antes de la etapa (b), la muestra puede procesarse para aislar, enriquecer y/o purificar, el ADN presente en la misma. Por ejemplo, puede procesarse una muestra de plasma usando un proceso o kit de aislamiento de ADNec para proporcionar una solución posterior (no natural) que comprende una mezcla de dicha especie de ADN junto con el a Dn metilado de forma diferencial (por ejemplo, de origen materno) que no se origina a partir del feto y/o la placenta del feto. La etapa de tratamiento en (b) puede comprender la etapa de añadir una solución separada que comprende dicho reactivo (por ejemplo, una enzima de restricción sensible a la metilación) al ADN mezclado de la muestra (por ejemplo, a una solución no natural que comprende dicho ADN mezclado); y/o puede comprender mantener (o cambiar) ciertas condiciones. En particular, cuando dicho reactivo comprende una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, la etapa de tratamiento en (b) puede comprender incubar el ADN y la enzima o enzimas juntos a aproximadamente 37 °C durante entre aproximadamente 5 min y 300 min, tal como entre aproximadamente 30 min y 90 min o aproximadamente 60 min y opcionalmente puede comprender una etapa de incubación de dicha mezcla a una temperatura más alta (por ejemplo, entre aproximadamente 50 °C y 90 °C, tal como aproximadamente 80 °C) para desactivar la enzima o enzimas. En determinadas realizaciones, la composición formada para una etapa de tratamiento de (b) puede ser de origen no natural. Por ejemplo, las sales particulares de componentes de la solución (o tampón) y/o la mezcla de ADNec (por ejemplo, humano) junto con una o más enzimas de restricción derivadas de bacterias (o un mutante no natural de las mismas) pueden ser una composición o mezcla no natural. Adicionalmente, cualquiera de los métodos de la presente invención puede producir una molécula de ácido nucleico producidain vitro,tal como un producto de ADN de una reacción de PCR (por ejemplo, un "producto de PCR"). Una o más de dichas moléculas de ácido nucleico producidasin vitropueden no ser naturales porque comprenden un cebador y/o una sonda de nucleótido que incluye al menos un marcador detectable, habiéndose generado dicha molécula de ácido nucleico mediante extensión con polimerasa (o digestión parcial con nucleasa) de un cebador y/o sonda marcados tales y, por tanto, proporciona al menos una fracción de dichas moléculas de ácido nucleico que incluyen un marcador detectable, de tal manera que aunque la secuencia de ácido nucleico de las moléculas de ácido nucleico puede comprender una secuencia de origen natural (o fragmento de la misma), una molécula de ácido nucleico producidain vitrotal no es natural en virtud de (al menos) el marcador detectable no natural que incluye. En realizaciones particulares, antes de la etapa (b), la muestra tomada de dicha mujer embarazada puede procesarse para extraer el ADN presente en dicha muestra; por ejemplo, dichos procesos pueden extraer ADN extracelular circulante total de dicha muestra, o dichos procesos pueden extraer y/o enriquecer ADN extracelular circulante fetal.
En determinadas realizaciones del método de la presente invención, la cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones en la etapa (e) pueden compararse con umbral o umbrales y/o distribución o distribuciones de referencia, en donde una o más (preferentemente dos o más) de dichas cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones más altas o más baja que dicha distribución o distribuciones umbral y/o de referencia indican la presencia de la aneuploidía cromosómica en el feto. El umbral o umbrales y/o la distribución o distribuciones de referencia pueden venir de estudios anteriores, incluyendo aquellos de muestras de control, o pueden generarse a partir de una pluralidad de muestras analizadas mediante un método de la invención. Por ejemplo, si hay un número de muestras diferentes (tal como aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90, 10, 120, 150, 175, 200, 250, 500 o más de aproximadamente 500 muestras; en particular, (aproximadamente 60 muestras y más particularmente más de 500 muestras) se analizan de esta manera, y una u otra muestra individual muestra una cantidad de (c) o una cantidad relativa de (e) que es un valor atípico de la población de cantidades análogas de la mayoría de las otras muestras, entonces esto indica que el feto llevado por la mujer embarazada de la cual se tomó la muestra individual tiene una aneuploidía cromosómica. Como se ha descrito anteriormente, se apreciará que incluso si las cantidades o proporciones relativas determinadas en la etapa (e) se comparan con el umbral o umbrales y/o la distribución o distribuciones de referencia, una indicación definitiva de la presencia (o ausencia) de la aneuploidía cromosómica en el feto puede no ser posible en todas las circunstancias o en cada muestra. En consecuencia, en tales realizaciones de la presente invención, también incluyen aquellos en que una probable o posible presencia (o ausencia), más que una indicación definitiva, de la aneuploidía cromosómica está indicada, incluyendo aquellas realizaciones que incluyen una etapa adicional de señalización o señalización de que se realiza una prueba de diagnóstico adicional para proporcionar más certeza o un diagnóstico definitivo. Las pruebas de diagnóstico adicionales ilustrativas incluyen cualquiera de las que se describen en otra parte del presente documento, en particular tal como NIPT basada en NGS como se describe en el EJEMPLO 1.
Una indicación de que la aneuploidía cromosómica está presente en el feto puede evaluarse, en su lugar o adicionalmente, considerando: (i) el aumento (o la disminución) de una medida o señal que representa una cantidad de la primera especie de ADN diana (tal como una determinada a partir de una u otra de las DMR diana) en comparación con la esperada en relación con una medida o señal que representa una cantidad de la especie de ADN de referencia (tal como una determinada a partir de las DMR de referencia); y/o (ii) en donde cae una medida o señal que representa una cantidad de la primera especie de ADN diana (tal como una determinada a partir de una u otra de las DMR diana) determinada a partir de la muestra, a partir de la consideración de una distribución de referencia.
En determinadas realizaciones, la cantidad o cantidades umbral pueden establecerse mediante un patrón de control; por ejemplo, establecida experimentalmente a partir de una muestra conocida (o una pluralidad de muestras conocidas) una vez o por separado, y/o una cantidad o cantidades umbral que se establecen (por ejemplo, a partir de una muestra o una pluralidad de muestras conocidas) aproximadamente al mismo tiempo que la prueba muestra (o muestras de prueba), tal como en la misma ejecución, en particular estableciendo la cantidad o cantidades umbral practicando un método de la presente invención en muestras contenidas en pocillos de placas de microtitulación donde una o más muestras conocidas se colocan en uno o más pocillos (separados) y una o más muestras de prueba se colocan en otros pocillos. En otras realizaciones de la presente invención, se realiza una comparación con una cantidad umbral y/o distribución de referencia de cantidades a partir de la cantidad relativa (tal como la relación de) una cantidad de la primera especie de ADN diana (es decir, un cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica) a una cantidad de la especie de referencia de ADN (es decir, el cromosoma de referencia). Por ejemplo, desde una perspectiva teórica, se esperaría que una cantidad de la primera especie de ADN diana que se origina a partir de un conjunto diploide normal de cromosomas 21 humanos mostrara una proporción de aproximadamente 2:2 (es decir, 1:1) con respecto a la cantidad de la especie de referencia de ADN que se origina de un conjunto de referencia (diploide) de, por ejemplo, el cromosoma 2. Sin embargo, en caso de trisomía 21, se esperaría que dicha relación fuera de aproximadamente 3:2. Como entenderá ahora una persona experta en la materia, se esperaría que otras aneuploidías cromosómicas (o cromosómicas parciales) mostraran otras proporciones teóricas, por ejemplo, 1:2 en el caso de una pérdida de un cromosoma completo, o una pérdida parcial tal como una eliminación parcial de la ubicación de la primera especie de ADN, en comparación con el cromosoma de referencia que comprende la ubicación de la segunda especie de ADN. En determinadas realizaciones, por ejemplo, si no se diferencian tal como por diferencias de mutilación, la presencia de otro ADN (es decir, en una mezcla con dicho otro ADN) tal como ADNec materno euploide en mezcla con ADNec fetal aneuploide podría dar como resultado tales proporciones modificadas dependiendo de las cantidades relativas de ADNec materno (euploide) y fetal (aneuploide). Como también entenderá una persona experta en la materia, dichas proporciones modificadas pueden resultar de otros factores tales como la eficiencia relativa de la reacción (por ejemplo, reacción de PCR) de cada amplicón. En consecuencia, en realizaciones determinadas de dichas realizaciones, la cantidad umbral es una proporción que es (detectable y/o significativamente) mayor o menor que 2:2 (100 %), tal como aproximadamente 3:2 (150 %), aproximadamente 2:3 (66 %), aproximadamente 1:2 (50%) o aproximadamente 2:1 (200%); incluyendo cantidades umbrales y/o proporciones superiores a aproximadamente el 200 %, menos de aproximadamente el 50 % o es una seleccionada de la lista que consiste en aproximadamente: el 190 %, el 180 %, el 170 %, el 160 %, el 150 %, el 140 %, el 130 %, el 120 %, el 110 %, el 105 %, el 95 %, el 90 %, el 85 %, el 80 %, el 75 %, el 70 %, el 65 %, el 60 % y el 55 %. Como alternativa, en realizaciones particulares, la cantidad umbral puede determinarse simplemente porque no hay una cantidad detectable de la primera (o segunda) especie de ADN, tal como en el síndrome de Turner (una mujer humana con un cariotipo "45, X" en lugar del cariotipo totalmente euploide "46,XX"). Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, diferencias en las sensibilidades de detección y cuantificación para diferentes regiones de los cromosomas diana y/o de referencia (y/o DMR), tales proporciones teóricas pueden no ser alcanzables en la práctica. En consecuencia, la presencia de aneuploidía cromosómica en el feto puede indicarse cuando una cantidad determinada de la etapa (c) no es equivalente a una cantidad determinada de la etapa (d), donde la equivalencia de las cantidades no significa que tengan el mismo valor. De hecho, la presencia de aneuploidía cromosómica en el feto puede estar indicada por una diferencia en, una distorsión o de otro modo un sesgo en la cantidad determinada de la etapa (c) en comparación con la esperada para un feto euploide, tal como a partir de la cantidad determinada de la etapa (d).
En determinadas realizaciones, un parámetro (tal como una media, una mediana, una desviación típica, una desviación absoluta mediana o una puntuación z) se calcula con respecto a un conjunto de muestras dentro de cada ejecución, placa o conjunto de datos de detección/análisis. En realizaciones determinadas de dichas realizaciones, dicho parámetro calculado se usa para identificar valores atípicos (tales como muestras de trisomía) de aquellas muestras de prueba detectadas/analizadas en dicha ejecución, placa o conjunto de datos (por ejemplo, un análisis "específico de la ejecución"). En realizaciones particulares, dicho parámetro se calcula a partir de todas las muestras de prueba sin conocimiento de la identidad de los valores atípicos (por ejemplo, un análisis "enmascarado"). En otras realizaciones particulares, dicho parámetro se calcula a partir de un conjunto de muestras de referencia que se sabe que son patrones (no atípicos) (como muestras que se sabe contienen ADNec de fetos euploides) o muestras de prueba que se presume que son (o es poco probable que lo sean) tales patrones.
La persona experta conocerá la comparación y detección de diferencias entre distribuciones de muestra y distribuciones de referencia, o valores atípicos de muestra de distribuciones de referencia, e incluirá el uso de pruebas estadísticas paramétricas y no paramétricas tales como el uso de pruebas de la t (una o dos colas), Prueba de suma de rangos de Mann-Whitney y otras, incluyendo el uso de una puntuación z, tal como una puntuación z basada en la desviación absoluta media (por ejemplo, tal como la usada por Stumm et al 2014, Prenat Diagn 34:185). Al comparar una distribución con (o valores atípicos de) una distribución de referencia, entonces en determinadas realizaciones de la invención, la comparación se distingue (y/o se identifica como significativamente diferente) si la separación de las medias, las medianas o las muestras individuales son mayores que aproximadamente 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 1,95, 1,97, 2,0 o mayores que aproximadamente 2,0 distribuciones típicas ("SD") de la distribución de referencia; y/o si una muestra individual se separa de la distribución de referencia con una puntuación z mayor que aproximadamente 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,5, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,75, 4,0, 4,5, 5,0 o mayor que aproximadamente 5,0.
En determinadas realizaciones, en el contexto de un conjunto de datos, puede calcularse una puntuación z (o una estadística equivalente basada en el patrón de distribución de réplicas de un parámetro) para identificar punto o puntos de datos periféricos (por ejemplo, que representan una cantidad excesiva de la especie de ADN, tal como en el contexto de una prueba que busca identificar a una mujer embarazada que se predice que tendrá o tendrá un riesgo aumentado de sufrir o desarrollar preeclampsia, o que represente una cantidad excesiva de un cromosoma sobre un cromosoma de referencia, tal como en el contexto de una prueba buscando identificar un feto que sufre una aneuploidía cromosómica), los datos que representan dicho punto de datos se eliminan del conjunto de datos y se realiza un análisis de puntuación z posterior en el conjunto de datos para tratar de identificar más valores atípicos. Un análisis de puntuación z iterativo de este tipo puede ser particularmente útil en la detección de aneuploidías cromosómicas fetales usando un método de la presente invención, donde a veces dos o más muestras de aneuploidía en una ejecución pueden sesgar un único análisis de puntuación z, y/o donde hay pruebas de seguimiento disponibles para confirmar falsos positivos y, por lo tanto, evitar falsos negativos es potencialmente más importante que la identificación (inicial) de falsos positivos.
La práctica del método de la presente invención puede permitir la detección relativa (o cantidad) de la primera especie de ADN diana (por ejemplo, de un cromosoma, o parte del mismo, relacionado con una aneuploidía cromosómica tal como el cromosoma 21 humano) y especies de ADN de referencia (por ejemplo, de un cromosoma de referencia, o parte del mismo, tal como el cromosoma 12, 5 o 2) y, por tanto, ayudan a la detección, la identificación o el diagnóstico rápidos, sencillos y rentables de una aneuploidía cromosómica en un feto. Un enfoque tal puede establecerse y practicarse más fácilmente en muchos laboratorios, requiriendo, por ejemplo, una máquina de PCR relativamente sencilla, fiable y rentable; y no requiriendo máquinas de secuenciación de última generación, caras y especializadas de alto rendimiento. De hecho, en determinadas realizaciones de dichas realizaciones de la presente invención, la detección en la etapa (c) de dichas DMR diana y dicha detección en la etapa (d) de dichas DMR de referencia se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra, y en el mismo recipiente de reacción/detección, y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR y usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR diana. La detección, identificación o cuantificación relativas de la primera especie de ADN diana y de referencia (a través de las DMR diana y las DMR de referencia), en aquellas realizaciones realizadas en el mismo recipiente de reacción/detección y de forma eficaz simultáneamente, puede realizarse ventajosamente mediante el uso de etiquetas detectables que puedan distinguir al menos dos de las DMR diana de las DMR de referencia y, si se usan, sus OR correspondientes detectadas en la etapa opcional (f). Una realización adicional particular de este tipo donde la detección (c) y (d) se realiza en el mismo recipiente de reacción/detección y de forma eficaz simultáneamente incluye donde dicha detección en la etapa (c) y dicha detección en la etapa (d) se realizan mediante PCR basada en sonda cuantitativa en tiempo real en múltiplex usando al menos una sonda marcada específica para cada una de dichas DMR y, si se usan, cada OR.
En todos los aspectos de la presente invención, se incluyen realizaciones cuando la presencia de la aneuploidía cromosómica es una aneuploidía tal total o parcial, para una anomalía cromosómica que está asociada con una anomalía fetal y/o un trastorno congénito. Por ejemplo, dicha anomalía cromosómica puede seleccionarse del grupo que consiste en: una trisomía (tales como trisomía 21, trisomía 18 o trisomía 13), una anomalía de los cromosomas sexuales (tales como síndrome de Turner, síndrome de Klinefelter, [síndrome de Noonan], Síndrome triple x, síndrome XXY o síndrome X frágil o síndrome XYY o síndrome XXYY), una deleción cromosómica (tales como síndrome de Prader-Willi, síndrome de Cris-du-chat, Síndrome de Wolf-Hirschhorn o síndrome de deleción 22q11, distrofia muscular de Duchene), Síndrome de Beckwith-Wiedemann, Síndrome de Canvan y neurofibromatosis. De máxima relevancia, en términos de prevalencia y, por tanto, de importancia médica y social, es cuando dicha anomalía cromosómica es una trisomía, tal como una seleccionada de la lista que consiste en trisomía 21, trisomía 18 o trisomía 13.
En aquellas realizaciones de la presente invención en que la mujer embarazada es humana, el cromosoma relevante a la aneuploidía cromosómica es un cromosoma humano seleccionado de la lista que consiste en: cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, cromosoma X y cromosoma Y, preferentemente cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, el cromosoma relevante a la aneuploidía cromosómica es el cromosoma 21 humano. En algunas de cualquiera de dichas realizaciones, dicha aneuploidía cromosómica puede ser una aneuploidía de dicho cromosoma. En todos los aspectos de la presente invención, la aneuploidía cromosómica es una monosomía o una trisomía de dicho cromosoma, que como entenderá una persona experta en la materia, puede ser una aneuploidía parcial o completa tal como una monosomía o trisomía parcial o completa de dicho cromosoma, en donde una aneuploidía "parcial" incluye el significado de un desequilibrio del material genético provocado por la pérdida o la ganancia de parte de un cromosoma. Por ejemplo, una aneuploidía parcial puede incluir la situación de una translocación desequilibrada, donde un individuo porta un cromosoma derivado formado mediante la rotura y fusión de dos cromosomas diferentes. En este ejemplo, el individuo tendría tres copias de parte de un cromosoma (dos copias normales y la parte que existe en el cromosoma derivado) y solo una copia de parte del otro cromosoma implicado en el cromosoma derivado.
Correspondientemente, en aquellas realizaciones de la presente invención en que la mujer embarazada es humana, uno o más del cromosoma o cromosomas de referencia pueden ser uno seleccionado de la lista que consiste en: cromosoma 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 humano, cromosoma 14, 15, 16, 17 humano, cromosoma 19 humano, cromosoma 20 humano, cromosoma 22 humano y cromosoma 23 humano. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, el cromosoma de referencia es el cromosoma 5 humano o el cromosoma 12 humano.
En determinadas realizaciones de la presente invención, dos o más de dichas DMR de referencia se ubican en diferentes cromosomas de referencia. Por ejemplo, en determinada realización, una de dichas DMR de referencia está ubicada en el cromosoma 5 humano y otra de dichas DMR de referencia está ubicada en el cromosoma 12 humano.
Sin embargo, también se abarcan dentro del alcance de la presente invención realizaciones donde uno (o más) de los cromosomas usados como cromosoma de referencia es un cromosoma que puede estar asociado a una aneuploidía cromosómica pero un cromosoma diferente al relevante para la aneuploidía cromosómica para la cual se está aplicando el método de detección. Por ejemplo, si el método de la presente invención se está practicando para detectar la trisomía 21 en un feto llevado por una mujer humana embarazada, entonces, por ejemplo, el cromosoma 18 humano o el cromosoma 13 humano, en particular el cromosoma 13, puede usarse como un cromosoma de "referencia". En un ejemplo tal, dada la probabilidad insignificante de que el feto sea portador de una trisomía 21 y una trisomía 13, un exceso del cromosoma 21 en comparación con el cromosoma 13 indicaría una trisomía del cromosoma 21. Correspondientemente, mediante el uso del mismo ensayo pero ahora considerando el cromosoma 13 como el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica para la cual se aplica el método de detección, entonces un exceso del cromosoma 13 en comparación con el cromosoma 21 (equivalente a una reducción en el cromosoma 21 en comparación con el cromosoma 13) indicaría una trisomía del cromosoma 13. Tal selección de cromosomas "de referencia" y la práctica/consideración de los métodos de la presente invención tendrían ventajas particulares al proporcionar la posibilidad de detectar la presencia (o ausencia) de una aneuploidía en más de un cromosoma relevante para una aneuploidía cromosómica en un ensayo único. Un ensayo de este tipo no solo ahorraría tiempo y costes, sino también podría permitir la detección de la presencia de más de una aneuploidía cromosómica a partir de una sola muestra; que, dado el nivel relativamente bajo de ADN fetal normalmente presente en una muestra materna, entonces requeriría menos muestreo o menos muestra tomada
En realizaciones particulares, el método de la presente invención puede comprender además la etapa de:
(f) determinar una cantidad de ADN total en dicha muestra detectando al menos una región distinta (OR) que no está metilada de forma diferencial entre el ADN que se origina de las células de un feto y/o la placenta de un feto y ADN de origen materno, cuya modificación de las OR por dicho reactivo es insensible a la metilación de ADN, en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa (f) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y dicha región o regiones distintas y, en una realización, usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR diana y para al menos una (preferentemente cada una) de dicha o dichas OR. Como se desvela también en el presente documento, las detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa (f) pueden realizarse usando: un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia, para al menos dos (preferentemente cada una) de dichas DMR diana y para al menos una (preferentemente cada una) de dichas.
A diferencia de las DMR, una "otra región" ("O"), como se usa en la presente invención, no está (significativamente) metilada de forma diferencial entre las especies de ADN que se originan a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen material con el que se mezcla en la muestra. Por ejemplo, según las condiciones y la naturaleza del reactivo usado, no hay diferencia detectable entre la modificación por dicho reactivo en la otra región de dicha especie de ADN (fetal) en comparación con la otra región del ADN (materno) mezclado. Tal no diferencia puede lograrse si la otra región no comprende sitios para la metilación, si no hay diferencia en el grado de metilación si dichos sitios están presentes, o mediante el uso de un reactivo que no reconoce ningún sitio de metilación presente en la otra región. En consecuencia, en realizaciones alternativas de la presente invención, la al menos una OR usada en la etapa opcional (f) es una para la cual no se reconoce (o puede) reconocerse o detectarse (o reconocible) ninguna diferencia (significativa) en la metilación entre dicha especie de ADN (fetal) y el otro ADN (materno) con dicho reactivo.
En determinadas realizaciones del presente método de la invención, dicha o dichas OR se ubican en uno o más del cromosoma o cromosomas de referencia. Uno o más de dichos cromosoma o cromosomas de referencia pueden, en el caso de una mujer humana embarazada, ser uno seleccionado de la lista que consiste en: cromosoma 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 humano, cromosoma 14, 15, 16, 17 humano, cromosoma 19 humano, cromosoma 20 humano, cromosoma 22 humano y cromosoma 23 humano. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, el cromosoma de referencia es el cromosoma 5 humano o el cromosoma 12 humano. En determinadas realizaciones particulares, al menos una de dicha o dichas OR puede estar ubicada en el mismo cromosoma o cromosomas de referencia que al menos una de dicha o dichas DMR de referencia, por ejemplo, una de dichas DMR de referencia y una de dichas OR pueden estar ubicadas ambas en el cromosoma 5 humano o en el cromosoma 12 humano. En otras realizaciones, dicha o dichas OR están ubicadas en un cromosoma o cromosomas relevantes para una aneuploidía cromosómica.
La o las OR (es decir, que no están tan metiladas de forma diferencial), como se usa en la presente invención, pueden no superponerse con una o más de las DMR (por ejemplo, de referencia) usadas en la presente invención. Por ejemplo, una OR puede ubicarse más de aproximadamente 10 pb, 20 pb, 50 pb o más de 100 pb, 500 pb, 1 kb o 10 kb, más allá de una (o todas) las DMR (por ejemplo, de referencia), tal como está ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de (incluyendo realizaciones que están ubicadas dentro del mismo gen que) dicha DMR (por ejemplo, de referencia). En particular, la ubicación genómica de la OR, como se usa en la presente invención, generalmente puede estar ubicada en la misma parte del genoma, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de (incluyendo las realizaciones que están ubicadas dentro del mismo gen que) la ubicación genómica de al menos una de las DMR (por ejemplo, de referencia) usados en el presente documento. Particularmente en el contexto de la fracción fetal de ADNec, la detección (y particularmente la cuantificación) de tales especies de ADN se mejora (por ejemplo, en términos de sensibilidad, exactitud y/o precisión) si la OR está ubicada en la misma parte del genoma que una de las DMR de referencia. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que con tales DMR y OR ubicadas de manera similar, particularmente cuando se usa en tal contexto, se mitiga el efecto de la variación en el empaquetamiento de la cromatina/nucleosoma en todo el genoma y, por tanto, la estabilidad/degradación de diferentes regiones del ADN genómico, de tal manera que cualquier diferencia en la estabilidad/degradación de una DMR (por ejemplo, de referencia) (por ejemplo, detectar la especie cromosómica de referencia del ADN fetal) en comparación con la OR (que detecta el ADN total) es menor y, por lo tanto, puede realizarse una cuantificación relativa (y absoluta) sin que se confunda (significativamente) por diferencias cuantitativas provocadas por el empaquetamiento (significativamente) diferencial de cromatina/nucleosoma en todo el genoma entre dicha DMR y una OR.
La presente invención incluye el uso opcional de una OR en la etapa opcional (f) para proporcionar la detección de una cantidad de ADN total en la mezcla. Sin embargo, la presente invención también abarca realizaciones que usan más de una OR. Por ejemplo, la invención incluye realizaciones en donde dicha detección en la etapa (f) comprende usar al menos dos de dichas OR, tal como dos, tres o cuatro de dichas OR. En realizaciones particulares de todos los aspectos de la presente invención, el número de dichas OR usadas en la etapa opcional (f) es el mismo que el número de DMR de referencia usadas en la etapa (d). Por ejemplo, si se usan dos DMR de referencia, entonces se usan otras dos regiones en dicha realización, y si se usan tres DMR de referencia, entonces se usan otras tres regiones (como se muestra en la FIGURA 1).
Como se describe en otra parte en el presente documento, la presente invención incluye realizaciones en donde la OR opcional generalmente está ubicado en la misma parte del genoma, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de (incluyendo las realizaciones dentro del mismo gen que) la ubicación genómica de al menos una de las DMR (tal como una DMR de referencia) usadas en el presente documento. También como se describe en otra parte del presente documento, ciertas realizaciones de la presente invención incluyen donde la OR está generalmente ubicado en la misma parte del genoma, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de (incluyendo las realizaciones dentro del mismo gen que) la ubicación genómica de al menos una de las DMR usadas en el presente documento (tales como una DMR diana). En determinadas realizaciones, la OR no se superpone con dicha DMR. En consecuencia, si se usan múltiples OR en la presente invención, después se incluyen realizaciones en donde dos o más de tales OR están ubicadas de manera similar en el genoma a las dos o más DMR (tales como DMR de referencia). Por ejemplo, una de dichas OR puede estar ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de (incluyendo las realizaciones dentro del mismo gen que) una DMR de referencia usada en la etapa (d) y cada una de dichas OR (por ejemplo, una segunda OR) está ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de (incluyendo las realizaciones dentro del mismo gen que) otra de dichas DMR (por ejemplo, no superpuestas) (por ejemplo, una segunda DMR de referencia). En determinadas realizaciones una OR adicional, puede superponerse con una DMR (tal como una DMR de referencia).
Una OR usada en la presente invención, cuando generalmente se ubica en la misma porción del genoma que una DMR (tal como una DMR de referencia), puede estar ubicada en dirección 5' o en dirección 3' de una de dichas DMR dentro de una distancia seleccionada del grupo que consiste en: entre aproximadamente de 16 kb a 20 pb, 14 kb a 20 pb, 12 kb a 20 pb, 10 kb a 20 pb, 8 kb a 20 pb, 6 kb a 20 pb, 5 kb a 20 pb, 4 kb a 20 pb, 3 kb a 2 pb, 16 kb a 20 pb, 1 kb a 20 pb, 500 pb a 20 pb, 200 pb a 20 pb, 20 kb a 15 kb, 15 kb a 10 kb, 12 kb a 8 kb, 10 kb a 8 kb, 11 kb a 7 kb, 11 kb a 10 kb, 9 kb a 8 kb, 8 kb a 6 kb, 6 kb a 4 kb, 4 kb a 2 kb, 2 kb a 500 pb, 1 kb a 100 pb, 500 pb a 50 pb, 400 pb a 200 pb y 500 pb a 100 pb y 500 pb a 300 pb. En realizaciones particulares, cada Or usada en la presente invención generalmente está ubicada en una DMR diferente de las usadas (tales como DMR de referencia).
Si se usan múltiples OR, entonces la presente invención incluye realizaciones en donde la detección en la etapa opcional (f) se realiza usando el mismo marcador detectable para cada una de dichas OR y/o comprende<p>C<r>cuantitativa multiplex en tiempo real usando al menos dos sondas marcadas, cada una de las cuales es específica para una de dichas OR.
En determinadas realizaciones del presente método de la invención, la detección en la etapa (f), si se lleva a cabo, comprende usar al menos dos de dichas OR. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, el número de dichas OR puede ser el mismo que el número de DMR de referencia usadas en la etapa (d). En una realización adicional de tales realizaciones, una de dichas DMR de referencia y una de dichas OR pueden estar ubicadas ambos en un cromosoma de referencia (por ejemplo, el cromosoma 5 humano) y una segunda DMR de referencia y una segunda de dichas OR pueden estar ubicadas ambas en otro cromosoma de referencia (por ejemplo, el cromosoma 12 humano). En ciertas de tales realizaciones adicionales, una de dichas OR está ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de una DMR de referencia usada en la etapa (d) y cada una de dichas OR está ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de otra de dichas DMR de referencia.
En una realización de la presente invención, la detección de las diversas regiones del ADN, es decir, las DMR (y las OR, si están incluidas) puede producirse en un proceso simplificado. Correspondientemente, una característica de la presente invención es que la detección de las diversas regiones del ADN, es decir, las DMR (y las OR, si están incluidas), puede producirse en un proceso simplificado. Por ejemplo, usando una única alícuota de ADN de la muestra, dichas regiones de ADN pueden detectarse en un único recipiente. Esta característica puede simplificar los métodos y puede proporcionar una detección más eficiente y precisa (especialmente en aquellas realizaciones en donde la detección es cuantitativa). La expresión "recipiente" se reconocerá en la técnica e incluye realizaciones de un recipiente (tal como un tubo, un pocillo de una placa de microtitulación, un nano-pocillo, un recipiente de reacción capilar, etc.) en donde se produce un proceso o procedimiento comprendido en el método, tal como un proceso de reacción y/o detección o una etapa de un método de la presente invención. Otros recipientes de este tipo pueden incluir gotitas en emulsiones de aceite/agua, nanopartículas o una cámara de hibridación; según sea apropiado con la tecnología de detección usada. Los marcadores detectables usados, en determinadas realizaciones de la presente invención pueden ser diferentes para cada una de las DMR diana y/o pueden ser los mismos para cada DMR de referencia y/o pueden ser los mismos para cada OR (si se incluye), con la condición de que, cuando se detecta esencialmente de forma simultánea, el marcador o marcadores usados para las DMR diana son diferentes (es decir, pueden detectarse por separado) del marcador o marcadores usados para las DMR de referencia (y para las OR, si se usan). Como alternativa, los marcadores detectables usados, en determinadas realizaciones de la presente invención pueden ser diferentes (por ejemplo, no los mismos) para cada DMR y/o pueden ser diferentes (por ejemplo, no los mismos) para cada OR (si se incluyen). Los marcadores detectables usados en el método de la invención pueden ser los mismos para cada DMR de referencia y, en determinadas realizaciones, pueden ser los mismos para cada OR (si está incluida), siempre que el marcador o marcadores usados para las DMR diana sean diferentes, (es decir, pueden detectarse por separado) del marcador o marcadores usados para las DMR de referencia. Y diferente del marcador o marcadores usados para las OR (si se usan). Los marcadores detectables que son "los mismos", también puede incluir marcadores que aunque estructuralmente diferentes, son funcionalmente (esencialmente) similares ya que no pueden diferenciarse significativamente por la tecnología de detección empleada. Por ejemplo, los tintes fluorescentes estructuralmente diferentes pueden considerarse "iguales" si sus espectros de excitación y emisión son (sustancial o esencialmente) similares, o se superponen hasta tal punto que pueden excitarse y detectarse simultáneamente con la misma o mismas longitudes de onda. Los marcadores adecuados (y modalidades de detección) se describen con más detalle en otra parte del presente documento. Preferentemente, la detección de la o las DMR y la o las OR (si están incluidas) puede realizarse de manera eficaz simultáneamente. Por ejemplo, dentro del mismo recipiente (de reacción/detección), todas estas regiones (y por tanto dichas especies de ADN y ADN total) pueden detectarse en menos de aproximadamente 5 s, 1 s, 0,5 s, 100 ms, 10 ms, 1 ms, 100 us, 10 us o 1 us entre sí (en particular, menos de aproximadamente 0,5 s, y más particularmente menos de aproximadamente 100 ms o entre sí), y por ejemplo sin transferir el recipiente, o la reacción/mezcla, a cualquier recipiente, ensayo o equipo posteriores, o por ejemplo, sin adaptar o recalibrar el proceso de detección para (cualquiera de) las<d>M<r>o las OR por separado. El uso de marcador o marcadores detectables, por ejemplo al menos uno para dicha o dichas DMR diana y al menos uno para la o las DMR de referencia, utiliza componentes, procesos y/o etapas que no son naturales. Por ejemplo, una composición de dos marcadores específicos junto con las regiones específicas de ADN (generalmente) no se encontraría en la naturaleza. En particular, las sondas cortas usadas en PCR cuantitativa basada en sondas, si bien puede comprender una secuencia de ADN que es un fragmento de la que se encuentra en un genoma natural, cuando se unen a uno o más marcadores (tales como un tinte fluorescente) forman un fragmento marcado específico que no es natural.
A modo de descripción gráfica, una representación esquemática de la disposición general de la o las DMR diana, las DMR de referencia o la o las OR, si se usan, y el marcador o marcadores detectables se usan para una realización de la presente invención, se presenta en la FIGURA 6. (1a) La presencia de metilación en el ADN en una DMR diana (DMR1) ubicada en el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica se detecta usando un marcador o marcadores detectables; (1b) La presencia de metilación en el ADN en una segunda DMR diana (DMR2) ubicada en el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica se detecta usando un marcador o marcadores detectables diferentes; (1') La presencia de metilación en el ADN en dos DMR de referencia se detecta con el mismo marcador o marcadores detectables (pero diferentes de las usadas para detectar la o las DMR diana; (3') La detección de las DMR de referencia puede detectarse en el contexto de otras dos regiones opcionales ("OR1" y "OR2")) usando el mismo marcador o marcadores detectables (pero diferentes a aquellos usados para detectar las DMR); (2) Una o más de dichas OR pueden estar ubicadas en el mismo cromosoma que una DMR de referencia; en particular (4) una OR puede estar en la misma porción del genoma (por ejemplo, entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de) una d Mr de referencia.
En el contexto de la presente invención, la metilación en cualquier DMR particular usada en el método inventivo (tal como DMR diana o una DMR de referencia) puede detectarse en el contexto de al menos una OR. A modo de descripción gráfica, una representación esquemática de una posible disposición general de dicha o dichas DMR, la o las OR y el marcador o marcadores detectables, como se usa para una realización de dicha detección de DMR, se presenta en la FIGURA 1(a). (1) La presencia de metilación en el ADN en DMR1 se detecta en el contexto de otra región ("OR1") ubicada dentro de la misma parte del genoma (por ejemplo, entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de) DMR1. (2) Opcionalmente, pueden detectarse DMR y/u OR adicionales (tales como DMR2 y/u OR2, y hasta DMRn y ORn), y pares de dichas DMR y OR adicionales pueden ubicarse cada uno de ellos en la misma parte del genoma (por ejemplo, entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de) entre sí. Opcionalmente, (3) la presencia de metilación en el ADN se detecta en múltiples DMR, cuando se ubica en el mismo cromosoma diana o en uno o más cromosomas de referencia, usando el mismo marcador o marcadores detectables y/o (4) la cantidad de ADN total detectado usando al menos una OR (OR1, y opcionalmente, OR2 o hasta ORn) se detecta usando marcador o marcadores detectables diferentes a los usados para detectar la metilación en las DMR (opcionalmente, el marcador o marcadores detectables usados son las igual para todas las OR, cuando se encuentren en el mismo cromosoma diana o en uno o más cromosomas de referencia).
También en el contexto de la presente invención, cuando la metilación en dos o más DMR usadas (tales como DMR diana o una DMR de referencia), cuando se encuentra en el mismo cromosoma diana o en uno o más cromosomas de referencia, puede detectarse usando el mismo marcador o marcadores detectables. A modo de descripción gráfica, una representación esquemática de la disposición general de tales DMR, la o las OR (si se usan) y el marcador o marcadores detectables, como se usa para una realización de dicha detección de DMR, se presenta en la FIGURA 1(b). (1) La presencia de metilación en el ADN en dos o más DMR, DMR1 y DMR2 (y, opcionalmente, hasta DMRn), cuando se encuentra en el mismo cromosoma diana o en uno o más cromosomas de referencia, se detecta en cada caso usando el mismo marcador o marcadores detectables. (2) Opcionalmente, una otra región ("OR") puede estar ubicada dentro de la misma parte del genoma (por ejemplo, entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de) una de las DMR). (3) La cantidad de ADN total detectada usando al menos una OR (OR1 y, opcionalmente, OR2 o hasta ORn) se detecta usando marcador o marcadores detectables diferentes a los usados para detectar la metilación en las DMR (opcionalmente, el marcador o marcadores detectables usados son los mismos para todas las OR (cuando se encuentran en el mismo cromosoma diana o en uno o más cromosomas de referencia). (4) Opcionalmente, se detecta de esta manera la metilación en más de dos DMR y/o se detecta la cantidad de ADN total en más de una OR.
El uso de una combinación tal de características en la presente invención proporciona oportunidades para mejoras de eficiencia y/o encantamiento sinérgico del resultado. Por ejemplo, una sensibilidad y/o exactitud y/o especificidad y/o precisión mejoradas de detección (por ejemplo, detección de una cantidad cuantitativa) o dicha especie de ADN (fetal), en particular del cromosoma de referencia, puede obtenerse mediante el uso de una combinación tal; cuyo grado de mejora puede ser sinérgico, en comparación con el uso de cada característica por sí sola; por ejemplo, la mejora obtenida mediante el uso de las características combinadas es mayor que la suma de cada mejora obtenida mediante el uso de cada característica individualmente. En determinadas realizaciones de la invención, el ensayo o la prueba proporciona una sensibilidad general (tasa de verdaderos positivos), especificidad (tasa de verdaderos negativos) y/o tasa de no informable según se desee para dicha prueba; por ejemplo: una sensibilidad del 100 %, casi el 100 %, más del 97 % (en particular, más del 97,5 %) o más del 95 %; una especificidad mayor que el 95 %, en particular, mayor que el 96 %; y/o una tasa no informable de menos del 10 % (en particular, menos del 7 %), tal como menos del 6 % o el 5 %. En realizaciones particulares, el ensayo o la prueba de la invención puede proporcionar una sensibilidad mayor que el 95 %, una especificidad mayor que el 90 % y una tasa no informable de menos del 10 % y más particularmente puede proporcionar una sensibilidad mayor que el 97 %, una especificidad mayor que el 95 % y una tasa no informable de menos del 7 %.
Como resultará evidente para el experto en la materia tras la presente divulgación, puede llevarse a cabo una etapa análoga y adicional a la etapa (c) en el método para detectar la metilación y, por tanto, determinar/cuantificar/comparar, la cantidad de un segundo cromosoma diana (por ejemplo, con respecto al cromosoma o cromosomas de referencia) cuando tal segundo cromosoma diana es también un cromosoma (por ejemplo, diferente) relevante para una aneuploidía cromosómica (por ejemplo, diferente). Un método tal que sea capaz de detectar la presencia de dos (o más) aneuploidías cromosómicas diferentes en un feto de una mujer embarazada tiene ventajas particulares en términos de coste, velocidad y comodidad.
En determinadas realizaciones, antes de o como parte de la detección que se produce como parte de una etapa (c) y/o una etapa (d) y/o etapa opcional (f) de cualquier método de la presente invención, cada región de ADN que comprende dicha o dichas DMR y/o dicha o dichas OR opcionales, respectivamente, se amplifica o amplifican. La amplificación del ADN puede llevarse a cabo usando cualquier proceso de replicación adecuado y, en particular, de tales realizaciones, cada una de la o las DMR y/o la o las OR opcionales, se amplifica mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores adecuadamente diseñados para cada DMR y/u OR. El experto habitual podrá diseñar fácilmente dichos cebadores de PCR para su uso en el método de la invención, por ejemplo, mediante el uso de algoritmos y programas de diseño de cebadores tales como Clone Manager Professional 9 (Sci-Ed Software), Vector NTI (Life Technologies) o herramientas basadas en web como las que se encuentran en www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ o molbiol-tools.ca/PCR.htm. Aquellas realizaciones de la presente invención que comprenden amplificación por PCR pueden comprender además etapas específicas que están relacionadas con la práctica de la PCR, tal como cualquiera de aquellas descritas en el presente documento, o en particular las etapas de: (A) proporcionar una mezcla de reacción que comprende un<a>D<n>diana bicatenario, un par de cebadores (por ejemplo, un par de cebadores descritos en el presente documento) diseñados para amplificar una región de dicho ADN (tal como una DMR o una OR opcional como se describe en el presente documento) en donde el primer cebador es complementario a una secuencia en la primera cadena del a Dn diana y el segundo cebador es complementario a una secuencia en la segunda cadena del ADN diana, polimerasa Taq y una pluralidad de nucleótidos libres que comprenden adenina, timina, citosina y guanina; (B) calentar la mezcla de reacción a una primera temperatura predeterminada durante un primer tiempo predeterminado para separar las cadenas del ADN diana entre sí; (C) enfriar la mezcla de reacción a una segunda temperatura predeterminada durante un segundo tiempo predeterminado en condiciones para permitir que el primer y el segundo cebadores se hibriden con sus secuencias complementarias en la primera y segunda hebras del ADN diana y para permitir que la polimerasa Taq extienda los cebadores; y (D) repetir las etapas (B) y (C) al menos 20 veces.
La expresión PCR cuantitativa "basada en sonda" está reconocida en la técnica y abarca diversas realizaciones descritas y comercializadas bajo diferentes nombres comerciales (tales como PCR "TaqMan" de Roche) y usa una sonda indicadora (por ejemplo, fluorescente) que es específica para la detección de un amplicón determinado (por ejemplo, una DMR u otra región). La PCR cuantitativa basada en sondas es distinta de la PCR cuantitativa que usa colorantes de unión al ADN bicatenario (por ejemplo, SYBR Green) como indicadores, ya que tales colorantes de unión al ADN bicatenario se unen de manera no especial a cualquier amplicón bicatenario y, por ejemplo, no pueden usarse para distinguir entre la detección de la o las DMR (es decir, dichas especies de ADN) de la detección de la o las otras regiones (es decir, detección de ADN total). Como la persona experta en la materia apreciará, puede detectarse un amplicón específico de PCR usando una única sonda o usando múltiples sondas (tales como dos o tres sondas) para un amplicón. En particular, la PCR cuantitativa basada en sondas puede incluir reacciones de amplificación en donde se han incorporado procesos de detección de un ácido nucleico diana usando oligonucleótidos marcados que usan la actividad nucleasa 5' a 3' de una polimerasa de ácido nucleico para escindir el oligonucleótido marcado hibridado (por ejemplo, la sonda) de dúplex hibridados y liberan fragmentos de oligonucleótidos marcados para su detección. Dichos enfoques y procesos son conocidos en la técnica y se describen en términos más generales por Gelfand et al (documentos US5804375, EP0543942 y miembros de la familia relacionados) y/o Livak et al (documentos US6258569, EP0792374 y miembros de la familia relacionados), e incluyen donde la sonda comprende un marcador detectable en combinación con una molécula inactivadora que inactiva la detectabilidad del marcador cuando se une, de tal manera que se requiere que se produzca la nucleasa 5' a 3' (y por tanto la amplificación) antes de que el marcador detectable se libere en la mezcla de reacción (muy lejos del inactivador) y, por tanto, pueda detectarse. Adicionalmente, los enfoques de PCR cuantitativa "basados en sondas" pueden mejorarse alternativa o adicionalmente mediante el uso de sondas que comprenden conjugados de oligonucleótido-fluoróforo-inactivador-proteína de unión de surco menor, tal como se describe por Reed et al (documentos US6727356, EP1235938 y familiares relacionados). Las moléculas inactivadoras ilustrativas incluyen BHQ1, BHQ3, Eclipse, BHQ2, BBQ650.
Dicha PCR cuantitativa basada en sondas puede llevarse a cabo con un enfoque análogo, usando una máquina como un LightCycler en la que se mide la intensidad de la señal (por ejemplo, a lo largo del tiempo) y se usa para determinar cuantitativamente la detección. Sistemas y enfoques para tal detección se describen por Woudenberg et al (documentos US6929907, EP0706649 y miembros de la familia relacionados) y/o Higuchi (documentos US5994056, EP0512334 y miembros de la familia relacionados). Como alternativa, PCR digital (dPCR), es decir, PCR llevada a cabo en múltiples eventos para determinar el número de eventos de amplificación como método para cuantificar una cantidad de ADN detectado. Por ejemplo, dPCR que se lleva a cabo en nanopocillos o gotitas (ddPCR). Los proveedores disponibles en el mercado de tecnología ddPCR incluyen Bio-Rad y Rain Dance.
La persona experta será capaz de diseñar cebadores y sondas adecuados (y con marcadores adecuados, por ejemplo colorantes) para la detección por PCR cuantitativa basada en sondas de las DMR y/o la olas OR); por ejemplo, usando software de diseño de cebadores/sonda como se describe en otra parte del presente documento. Como se sabrá, los cebadores de PCR pueden superponerse a sitios de metilación específicos para el reactivo modificador específico de metilación usado en los métodos, en particular, cuando el reactivo comprende una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, tal como uno (o una combinación de los mismos) como se desvela en el presente documento. En dichas realizaciones particulares, uno u otro (o cuando se consideran juntos, ambos) de los cebadores de PCR para una DMR determinada pueden superponerse a dos o tres de dichos sitios de metilación (tales como dos o tres sitios de restricción para enzimas de restricción sensibles a la metilación, cada uno de los cuales puede comprender, o comprende, un sitio de metilación). Como alternativa o además, los cebadores para una DMR pueden diseñarse para flanquear uno, dos, tres o más de dichos sitios de metilación, tales como hasta 10, 15, 20, 25 o 50 de dichos sitios de metilación, en particular, sitios de restricción flanqueantes para uno, dos, tres o más de dichos sitios de metilación (más particularmente, entre dos y cuatro de dichos sitios de metilación), tales como hasta 10, 15, 20, 25 o 50 enzimas de restricción sensibles a la metilación, cada uno de los cuales puede comprender, o comprende, un sitio de metilación.
En otras realizaciones, un marcador o marcadores detectables usada en la etapa (c) y/o una etapa (d) y/o la etapa opcional (f) de un método de la invención se selecciona independientemente del grupo que consiste en: marcador fluorescente, de proteína, de molécula pequeña o radiactivo. Por ejemplo, pueden usarse marcadores fluorescentes que sean iguales (incluyendo, que tengan espectros de excitación y/o emisión similares o superpuestos) para la o las DMR, y puede usarse un marcador fluorescente que tenga un espectro de excitación y/o emisión (en particular, un diferente espectro de emisión) para la detección de la o las OR opcionales. La persona experta en la materia podrá seleccionar dichos marcadores fluorescentes apropiados para su uso en la presente invención de, por ejemplo, el grupo que consiste en: FAM, TET, JOE, VIC, h Ex , NED, PET, ROX, TAMRA, Quasar y Texas Red y LCCyan500, 6FAm , Cy5, LCRed610 y LCRed640. Pueden usarse marcadores fluorescentes con un resto inactivador correspondiente; siendo bien conocida en la técnica la selección de dichos pares de marcadorinactivador, y puede incluir un par de marcador-inactivador seleccionado de la lista que consiste en: LCCyan500/BHQ1, Cy5/BHQ3, 6FAM/Eclipse, LCRed610/BBQ650 y LCRed640/BHQ3.
En otras realizaciones, un marcador o marcadores detectables puede ser una proteína o una etiqueta de molécula pequeña que, por ejemplo, puede detectarse usando un anticuerpo específico y enfoques de detección de tipo ELISA. El uso de la misma proteína o molécula pequeña o una proteína o molécula pequeña detectablemente diferente según corresponda para los mismos o diferentes marcadores y la detección apropiada de las diversos DMR y/o la o las OR opcionales, también puede utilizarse para el marcador o marcadores detectables usados en la presente invención. Los diferentes marcadores radiactivos pueden distinguirse por su energía de emisión, características de penetración/excitación y tipo de partícula (por ejemplo, distinguiendo entre partículas alfa y beta). En la presente invención también pueden emplearse otros marcadores detectables (tales como etiquetas codificadas por ácidos nucleicos).
En realizaciones particulares de la presente invención, la detección en la etapa (c) comprende PCR basada en sonda cuantitativa en tiempo real, por ejemplo, usando al menos una sonda marcada que sea específica para una de la o las DMR diana. En aquellas realizaciones donde la amplificación por PCR de múltiples DMR y/u OR opcionales se realiza en la misma reacción, dicha PCR puede considerarse como "múltiplex" (o "dúplex" si solo se amplifican dos DMR y/u OR). Igualmente, la detección en la etapa (d) en los métodos de la invención puede, además o alternativamente, comprender PCR cuantitativa basada en sondas en tiempo real, tal como usando al menos una sonda marcada específica para una de dicha o dichas DMR de referencia. También igualmente, la detección en la etapa opcional (f) en los métodos de la invención puede, además o alternativamente, comprender PCR cuantitativa basada en sondas en tiempo real, tal como usando al menos una sonda marcada específica para una de dicha o dichas OR.
Los cebadores y/o sondas usados en el método de la presente invención pueden configurarse o diseñarse para detectar la metilación en una o más de las DMR mediante detección específica de secuencia después de, por ejemplo, la conversión con bisulfito de CpG metilados en uracilo. A modo de ejemplo no limitante, dicha detección puede producirse con MSP o MmethylLight como se describe en otra parte del presente documento.
En realizaciones particulares de la presente invención, la detección en la etapa (c) de un método de la invención comprende PCR basada en sonda cuantitativa en tiempo real, por ejemplo, usando al menos dos sondas marcadas, cada una de los cuales es específica para una de dichas dos o más DMR diana; y/o dicha detección en la etapa (d) comprende una PCR cuantitativa basada en sondas en tiempo real múltiplex usando al menos dos sondas marcadas, cada una de las cuales es específica para una de dichas DMR de referencia.
En otras realizaciones de la presente invención, dicha detección en la etapa (f) comprende una PCR cuantitativa en tiempo real usando al menos una sonda marcada específica para una de dicha o dichas OR.
Cuando se usan dos o más de dicha o dichas OR, la presente invención incluye realizaciones en donde la detección en la etapa opcional (f) se realiza usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para cada una de dichas OR; y/o en donde dicha detección en la etapa (f) comprende una PCR basada en sondas cuantitativa en tiempo real múltiplex usando al menos dos sondas marcadas, cada una de las cuales es específica para una de dichas OR.
En realizaciones particulares, una o más (preferentemente todas) las etapas de detección (es decir, aquellas requeridas para la o las DMR y la o las OR) se llevan a cabo de manera eficiente y eficaz usando PCR basada en sondas cuantitativa múltiplex (por ejemplo, TaqMan), en una etapa del proceso o reacción. Por ejemplo, en realizaciones particulares de la presente invención, dicha detección de la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), se llevan a cabo usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente de reacción/detección, y de forma eficaz simultáneamente entre sí y por PCR basada en sonda cuantitativa en tiempo real múltiplex usando al menos una sonda marcada específica para cada una de dichas DMR y OR opcional u opcionales. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, el reactivo comprende una o más enzimas de restricción sensibles a la metilación, tal como uno (o una combinación de los mismos) como se desvela en el presente documento.
La presente invención también puede incluir procedimientos adicionales, tales como uno o más procedimientos de control. Por ejemplo, la presente invención puede incluir una o más etapas dirigidas a la detección de una tercera clase de región de ADN que actúa como control para la etapa de modificación (por ejemplo, como control para la digestión con enzimas de restricción). Tales realizaciones pueden, por ejemplo, llevarse a cabo también usando una PCR basada en sondas cuantitativa en tiempo real múltiplex en donde dicha región de control se amplifica y se detecta mediante un conjunto adicional de cebadores/sonda o sondas con un marcador detectable adicional usado para dicha clase de región.
En la presente invención, dichas especies de ADN diana y de referencia se originan a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y dicha muestra es de una mujer embarazada. En determinadas realizaciones, la muestra puede obtenerse de forma no invasiva. Por ejemplo, dicha especie de ADN es ADN extracelular circulante en circulación que se ha detectado a partir de la muestra que es sangre o una fracción de sangre (tal como plasma o suero) que se ha obtenido de la mujer embarazada por medios convencionales tales como un tubo de extracción de sangre. En dichas realizaciones, la muestra puede comprender ADN que tiene origen materno; es decir, se origina a partir de células (y por lo tanto del genoma de) la mujer embarazada.
En todos los aspectos de la presente invención, existen realizaciones en donde la muestra es una muestra de tejido o una muestra de fluido biológico. En particular, la muestra es sangre completa o una fracción de sangre (por ejemplo, tal como plasma o suero). En realizaciones alternativas, la muestra es fluido biológico seleccionado del grupo que consiste en: orina, saliva, sudor, lágrimas, flema, leche materna, aspirado de mama, secreción vaginal, lavado vaginal y lavado de colon. En realizaciones más particulares, la muestra es una muestra de plasma o suero de la mujer embarazada, o es orina de la mujer embarazada. En otras realizaciones, la muestra está en gran medida (o esencialmente) libre de células y/o no es una muestra de sangre completa.
En realizaciones particulares de todos los aspectos de la invención, dicha especie de ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto es ADN extracelular circulante y dicha muestra es una fracción de sangre tal como plasma o suero.
La presente invención incluye realizaciones en donde la o las DMR (tales como las DMR diana y/o las DMR de referencia) está o están hipermetiladas en el ADN fetal e hipometiladas en el ADN materno. En determinadas realizaciones, una DMR tal puede estar ubicada en un promotor, una región potenciadora o un exón de un gen, tal como un gen desvelado en el presente documento o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. Como alternativa, una DMR puede estar ubicada en un intrón de dicho gen o en una región no codificante del genoma. En realizaciones particulares de todos los aspectos de la presente invención, un genoma y/o gen tal es un genoma o gen humano.
Se incluyen específicamente en la presente invención realizaciones en donde dicha o dichas DMR comprenden al menos uno, preferentemente al menos dos, sitio o sitios de metilación específicos para dicho reactivo. Por ejemplo, comprende tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más que diez, tales como aproximadamente 15, 20, 25, 50 o más de 50 sitio o sitios de metilación específicos para dicho reactivo.
En el contexto de las DMR ubicadas en el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica, la presente invención abarca cualquier DMR adecuada ubicada en un cromosoma tal, tales como aquellas descritas en cualquier otra parte del presente documento.
En realizaciones particulares de la presente invención, por ejemplo, cuando el método está configurado para buscar la detección de una aneuploidía cromosómica del cromosoma 21 humano, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionado independientemente de uno desvelado en el documento WO 2011/092592, incluyendo uno seleccionado de la lista que consiste en: EP1, EP2, EP3, EP4, EP5, EP6, EP7, EP8, EP9, EP10, EP11 y EP12 del documento WO 2011/092592 (SEQ ID NO: 33-44 del documento WO 2011/092592), como se investiga más detalladamente en Lim et al 2014, BMC Medical Genomics 7:1).
En otras realizaciones particulares de la presente invención, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de la lista que consiste en: AIRE (ENSG00000160224; gen regulador autoinmunitario humano; Cr21:44.285.838-44.298.648 cadena directa, GRCh38:CM000683.2), SIM2 (ENSG00000159263; homólogo 2 humano resuelto; Cr21:36.699.133-36.749.917 cadena directa, GRCh38:CM000683.2) y ERG (ENSG00000157554; gen humano relacionado con ETS; Cr21:38.380.027-38.661.780 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen.
En otras realizaciones particulares de la presente invención, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de la lista que consiste en: PDE9A (ENSG00000160191; fosfodiesterasa 9A humana; Cr21:42.653.636-42.775.509 cadena directa, GRCh38:CM000683.2), PPP1R2P2 (ENSG00000234008; proteína fosfatasa 1 humana, gen del pseudogén 2 de la subunidad 2 reguladora (inhibidora); Cr21:35.887.195-35.887.807 cadena directa, GRCh38:CM000683.2), CBR1 (ENSG00000159228; gen de carbonil reductasa 1 humana; Cr 21:36.069.941-36.073.166 cadena directa, GRCh38:CM000683.2), DSCAM (ENSG00000171587; gen de la molécula de adhesión celular del síndrome de Down humano; Cromosoma 21: 40.010.999-40.847.139 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2), C21orf29 (ENSG00000175894; dominio de laminina G de tipo trombospondina humana y gen de repeticiones EAR; Cromosoma 21: 44.497.892-44.711.580 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2), HLCS (ENSG00000159267; gen de la holocarboxilasa sintetasa humana; Cromosoma 21: 36.750.888-36.990.236 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, en particular, cada caso una región descrita en el documento WO 2007/132176; o seleccionado de la lista que consiste en: CGI137, Similitud con Fem1A(C. elegans),CGI009 y CGI132 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, en particular, cada caso una región descrita en el documento WO 2007/132176. O, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen siendo C21orf57 (ENSG00000182362; metalopeptidasa ybeY; Cromosoma 21: 46.286.337-46.297.751 cadena directa, GRCh38:CM000683.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. O, cada una de dichas<d>M<r>diana está ubicada en una región y/o gen siendo C21orf29 (ENSG00000175894; Cromosoma 21: 44.497.892-44.711.580 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. O, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen siendo CGI149 (ENSG00000115561; proteína de cuerpo multivesicular cargado 3, CHMP3; HGNC:29865; Cromosoma 2: 86.503.431-86.563.479 cadena inversa, GRCh38:CM000664.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen (Chim at al 2008; Yin et al, 2014; Prenat Diagn 34:63). En realizaciones particulares de dichas realizaciones, al menos una de dichas DMR diana está ubicada en DSCAM o C21orf57 o C21orf29 o CGI149, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; tal como cuando una de dichas primeras d Mr diana está ubicada en DSCAM y otra de dichas primeras DMR diana está ubicada en C21orf57 (o en C21orf29 o CGI149), o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen.
En otras realizaciones particulares de la presente invención, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259 y 261 del documento WO 2011/034631, tales como seleccionados independientemente de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 37, 257, 258 y 259, en particular, cualquiera de dichas regiones y/o genes desvelados en el documento WO 2011/034631 estando hipermetilados en el ADN fetal con respecto al ADN materno. En determinadas realizaciones de dichas realizaciones particulares de la presente invención, una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen que es SEQ ID NO: 37 del documento WO 2011/034631 (SEQ ID NO: 51 de la presente divulgación) y otra de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen que es SEQ ID NO: 258 del documento WO 2011/034631 (SEQ ID NO: 185 de la presente divulgación) u otra de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen que es SEQ ID NO: 239 del documento WO 2011/034631 (SEQ ID NO: 182 de la presente divulgación) u otra de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen que es SEQ ID NO: 39 del documento WO 2011/034631 (SEQ ID NO: 125 de la presente divulgación) o ubicada en aproximadamente 100 pb, 50 pb, 40bp, 30bp, 20 pb o 10 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen.
En realizaciones alternativas de la presente invención, por ejemplo, cuando el método está configurado para buscar la detección de una aneuploidía cromosómica del cromosoma 18 humano, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de: VAPA-APCDDI (ENSG00000101558; proteína A asociada a VAMP (proteína de membrana asociada a vesículas); Cromosoma 18: 9.914.002-9.960.021 cadena directa, GRCh38:CM000680.2) y maspina (ENSG00000206075; también conocida como SERPINB5; inhibidor de serpina peptidasa, clado B (ovoalbúmina), miembro 5; Cromosoma 18: 63.476.761-63.505.085 cadena directa, GRCh38:CM000680.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. En dichas realizaciones particulares, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región del gen maspina (también conocido como "SERPINAB5") que se describe en el documento EP 1751 307 estando metilado de forma diferencial entre un feto y su madre, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. O, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen que es un factor nuclear de linfocitos T activados, citoplasmático 1 (NFATC1; ENSG00000131196; Cromosoma 18: 79.395.856-79.529.325 cadena directa, GRCh38:CM000680.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. O, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen que es chr18gr00094 del documento WO 2011/034631, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen.
En otras realizaciones alternativas de la presente invención, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 y 32 del documento WO 2011/034631 (por ejemplo, SEQ ID NO:31 del documento WO 2011/034631/SEQ ID NO:17 de esta divulgación, o SEQ ID NO:23 del documento WO 2011/034631/SEQ ID NO:9 de esta divulgación), en particular, cualquiera de dichas regiones y/o genes desvelados en el documento WO 2011/034631 estando hipermetilados en el ADN fetal con respecto al ADN materno, o ubicados en aproximadamente 100 pb, 50 pb, 40bp, 30bp, 20 pb, 10 pb o 5 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, en particular, ubicados menos de 20 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen y más particularmente a menos de 10 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen.
En algunas realizaciones adicionales de la presente invención, por ejemplo, cuando el método está configurado para buscar la detección de una aneuploidía cromosómica del cromosoma 13 humano, cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de: la lista que consiste en: SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 del documento WO 2011/034631, en particular, cualquiera de dichas regiones y/o genes desvelados en el documento WO 2011/034631 estando hipermetilados en el ADN fetal con respecto al ADN materno.
En el contexto de las DMR ubicadas en el cromosoma de referencia, la presente invención abarca cualquier DMR adecuada ubicada en un cromosoma tal, tales como aquellas descritas en cualquier otra parte del presente documento.
En realizaciones particulares de la presente invención, por ejemplo, cuando el método está configurado para buscar la detección de un cromosoma de referencia, al menos una de dichas DMR de referencia está (preferentemente dos o más de dichas DMR de referencia cada una) ubicado en una región y/o gen seleccionado independientemente de la lista que consiste en: RASSF1A (ENSG00000068028; Miembro 1 de la familia del dominio de asociación Ras (RalGDS/AF-6); Cromosoma 3: 50.329.782-50.340.980 cadena inversa, GRCh38:CM000665.2), TBX3 (ENSG00000135111; caja T 3; Cromosoma 12: 114.670.254-114.684.164 cadena inversa, GRCh38:CM000674.2), CDC42EP1 (ENSG00000128283; proteína efectora CDC42 (unión a Rho GTPasa) 1; Cromosoma 22: 37.560.447-37.569.405 cadena directa, GRCh38:CM000684.2), PCDHGA1 (ENSG00000204956; subfamilia A de protocadherina gamma, 1; Cromosoma 5: 141.330.571-141.512.981 cadena directa, GRCh38:CM000667.2) y SPN (ENSG00000197471; sialoforina; Cromosoma 16: 29.662.979-29.670.876 cadena directa, GRCh38:CM000678.2); o seleccionado de SOX14 (ENSG00000168875; caja 14 SRY (región Y determinante del sexo); Cromosoma 3: 137.764.284-137.766.338 cadena directa, GRCh38:CM000665.2) y ZFY (ENSG00000067646; proteína de dedo de cinc, ligado a Y; Cromosoma Y: 2.935.281-2.982.506 cadena directa, GRCh38:CM000686.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o ubicada en MGC15523 (ENSG00000157637; también conocida como "SLC38A10", familia A de transportadores de solutos 10; Cromosoma 17: 81.245.000-81.295.547 cadena inversa, GRCh38:CM000679.2) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, al menos una de dichas DMR diana está ubicada en TBX3 o PCDHGA1, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; tal como cuando una de dichas DMR de referencia está ubicada en TBX3 y otra de dichas DMR de referencia está ubicada en PCDHGA1 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen.
En otras realizaciones particulares de la presente invención, cada una de dichas DMR de referencia está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 y 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 y 163 del documento WO 2011/034631, tales como seleccionados independientemente de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 52, 118 y 142 del documento WO 2011/034631, en particular, cualquiera de dichas regiones y/o genes desvelados en el documento WO 2011/034631 estando hipermetilados en el ADN fetal con respecto al ADN materno. En determinadas realizaciones de dichas realizaciones particulares de la presente invención, una de dichas DMR de referencia está ubicada en una región y/o gen que es SEQ ID NO: 52 del documento WO 2011/034631 (SEQ ID NO: 66 de la presente divulgación) y otra de dichas DMR de referencia está ubicada en una región y/o gen que es SEQ ID NO: 118 del documento W o 2011/034631 (SEQ ID NO: 102 de la presente divulgación)
La TABLA C muestra la conversión de los identificadores de secuencia usados en los documentos WO 2011/034631 y WO 2011/092592 a los identificadores de secuencia usados en la presente divulgación.
TABLA C: Tabla de conversión para identificadores de secuencia
SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
Presente invenciónDocumento WO 2011/034631 Documento WO 2011/092592 SEQ ID NO: 15 1 -SEQ ID NO: 16 2 -SEQ ID NO: 17 3 -SEQ ID NO: 18 4 -SEQ ID NO: 19 5 -SEQ ID NO: 20 6 -SEQ ID NO: 21 7 -SEQ ID NO: 22 8 -SEQ ID NO: 23 9 -SEQ ID NO: 24 10 -SEQ ID NO: 25 11 -SEQ ID NO: 26 12 -SEQ ID NO: 27 13 -SEQ ID NO: 28 14 -SEQ ID NO: 29 15
SEQ ID NO: 84 100 -SEQ ID NO: 85 101 -SEQ ID NO: 86 102 -SEQ ID NO: 87 103 -SEQ ID NO: 88 104 -SEQ ID NO: 89 105 -SEQ ID NO: 90 106 -SEQ ID NO: 91 107
SEQ ID NO: 92 108 -SEQ ID NO: 93 109 -SEQ ID NO: 94 110 -SEQ ID NO: 95 111 -SEQ ID NO: 96 112 -SEQ ID NO: 97 113 -SEQ ID NO: 98 114 -SEQ ID NO: 99 115 -SEQ ID NO: 100 116 -SEQ ID NO: 101 117 -SEQ ID NO: 102 118 -SEQ ID NO: 103 119 -SEQ ID NO: 104 120 -SEQ ID NO: 105 121 -SEQ ID NO: 106 122 -SEQ ID NO: 107 123 -SEQ ID NO: 108 124 -SEQ ID NO: 109 125 -SEQ ID NO: 110 126 -SEQ ID NO: 111 127 -SEQ ID NO: 112 128 -SEQ ID NO: 113 129 -SEQ ID NO: 114 130 -SEQ ID NO: 115 131 -SEQ ID NO: 116 132 -SEQ ID NO: 117 133 -SEQ ID NO: 118 134 -SEQ ID NO: 119 135 -SEQ ID NO: 120 136 -SEQ ID NO: 121 137 -SEQ ID NO: 122 138 -SEQ ID NO: 123 139 -SEQ ID NO: 124 140 -SEQ ID NO: 125 141 -SEQ ID NO: 126 142 -SEQ ID NO: 127 143 -SEQ ID NO: 128 144 -SEQ ID NO: 129 145 -SEQ ID NO: 130 146 -SEQ ID NO: 131 147 -SEQ ID NO: 132 148 -SEQ ID NO: 133 149 -SEQ ID NO: 134 150 -SEQ ID NO: 135 151 -SEQ ID NO: 136 152 -SEQ ID NO: 137 153 -SEQ ID NO: 138 154 -SEQ ID NO: 139 155 -SEQ ID NO: 140 156 -SEQ ID NO: 141 157 -SEQ ID NO: 142 158 -SEQ ID NO: 143 159 -SEQ ID NO: 144 160 -SEQ ID NO: 145 161 -SEQ ID NO: 146 162 -SEQ ID NO: 147 163 -SEQ ID NO: 148 176 -SEQ ID NO: 149 179 -SEQ ID NO: 150 180 -SEQ ID NO: 151 184 -SEQ ID NO: 152 188 -SEQ ID NO: 153 189 -SEQ ID NO: 154 190
(continuación)
SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO:
Presente invenciónDocumento WO 2011/034631 Documento WO 2011/092592 SEQ ID NO: 155 191 -SEQ ID NO: 156 193 -SEQ ID NO: 157 195 -SEQ ID NO: 158 198 -SEQ ID NO: 159 199 -SEQ ID NO: 160 200 -SEQ ID NO: 161 201 -SEQ ID NO: 162 202 -SEQ ID NO: 163 203 -SEQ ID NO: 164 205 -SEQ ID NO: 165 206 -SEQ ID NO: 166 207 -SEQ ID NO: 167 208 -SEQ ID NO: 168 209 -SEQ ID NO: 169 210 -SEQ ID NO: 170 211 -SEQ ID NO: 171 212 -SEQ ID NO: 172 213 -SEQ ID NO: 173 214 -SEQ ID NO: 174 221 -SEQ ID NO: 175 223 -SEQ ID NO: 176 225 -SEQ ID NO: 177 226 -SEQ ID NO: 178 231 -SEQ ID NO: 179 232 -SEQ ID NO: 180 233 -SEQ ID NO: 181 235 -SEQ ID NO: 182 239 -SEQ ID NO: 183 241 -SEQ ID NO: 184 257 -SEQ ID NO: 185 258 -SEQ ID NO: 186 259 -SEQ ID NO: 187 261 -SEQ ID NO: 188 - 33
SEQ ID NO: 189 - 34
SEQ ID NO: 190 - 35
SEQ ID NO: 191 - 36
SEQ ID NO: 192 - 37
SEQ ID NO: 193 - 38
SEQ ID NO: 194 - 39
SEQ ID NO: 195 - 40
SEQ ID NO: 196 - 41
SEQ ID NO: 197 - 42
SEQ ID NO: 198 - 43
SEQ ID NO: 199 - 44
Si se usan dos DMR que se ubican en el mismo cromosoma, entonces en realizaciones particulares de todos los aspectos de la presente invención, no están ubicadas en la misma parte del genoma y/o del gen. Por ejemplo, tales DMR pueden estar separadas por más de aproximadamente 20 kb, o más de aproximadamente 15 kb, 10kb, 8kb, 6kb, 4kb, 2kb, 1kb, 500 pb o 200 pb. Como alternativa, cuando en la presente invención se usan dos (o más) DMR que están ubicadas en el mismo cromosoma, pueden, en determinadas realizaciones, estar ubicadas en la misma región o gen (tal como uno descrito en el presente documento) y, además, pueden superponerse entre sí.
En realizaciones particulares de la presente invención, cuando se usan dos de dichas DMR de referencia (o se están usando más de dos DMR de referencia) al menos una (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia está ubicada en una parte del genoma y/o gen (preferentemente que es humano) que es RASSF1A y/o TBX3 y/o PCDHGA1 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; y/o al menos una (preferentemente cada una) de dichas DMR de referencia está ubicada entre aproximadamente las posiciones 4.700 pb y 5.600 pb de RASSF1A (Secuencia de referencia NCBI: NG_023270.1: Miembro 1 de la familia del dominio de la asociación Homo sapiens Ras (RaIGDS/AF-6) (RASSF1), RefSeqGene en el cromosoma 3; SEQ ID NO: 13); y/o está ubicada entre aproximadamente las posiciones 1.660 pb y 2.400 pb de TBX3 (Secuencia de referencia NCBI: NG_008315.1: Homo sapiens caja T 3 (TBX3), RefSeqGene en el cromosoma 12; SEQ ID NO: 14) y/o está ubicada en PCDHGA1 entre 141.330.571 y 141.512.981, de la secuencia de referencia del NCBI del cromosoma 5 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000005.10 GI:568815593; SEQ ID NO: 217), o entre aproximadamente 141.492.450 a 141.492.750 o 141.492.550 a 141.492.700 o 141.492.580 a 141.492.7690 de dicha secuencia. En realizaciones más particulares: (i) una DMR de referencia comprende una ubicada entre aproximadamente las posiciones 4.700 pb y 5.600 pb de RASSF1A y una segunda DMR de referencia comprende una ubicada entre aproximadamente las posiciones 1.660 pb y 2.400 pb de TBX3: o (ii) una DMR de referencia comprende una ubicada entre aproximadamente las posiciones 141.492.450 a 141.492.750 o 141.492.550 a 141.492.700 o 141.492.580 a 141.492.7690 de PCDh Ga 1 (Secuencia de Referencia NCBI del cromosoma 5 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000005.10 GI:568815593) y una segunda DMR de referencia comprende una ubicada entre aproximadamente las posiciones 1.660 pb y 2.400 pb de TBX3.
En realizaciones particulares, una DMR de referencia está ubicada en RASSF1A entre aproximadamente las posiciones 4.900 pb y 5.500 pb, 5.000 pb y 5.400 pb o 5.100 pb y 5.300 pb de RASSF1A; y/o está ubicado en TBX3 entre aproximadamente las posiciones 1.800 pb y 2.260 pb, 1.920 pb y 2.160 pb o 1.920 pb y 2.080 pb de TBX3 (tal como SEQ ID NO: 203); y/o está ubicada en DSCAM entre aproximadamente las posiciones 40.841.600 pb y 40.841.900 pb, 40.841.625 pb y 40.841.840 pb o 40.841.650 pb y 40.841.790 pb; y/o está ubicada entre aproximadamente las posiciones 141.492.450 a 141.492.750, 141.492.550 a 141.492.700 o 141.492.585 a 141.492.690 de PCDHGA1 (Secuencia de Referencia NCBI del cromosoma 5 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000005.10 GI:568815593) tal como SEQ ID NO: 221.
En realizaciones particulares de la presente invención, cuando se usan dos de dichas DMR diana (o se están usando más de dos DMR diana) al menos una (preferentemente cada una) de dichas DMR diana está ubicada en una parte del genoma y/o gen (preferentemente que es humano) que es DSCAM y/o C21orf57, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; y/o al menos una (preferentemente cada una) de dichas DMR diana está ubicada entre aproximadamente las posiciones 40.841.584 y 40.842.020 de DSCAM; (Molécula de adhesión celular del síndrome de Down; Secuencia de referencia del NCBI del cromosoma 21 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000021.9 GI:568815577, región 40.010.999 a 40.847.113; SEQ ID NO: 200); y/o se encuentra en no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de C21orf57 (YBEY; Cromosoma 21: 46.286.337-46.297.751 cadena directa, GRCh38:CM000683.2; tal gen, incluyendo regiones flanqueantes en dirección 5'/en dirección 3' de 250 pb, SEQ ID NO: 218); y/o se encuentra en no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de C21orf29 (dominio de laminina G tipo trombospondina y repeticiones Ea R, TSPEARM; HGNC:1268; Cromosoma 21: 44.497.892 44.711.580 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2); y/o se encuentra en no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de CGI149 (proteína 3 del cuerpo multivesicular cargado, CHMP3; h Gn C:29865; Cromosoma 2: 86.503.431-86.563.479 cadena inversa, GRCh38:CM000664.2).
En realizaciones particulares, una DMR diana está ubicada en DSCAM entre aproximadamente las posiciones 40.841.600 pb y 40.841.900 pb, 40.841.625 pb y 40.841.840 pb o 40.841.650 pb y 40.841.790 pb de DSCAM (con referencia al cromosoma 21 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000021.9 GI:568815577, región), tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 201; y/o está ubicada en aproximadamente 200 pb, 150 pb o 100 pb en dirección 5' o en dirección 3' de C21orf57, tal como entre aproximadamente las posiciones 46.297.700 a 46.297.940, 46.297.750 a 46.297.900 o 46.297.790 a 46.297.890 de la cadena directa del cromosoma 21, GRCh38:CM000683.2, tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 219; y/o está ubicada en aproximadamente 200 pb, 150 pb o 100 pb en dirección 5' o en dirección 3' de C21orf29, tal como entre aproximadamente las posiciones 44.709.100 a 44.709.900, 44.709.300 a 44.709.700 o 44.709.400 a 44.709.600 de la cadena directa del cromosoma 21, GRCh38:CM000683.2, tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 231; y/o está ubicada en aproximadamente 200 pb, 150 pb o 100 pb en dirección 5' o en dirección 3' de CGI149, tal como entre aproximadamente las posiciones 46.667.100 a 46.667.950, 46.667.300 a 46.667.750 o 46.667.400 a 46.667.650 de la cadena directa del cromosoma 21, GRCh38:CM000683.2, tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 232.
A modo de un ejemplo no limitante, en una realización de la presente invención: (i) una de dichas DMR diana está ubicada en Ds Ca M y otra de dichas DMR diana está ubicada en C21orf57 (o en C21orf29 o CGI149) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; y (ii) una de dichas DMR de referencia está ubicada en TBX3 y otra de dichas DMR de referencia está ubicada en PCDHGA1 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. En realizaciones particulares de dichas realizaciones: (i) una de dichas DMR diana comprende SEQ ID NO: 201 y otra de dichas DMR diana comprende SEQ ID NO: 219 (o SEQ ID NO: 231 o 232); y (ii) una de dichas DMR de referencia comprende SEQ ID NO: 203 y otra de dichas DMR de referencia comprende SEQ ID NO: 220.
La disposición general de las DMR y otras regiones ("OR") de la detección diferencial de ADN basada en metilación usada en el EJEMPLO 1, se representa gráficamente en la FIGURA 2: (1a) DMR1 se encuentra en el exón 2 de RASSF1A y OR1 se encuentra dentro del exón 4 de RASSF1A, con DMR1 ubicada entre las posiciones 50.340.672 pb y 50.340.784 pb y OR1 ubicada entre las posiciones 50.331.604 pb y 50.331.702 pb de la secuencia genómica de RASS1A (Secuencia de referencia NCBI: N<c>_000003.12 cromosoma 3 deHomo sapiens,GRCh38 Primary Assembly), separando DMR1 y OR1 por una distancia de 8.969 pb. (1b) DMR2 se encuentra en la región promotora de TBX3, con DMR2 ubicada entre las posiciones 114.687.095 pb y 114.687.189 pb y OR2 ubicada entre las posiciones 114.676.384 pb y 114.676.454 pb de la secuencia genómica de TBX3 (Secuencia de referencia NCBI: NC_000012.12 cromosoma 12 deHomo sapiens,GRCh38 Primary Assembly), separando DMR2 y OR2 por una distancia de 10.640 pb. (2) La metilación en el ADN en las dos DMR se detecta mediante PCR cuantitativa basada en sondas usando los respectivos cebadores de PCR directos (F) e inversos (R) y sondas específicas de región, cada sonda marcada con los mismos marcadores (P*). (3) El ADN total se detecta en dos<o>R mediante PCR cuantitativa basada en sondas usando los respectivos cebadores de PCR directos (F) e inversos (R) y sondas específicas de región, cada sonda marcada con los mismos marcadores para las OR que son diferentes a los marcadores usados para las dos DMR (P**). Los detalles de las secuencias de cebadores y sondas y de los marcadores de las sondas se exponen en la TABLA 1.
La disposición general de las DMR y otras regiones ("OR") usadas en una realización no limitante de la presente invención, se representa gráficamente en la FIGURA 6: (1a) una primera DMR diana (DMR1) se encuentra, por ejemplo, en DSCAM (Molécula de Adhesión de Células del Síndrome de Down; Secuencia de referencia del NCBI del cromosoma 21 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000021.9 GI:568815577, región 40.010.999 a 40.847.113; SEQ ID NO: 200) como una ubicada en SEQ ID NO: 51 y (1b) otra primera DMR diana (DMR2) se encuentra en una región a no más de 250 pb en dirección 5' o en dirección 3' de, por ejemplo, C21orf57 (YBEY; Cromosoma 21: 46.286.337-46.297.751 cadena directa, GRCh38:CM000683.2; tal gen, incluyendo regiones flanqueantes en dirección 5'/en dirección 3' de 250 pb, SEQ ID NO: 218) como una ubicada en SEQ ID NO: 185; (1') se encuentra una primera DMR de referencia (DMR1') en la región promotora de TBX3 (tal como una ubicada en SEQ ID NO: 66) y OR1' se encuentra en TBX3 (en el cromosoma humano 12 (2a'), con DMR1 ubicada entre las posiciones 114.687.093 pb y 114.687.191 pb y OR1 ubicada entre las posiciones 114.676.384 pb y 114.676.454 pb de la secuencia genómica de TBX3 (Secuencia de referencia NCBI: NC_000012.12 cromosoma 12 deHomo sapiens,GRCh38 Primary Assembly), separando DMR1' y OR1' por una distancia entre aproximadamente 10.600 pb y 10.810 pb (4a'); y una segunda DMR de referencia (DMR2') se encuentra en PCDHGA1 (tal como una ubicada en SEQ ID NO: 102) y OR2' se ubica en PCDHGA1 (en el cromosoma humano 5 (2b'), con DMR2' ubicada entre las posiciones 141.492.593 - 141.492.687 y OR2' ubicada entre las posiciones 141.492.918 - 141.493.009 de la secuencia genómica PCDHGA1 (Secuencia de Referencia NCBI del Cromosoma 5 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000005.10 GI:568815593); separando DMR2' y OR2' por una distancia de aproximadamente 300 pb (4b'). Pueden encontrarse (1a) DMR1 y/o (1b) DMR2 alternativas: (x) en una región de no más de 250 pb en dirección 5' o en dirección 3' de, por ejemplo, C21orf29 (TSPEARM; HGNC:1268; Cromosoma 21: 44.497.892-44.711.580 cadena inversa, GRCh38:CM000683.2); tal como una ubicada en SEQ ID NO: 231; o (y) en una región de no más de 250 pb en dirección 5' o en dirección 3' de, por ejemplo, CGI149 (CHMP3; HGNC:29865; Cromosoma 2: 86.503.431-86.563.479 cadena inversa, GRCh38:CM000664.2) tal como una ubicada en SEQ ID NO: 232)
En la realización de la presente invención representada gráficamente por la FIGURA 6, cada una de las dos primeras DMR diana se detecta con el marcador o marcadores detectables diferentes (1a) y (1b); las dos DMR de referencia (DRM1' y DMR 2') se detectan con el mismo marcador o marcadores detectables (1'); y las dos OR opcionales (OR1' y OR2') se detectan con el mismo marcador o marcadores detectables (3').
Determinadas realizaciones de la presente invención, comprenden el uso de una o más de las DMR, OR, secuencias de los cebadores y/o sondas anteriores, en particular cualquiera de los establecidos en la TABLA 1, TABLA D o TABLA 5, o TABLA E, TABLA 8 o TABLA 10. En realizaciones determinadas de dichas realizaciones, una sonda determinada comprende una secuencia expuesta en la TABLA 1, TABLA D o TABLA 5, o TABLA E, TABLA 8 o TABLA 10 y uno cualquiera de los pares de marcador e inactivador (opcionalmente, con un resto de ranura de unión menor) como se establece en la TABLA 1, TABLA D o TABLA 5, o TABLA E, TABLA 8 o TABLA 10. En particular, la sonda puede comprender la combinación de la secuencia con el par marcador y desactivador (opcionalmente, con el resto del surco de unión menor) como se establece en la TABLA 1, TABLA D o TABLA 5, o TABLA E, TABLA 8 o TABLA 10 para dicha sonda. Otras realizaciones de la presente invención, comprenden el uso de la combinación específica de dos o más (por ejemplo, de todas) las DMR, OR, secuencias de los cebadores y/o sondas anteriores, en particular, la combinación de los cebadores/sondas como se establece en la TABLA 1 y/o la combinación de los cebadores/sondas como se establece en la TABLA 5, incluyendo un cebador o sonda de la TABLA D; más particularmente la combinación de los cebadores/sondas como se establece en la TABLA E para la versión de ensayo V10.3.
El término "sitio o sitios de metilación" será reconocido en la técnica y tiene un significado que abarca, por ejemplo, un motivo CpG dentro de una secuencia de nucleótidos corta (por ejemplo, una que tiene 4, 6, 8, 10 o 12 pb de longitud) que está, preferentemente, reconocido por una enzima de restricción sensible a la metilación, tal como uno desvelado en otra parte del presente documento.
De manera análoga, y particularmente en el contexto de aquellas realizaciones de la presente invención que utilizan una o más OR, la OR, cuando se ubica en partes y/o genes particulares del genoma, podría ubicarse en un promotor, región potenciadora o un exón de un gen, o alternativamente, ubicarse en un intrón de dicho gen o en una región no codificante del genoma. En realizaciones particulares de todos los aspectos de la presente invención, un genoma y/o gen tal es un genoma o gen humano. En realizaciones particulares, cuando se usa una OR en la presente invención y está ubicada en la misma porción del genoma y/o gen que presenta uno o más DMR (preferentemente, que no se superponga con una DMR usada en la invención), entonces se ubica en una parte del genoma y/o gen tal como un gen (por ejemplo, humano, y/o en particular cuando dicha especie de ADN es ADNec fetal) que es RASSF1A y/o TBX3 y/o PCDHGA1 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, o se selecciona del grupo que consiste en: RASSF1A, TBX3, HLCS, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, MGC15523, SOX14 y SPN y DSCAM y C21orf57 y C21orf29 y CGI149 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. Cuando no está ubicada junto con una DMR (por ejemplo, cuando se usa una segunda o múltiples otras regiones), entonces esa otra región podrá, en determinadas realizaciones, estar ubicada en un gen constitutivo (por ejemplo, humano) (tales como GAPDH, beta-actina, ALB, APOE o RNASEP). De manera análoga, y particularmente en el contexto de otras realizaciones de la presente invención que usan una o más OR, la OR puede estar ubicada en partes y/o genes particulares del genoma y puede estar ubicada en un promotor, región potenciadora o un exón de un gen, o alternativamente, ubicarse en un intrón de dicho gen o en una región no codificante del genoma. En tales realizaciones particulares de todos los aspectos de la presente invención, un genoma y/o gen tal es un genoma o gen humano. En realizaciones particulares, una OR usada en la presente invención está ubicada en un gen constitutivo (por ejemplo, humano) (tales como GAPDH, beta-actina, ALB, APOE o RNASEP) o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen. Alternativamente, dicha OR puede estar ubicada en la misma parte del genoma y/o gen que presenta una o más DMR (tales como aquellas ubicadas en RASSF1A, TBX3, H<l>CS, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, MGC15523, SOX14 o SPN o DS<c>A<m>o PCDHGA1 o una secuencia de A<d>N de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen) y preferentemente no se superpone con una DMR usada en la invención.
En realizaciones particulares de todos los aspectos de la invención que usan una o más OR, dicha OR comprende una parte del genoma sin un sitio de metilación específico para dicho reactivo, y dicha OR está ubicada en los genes (por ejemplo, humanos) RASSF1A o TBX3 (por ejemplo, SEQ ID NO: 13 y 14 respectivamente) o DSCAM (SEQ iD NO: 200) o PCDHGA1 (SEQ ID NO: 217) o C21orf57 (dicho gen incluye regiones flanqueantes en dirección 5'/en dirección 3' de 250 pb de SEQ ID NO: 218) o C21orf29 o CGI149 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen, e incluye realizaciones más particulares en donde dos o más de dichas otras regiones se usan en la etapa de detección (c) y la primera otra región está ubicada entre aproximadamente las posiciones 14.220 pb y 13.350 pb de dicho RASSF1A y la segunda otra región está situada entre aproximadamente las posiciones 12.400 pb y 13.000 pb de dicho TBX3. En realizaciones particulares, una otra región está ubicada en RASSF1A entre aproximadamente las posiciones 14.230 pb y 14.340 pb, 14.230 pb y 14.330 pb, 14.230 pb y 14.320 pb o 14.230 pb y 14.310 pb de dicho RASSF1A; y/o está ubicada en TBX3 entre aproximadamente las posiciones 12.400 pb y 12.940 pb, 12.700 pb y 12.850 pb o 12.710 pb y 12.790 pb de dicho TBX3 (tal como SEQ ID NO: 204); y/o está ubicada en DSCAM entre aproximadamente las posiciones 40.841.150 pb y 40.841.525 pb, 40.841.200 pb y 40.841.475 pb o 40.841.250 pb y 40.841.425 pb de DSCAM (con referencia al cromosoma 21 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: n C_000021.9 Gl:568815577, región), tal como, por ejemplo, SEQ ID NO: 202; y/o está ubicado en PCDHGA1 entre aproximadamente las posiciones 141.492.800 - 141.493.100. 141.492.850 -141.493.050. 141.492.900 - 141.493.020. 141.492.918 - 141.493.009 de PCDHGA1 (Secuencia de referencia del NCBI del cromosoma 5 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000005.10), tal como SEQ ID NO: 221. Como alternativa, una OR puede estar ubicada en un exón tal como entre aproximadamente las posiciones 13.790 pb y 13.880 pb, o 14.490 pb y 14.600 pb de dicho RASSF1A, o entre aproximadamente las posiciones 8.040 pb y 8.180 pb o 6.230 pb y 6.350 pb de dicho TBX3; o una OR puede estar ubicada en un intrón tal como entre aproximadamente las posiciones 10.500 pb y 11.90 pb de dicho RASSF1A, o entre aproximadamente las posiciones 10.000 pb y 11.000 pb de dicho TBX3. Como alternativa, una OR puede estar ubicada en DSCAM, tal como la secuencia TCCGTGTGCTCCACCCTTTGAATTCAGAACGACATAGTGGATACTCCGTGGGGCTGCTGGAATCTTCCaTTCc CACT GCCTTATCTT (SEQ ID NO.: 202), que puede amplificarse y detectarse con las siguientes sondas y cebadores:
TABLA D: r n r n D AM R
TABLA E: Cebador sondas ara ensa os demostrados del EJEMPLO 10
continuación
Ahora hay pruebas sólidas de que el nivel de ADNec fetal (y/o ADNec total) presente en el sistema circulatorio (por ejemplo, en el plasma) de una mujer embarazada es un marcador de una o más formas de preeclampsia, tal como la preeclampsia de aparición temprana, preeclampsia leve y/o grave (véase Hahn et al 2011, Placenta 32(Supl):S17). La presente invención muestra una utilidad particular en la detección/cuantificación eficiente, eficaz, sensible y/o de baja variabilidad del ADNec fetal presente en plasma de mujeres embarazadas, y la presente invención tiene una utilidad particular en ellas. En consecuencia, en realizaciones particulares de la presente invención, el individuo es una mujer embarazada (por ejemplo, humana) que es susceptible de padecer o desarrollar una afección médica asociada al embarazo; donde dicha afección médica asociada al embarazo es preeclampsia. Como se usa en el presente documento, un individuo "susceptible a" una afección médica puede describirse alternativamente como "se sospecha que" o "se considera en riesgo de ser susceptible a" sufrir o desarrollar una afección médica; el método de la presente divulgación puede usarse para detectar y/o diagnosticar la susceptibilidad del individuo a, riesgo de padecer o desarrollar, o padecer o desarrollar, una afección médica.
Como se desvela también en el presente documento, el individuo puede ser una mujer embarazada (por ejemplo, humana) que es susceptible (o se considera que está en riesgo de ser susceptible) de padecer o desarrollar una afección médica asociada al embarazo seleccionada del grupo que consiste en: parto prematuro, retraso del crecimiento intrauterino y gemelo evanescente. En particular, en comparación con el EJEMPLO 1, la sensibilidad de la presente invención es tal que las discrepancias entre los niveles de ADNec determinados por el método de la invención y los determinados por recuentos de secuencias del cromosoma Y determinados mediante enfoques de secuenciación masiva paralela, puede ser útil para identificar uno o más casos de gemelo evanescente en embarazos de gemelos (mixtos) que anteriormente se creían embarazos únicos, y/o para seguir el desarrollo relativo y la salud de uno u otro de dichos embarazos de gemelos (de sexo mixto). La presente invención también puede usarse en la determinación del género de embarazos de gemelos, considerando los valores relativos del ADNec fetal en comparación con los recuentos de secuencias del cromosoma Y determinados a partir del ADNec (por ejemplo, mediante el uso de enfoques de secuenciación paralela). A este respecto, cabe señalar que los enfoques que usan la secuenciación masiva paralela de ADNec aleatorio en sangre materna normalmente siempre cuentan una frecuencia muy baja de secuencias del "cromosoma Y" (como entre aproximadamente el 0,003 % y el 0,004 % de todas las secuencias, o entre aproximadamente el 0,0015 % y 0,01 % o 0,002 % y 0,005 % de todas las secuencias) en todos los embarazos femeninos debido a la homología de ciertas secuencias cortas del cromosoma Y con otros cromosomas. Un corte de los recuentos de secuencia del "cromosoma Y" de aproximadamente el 0,005 %, o entre aproximadamente el 0,003 %, el 0,004 %, el 0,006 % o el 0,007 %, por lo tanto, puede emplearse para muestras femeninas.
En todos los aspectos de la presente invención, el reactivo que modifica diferencialmente el ADN metilado y no metilado puede comprender bisulfito y/o un agente que digiere selectivamente ADN no metilado sobre metilado (por ejemplo, dicho agente puede digerir ADN no metilado pero no ADN metilado). En realizaciones particulares, el agente reactivo comprende: al menos una enzima sensible a metilación; al menos una enzima de restricción sensible a metilación; y/o un agente seleccionado del grupo que consiste en: AatII, AciI, AclI, AfeI, AgeI, AgeI-HF, AscI, AsiSI, AvaI, BceAI, BmgBI, BsaAI, BsaHI, BsiEI. BsiWI, BsmBI, BspDI, BsrFI, BssHII, BstBI, BstUI, ClaI, EagI, FauI, FseI, FspI, HaeII, HgaI, HhaI, HinP1I, HpaII, Hpy99I, HpyCH4IV, KasI, MluI, NaeI, NarI, NgoMIV, NotI, NotI-HF, NruI, Nt.BsmAI, Nt.CviPII, PaeR7I, PluTI, PmlI, PvuI, PvuI-HF, RsrII, SacII, SalI, SalI-HF, SfoI, SgrAI, SmaI, SnaBI, TspMI y ZraI y Cac8I y PhoI. En realizaciones particulares, dicho reactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en: BstUI, HhaI y HpaII y AciI.
En realizaciones relacionadas, el reactivo puede comprender dos o más de cualquiera de los reactivos desvelados en el presente documento. Por ejemplo, puede comprender dos, tres, cuatro, cinco o más (por ejemplo, hasta siete, ocho o diez) enzimas de restricción sensibles a la metilación, incluyendo un reactivo que comprende o consiste esencialmente en dos o tres de las enzimas de restricción sensibles a la metilación seleccionadas del grupo que consiste en: BstUI, HhaI y HpaII.
El uso de bisulfito o enzimas de restricción sensibles a la metilación para estudiar la metilación diferencial será bien conocido por el experto habitual, que pueden aplicar enseñanzas de textos convencionales o adaptaciones de métodos publicados tales como Poon et al (2002), Nygren et al (2010) o Yegnasubramanian; et al (2006, Nuc Acid Res 34:e19). A modo de ilustración, los inventores proporcionan ejemplos en el presente documento que emplean el uso de enzimas de restricción sensibles a la metilación como reactivo que modifica diferencialmente el ADN metilado y no metilado. Para ilustración adicional usando bisulfito como reactivo, será evidente para el experto habitual que los sitios de metilación del ADN modificado con bisulfito pueden detectarse usando, por ejemplo, PCR específica de metilación (tal como usando cebadores y/o sondas que se unen selectivamente a las secuencias modificadas con bisulfito) y/o mediante la uso posterior de enzimas de restricción cuyo sitio de reconocimiento se crea tras dicha modificación con bisulfito. La PCR específica de metilación ("MSP") está descrita por Herman et al (documento US6200756, documento EP0954608 y miembros de la familia relacionados); y Laird et al (documento US6331393, documento EP1185695 y miembros de la familia relacionados) describen un desarrollo adicional de MSP usando PCR basada en sonda (conocida como "MmethylLight").
En realizaciones particulares de todos los aspectos de la invención, debe detectarse y/o determinarse una cantidad cuantitativa de la primera especie de ADN diana y/o de la especie de referencia de ADN (y/o de dicho ADN total). En consecuencia, en tales realizaciones, una o más (por ejemplo, cada una) de dichas etapas de detección y/o determinación comprenden una detección cuantitativa y dicha cantidad detectada de dicha especie de ADN se expresa como una concentración relativa de dicha especie de ADN con respecto al ADN total presente en dicha muestra. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la presente invención, en cada una de dichas etapas de determinación, cada una de dichas cantidades determinadas de dicha primera especie de ADN diana y de dicha segunda especie de ADN diana opcional, se expresa como concentraciones relativas de dicha primera especie de ADN diana, y de dicha segunda especie de ADN diana opcional, en cada caso al ADN total en dicha muestra. En aquellas realizaciones en donde se detecta una tercera (o cuarta) especie de ADN diana, entonces la presente invención también prevé que la cantidad de dicha tercera (o cuarta) especie de ADN diana se exprese como concentración relativa.
Si se conoce una cantidad absoluta de ADN total, entonces, correspondientemente, puede determinarse una cantidad absoluta (por ejemplo, representada por una concentración tal como pg/ml o equivalentes genómicos tales como Eg/ml) de cualquiera de las especies de ADN a partir de dicha concentración relativa. Puede determinarse una cantidad absoluta de ADN total para una muestra, para determinadas realizaciones, incluyendo las etapas adicionales de: detectar y/o determinar una cantidad de ADN total en una muestra patrón de ADN de cantidad conocida usando las mismas otras regiones que se usan en la etapa (c); y comparar la señal detectada a partir de dicha muestra patrón de ADN con la señal detectada en la etapa (c). Una muestra patrón de ADN de este tipo (de cantidad/concentración conocida) está fácilmente disponible en fuentes comerciales, y especialmente si se prepara y se analiza usando una serie de diluciones, puede usarse fácil y eficientemente para determinar (mediante interpolación/estimación a partir de la curva patrón) una cantidad absoluta de ADN total presente en la muestra. En la práctica, dicha curva patrón puede prepararse y analizarse esencialmente como se describe para una OR opcional (pero en un conjunto separado de recipientes/reacciones patrón), preferentemente en la misma ejecución que la detección de la o las<d>M<r>/OR; e incluso puede usar la misma mezcla maestra de reacción. En consecuencia, si bien la o las "DMR" del control de ADN pueden detectarse para dicho ADN patrón, no se requiere dicha señal para generar una curva patrón. En consecuencia, si se usa la señal de una muestra de ADN patrón para comparar, en determinadas realizaciones donde cada una de dichas etapas de detección y/o determinación comprende una detección cuantitativa, dicha cantidad detectada de dicha especie de ADN puede expresarse como una cantidad absoluta de dicha especie de ADN en dicha muestra.
En consecuencia, en una realización del método de la presente invención, el método comprende además las etapas de:
• determinar una cantidad de ADN en una muestra patrón de ADN de cantidad conocida con respecto a las mismas DMR usadas en la etapa (c) y/o la etapa (d) y/o en la etapa opcional (f); y
• comparar cada una de las señales detectadas a partir de dicha muestra patrón de ADN con las señales respectivas detectadas en la etapa (c) y/o la etapa (d) y/o en la etapa opcional (f).
En cualquiera de las realizaciones de la presente invención que usan una muestra patrón de ADN, se incluye algunas de dichas realizaciones en donde la muestra patrón de ADN es una muestra de ADN genómico humano de concentración conocida. Por ejemplo, un ADN genómico humano tal de concentración conocida puede derivar (por ejemplo, aislarse o purificarse) de células humanas cultivadasin vitro,tales como aquellos que se sabe que tienen un complemento de cromosomas euploide o aneuploidía (tal como una T21). En realizaciones alternativas de la presente invención, la muestra patrón de ADN es una muestra de ADN sintética o modificada de concentración conocida.
Como ahora resultará evidente para una persona experta en la materia, la muestra patrón de ADN puede no estar metilada de forma uniforme, de forma adecuada, de forma diferencial o de otro modo (en particular si se aísla de un cultivo de células humanas). En consecuencia, la presente invención incluye aquellas realizaciones en donde la muestra patrón de ADN no se trata con el reactivo que modifica diferencialmente el ADN metilado y no metilado (tal como un reactivo descrito en el presente documento).
En una realización particular de la presente invención, en cada una de dichas etapas de determinación, cada una de dichas cantidades determinadas de dicha primera especie de ADN diana y de dicha segunda especie de ADN diana opcional y de la especie de ADN de referencia, se expresa como una cantidad absoluta de dicha especie de ADN en dicha muestra. Sin embargo, como un aspecto de la invención se refiere a la comparación de (o consideración de cantidades o proporciones relativas) las cantidades determinadas de una o más (tales como dos) primeras especies diana de ADN (es decir, el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica) con las cantidades determinadas de la especie de referencia de ADN (es decir, un cromosoma de referencia), dicha comparación puede realizarse y no requiere la consideración de las cantidades absolutas. A modo de explicación, la relación entre "señal-Diana-Cromosoma'V'señal-Total-ADN" y "señal-Cromosoma-Referencia'V'señal-Total-ADN" es, debido a la cancelación matemática del componente "señal-Total-ADN", la misma que la relación entre "señal-Diana-Cromosoma" y "señal-Referencia-Cromosoma". En consecuencia, la presente invención también incluye realizaciones en donde la identificación de la presencia (o ausencia) de la aneuploidía cromosómica presente en el feto se realiza en la etapa (e) sin conocimiento ni consideración de la cantidad de ADN total presente en la muestra. Por ejemplo, la determinación en la etapa (e) puede realizarse directamente a partir de los números Ct (o Cp) generados a partir de qPCR, ya que se correlacionan inversamente con las concentraciones (cantidades) iniciales de las especies de ADN que se están cuantificando.
En determinadas realizaciones de la presente invención, se realiza una pluralidad de conjuntos de determinaciones para la etapa (c) y/o la etapa (d) y la etapa opcional (f), realizado cada conjunto de dichas determinaciones usando una alícuota diferente de ADN de dicha muestra, por ejemplo, en un recipiente diferente y de forma eficaz simultáneamente con cada otro miembro de la pluralidad de conjuntos de determinaciones. Cada miembro de dicha pluralidad puede considerarse una "réplica" del ensayo para la misma muestra (por ejemplo, tomada de la misma mujer embarazada). Las réplicas pueden incorporarse eficientemente al método del ensayo, por ejemplo, configurando dicho ensayo replicado para practicarlo en un recipiente diferente, tal como un pocillo diferente en la misma (o diferente) placa de microtitulación tal como una usada en una realización de qPCR de la presente invención.
En aquellas realizaciones de la presente invención que usan réplicas de las muestras, dicho número de réplicas para la muestra (pluralidad de conjuntos de determinaciones) puede estar entre 2 y aproximadamente 50 (conjuntos), tal como entre 2 y aproximadamente 20, entre 2 y aproximadamente 10 o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 15 (conjuntos); preferentemente en donde dicho número de réplicas (pluralidad de conjuntos) de determinaciones se selecciona del grupo que consiste en: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 (conjuntos de dichas determinaciones); en particular, entre aproximadamente 3 y 10 conjuntos de dichas determinaciones, más particularmente 6 conjuntos aproximadamente de dichas determinaciones. Por ejemplo, para aquellas realizaciones del ensayo que usan una placa de microtitulación, el número de réplicas puede representarse practicando el método de la presente invención en alícuotas de la misma muestra realizadas en tal número de (diferentes) pocillos de dicha placa de microtitulación.
La inclusión de réplicas en el método y, opcionalmente, su análisis, puede proporcionar información adicional sobre, por ejemplo, la robustez, el error u otra variabilidad en el método y, por tanto, una o más de las cantidades de ADN determinadas a partir del mismo. De hecho, en determinadas realizaciones de la invención que usan tales réplicas, la cantidad o cantidades relativas determinadas en la etapa (e), se determina a partir de dicha pluralidad de conjuntos de determinaciones realizadas para la etapa (c) y/o la etapa (d) y/o la etapa opcional (f). Dicha cantidad podrá determinarse, en dichas realizaciones, usando una cantidad promedio de ADN determinada para cada conjunto (de réplicas), tal como una cantidad media, mediana o moda de ADN determinada para cada conjunto (de réplicas), preferentemente una cantidad media de ADN determinada para cada conjunto (de réplicas).
Como alternativa o además, el método de la presente invención puede practicarse (con o sin réplicas) en una pluralidad de muestras diferentes, cada una tomada de una mujer embarazada diferente (por ejemplo, humana). En dichas realizaciones, especialmente cuando en ausencia de cualquier metodología de etiquetado molecular, dicho método se lleva a cabo en una pluralidad de muestras tomadas cada una de una mujer embarazada diferente, llevando a cabo cada método en un recipiente separado y de forma eficaz simultáneamente con cada miembro distinto de la pluralidad de muestras. Como entenderá ahora una persona experta en la materia, el método puede practicarse en cada muestra en un pocillo diferente de, por ejemplo, una placa de microtitulación.
Al practicar el método de la presente invención en múltiples muestras tomadas de diferentes mujeres embarazadas, puede practicarse en un número (pluralidad) de dichas muestras diferentes, comprendido entre 2 y aproximadamente 500 (o más de 500) muestras, tal como entre 2 y aproximadamente 200, entre 2 y aproximadamente 100 o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 muestras; preferentemente en donde dicha pluralidad de muestras se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 y 140 muestras (o más de 150 muestras); en particular, aproximadamente 60 muestras, cada una tomada de una mujer embarazada diferente.
En particular, la práctica del método de múltiples muestras tomadas de múltiples mujeres embarazadas (por ejemplo, humanas), tras la divulgación de la presente invención, ahora será posible para la persona experta en la materia; por ejemplo, mediante el uso de un sistema qPCR basado en placas de microtitulación tal como el LightCycler de Roche. Dichas múltiples muestras pueden ubicarse en diferentes pocillos de la misma placa de microtitulación o pueden ubicarse en diferentes placas de microtitulación. La inclusión y el análisis de una pluralidad de muestras tal, especialmente si se combina con una pluralidad de réplicas para cada muestra, puede permitir que la identificación de la presencia (o ausencia) de la aneuploidía cromosómica se realice con mayor certeza o confianza. Por ejemplo, la magnitud relativa de la variación en las cantidades determinadas de una muestra dada (por ejemplo, la desviación típica) para las diversas réplicas en comparación con la magnitud relativa de la variación en la cantidad determinada para todas las (diferentes) muestras, puede proporcionar información adicional en la etapa (e) (o etapa opcional (e)') para la detección de la aneuploidía cromosómica. Por ejemplo, una gran diferencia en una cantidad con poca variación relativa entre réplicas dará más confianza de que existe una diferencia con las otras muestras.
La inclusión de múltiples muestras (y/o réplicas) en una única ejecución (por ejemplo, una placa de microtitulación) también puede proporcionar ventajas al permitir la comparación de un experimento con otro; conteniendo cada ejecución al menos algunas muestras diferentes. La comparación entre series también puede verse facilitada por el uso de muestras control o patrón comunes a las diferentes ejecuciones, que puede permitir la normalización de cantidades medidas o calculadas entre o a través de ejecuciones. Sin embargo, con un número de muestras diferentes (por ejemplo, aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 130, 140, 150 o más de 150) en cada ejecución; en particular, aproximadamente 60 muestras diferentes en cada ejecución, las cantidades determinadas a partir de una ejecución pueden compararse con otras ejecuciones mediante métodos de normalización tales como los conocidos por el experto o los expertos en la materia o como se describen en otra parte del presente documento.
Una característica de determinadas realizaciones de la presente invención es que una cantidad del cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica se estima o se determina usando dos (o más) DMR diana ubicadas en dicho cromosoma. El uso y/o la consideración de las cantidades determinadas a partir de cada una de dichas dos (o más) DMR pueden proporcionar certeza o confianza adicional a una indicación de que hay una aneuploidía cromosómica presente (o ausente) en el feto. Por ejemplo, si la cantidad determinada en relación con una sola DMR diana indica que está presente una aneuploidía cromosómica, entonces esto puede considerarse una indicación menos segura o confiable que un resultado en donde las cantidades determinadas en relación con dos (o más) DMR diana indican que está presente una aneuploidía cromosómica.
En consecuencia, la presente invención incluye aquellas realizaciones donde una cantidad de la primera especie de ADN diana se determina a partir de la cantidad detectada de metilación en una de las DMR diana y una cantidad de la primera especie de ADN diana se determina a partir de la cantidad detectada de metilación en otra de la DMR diana.
En realizaciones particulares de dichas realizaciones, dos o más cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, pueden determinarse en la etapa (e) para dos o más cantidades de la primera especie de ADN diana, cada una con respecto a una o más de dichas primeras DMR diana.
En determinadas realizaciones, puede considerarse un análisis combinado de estas dos (o más) cantidades, tal como una media o una mediana de tales dos o más cantidades. Como alternativa, como se describe en el presente documento, en realizaciones particulares, dos o más (preferentemente cada una) de la cantidad o cantidades o proporciones relativas determinadas en la etapa (e) pueden usarse de forma independiente o por separado para considerar, determinar o indicar la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto. Una consideración o análisis "bidimensional" tal puede representarse o visualizarse usando un diagrama de dispersión tal como uno mostrado en la FIGURA 7; y/o siguiendo el uso de una gran cantidad de muestras y réplicas diferentes (opcionalmente con normalización entre ejecuciones) tal como uno mostrado en la FIGURA 8. Como ahora resultará evidente, el uso de más de dos (tal como una tercera) DMR como una DMR diana proporcionaría aún más certeza o confianza en el análisis, y la presente invención prevé específicamente el uso de las DMR diana adicionales para, por ejemplo, proporcionar un análisis "tridimensional" para ayudar aún más a la identificación de la aneuploidía cromosómica.
Cada una de las cantidades del cromosoma diana determinadas a partir de las DMR diana puede considerarse en relación con un umbral o distribución de cantidades de referencia. En particular, determinadas realizaciones de la presente invención son cuando en la etapa (e) dos o más (preferentemente cada una) de dicha cantidad o cantidades o proporciones relativas pueden compararse con umbral o umbrales y/o distribución o distribuciones de referencia, en donde dos o más (preferentemente cada una) de dichas cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones más altas o más baja que dicha distribución o distribuciones umbral y/o de referencia indican la presencia de la aneuploidía cromosómica en el feto.
Como se describe en el presente documento, la cantidad del umbral o umbrales y/o distribución o distribuciones de referencia pueden identificarse o proporcionarse a partir de registros o información externos, o pueden determinarse a partir del uso, la consideración y/o el análisis de múltiples muestras analizadas y cantidades determinadas de acuerdo con un método de la presente invención. En consecuencia, en realizaciones particulares, puede determinarse un umbral y/o una distribución de referencia a partir de una pluralidad de muestras, cada muestra tomada de una mujer embarazada diferente, tal como practicando el método descrito anteriormente en tales muestras; opcionalmente en donde se realizan réplicas (pluralidad de conjuntos) de determinaciones para la etapa (c) y/o la etapa (d), y la etapa opcional (c)' y la etapa opcional (f) para cada muestra, tal como practicando el método como se establece en el presente documento.
Al analizar una pluralidad de muestras y/o réplicas en un método de la invención, las muestras (y/o réplicas) pueden organizarse en diferentes grupos o ejecuciones (tal como en diferentes placas de microtitulación en un experimento de qPCR). En dichas realizaciones, dos o más grupos de dicha pluralidad de muestras/réplicas pueden analizarse grupo por grupo, tal como cada grupo analizado en una ejecución, ensayo o placa de microtitulación separados, y el umbral y/o la distribución de referencia se determinan mediante la normalización de la cantidad o cantidades o proporción o proporciones determinadas a partir de cada grupo de muestras. La "normalización" puede considerarse como cualquier método adecuado que permita que los resultados (por ejemplo, las cantidades) determinados a partir de las muestras/las réplicas de un grupo puedan compararse/ser comparables con aquellas de otro grupo. Por ejemplo, para poder comparar los análisis realizados en una ejecución (o placa de microtitulación) con los de otra ejecución (o placa de microtitulación). La persona experta dispondrá de diversos enfoques de normalización, incluso en donde dicha normalización entre grupos de muestras puede realizarse considerando la diferencia entre una cantidad o proporción específica de la muestra (tal como una media de conjuntos de determinaciones realizadas para dicha muestra) y un promedio (tal como una mediana) de la cantidad o proporción determinada para todas las muestras en el mismo grupo que dicha muestra específica; en particular, como se describe en el EJEMPLO 4 y se representa en la FIGURA 8.
Dados tales números de cantidades específicas de la muestra, la presencia de aneuploidía cromosómica en el feto puede estar indicada por la cantidad o proporción específica de la muestra con respecto a dicho feto que es un valor atípico en comparación con el umbral o umbrales y/o la distribución o distribuciones de referencia de la cantidad o cantidades o proporción o proporciones determinados con respecto a una o más (preferentemente a dos o a cada una) de las DMR diana. En realizaciones particulares de dichas realizaciones, la presencia de aneuploidía cromosómica en el feto puede indicarse mediante la cantidad o proporción específica de la muestra con respecto a dicho feto que se encuentra dentro de un grupo numérico ubicado: (a) fuera de un grupo de cantidades o proporciones específicas de la muestra con respecto a una pluralidad de otros fetos que son (presuntamente) euploides; y/o (b) dentro de un grupo de cantidades o proporciones específicas de la muestra con respecto a una pluralidad de otras muestras que representan fetos que tienen la aneuploidía cromosómica; preferentemente en donde dicha pluralidad de otras muestras que representan fetos se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 2-10, 12-15, 16-25, 26-30, 32-40, 42-50, 52-75, 78-100, 105-125, 130-150, 155 175, 180-200, 205-250, 255-300, 305-350, 355-400, 405-450, 455-500 y más de 500 otras muestras. En realizaciones relacionadas, el grupo puede definirse por una forma circular u ovular visualizada en un diagrama de dispersión de cantidades, en donde las coordenadas de dicha forma circular u ovular pueden predefinirse o calcularse a partir de las muestras analizadas en el método. La cantidad o cantidades del cromosoma diana en comparación con el cromosoma de referencia determinada en dos o más DMR diana pueden considerarse entonces en relación con tales coordenadas, cuando una muestra que tenga cantidades que se encuentren dentro de dicho límite sea indicativa de que la aneuploidía cromosómica está presente en el feto de la mujer embarazada de la que se tomó esa muestra. Como será evidente, pueden establecerse diferentes límites para identificar muestras de aneuploidía con diversos grados de certeza o confianza. Por ejemplo, aquellos que se encuentran más cerca del límite, o que se encuentran fuera del límite pero dentro de un segundo límite (una llamada "zona gris"), pueden estar sujetos a análisis o pruebas adicionales. De hecho, el método de la presente invención puede practicarse como una preselección de los ensayos NIPT de la técnica anterior (tales como NIPT basada en secuenciación de última generación para aneuploidía) como un medio para reducir significativamente el número de muestras que van a analizarse en dichos ensayos NIPT de la técnica anterior. Por ejemplo, la definición de un límite (tal como uno siendo el comienzo de una "zona gris") puede usarse para identificar la gran cantidad de muestras que son negativas, es decir, embarazos con un feto euploide, y después solo probar, usando el ensayo NIPT de la técnica anterior, el número mucho menor de muestras que no son claramente negativas. Incluso con un ensayo de diagnóstico que actúe como tal, una prueba que tenga una tasa de falsos positivos de varios porcentajes puede proporcionar una prueba previa altamente eficiente; especialmente si dicho ensayo tiene una tasa baja de falsos negativos.
En otras realizaciones, puede realizarse una combinación de dicho análisis de grupos/circular/ovalado con un análisis de puntuación Z. Por ejemplo, puede realizarse un análisis de grupos/circular/ovalado de este tipo para identificar muestras euploides y puede realizarse un análisis de puntuación Z (tal como uno descrito en el presente documento) para identificar muestras aneuploides. Una mayor seguridad en la identificación de una aneuploidía cromosómica se atribuiría entonces a una muestra que muestra concordancia con técnicas de análisis tan diferentes.
Antes de o como parte de dicho análisis, uno o más de las muestras, las mediciones, las señales y/o las cantidades determinadas a partir del método están sujetas a uno o más procesos o etapas de control de calidad. Por ejemplo, la concentración y/o el patrón de fragmentación del ADN presente en y/o extraído de la muestra puede considerarse antes de la etapa (b) y no incluir la muestra en el análisis o (en el caso de una concentración alta) el ADN diluido.
En realizaciones particulares de dichas realizaciones de la presente invención, antes de la etapa (b) la concentración del ADN puede medirse, por ejemplo, con un kit NGS de alta sensibilidad DNF-474 (Advances Analytical Technologies, Inc.; Ankeny, Ee . Uu .) usando un analizador de fragmentos (Advances Analytical Technologies, Inc.; Ankeny, EE.UU.). La concentración de ADN del primer pico significativo, que puede ubicarse alrededor de 80 a 220 pb de tamaño y alcanzar picos en promedio en 165 pb, puede determinarse, cuyo pico puede representar el ADN extracelular circulante aislado. En determinadas realizaciones, las muestras que muestran una concentración de ADN mayor que aproximadamente 0,3 ng/ul de este pico se diluyen hasta aproximadamente 0,3 ng/ul. Una dilución tal puede ayudar a evitar predicciones falsas positivas de muestras debido a cantidades demasiado altas de concentración de ADN en comparación con muestras de baja concentración. Otro criterio de control de calidad que puede aplicarse con dicho análisis de fragmentos incluye detectar (y, por ejemplo, excluir) aquellas muestras con fragmentación de ADN extracelular circulante (representada, por ejemplo, por picos irregulares que se producen en tamaños inferiores a aproximadamente 100 pb) y/o contaminación por ADN genómico.
Otros posibles criterios de control de calidad que pueden incorporarse a cualquier aspecto de la presente invención incluyen aquellos donde los datos de una muestra solo se incluyen en el análisis si uno o más de los siguientes son verdaderos:
• El número de réplicas presentes de los datos generados es mayor que aproximadamente cuatro, cinco, seis, siete u ocho; y/o
• La Cp media en un canal qPCR para una o más de las DMR u OR opcionales usadas es menos que aproximadamente 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36; y/o
• La desviación estándar de la media de los valores de Cp en un canal qPCR para una o más de las DMR u OR opcionales usadas es menos que aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,9, 0,9 o 1,0, o menos que aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4 o 1,5; y/o
• Todas las réplicas tienen valores válidos en todos los canales de qPCR que usaron las DMR y las OR opcionales; y/o
• En un análisis de fragmentos, la muestra no muestra picos irregulares por debajo de aproximadamente 100 pb y/o contaminación por ADN genómico; y/o
• La concentración de ADNec es mayor que aproximadamente 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 ng/ul y/o menos que aproximadamente 0,3, 0,4 o 0,5 ng/ul; y/o
• La Cp media en un canal qPCR que mide el ADN total es mayor que aproximadamente 22, 24, 25, 26, 27 o 28.
En aquellas realizaciones de la presente invención en donde se determina el ADN total (y por tanto, por ejemplo, la fracción fetal de ADNec) presente en la muestra, así como la identificación de una aneuploidía cromosómica en el feto, dicho método de la presente invención puede aplicarse para detectar un riesgo aumentado de que una mujer embarazada sufra o desarrolle una afección médica asociada al embarazo.
En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere aun métodopara detectar un riesgo aumentado de que una mujer embarazada sufra o desarrolle una afección médica asociada al embarazo; comprendiendo dicho método las etapas:
(i) llevar a cabo un método de la invención como se describe anteriormente;
(ii) determinar al menos una cantidad, tal como una cantidad absoluta o relativa, del ADN fetal presente en la muestra; y
(iii) comparar la cantidad de ADN fetal determinada con un umbral y/o distribución de referencia,
en donde un aumento en o una desviación de, la cantidad de dicho ADN fetal a partir de dicho umbral y/o distribución de referencia indica un riesgo aumentado de que la mujer embarazada sufra o desarrolle dicha afección médica asociada al embarazo.
Un riesgo tal podrá evaluarse en su lugar o adicionalmente considerando: (i) el aumento de veces (por ejemplo, 1,5, 3, 3,5 o 4 veces) de ADNec fetal (determinado para dicha mujer en comparación con una cantidad umbral), teniendo en cuenta la determinación de que para embarazos tardíos puede usarse un aumento más alto en el ADNec fetal (Zeybek et al 2013, J Obstet Gynaecol Res 39:632); y/o (ii) en qué percentil cae la cantidad de ADNec determinada de la mujer, a partir de la consideración de una distribución de referencia de cantidades como las determinadas en mujeres de bajo riesgo o que no padecieron ni desarrollaron preeclampsia, por ejemplo, si la fracción de ADNec fetal se encuentra dentro del percentil 90 de dicha distribución, entonces puede considerarse que la mujer tiene un riesgo aumentado de sufrir preeclampsia leve o grave (Jakobsen et al 2013, Transfusion 53:1956). Pueden considerarse otros factores relevantes para determinar una cantidad umbral adecuada. Por ejemplo, una mujer embarazada que también padece cáncer de mama, puede tener un mayor sesgo de metilación en RASSF1A presente en su plasma debido a ambos factores.
De manera análoga, determinadas realizaciones de dicho aspecto de la presente invención incluyen además la etapa de: comparar la cantidad de dicha especie de ADN detectada con una cantidad umbral y/o una distribución de cantidades de referencia, en donde una cantidad de dicha especie de ADN que excede dicho umbral (o que no es un valor atípico en comparación con dicha población) indica que puede realizarse un diagnóstico de una anomalía en dicha especie de ADN presente en dicha muestra, preferentemente una alícuota separada de ADN de, dicha muestra. Por ejemplo, si la fracción de ADNec fetal es mayor que aproximadamente el 10 %, el 9 %, el 8 %, el 7 %, el 6 %, el 5 %, el 4 %, el 3 %, el 2 %, el 1 % o el 0,5 % del ADNec total presente en el plasma materno (en particular, más de aproximadamente el 4 %, más particularmente mayor que aproximadamente el 3 % de fracción de ADNec fetal), entonces habría suficiente fracción o ADNec fetal para llevar a cabo eficazmente una prueba posterior para investigar una o más características del ADNec fetal, por ejemplo, para investigar la posibilidad o existencia de una anomalía cromosómica o mutación comprendida dentro de dicho ADNec fetal (tal como el uso de NIPT basada en secuenciación masiva paralela). En el caso de embarazos gemelares, los inventores determinan que una fracción fetal mínima de ADNec para NIPT de un embarazo gemelar podría considerarse del 8 %, o aproximadamente el 5 %, el 6 %, el 7 %, el 9 % o el 10 % y para embarazos gemelares monocoriónicos con genotipos concordantes (salvo raras excepciones, Chen et al, 2013, Am J Med Genet A, 161A:1817), una fracción de ADNec fetal del 4 %, o aproximadamente el 2 %, el 3 % o el 5 %, sería suficiente.
A menos que el contexto dicte lo contrario, las descripciones y definiciones de las características establecidas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.
Determinados aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a la descripción, las figuras y las tablas establecidas en el presente documento.
EJEMPLO 1 (Comparativo):Uso de un método de detección de ADN basado en metilación diferencial en una etapa de cuantificación previo a la NIPT basada en MGS en embarazos múltiples, incluso en casos de gemelos evanescentes
Recogida de muestras, procesamiento y extracción de ADN:
36 muestras de sangre de mujeres embarazadas con gestaciones múltiples (embarazos de gemelos y trillizos mono, di y tricoriónicos) se recogieron entre el 6 de noviembre de 2012 y el 16 de noviembre de 2013, para fines de investigación y desarrollo (I+D) y como parte del procedimiento de laboratorio de pruebas prenatales no invasivas (NIPT) de rutina. Una muestra de sangre provino de una mujer embarazada de trillizos, las 35 muestras restantes procedían de embarazos gemelares. De cada mujer embarazada que llevaba un embarazo múltiple se recogieron dos muestras cada una con 7-10 ml de sangre venosa usando tubos de extracción de sangre de ADN sin células Streck (Streck). Las muestras de sangre fueron enviadas al laboratorio de diagnóstico con un plazo máximo de entrega de 4 días. Se recogieron de manera similar otras muestras de sangre de mujeres embarazadas analizadas en el presente documento.
La preparación del plasma se realizó mediante centrifugación (1600 g durante 10 min a 4 °C) y separación del plasma seguida de una segunda etapa de centrifugación (16000 g durante 10 min a 4 °C). La extracción de ADN extracelular circulante total (ADNec) se realizó con el kit de ácido nucleico circulante QIAamp (Qiagen) según el protocolo del fabricante usando 3,0-4,0 ml de plasma con un volumen de elución final de 60 ul de tampón AVE (Qiagen).
Cuantificación de ADN:
El ADN extracelular circulante fetal (ADNec fetal) se detectó y se cuantificó en relación con el ADN extracelular circulante total (ADNec total) para determinar la fracción de ADNec fetal como concentración relativa y cantidad absoluta mediante una detección de ADN basada en metilación diferencial. A partir del ADN extracelular circulante eluido, se digirieron 11 ul con las enzimas sensibles a la mutilación de CpGHhaI(0,4 U/ul), Hpall (0,3 U/ul) y BstUI (0,3 U/ul) en una reacción de 22 ul usando CutSmartTM Buffer (New England Biolabs). La reacción se incubó durante 60 min a 37 °C y 60 min a 60 °C. Se usaron 10 ul de la reacción de digestión como molde de ADN para la PCR cuantitativa basada en sonda (las reacciones se realizaron por duplicado), descrito brevemente como sigue.
Se realizó una reacción de PCR de 25 ul usando una mezcla maestra de PCR concentrada 2 veces (kit QuantiFast Multiplex PCR, Qiagen). Se usaron cebadores que abarcan sitios de enzimas de restricción sensibles a la metilación de CpG de la región respectiva que está metilada diferencialmente entre el ADN fetal y materno (como una DMR) en combinación con sondas marcadas con FAM para dichas DMR, y cebadores que no abarcan ningún sitio de enzimas de restricción, una otra región que no está metilada de forma diferencial entre el ADN fetal y materno (como OR) se usa en combinación con sondas marcadas con VIC para dichas OR. Las secuencias de los cebadores y sondas marcadas usadas en este ejemplo se describen en la TABLA 1, y los perfiles del termociclador usados para la PCR cuantitativa basada en sonda (TaqMan) (LightCycler 480 II Instrument; Roche) se describen en la TABLA 2. En este ejemplo, las sondas usadas para detectar la presencia de las dos DMR, están marcadas cada una con el mismo resto fluorescente de amidita de fluoresceína (FAM) detectable, y cada una con el mismo resto inactivador no fluorescente (NFQ) de surco de unión menor (MGB), y las sondas usadas para detectar la presencia de las dos OR, cada una está marcada con el mismo resto fluorescente detectable de VIC (life Technologies) y cada una con el mismo resto MGBNFQ.
TABLA 1: Com onentes de PCR cuantitativa basados en sondas
TABLA 2: Perfiles de termociclador
continuación
El diseño del ensayo de detección de ADN basado en mutilación diferencial usado en este ejemplo se basa en dos DMR marcadoras que se describen como hipometiladas en el ADN materno e hipermetiladas en el ADN fetal (Nygren, et al, 2010: Clin Chem 56, 1627; Chan et al, 2006: Clin Chem 42, 2211; Chiu et al, 2007: Am J Pathol 170, 941) y dos otras regiones (OR) no metiladas de forma diferencial entre el ADN materno y fetal, cada una de las cuales está ubicada entre aproximadamente 20 pb y 20 kb de su DMR. En particular, el locus insensible a la metilación ubicado en RASSF1A está ubicado entre 8 kb y 9 kb (8,97 kb) en dirección 3' del locus sensible a la metilación ubicado en RASSF1A, y el locus insensible a la metilación ubicado en TBX3 está ubicado entre 10 kb y 11 kb (10,64 kb) en dirección 3' del locus sensible a la metilación ubicado en TBX3. La FIGURA 2 representa las respectivas disposiciones y modalidades de detección de los dos DMR y las otras dos regiones usadas en este ejemplo.
Se realizaron reacciones de PCR cuantitativas basadas en sondas paralelas (en reacciones separadas dentro de la misma serie de PCR) usando como molde una dilución en serie de ADN genómico masculino (Promega) que tenía concentraciones conocidas como un patrón. La fracción de ADNec fetal se calculó mediante cuantificación relativa de señales en el canal FAM (DMR; es decir, detectar ADNec fetal) frente al canal VIC (OR; es decir, detectar ADNec total) y la cantidad absoluta de ADNec total se calculó mediante cuantificación absoluta de señales en el canal VIC obtenido de la muestra en comparación con el canal VIC obtenido de la serie de diluciones de ADN patrón de concentración conocida. Estas cuantificaciones relativas y absolutas se realizaron usando el software LightCycler 480 versión 1.5.0 (Roche).
Secuenciación del ADN del plasma materno y análisis de datos para identificar aneuploidía fetal:
Las bibliotecas de secuenciación de ADN se prepararon usando el Kit de prep. de ADN NEBNext Ultra™ de Illumina. Las bibliotecas se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante de forma automatizada en un robot Hamilton STARplus. La calidad y la cantidad de la biblioteca se midieron usando un instrumento Bioanalyzer (Agilent) y un fluorómetro Qbit (Invitrogen). Basándose en la cuantificación de la biblioteca, se prepararon diluciones y conjuntos equimolares de 12 muestras por conjunto. Las muestras agrupadas se secuenciaron en un carril de una célula de flujo Illumina v3 en un secuenciador Illumina HiSeq2000. Los grupos clonales se generaron usando TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS en un sistema de generación de grupos cBot de acuerdo con el protocolo del fabricante. El análisis bioinformático para identificar la aneuploidía cromosómica fetal se llevó a cabo como se describió anteriormente, con puntuaciones z >3 que indican la presencia de una trisomía 21 fetal (Stumm et al 2014, Prenat Diag 34:185). En los casos de un resultado positivo de la prueba de aneuploidía fetal de este método basado en NGS, el resultado se confirmó mediante métodos de diagnóstico invasivos.
Resultados:
El % de fracción fetal de ADNec característico determinado mediante el método del presente ejemplo y los resultados de la prueba de aneuploidía determinados mediante dicho método basado en NGS para las muestras de sangre se dan en la TABLA 3. Hubo dos resultados positivos de las pruebas basadas en NGS que indicaron trisomía 21 fetal. Ambos se confirmaron mediante cariotipo después de la amniocentesis; por lo tanto, la tasa de falsos positivos en este estudio basado en NGS fue del 0 %. Una muestra de sangre representó a gemelos monocoriónicos con cariotipos concordantes [47,XY,+21] y la otra representó a gemelos dicoriónicos con cariotipos discordantes [47,XY,+21 y 46,XX]. En ambas muestras la fracción fetal alcanzó el 18,0 y el 24,8%, respectivamente. Todos los demás resultados de NIPT basados en NGS fueron negativos para las trisomías 21, 18 y 13. Hasta el momento no hay evidencia de resultados falsos negativos de NIPT en los embarazos incluidos en este estudio.
TABLA 3: Características^ resultados NIPT de las^ muestras de san re reco idas
continuación
La detección fiable de aneuploidía fetal en embarazos gemelares mediante NIPT basada en NGS de la técnica anterior depende de una cantidad suficientemente alta de ADNec fetal de cada feto en la sangre materna. Se han publicado diferentes datos y consideraciones sobre cómo debe definirse el límite inferior de la fracción de ADNec fetal para garantizar que la contribución de cada gemelo esté por encima del umbral de detección (Leung et al 2013, Prenat Diag 33:675; Qu et al 2007, Am J Pathol 170:941; Struble et al 2013, Fetal Diagn Ther 7 de diciembre publicación electrónica previa a la impresión). Esto es especialmente importante en el caso de embarazos de gemelos dicoriónicos con cariotipos discordantes. En el estudio descrito anteriormente, se usó información de respaldo para la definición de la fracción mínima de ADNec fetal para embarazos gemelares derivada de la representación del cromosoma Y, si solo uno de los dos fetos es varón. Usando el método del presente ejemplo, puede determinarse la fracción total de ADNec fetal, que refleja el sumario del ADNec fetal derivado de ambos fetos. Usando la representación del cromosoma Y de la secuenciación de última generación, la cantidad de ADNec fetal puede determinarse para fetos masculinos (como se describe en Stumm et al 2014). Por lo tanto, en el caso de género fetal mixto, la cantidad que contribuye de cada feto puede determinarse restando la cantidad de ADNec fetal determinada por la representación cromosómica Y de la fracción de ADNec fetal medida mediante el método del presente ejemplo. Las fracciones de ADNec fetal determinadas mediante el método del presente ejemplo se compararon con los valores obtenidos de lecturas del cromosoma Y de la secuenciación de última generación para casos con género conocido (véase la FIGURA 3). Existe una correlación de la cantidad de ADNec específico masculino (eje y) con la fracción de ADNec fetal medida mediante el método del presente ejemplo (eje x). Por lo tanto, para embarazos gemelares con género masculino/masculino es aproximadamente cierto: [y = x], para géneros femenino/masculino es: [y = 0,5x] y para femenino/femenino: [y = 1]. Los géneros de los casos con valores similares son masculino/masculino y en caso de valores diferentes con baja representación del cromosoma Y, los géneros son femenino/femenino. Los casos intermedios, que muestran aproximadamente la mitad del porcentaje de fracción fetal como representación del cromosoma Y, son de género mixto. Los datos presentados en la FIGURA 3 muestran que no solo es posible determinar los sexos fetales usando resultados de NIPT basados en NGS de la técnica anterior para embarazos gemelares, sino también que la medición de la cantidad de fracción fetal de ADNec determinada mediante el método del presente ejemplo es precisa en comparación con el recuento de frecuencia de las secuencias del cromosoma Y. Por otro lado, estos datos respaldan la hipótesis de que cada feto de un embarazo gemelar contribuye aproximadamente con la mitad de la fracción total de ADNec fetal. Esto lleva a la conclusión de que, en el caso de embarazos gemelares, se requeriría el doble de cantidad de ADNec fetal y, por lo tanto, podría considerarse que la fracción fetal mínima recomendada de ADNec para la NIPT basada en NGS de la técnica anterior de un embarazo gemelar es del 8 %.
Para embarazos gemelares monocoriónicos con genotipos concordantes (aparte de raras excepciones, Chen et al 2013, Am J Med Genet A 161A:1817), una fracción de ADNec fetal del 4 % sería suficiente para detectar una aneuploidía fetal, al igual que para los embarazos individuales. Sin embargo, para el servicio NIPT de laboratorio de rutina, un problema importante va en contra de las implicaciones de criterios de calidad tan diferentes para embarazos mono y dicoriónicos: la determinación de la corionicidad depende de la edad gestacional y de la experiencia práctica del médico que realiza el examen de ecografía. La corionicidad es claramente detectable en el primer trimestre de un embarazo múltiple, pero en etapas posteriores la detección se vuelve más difícil (Sperling et al 2001, Acta Obstet Gynecol Scand 80:287). Por lo tanto, es una estrategia más segura definir generalmente una fracción mínima de ADNec fetal para embarazos gemelares, que es aplicable tanto para embarazos múltiples monocoriónicos como dicoriónicos.
Identificación de gemelos evanescentes:
En dos casos de prueba de aneuploidía NIPT en los que se midió la fracción de ADNec fetal usando el método del presente ejemplo, se identificaron una trisomía 21 (puntuaciones z 13,5 y 3,4 respectivamente), pero también se observó una sorprendente discrepancia entre la fracción total de ADNec fetal medida mediante el método del presente ejemplo y la cantidad de ADNec fetal medida mediante la representación del cromosoma Y.
Para el caso A, dos análisis de muestras de sangre (primera muestra y muestra de respaldo) estimaron que la fracción total de ADNec fetal medida con el método del presente ejemplo fue del 20,7 % y del 24,8 %, respectivamente, mientras que el ADNec fetal de acuerdo con la representación del cromosoma Y de la secuenciación de última generación fue del 9,2 % y del 9,3 %, respectivamente. Se especuló y se informó al médico, que el embarazo puede ser un embarazo gemelar de sexo mixto, quien confirmó que se había observado un gemelo fallecido durante una ecografía en la semana 10. Otra muestra de sangre tomada en el tercer trimestre del embarazo (38+2) resultó negativa para trisomía 21 y la cantidad de ADNec fetal medida por la representación del cromosoma Y se correlacionó con la cantidad fetal medida por QuantYfeX (21,7 % y 21,4). que coincidía con el género masculino determinado por el cariotipo del feto vivo. Al nacer, se encontró un feto papiráceo en el tejido placentario del que se pudo aislar una cantidad suficiente de células para el cultivo celular y después de la colocación de bandas GTG, se confirmó un cariotipo femenino positivo para trisomía 21 (47,XX,+21).
Para el caso B, se monitorizó una representación cromosómica Y ligeramente aumentada, lo que indica un ADN fetal específico masculino del 3,0 % y el 2,7 % respectivamente. Como las estimaciones de la fracción fetal de ADN libre medidas con el método del presente ejemplo fueron muy superiores (13,4 % y 10,0 %), los presentes inventores plantearon la hipótesis a partir de esta discrepancia en la fracción fetal medida, que dos fetos con género discordante contribuyen a la fracción fetal y siendo el feto masculino el uno afectado por la trisomía 21. Esta sugerencia derivó de la correlación de la cantidad de ADNec fetal específica del cromosoma Y de aproximadamente el 3 % con la puntuación z elevada alrededor del valor de corte de 3,0. Dado que el examen fue claramente solicitado para un embarazo único, se sospechaba que el ADNec fetal masculino específico provenía de un gemelo evanescente, tal vez portador de una trisomía 21, que no fue reconocido o no indicado en el formulario de consentimiento para NIPT. Por lo tanto, se informó que el resultado era indeciso para el cromosoma 21 y se comunicaron los datos contradictorios al médico responsable, incluyendo un aviso sobre el posible gemelo evanescente, para mayor aclaración mediante ecografía. El médico responsable confirmó posteriormente que el embarazo había comenzado como gemelar y después continuó como embarazo único. Se confirmó que el sexo del feto vivo y aparentemente sano era femenino y, por lo tanto, el ADNec fetal que provocó el aumento de la puntuación z para la trisomía 21 puede asignarse claramente a un feto masculino fallecido.
EJEMPLO 2 (Comparativo):Sensibilidad de detección mejorada de cromosomas de referencia usando dos regiones metiladas de forma diferencial usando el mismo resto/restos detectables para cada región metilada de forma diferencial.
Los inventores observan que una reacción compleja y múltiple que detecta dos DMR usando el mismo resto/restos detectables para cada una de dichas DMR (así como otras dos regiones (OR) no metiladas de forma diferencial) fue más sensible para detectar cromosomas de referencia derivados del feto que las reacciones de detección previas que cada una detectó, en reacciones de PCR separadas, una sola DMR (así como una sola OR) (FIGURA 4).
En otro método de detección de ADN basado en metilación diferencial, dos DMR (las que se encuentran en RASSF1A y TBX3, como se describe en el Ejemplo 1), y ubicadas en los cromosomas 3 y 12 humanos respectivamente, se detectaron (en 4 diluciones) con la misma alícuota de ADN y reacción (de forma eficaz simultáneamente (usando PCR cuantitativa basada en sonda (TaqMan)) - también con dos OR (las que se encuentran en RASSF1A y TBX3, como se describe en el Ejemplo 1), usando el mismo resto/fracciones detectables para cada una de dichas DMR (y un resto/fracciones detectables para dicha al menos una OR que es diferente al resto/fracciones detectables usados para dichas DMR). En comparación, la detección de cromosomas de referencia derivados del feto en ADNec fue menos sensible, como lo muestra la detección en números de ciclo más altos (Cp), si cada DMR (y su correspondiente OR) se detectó de forma independiente en reacciones separadas. Las regiones/marcadores, cebadores/sondas y metodología de detección fueron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que para las reacciones de un solo locus, solo la DMR (y la OR correspondiente) de un gen determinado (RASSF1A o TBX3) se detectaron simultáneamente en una sola reacción.
Por el contrario, se determina que la detección de cromosomas de referencia derivados del feto en ADNec usando una reacción múltiple de las dos DMR usando diferentes restos detectables (por ejemplo, FAM para el locus RASSF1A y VIC para el locus TBX3) es aún menos sensible (y además es difícil de detectar simultáneamente con cualquier OR); sin desear quedar ligados a teoría alguna, se cree que debido a la mayor complejidad de la compensación de color, el número limitado de marcadores fluorescentes detectables por separado y/o los efectos de "blanqueo" de tantos marcadores fluorescentes que están presentes en la misma reacción.
Dada la naturaleza exponencial de la detección cuantitativa por PCR, una mayor sensibilidad de detección (es decir, números de ciclos más bajos) también equivaldría a una mayor precisión de la cuantificación, ya que la corrección de curvas estándar y la interpolación entre puntos de datos, estaría sujeta a menos error que el que surge con las cantidades de<a>D<n>(es decir, de cuantificación de los cromosomas de referencia) correlacionadas con la detección en números de ciclos más altos.
EJEMPLO 3 (Comparativo):Uso de un método de cuantificación de ADN basado en metilación diferencial para la detección de un riesgo aumentado de que una mujer embarazada padezca o desarrolle preeclampsia (ejemplo profético).
Usando un método de ejemplo comparativo, a las mujeres embarazadas se les evalúa el riesgo de sufrir o desarrollar preeclampsia de la siguiente manera. En primer lugar, se recoge una muestra de sangre de la mujer para quien se va a evaluar dicho riesgo y se extrae el ADNec total del plasma de dicha muestra sustancialmente de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 1. En segundo lugar, usando un método sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1, se determina una cantidad relativa y/o absoluta de ADNec fetal y ADNec total presente en el plasma, donde la cantidad absoluta de ADNec fetal y/o total puede expresarse como la cantidad de equivalentes del genoma ("Eq"). En tercer lugar, dicha cantidad determinada de ADNec y/o ADNec total se compara con una cantidad umbral o una distribución de referencia de cantidades, y se determina que las mujeres tienen un riesgo aumentado de padecer o desarrollar preeclampsia si la cantidad de ADNec fetal o ADNec total excede tal valor umbral y/o es un valor atípico en dicha distribución.
Por ejemplo, usando valores umbral publicados (Papantoniou et al 2013, Prenat Diag 33:682) si el ADNec total excede una cantidad de aproximadamente 7.500 Eg/ml de plasma o si la fracción de ADNec fetal excede una cantidad de aproximadamente 500 Eg/ml de plasma, entonces se determina que la mujer tiene un riesgo aumentado. Un riesgo tal podrá evaluarse en su lugar o adicionalmente considerando: (i) el aumento de veces (por ejemplo, 1,5, 3, 3,5 o 4 veces) de ADNec fetal (determinado para dicha mujer en comparación con una cantidad umbral), teniendo en cuenta la determinación de que para embarazos tardíos puede usarse un aumento más alto en el ADNec fetal (Zeybek et al 2013, J Obstet Gynaecol Res 39:632); y/o (ii) en qué percentil cae la cantidad de ADNec determinada de la mujer, a partir de la consideración de una distribución de referencia de cantidades determinadas en mujeres de bajo riesgo o mujeres que no padecieron ni desarrollaron preeclampsia, por ejemplo, si la fracción de ADNec fetal se encuentra dentro del percentil 90 de dicha distribución, entonces se considera que la mujer tiene un riesgo aumentado de sufrir preeclampsia leve o grave (Jakobsen et al 2013, Transfusion 53:1956).
En este ejemplo, la detección de un riesgo se realiza mediante un producto de programa informático que realiza las operaciones representadas en la FIGURA 5. La operación (A) recibe las señales (1) y (2) que representan, respectivamente, el ADNec fetal y total que se usan por el producto de programa informático para determinar un parámetro (4) que representa la cantidad relativa y/o absoluta de ADNec fetal (o total) presente en el plasma de la mujer. Esta operación puede opcionalmente recibir una señal (3) que represente una cantidad absoluta de ADN patrón. Una segunda operación (B) compara dicho parámetro determinado (4) con una cantidad umbral (5) y/o una población de cantidades de referencia (6) para determinar e informar (7) si o no (y basándose en dicha comparación) se determina que la mujer tiene un riesgo aumentado de padecer o desarrollar preeclampsia.
EJEMPLO 4:Uso de un método de la invención como un método directo y eficaz para que NIPT detecte la trisomía 21
La presente invención pudo identificar muestras de ADNec obtenidas de mujeres embarazadas que portaban un feto con trisomía 21.
En una reacción de PCR múltiplex única de un método de la presente invención, la cantidad de especies de ADN del cromosoma 21 fetal presente en muestras de ADN libre obtenidas de 58 mujeres humanas embarazadas se determinó en cada una de dos DMR diana, y la cantidad de especies de ADN de referencia de los cromosomas fetales 5 y 12 (como cromosomas de referencia) presentes en la muestra de ADN libre se determinó mediante el uso de dos DMR de referencia (véase la FIGURA 6) y con respecto a cada mujer embarazada. Las cantidades relativas de las 21 especies cromosómicas fetales (estimadas en cada una de las dos DMR diana) y dichas especies de referencia cromosómica fetal (según lo estimado por ambas de las dos DMR de referencia) se calculó como una proporción, y cada proporción se usó para representar un diagrama de dispersión que muestra la media específica de la muestra (n=6 réplicas) de cada una de las dos proporciones para cada mujer humana embarazada (FIGURA 7). Este diagrama de dispersión muestra que los tres puntos "+", representando cada uno una muestra obtenida de una mujer embarazada que se sabe que porta un feto con trisomía 21 ("T21"), pueden reconocerse fácilmente como valores atípicos. Este diagrama de dispersión también demuestra una característica ventajosa del método inventivo, en el sentido de que una muestra no T21 se observó como un valor atípico para una, pero no la otra, DMR diana en el cromosoma 21. Solo mediante el uso de un método y análisis que pueda analizar al menos dos de dichos marcadores, tal como el presente método inventivo, habría identificado correctamente esta muestra como un valor atípico de la población no T21 en lugar de como una muestra T21. Por ejemplo, si solo se hubiera considerado la DMR diana representada por el eje X, o si se hubiera considerado el promedio de ambas DMR diana (es decir, ambas DMRs diana consideradas juntas), entonces una muestra tal se habría identificado falsamente siendo una muestra T21.
Los datos que se muestran en la FIGURA 7 se generaron a partir de las 58 muestras tomadas de 58 mujeres humanas embarazadas en una única ejecución de qPCR. Sin embargo, posteriormente se analizaron 110 muestras adicionales tomadas de 110 mujeres humanas embarazadas mediante el mismo método inventivo en dos ejecuciones de qPCR adicionales, analizando cada análisis muestras de 54 y 56 mujeres humanas embarazadas, respectivamente. Mediante la normalización de los datos generados a partir de las tres ejecuciones separadas, el total de las 168 muestras pudo visualizarse en un único diagrama de dispersión (FIGURA 8). Se ve claramente la separación del grupo de las nueve muestras T21 de las muestras que no son T21; por ejemplo, como se demarca por el límite curvo que se muestra (de puntos). La normalización entre ejecuciones se realizó restando el valor mediano de la proporción aplicable en todas las réplicas de una única ejecución de la siguiente manera de la media de cada proporción para cada muestra. Los valores normalizados resultantes se representaron usando una escala logarítmica después de la conversión a valores positivos sumando dos.
La solidez del método de la invención para analizar numerosas muestras (en este ejemplo 168) en múltiples ejecuciones (en este ejemplo 3) se demuestra (FIGURA 9) considerando la separación independiente de las ejecuciones, para cada una de las ejecuciones 1 a 3, de las, en total, nueve muestras T21 (en esta figura representadas por "o") de las muestras que no son T21 (en esta figura representadas por "+"), de la distancia de cada punto desde la FIGURA 8 (por ejecución) desde el punto central de la línea de demarcación curva (en este ejemplo, 0,5, 0,55). Las nueve muestras se clasificaron con éxito sin resultados falsos negativos ni falsos positivos.
La cantidad de una especie de ADN del cromosoma 21 fetal se determinó usando dos DMR diana: (i) una primera DMR de este tipo está localizada en el gen DSCAM (Molécula de Adhesión Célula del Síndrome de Down; Secuencia de referencia del NCBI del cromosoma 21 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000021.9 GI:568815577, región 40.010.999 a 40847113; SEQ ID NO: 200) ubicada en el cromosoma humano 21q22.2; y (ii) una segunda DMR ubicada en aproximadamente 250 pb en dirección 5'/en dirección 3' de C21orf57 (YBEY; Cromosoma 21: 46.286.337-46.297.751 cadena directa, GRCh38:CM000683.2; incluyendo dicho gen regiones flanqueantes en dirección 5'/en dirección 3' de 250 pb de SEQ ID NO: 218 ubicada en el cromosoma humano 21q22.3.
La cantidad de una especie de ADN del cromosoma de referencia fetal se determinó usando dos DMR de referencia:
(i) una primera DMR presente en el gen TBX3 (como se describió anteriormente) ubicada en el cromosoma humano 12q24.21; y
(ii) una segunda DMR de este tipo presente en el gen PCDHGA1 (subfamilia A, 1 de protocadherina gamma; Secuencia de referencia del NCBI del cromosoma 5 deHomo sapiens,GRCh38.p2 Primary Assembly: NC_000005.10 GI:, región 141.330.571 a 141.512.981; SEQ ID NO: 217) ubicada en el cromosoma 5q31.3. También se amplificó en cada reacción múltiple una primera OR ubicada aproximadamente a 10 kb de la DMR en TBX3 (véase anteriormente) y una segunda O<r>ubicada aproximadamente a 300 pb de la DMR en PCDHGA1. Las secuencias de las respectivas DMR (y OR) usadas se describen en la TABLA 4.
�� Se recogieron muestras de ADNec de 168 mujeres humanas embarazadas (incluyendo 9 de las cuales se sabía que llevaban un feto con T21), se prepararon y se digirieron con enzimas sensibles a la metilación CpGHhaI, HpaIyBstUIcomo se describe en el EJEMPLO 1. Se realizó una reacción de PCR cuantitativa múltiple basada en sondas de los cuatro loci separados descritos en la TABLA 4 en réplicas (n = 6) de cada una de dichas muestras como se describe en el EJEMPLO 1, excepto que el tampón de PCR usado fue PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix (Quanta BioSciences), usando los cebadores de PCR y las sondas marcadas (con desactivadores) como se establece en la TABLA 5 y dividiendo las muestras en tres series de 58, 54 y 56 muestras respectivamente; cada serie consiste en un ensayo inventivo de este tipo realizado en una única placa de microtitulación de 384 pocillos (Roche) con un LightCycler 480II (Roche).
TABLA 5: Cebador sondas
El formato de dicho ensayo es generalmente como se muestra en la FIGURA 6, donde la DMR1 de dicha figura se ubica en el gen DSCAM del cromosoma 21 humano, la DMR2 de dicha figura se ubica en aproximadamente 250 pb en dirección 5'/en dirección 3' del gen C21orf57 del cromosoma 21 humano, la DMR1' de dicha figura está ubicada en el gen TBX3 del cromosoma 12 humano y la DMR2' de dicha figura está ubicada en el gen PCDHGA1 del cromosoma 5 humano. Para los fines de calcular una cantidad relativa de o proporción entre, las DMR diana en el cromosoma 21 y las DMR de referencia en los cromosomas 5 y 12 las OR no son necesarias como si se usaran para calcular una fracción fetal del cromosoma respectivo, dicho valor quedaría cancelado en las fórmulas matemáticas. Por tanto, la cantidad de ADN total que puede estimarse a partir del uso de las OR no es necesaria para analizar el estado T21 del feto, pero aún puede utilizarse para calcular la fracción de ADNec fetal a partir del ADN total; por ejemplo, para los fines descritos en los EJEMPLOS 6 y/o 7 y/o como una medida de control de calidad posible o adicional (por ejemplo, EJEMPLO 6), o para fines de otro diagnóstico tal como se describe en el EJEMPLO 7. Como puede observarse de la Tabla 5, la sonda para la DMR diana del cromosoma 21 ubicada en el DSCAM está marcada de manera diferente a la sonda para la DMR diana del cromosoma 21 ubicada en aproximadamente 250 pb en dirección 5'/en dirección 3' de C21orf57; también la DMR de referencia del cromosoma 12 ubicada en TBX3 y aquella en el cromosoma 5 ubicada en PCDHGA1 están marcadas con el mismo marcador (diferente de las DMR diana). Finalmente, si es necesario para una estimación del ADN total, las dos OR están marcadas ambas con el mismo marcador, que también es diferente de los otros marcadores usados en el ensayo multiplex. En general, se usan 4 marcadores, lo que permite estimar de forma independiente la cantidad de cromosoma 21 para cada DMR diana y detectar con mayor sensibilidad la cantidad de cromosomas de referencia (véase el EJEMPLO 2), por ejemplo, por referencia a las señales respectivas para cada DMR (u OR) de la muestra en comparación con las señales para la DMR (u OR) respectiva obtenida de la serie de diluciones de ADN patrón de concentración conocida (como se describe en el EJEMPLO 1) como puede proporcionarse en cada placa (ejecución) de qPCR como las muestras de prueba. Estas cuantificaciones relativas y absolutas se realizaron usando el software LightCycler 480 versión 1.5.0 (Roche). Para cada muestra se calculó la proporción media [n=6 réplicas] específica de muestra de cada % de ADNec fetal de las especies de ADN diana del cromosoma 21 y el % de ADNec fetal de ambas especies de ADN de referencia del cromosoma de referencia, y para cada placa, se calculó la mediana general de todas las réplicas. El análisis fue como se describe anteriormente.
EJEMPLO 5:Análisis iterativo de puntuación z para detectar trisomía 21 en NIPT sin referencia a patrones euploides internos conocidos
Mediante la aplicación de un enfoque iterativo de puntuación z, los inventores fueron capaces de identificar todas las muestras conocidas de Trisomía 21 a partir de las muestras de prueba sin hacer referencia a las muestras euploides conocidas en la estimación de la media y las desviaciones típicas en el análisis de puntuación z.
Los datos de cada ejecución (placa de qPCR) de muestras analizadas en el EJEMPLO 4 se volvieron a analizar de la siguiente manera. En primer lugar, se calculó la relación media de cada DMR diana del cromosoma 21 con respecto a las DMR de los cromosomas de referencia de cada réplica de las muestras (n=6), y para todas las muestras presentes en dicha serie (placa) se calculó una media general y una desviación típica para cada proporción sin referencia a si se sabía que una muestra era euploide o trisomía. En segundo lugar, basándose en dichas medias específicas de ejecución y desviación típica, se calcularon puntuaciones z separadas (específicas del experimento) para cada relación asociada con cada DMR diana para cada muestra presente en el experimento. En tercer lugar, para cada DMR, dichas proporciones se verificaron para aquellas iguales o superiores a 1,95, y todas las muestras representadas por dichas puntuaciones z atípicas fueron, de forma independiente para cada una de las dos DMR diana, excluidas del conjunto de referencia respectivo, muestras usadas para cualquier determinación posterior de los factores de cálculo de la puntuación z (relación media específica de la ejecución y desviación típica). Se calculó una segunda media y desviación típica para cada relación, de forma independiente para cada<d>M<r>diana, sobre los datos con respecto a las muestras restantes en el conjunto de datos de referencia y se usa para realizar un segundo análisis de puntuación z de cada relación para todas las muestras en dicho conjunto. En cuarto lugar, las puntuaciones z resultantes (es decir, las calculadas después de la primera eliminación iterativa) se verifican en busca de valores atípicos, de forma independiente para cada DMR diana, como en la tercera etapa, como anteriormente y aquellas muestras asociadas a una puntuación z igual o mayor a 1,95 se excluyen del conjunto de datos de referencia usado para calcular las puntuaciones z con respecto a cada DMR. Después se calculó una tercera media y desviación estándar, de forma independiente para cada DMR diana, para cada proporción sobre los datos con respecto a las muestras restantes en el conjunto de datos de referencia respectivo y se usa para realizar un tercer análisis de puntuación z para cada proporción de todas las muestras en dicho conjunto. Este proceso iterativo se repitió 20 veces y ninguna muestra que alguna vez fue excluida del conjunto de referencia DMR respectivo se volvió a incluir en un conjunto de datos de referencia, incluso si la puntuación z de la muestra respectiva volviera a cambiar a menos de 1,95 después de una eliminación iterativa. Las puntuaciones z de las muestras resultantes para cada proporción y muestra se muestran en la FIGURA 10, que muestra una separación completa de las muestras euploide y T21 (representada por puntuaciones z superiores a aproximadamente 3,0 para cada una de las dos proporciones; y/o porque la media de las dos puntuaciones z es mayor que aproximadamente 3,0; y/o mediante una aproximación en grupo o a distancia análoga a la descrita en el EJEMPLO 4/FIGURA 9). Los valores atípicos diploides que obtienen valores superiores a las puntuaciones z medias de 3 se excluyeron mediante la definición de una regla: los resultados discordantes (Marcadores 1 y 2) se controlan según el grado de diferencia. Si la diferencia era superior a 4,0, no eran positivos/no informables.
EJEMPLO 6:Uso de un método de la invención para estimar la fracción de ADNec fetal
La fracción % de ADN fetal en el ADNec total aislado de la mujer embarazada se estimó calculando la proporción de la cantidad de ADN medida usando las dos DMR de referencia (comúnmente marcadas) presentes en los dos cromosomas de referencia y las dos DMR (comúnmente marcadas) presentes en los dos cromosomas de referencia y las dos OR (comúnmente marcadas); cada una dentro del mismo gen que su respectiva DMR. La información sobre la fracción fetal de ADNec puede usarse con fines de control de calidad, incluyendo determinar si hay suficiente ADN fetal presente en la muestra para permitir análisis posteriores tales como análisis basados en<n>G<s>como se describe en el EJEMPLO 1.
EJEMPLO7:Uso de un método de la invención para detectar un riesgo aumentado de que una mujer embarazada padezca o desarrolle preeclampsia (ejemplo profético)
Además de determinar si un feto llevado por una mujer embarazada es aneuploide, el formato del ensayo inventivo descrito en el EJEMPLO 4 (es decir, uno que lleva al menos una OR para medir el ADN total) se usa para determinar también si la mujer embarazada tiene riesgo de padecer o desarrollar preeclampsia de la siguiente manera.
Usando un método sustancialmente como se describe en el EJEMPLO 4, se determina una cantidad relativa y/o absoluta de ADNec fetal y ADNec total presente en el plasma, donde la cantidad absoluta de ADNec fetal y/o total puede expresarse como la cantidad de equivalentes del genoma ("Eq"). En tercer lugar, dicha cantidad determinada de ADNec y/o ADNec total se compara con una cantidad umbral o una distribución de referencia de cantidades, y se determina que las mujeres tienen un riesgo aumentado de padecer o desarrollar preeclampsia si la cantidad de ADNec fetal o ADNec total excede tal valor umbral y/o es un valor atípico en dicha distribución. Los valores publicados y otras formas de evaluar dicho riesgo incluyen aquellos descritos en el EJEMPLO 3. Un método tal de la presente invención puede usarse para generar señales para usar el producto del programa informático descrito en el EJEMPLO 3 (y representado por la FIGURA 5) para detectar dicho riesgo.
EJEMPLO 8:Preparación y distribución de un kit de la presente invención (ejemplo profético)
Se prepara un kit de la presente invención formando una solución tamponada para cada uno de los cebadores y sondas enumerados en la TABLA 5. Se coloca una alícuota de cada solución tamponada (por ejemplo, 200 ul) en tubos eppendorf separados y dichos tubos se envasan en un recipiente de cartón.
En un kit alternativo, se prepara una única solución tamponada que comprende una mezcla de cada uno de los cebadores y sondas enumerados en la TABLA 5.
En un kit alternativo adicional, el recipiente de cartón incluye además una alícuota de las sondas usadas para detectar las dos primeras DRM diana establecidas en la TABLA 5.
El recipiente de cartón del kit contiene además un manual de instrucciones impreso, que instruye al usuario a usar los componentes del mismo (junto con otros componentes) para practicar el método de la presente invención para buscar detectar una aneuploidía cromosómica en un feto.
EJEMPLO 9:Prueba con muestras recogidas (ejemplo profético)
Un número de muestras recogidas de numerosas mujeres embarazadas que se sabe que portan un feto aneuploide o euploide se analizan mediante un método de la presente invención (tal como usando un ensayo como se describe en el EJEMPLO 4), pero de forma ciega (es decir, los investigadores no saben qué muestra pertenece a qué clase de mujer embarazada) para tratar de identificar (por ejemplo, correctamente) aquellas muestras que se cree que contienen fetos que tienen una aneuploidía cromosómica (por ejemplo, trisomía 21). Después de que se haya llevado a cabo el análisis, las muestras se desenmascaran (es decir, si realmente portaban un feto con trisomía, tal como lo determina NGS y/u otras pruebas), y dicha información se compara para generar estimaciones o medidas de sensibilidad y especificidad para el método de la presente invención.
EJEMPLO 10:Otras realizaciones de un método directo y eficaz de la invención para que NIPT detecte la trisomía 21
La utilidad de un método de la invención que usa una combinación específica de DMR, OR y los marcadores fluorescentes/inactivadores se demuestran en el EJEMPLO 4. Sin embargo, los inventores han demostrado que dicho método no se limita a una combinación específica como otras combinaciones de DMR, OR y/o marcadores fluorescentes/inactivadores también muestran que dicho método de la invención puede detectar directa y eficientemente la trisomía 21 mediante NIPT. La TABLA 6 muestra las diversas permutaciones y/o combinaciones usadas para llevar a cabo dicha demostración.
Unos conjuntos de muestras de ADNec, cada conjunto obtenido de 56 o 58 mujeres embarazadas, se seleccionaron de una gran colección de dichas muestras para crear ejecuciones de prueba de qPCR separadas, en donde cada prueba incluyó entre 2 y 4 muestras de ADNec de embarazos que se sabe que fueron un feto con trisomía 21 (previamente determinado y confirmado mediante un método NIPT basado en secuenciación de última generación disponible en el mercado: PRENATEST®, LifeCodexx AG, Constanza, Alemania).
El método como se describe en el EJEMPLO 4 se realizó en cada ejecución de prueba de qPCR, se analizaron los datos de cada ejecución y se calcularon las proporciones de<d>M<r>, se corrigieron y se presentaron de forma análoga a lo mostrado en la FIGURA 8; excepto que para las diversas realizaciones de ensayos analizadas en el EJEMPLO 10, se usaron diferentes permutaciones de los marcadores (y el inactivador correspondiente) y, en dos casos, se usó la segunda Cr 21 DMR. Para cada ensayo respectivo se usaron DMR/OR como se muestra en la TABLA 6. Para el ensayo descrito en la segunda columna, la misma combinación de secuencias de cebadores, secuencias de sondas y sondas-marcadores/inactivadores son como se usan en el EJEMPLO 4 y como se describe en la TABLA 5. Para los ensayos descritos como V10.1 a V10.4, se usaron las mismas secuencias de cebadores y secuencias de sondas que en el EJEMPLO 4 y se describen en la TABLA 5, pero con la sonda-marcador (y el inactivador correspondiente) como se establece en la TABLA 6. Para los ensayos descritos como V10.5 y V10.6, se usaron las mismas secuencias de cebadores, secuencias de sondas y sondas-marcadores/inactivadores como en V10.1/10.4, excepto que en lugar de la DMR ubicada en C21orf57, se usó una segunda Cr 21 DMR (diana) alternativa: C21orf29 para V10.5 y CGI149 para V2.6. La secuencia de cada una de estas dos segundas Cr 21 DMR (diana) alternativas se muestra en la TABLA 7 y las secuencias de cebadores y sondas correspondientes y los marcadores/inactivadores usados en V10.5 y V10.6, se describen en la TABLA 8.
TABLA 7: DMR del cromosoma 21 alternativas
TABLA : r n r l DMR r m m l rn iv
Como se muestra en las FIGURAS 11 a 17 (que, en cada caso, el eje x representa DSCAM como una Cr 21 DMR; y el eje y representa la otra Cr 21 DMR), se demostró que cada una de estas diferentes realizaciones es un método directo y eficiente de la invención para que NIPT detecte la trisomía 21, ya que se agrupan distinguiblemente de las muestras que no son T21 en cada ejecución. En una sola versión del ensayo (V10.1), se descubrió que se producían "falsos negativos" en muestras verdaderamente positivas que se encontraban fuera del mismo límite de corte circular predefinido que se aplicó a todos los ensayos; y de esos dos falsos negativos, uno se identificó fácilmente como anónimo al tener una proporción de marcadores sustancialmente mayor para ambos marcadores. En algunos ensayos se produjo un pequeño número de falsos positivos, variando del 0 % (V10.4 y V10.5) al 4 % (V2.1) de los verdaderos negativos cuantificados en la ejecución, pero como entenderá el experto en la materia, en una prueba de diagnóstico para, por ejemplo, aneuploidía, es mucho más importante tener un mínimo de falsos negativos en comparación con los falsos positivos. El límite de corte circular predefinido usado en este ejemplo fue uno que se había definido previamente, después del análisis de los datos obtenidos de un gran conjunto aleatorio y ciego de pruebas de qPCR usando más de 700 muestras que incluían 15 muestras T21 en el formato de ensayo descrito en el EJEMPLO 4, para proporcionar la sensibilidad general (tasa de verdaderos positivos), la especificidad (tasa de verdaderos negativos) y la tasa de no informable según se desee para dicha prueba; por ejemplo: una sensibilidad del 100%, casi el 100%, más del 97% (preferentemente, más del 97,5%) o más del 95%; una especificidad mayor que el 95 %, preferentemente mayor que el 96 %; y/o una tasa no informable de menos del 10 % (preferentemente menos del 7 %), tal como menos del 6 % o el 5 %.
EJEMPLO 11:Uso de un método de la invención como un método directo y eficaz para que NIPT detecte la trisomía 18 (ejemplo profético)
Una o más de las combinaciones aneuploidía-DMR/marcador descritas en el EJEMPLO 10 se usan como base para que NIPT detecte la trisomía 18 (T18), como se describe brevemente a continuación. Usando un número limitado de muestras de embarazos T18 (una aneuploidía más rara), se usa un método como se describe en el EJEMPLO 4 o el EJEMPLO 10 (o por ejemplo, análogo a V10.3), excepto que se usan una (o dos) DMR del cromosoma 18, por ejemplo, en lugar de las dos DMR del cromosoma 21. Por ejemplo, en dicho ensayo pueden usarse las dos DMR del cromosoma 18 descritas en la TABLA 9, y los cebadores y secuencias de sonda correspondientes, y los marcadores/inactivadores usados, se describen en la TABLA 10.
Como apreciará ahora una persona experta en la materia, la región exacta del gen/región NFATC2 y/o cr18-gr00094 que puede usarse en tal ensayo, y la posición/secuencia precisa de los cebadores/sondas correspondientes puede optimizarse aún más (tal como usando una región que está en aproximadamente 350 pb, 300 pb, 250 pb, 200 pb, 150 pb, 100 pb, 50 pb, 20 pb, 10 pb o 5 pb en dirección 5'/en dirección 3' de aquellas regiones y secuencias que se muestran a continuación; preferentemente entre aproximadamente 350 pb y 200 pb, o 200 pb y 5 pb de las mismas). Adicionalmente, pueden usarse otras enzimas de restricción sensibles a la metilación además de las descritas en el EJEMPLO 10, por ejemplo, para mejorar la digestión del ADNec no metilado. Tales enzimas de restricción adicionales sensibles a la metilación pueden incluir AciI, Cac8I y/o PhoI.
TABLA 9: DMR del Cromosoma 18
TABLA 1 : r n r l DMR r m m l rn iv

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1.Un métodopara detectar una aneuploidía cromosómica en un feto en una mujer embarazada, comprendiendo dicho método las etapas:
(a) proporcionar una muestra que se ha tomado de dicha mujer embarazada, cuya muestra comprende ADN que se origina a partir de células de un feto y/o de la placenta de un feto en mezcla con ADN de origen materno metilado de manera diferente;
(b) tratar el ADN presente en dicha muestra con un reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado;
(c) determinar una cantidad de una primera especie de ADN diana, siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más regiones metiladas de forma diferencial (DMR) ubicadas en dicho cromosoma, dichas DMR diana metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de las DMR diana por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR diana indica dicha cantidad de primera especie de ADN diana en dicha muestra;
(d) determinar una cantidad de especies de ADN de referencia, siendo uno o más cromosomas de referencia, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más DMR de referencia ubicadas en dicho cromosoma o cromosomas de referencia, dichas DMR de referencia metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de dichas DMR de referencia por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR de referencia indica dicha cantidad de especie de ADN de referencia en dicha muestra; y
(e) determinar cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, de una cantidad determinada de la etapa (c) y una cantidad determinada de la etapa (d), en donde una o más de dicha cantidad o cantidades relativas indica la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto,
en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y usando: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana, opcionalmente, en donde en la etapa (e) dicha cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones se comparan con distribución o distribuciones umbral y/o de referencia, en donde una o más de dichas cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones más altas o más baja que dicha distribución o distribuciones umbral y/o de referencia indican la presencia de la aneuploidía cromosómica en el feto.
2. El método de la reivindicación 1 que comprende además la etapa:
(f) determinar una cantidad de ADN total en dicha muestra detectando al menos una región distinta (OR) que no está metilada de forma diferencial entre el ADN que se origina de las células de un feto y/o la placenta de un feto y ADN de origen materno, cuya modificación de las OR por dicho reactivo es insensible a la metilación de ADN,
en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa (f) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y dicha o dichas OR y usar: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana y para al menos una de dicha o dichas OR.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha detección de la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), se llevan a cabo usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente de reacción/detección, y de forma eficaz simultáneamente entre sí y por PCR basada en sonda cuantitativa en tiempo real múltiplex usando al menos una sonda marcada específica para cada una de dichas DMR y OR opcional u opcionales.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde se realiza una pluralidad de conjuntos de determinaciones para la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), realizado cada conjunto de dichas determinaciones usando una alícuota diferente de ADN de dicha muestra, en un recipiente diferente y de forma eficaz simultáneamente con cada otro miembro de la pluralidad de conjuntos de determinaciones, opcionalmente, en donde la cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones determinadas en la etapa (e) se determinan a partir de dicha pluralidad de conjuntos de determinaciones hechas para la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa opcional (f), preferentemente usando una cantidad promedio de ADN determinada para cada conjunto, tal como una cantidad media, mediana o moda de ADN determinada para cada conjunto, preferentemente una cantidad media de ADN determinada para cada conjunto.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho método se lleva a cabo en una pluralidad de muestras tomadas cada una de una mujer embarazada diferente, llevando a cabo cada método en un recipiente separado y de forma eficaz simultáneamente con cada miembro distinto de la pluralidad de muestras; opcionalmente, en donde dicha pluralidad de muestras está entre 2 y aproximadamente 500 muestras, tal como entre 2 y aproximadamente 200, entre 2 y aproximadamente 100 o entre aproximadamente 5 y aproximadamente 150 muestras; preferentemente en donde dicha pluralidad de muestras se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120 y 140 muestras tomadas cada una de una mujer embarazada diferente.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde una cantidad de la primera especie de ADN diana se determina a partir de la cantidad detectada de metilación en una de las DMR diana y una cantidad de la primera especie de ADN diana se determina a partir de la cantidad detectada de metilación en otra de las DMR diana; y
en donde dos o más cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, se determinan en la etapa (e) para dos o más cantidades de la primera especie de Ad N diana, cada una con respecto a una o más de dichas DMR diana; y
en donde dos o más de dicha cantidad o cantidades relativas o proporciones indican la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto,
opcionalmente, en donde en la etapa (e) dos o más de dicha cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones se comparan con distribución o distribuciones umbral y/o de referencia, en donde dos o más de dichas cantidad o cantidades relativas o proporción o proporciones más altas o más baja que dicha distribución o distribuciones umbral y/o de referencia indican la presencia de la aneuploidía cromosómica en el feto.
7.Un métodopara detectar un riesgo aumentado de que una mujer embarazada padezca o desarrolle preeclampsia; comprendiendo dicho método las etapas:
(i) llevar a cabo:
(a) proporcionar una muestra que se ha tomado de dicha mujer embarazada, cuya muestra comprende ADN que se origina a partir de células de un feto y/o de la placenta de un feto en mezcla con ADN de origen materno metilado de manera diferente;
(b) tratar el ADN presente en dicha muestra con un reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado;
(c) determinar una cantidad de una primera especie de ADN diana, siendo el cromosoma relevante para la aneuploidía cromosómica, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más DMR diana ubicadas en dicho cromosoma, dichas DMR diana metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de las DMR diana por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR diana indica dicha cantidad de primera especie de ADN diana en dicha muestra;
(d) determinar una cantidad de especies de ADN de referencia, siendo uno o más cromosomas de referencia, en dicha muestra detectando en dicha muestra la presencia de metilación en dos o más DMR de referencia ubicadas en dicho cromosoma o cromosomas de referencia, dichas DMR de referencia metiladas de forma diferencial entre el ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto y el ADN de origen materno, la modificación del ADN de dichas DMR de referencia por dicho reactivo es sensible a la metilación de ADN, en donde una cantidad detectada de ADN metilado en una o más de dichas DMR de referencia indica dicha cantidad de especie de ADN de referencia en dicha muestra; y (e) determinar cantidad o cantidades relativas, preferentemente proporción o proporciones, de una cantidad determinada de la etapa (c) y una cantidad determinada de la etapa (d), en donde una o más de dicha cantidad o cantidades relativas indica la presencia o ausencia de la aneuploidía cromosómica en el feto, (f) determinar una cantidad de ADN total en dicha muestra detectando al menos una OR que no está metilada de forma diferencial entre el ADN que se origina de las células de un feto y/o la placenta de un feto y ADN de origen materno, cuya modificación de las OR por dicho reactivo es insensible a la metilación de ADN,
en donde, dichas detecciones en la etapa (c) y la etapa (d) y la etapa (f) se realizan usando la misma alícuota de ADN de dicha muestra y en el mismo recipiente y de forma eficaz simultáneamente para dichas DMR diana y dichas DMR de referencia y dicha o dichas OR y usar: (x) el mismo marcador o marcadores detectables para al menos dos de dichas DMR de referencia; y (y) un marcador o marcadores detectables diferentes para al menos dos de dichas DMR diana y para al menos una de dicha o dichas OR y que comprende además las etapas:
• determinar una cantidad de ADN en una muestra patrón de ADN de cantidad conocida con respecto a las mismas DMR usadas en la etapa (c) y la etapa (d) y en la etapa (f); y
• comparar cada una de las señales detectadas a partir de dicha muestra patrón de ADN con las señales respectivas detectadas en la etapa (c) y la etapa (d) y en la etapa (f),
en donde la muestra patrón de ADN es una muestra de ADN genómico humano de concentración conocida; y
en donde en cada una de dichas etapas de determinación cada una de dichas cantidades determinadas de dicha primera especie de ADN diana y de la especie de ADN de referencia, se expresa como una cantidad absoluta de dicha especie de ADN en dicha muestra,
(ii) determinar una cantidad absoluta de ADN fetal presente en la muestra; y
(iii) comparar la cantidad de ADN fetal determinada con un umbral y/o distribución de referencia, en donde un aumento en o una desviación de, la cantidad de dicho ADN fetal a partir de dicho umbral y/o distribución de referencia indica un riesgo aumentado de que la mujer embarazada sufra o desarrolle preeclampsia.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha especie de ADN que se origina a partir de células de un feto y/o la placenta de un feto es ADN extracelular circulante y dicha muestra es una fracción de sangre tal como plasma o suero.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8:
en donde dicho reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado comprende bisulfito.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8:
en donde dicho reactivo que modifica de forma diferencial el ADN metilado y no metilado comprende un agente que digiere selectivamente ADN no metilado sobre metilado, preferentemente en donde, dicho agente comprende:
• al menos una enzima sensible a metilación;
• al menos una enzima de restricción sensible a metilación; y/o
• un agente seleccionado del grupo que consiste en: Aatll, Acil, AcII, Afel, Agel, Agel-HF, Ascl, AsiSl, Aval, BceAl, BmgBl, BsaAl, BsaHl, BsiEl. BsiWl, BsmBl, BspDl, BsrFl, BssHll, BstBl, BstUl, Clal, Eagl, Faul, Fsel, Fspl, Haell, Hgal, Hhal, HinP1I, Hpall, Hpy99l, HpyCH4IV, Kasl, Mlul, Nael, Narl, NgoMIV, Notl, Notl-HF, Nrul, Nt.BsmAl, Nt.CviPII, PaeR7l, PluTI, Pmll, Pvul, Pvul-HF, Rsrll, Sacll, Sall, Sall-HF, Sfol, SgrAl, Smal, SnaBl, TspMl y Zral.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 10, en donde dichas DMR comprenden al menos uno, preferentemente al menos dos, sitio o sitios de metilación específicos para dicho reactivo.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 11, en donde dos o más de dichas DMR de referencia se ubican en diferentes cromosomas de referencia.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 12, cuando depende de la reivindicación 2, en donde dicha o dichas OR se ubican en uno o más del cromosoma o cromosomas de referencia, preferentemente al menos una de dicha o dichas OR estando ubicada en el mismo cromosoma o cromosomas de referencia que al menos una de dicha o dichas DMR de referencia,
opcionalmente, en donde dicha OR está ubicada entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de una de dichas DMR de referencia.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 13, cuando depende de la reivindicación 2, en donde dicha detección en la etapa (f) comprende usar al menos dos de dichas OR;preferentemente en donde,el número de dichas OR es el mismo que el número de DMR de referencia usadas en la etapa (d);más preferentemente en donde, una de dichas OR se ubica en el mismo cromosoma que, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de, una DMR de referencia usada en la etapa (d) y otra de cada dichas OR está ubicada en el mismo cromosoma que, tal como entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 20 kb en dirección 5' o en dirección 3' de, otra de dichas DMR de referencia.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 14, en donde:
dicho cromosoma relevante a la aneuploidía cromosómica es un cromosoma humano seleccionado de la lista que consiste en: cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, cromosoma X y cromosoma Y, preferentemente cromosoma 21, cromosoma 18, cromosoma 13, lo más preferentemente cromosoma 21; en donde dicha aneuploidía cromosómica es una aneuploidía de dicho cromosoma, preferentemente una trisomía de dicho cromosoma.
16. El método de la reivindicación 15, en donde dicho cromosoma relevante a la aneuploidía cromosómica es el cromosoma 21 humano; en donde dicha aneuploidía cromosómica es una trisomía del cromosoma 21 humano.
17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 16, en donde:
cada cromosoma de referencia es un cromosoma humano seleccionado independientemente de la lista que consiste en: cromosoma 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, cromosoma 14, 15, 16, 17, cromosoma 19, cromosoma 20, cromosoma 22 y cromosoma 23, preferentemente cromosoma 5 o cromosoma 12.
18. El método de la reivindicación 17, en donde una DMR de referencia está ubicada en el cromosoma 5 humano, otra DMR de referencia está ubicada en el cromosoma 12 humano y
opcionalmente, en donde cada una de dichas DMR diana está ubicada en el cromosoma 21 humano, en el cromosoma 18 humano o en el cromosoma 13 humano, preferentemente en el cromosoma 21 humano.
19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 18, en donde dichas DMR están hipermetiladas en el ADN fetal e hipometiladas en el ADN materno.
20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 19, en donde:
(A) cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de:
• uno seleccionado de la lista que consiste en: SEQ ID NO. 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198 y 199; o
• la lista que consiste en: AIRE, SIM2 y ERG o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o • la lista que consiste en: Pd E9A, PPP1R2P2, CBR1, DSCAM, C21 orf29 y HLCS o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o
• C21 orf57 o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o
• la lista que consiste en: SEQ ID NO. 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186 y 187; y/o
(B) cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de:
• VAPA-APCDDI o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o
• maspina o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen
• la lista que consiste en: SEQ ID NO. 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 y 46; y/o
(C) cada una de dichas DMR diana está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de:
• la lista que consiste en: SEQ ID NO. 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 y 34.
21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 20, en donde:
• al menos una de dichas DMR diana está ubicada en una parte del genoma y/o un gen que es DSCAM y/o C21 orf57, o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o
• una de dichas DMR diana está ubicada en SEQ ID NO: 51 y otra de dichas DMR diana está ubicada en SEQ ID NO: 185.
22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 21, en donde cada una de dichas DMR de referencia está ubicada en una región y/o gen seleccionados independientemente de:
• la lista que consiste en: RASSF1A, TBX3, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, SOX14 y SPN o una secuencia de ADN de no más de 10 kpb, 5 kpb, 1 kpb, 500 pb, 250 pb, 150 pb, 100 pb o 50 pb en dirección 5' y/o en dirección 3' de dicha región y/o gen; o
• la lista que consiste en: SEQ ID NO. 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,
73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101,
102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,
124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145,
146 y 147.
23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 22, en donde dicho reactivo comprende una enzima de restricción sensible a la metilación.
24. El método de la reivindicación 23, en donde:
• dicho reactivo es uno seleccionado del grupo que consiste en: BstUI, Hha I y Hpall y AciI;
• dicho reactivo comprende dos, tres, cuatro, cinco o más enzimas de restricción sensibles a la mutilación; y/o • dicho reactivo comprende o consiste esencialmente en dos o tres de las enzimas de restricción sensibles a metilación seleccionadas del grupo que consiste en: BstUI, Hha I y Hpall.
25. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 u 8 a 24, en donde la mujer embarazada es un ser humano.
ES16794589T 2015-11-10 2016-11-09 Detección de aneuploidías cromosómicas fetales usando regiones de ADN que están metiladas diferencialmente entre el feto y la mujer embarazada Active ES2965036T3 (es)

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