CN109988831A - 叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法 - Google Patents

叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法 Download PDF

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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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Abstract

本发明属于生物医学领域，解决了单向单碱基延伸难以对变异位点进行精确确定，公开了一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延伸技术对所述目标片段进行双向延伸，得到等待检测基因位点，最后通过核酸质谱分析等待检测基因位点精确测定目标DNA序列；其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物对所述目标片段进行双向延伸；旨在通过双向单碱基延伸的技术，对叶酸代谢相关基因进行变异检查，从而为个体临床用药提供安全指导。

Description

叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法。
背景技术
基因组学研究表明，叶酸在体内的吸收效果与MCM6基因的表型密切相关。因此，检测相关基因的变异情况，能有效帮助人们合理饮食，保证营养平衡。
目前市场上的相关核酸质谱检测技术均是采用单向单碱基延伸技术来进行的。而单向单碱基延伸难以对变异位点进行精确确定。
本发明旨在通过双向单碱基延伸的技术，对叶酸代谢相关基因进行变异检查，从而为个体临床用药提供安全指导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法和检测试剂盒。
本发明采用的技术方案是：一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，通过设计的目标位点特异性引物组的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延伸技术对所述目标位点特异性引物组进行双向延伸，得到等待检测基因位点，最后通过核酸质谱分析等待检测基因位点精确测定目标DNA序列；
其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
优选地，所述目标位点特异性引物组包括：
用于扩增叶酸代谢相关基因MTHFR-1片段的特异性引物，该特异性引物的正向引物序列如SEQ ID Nos.1所示，该特异性引物的反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
用于扩增叶酸代谢相关MTHFR-2片段的特异性引物，该特异性引物的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，该特异性引物的反向引物序列如SEQ ID No.4所示；
用于扩增叶酸代谢相关MTRR-3片段的特异性引物，该特异性引物的正向引物序列如SEQ ID No.5所示，该特异性引物的反向引物序列如SEQ ID No.6所示。
优选地，所述单碱基延伸引物组包括：
用于扩增叶酸代谢相关基因MCM6-1片段的单碱基延伸引物，该单碱基延伸引物的序列如SEQ ID No.7所示；
用于扩增叶酸代谢相关MCM6-2片段的单碱基延伸引物，单碱基延伸引物的序列如SEQ ID No.8所示；
用于扩增叶酸代谢相关MTRR-3片段的单碱基延伸引物，单碱基延伸引物的序列如SEQ ID No.9所示。
优选地，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟,95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保存。
本发明的有益效果是：
通过设计的目标位点特异性引物的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延技术，通过双向延伸，得到待检基因位点，最后通过核酸质谱分析精确测定目标DNA序列。本发明旨在通过双向单碱基延伸的技术，对叶酸代谢相关基因进行变异检查，从而为个体临床用药提供安全指导。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明的一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，包括以下步骤：
1)提取样本DNA
1，将离心管中的样品10000rpm离心2min，去除上清液，留沉淀备用。
2、向上述离心管中加入350μl Buffer MC(MCL缓冲液)L和20μl Proteinase K(蛋白酶K)，震荡混匀，65℃水浴20min，间或混匀。
3、水浴完成之后向离心管中加入350μl Buffer MA和25μl SanMag Beads(吸附性磁珠)，振荡或者颠倒混匀，室温静置3min，间或混匀。
4、将离心管置于磁力架上30s，待SanMag Beads完全吸至管壁之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
5、向离心管中加入700μl 70％乙醇，吸打或者点振混匀，将离心管置于磁力架上30s，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
6、重复步骤5一次，室温开盖干燥10min至管内无液体残留。
7、向离心管中加入50μl TE Buffer(TE缓冲液)(pH8.0)，间或混匀。
8、取出离心管并置于磁力架上30s，待SanMag Beads完全吸至管壁上之后，小心吸取上清至新的离心管，即获得基因组DNA。
涉及到主要试剂耗材：DNA抽提试剂盒(上面用到的所有试剂都是这个试剂盒里面的)(Order NO.B518766)、移液器(步骤2、3、4、5、6、7、8)、枪头(步骤2、3、4、5、6、7、8)、小型离心机(步骤1)、磁力架(步骤4、5、8)，涡旋震荡器(步骤2、3、5、6、7)。
2)设计出特异性引物
NCBI网站上查询并下载该基因序列信息，在待测的位点的上下游选取20nt的特异性序列作为扩增引物。设计原则是：包含待测位点的DNA片段长度100bp-300bp均可，避免发夹结构和重复序列。设计完成以后，在引物5'端加入一段固定序列ACGTTGGATG。
3)设计出单碱基延伸引物，
单碱基延伸引物的设计同样是在该基因序列上设计，选择待测碱基位点上游和下游紧临的碱基，并根据质谱检测范围(4000道尔盾-9000道尔盾)，设计引物长度，设计原则引物扩增的第一个碱基即为待测碱基，而且避免发夹结构和重复序列。
4)核酸质谱分析，
1、配制1μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个SNP位点的forward(正向)和reverse(反向)引物。
2、以2ml、管配制PCR混液，DNA样本和对照不要加在其中。
3、加入2ul DNA样本，漩涡振荡器混匀，贴上封口膜。
4、将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：95℃ 2分钟，95℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃60秒，45个循环，72℃ 5分钟，4℃保温。
5、将各个位点的延伸引物稀释到100Um,计算在体系中的比例，配制iPLEX延伸引物混液。
6、在1.5mL管中配制iPLEX延伸混液。
7、每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好。
8、把板用膜封好，涡旋震荡和离心(4000rpm 5秒)。
9、将96孔板放上PCR仪进行以下热循环：
10、在样本板的每一个有样本的孔里加入41ul水然后离心。
11、将96孔板放入质谱仪，打开点样程序，进行自动点样操作。
12、打开飞行质谱软件，设置好参数，进行检测。
13、检测介绍后，在软件中自动生成结果，导出即可。
涉及到主要试剂耗材：96孔PCR板的离心机(步骤3、8、10)、涡旋震荡器(步骤3、8)、PCR仪(thermo)(步骤4、9)、MassARRAY质谱仪(agena)(步骤11、12、13)、PCR试剂盒(AgenaBioscience货号：11327)(步骤2)、单碱基延伸试剂盒(Agena Bioscience货号：10165)(步骤6)、移液器(步骤1、2、3、5、6、7、10)、枪头(步骤1、2、3、5、6、7、10)、96孔板(步骤2、3、4、7、8、9、10、11)、封口膜(步骤3、8)。
表1为特异性引物的序列表；表2为单碱基延伸引物序列表；
表1.特异性引物序列表
表2.单碱基延伸引物序列表
扩增片段 引物名称 序列号 5'-3'
MTHFR-1 MTHFR-1-E SEQ ID No.7 CTTATAAGGTGTCTGCGGGAG
MTHFR-2 MTHFR-2-E SEQ ID No.8 GAGCTGACCAGTGAAG
MTRR-3 MTRR-3-2-E SEQ ID No.9 CCCCGCCATCGCAGAAGAAAT
序列表
<110> 杭州云鼎基因生物科技有限公司
<120> 维生素D代谢相关基因突变位点的检测方法和检测试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTHFR-1的正向引物
<400> 1
acgttggatg cacttgaagg agaaggtgtc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTHFR-1的反向引物
<400> 2
acgttggatg gtgcatgcct tcacaaagcg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTHFR-2的正向引物
<400> 3
acgttggatg tctacctgaa gagcaagtcc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTHFR-2的反向引物
<400> 4
acgttggatg tctcccgaga ggtaaagaac 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTRR-3的正向引物
<400> 5
acgttggatg ctatatgcta cacagcaggg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTRR-3的反向引物
<400> 6
acgttggatg gaaaatccat gtaccacagc 30
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTHFR-1的单碱基延伸引物
<400> 7
cttataaggt gtctgcggga g 21
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTHFR-2的单碱基延伸引物
<400> 8
gagctgacca gtgaag 16
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)MTRR-3的单碱基延伸引物
<400> 9
ccccgccatc gcagaagaaa t 21

Claims (4)

1.一种叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于：通过设计的目标位点特异性引物组的单管多重PCR扩增反应得到目标片段，然后再利用单碱基延伸技术对所述目标位点特异性引物组进行双向延伸，得到等待检测基因位点，最后通过核酸质谱分析等待检测基因位点精确测定目标DNA序列；
其中，所述单碱基延伸技术是采用单碱基延伸引物组对所述目标片段进行双向延伸。
2.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述目标位点特异性引物组包括：
用于扩增叶酸代谢相关基因MTHFR-1片段的特异性引物，该特异性引物的正向引物序列如SEQ ID Nos.1所示，该特异性引物的反向引物序列如SEQ ID No.2所示；
用于扩增叶酸代谢相关MTHFR-2片段的特异性引物，该特异性引物的正向引物序列如SEQ ID No.3所示，该特异性引物的反向引物序列如SEQ ID No.4所示；
用于扩增叶酸代谢相关MTRR-3片段的特异性引物，该特异性引物的正向引物序列如SEQ ID No.5所示，该特异性引物的反向引物序列如SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求1所述的人类叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单碱基延伸引物组包括：
用于扩增叶酸代谢相关基因MCM6-1片段的单碱基延伸引物，该单碱基延伸引物的序列如SEQ ID No.7所示；
用于扩增叶酸代谢相关MCM6-2片段的单碱基延伸引物，单碱基延伸引物的序列如SEQID No.8所示；
用于扩增叶酸代谢相关MTRR-3片段的单碱基延伸引物，单碱基延伸引物的序列如SEQID No.9所示。
4.根据权利要求1所述的叶酸代谢相关基因突变位点的检测方法，其特征在于，所述单管多重PCR扩增的反应程序为：95℃2分钟,95℃30秒，56℃20秒，72℃60秒，45循环，72℃5分钟，4℃保存。
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