CN107190088A - 一种荧光pcr熔解曲线法检测hla基因型的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用荧光PCR熔解曲线法检测HLA基因型的试剂盒，包含HLA‑A、HLA‑B、HLA‑DRB1、HLA‑DQB1的基因分型，以含引物的96孔光学反应板进行扩增，藉由SYBR Green I对扩增的双股DNA产物主动结合，透过96孔熔解曲线的结果，综合判断HLA‑A、HLA‑B、HLA‑DRB1、HLA‑DQB1的低分辨率基因分型，从而辅助器官移植的配型诊断。
Description
技术领域
本发明属于荧光定性PCR领域，具体涉及一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA基因型的试剂盒。
背景技术
由主要组织兼容性复合体编码的分布于生物体有核细胞表面的抗原性物质，对人类而言， 被称为人类白细胞抗原( human leukocyte antigen, 简称HLA)。位于人类第六对染色体短臂上的人类白细胞抗原分子基因具有相当高的多样性，随着人类白细胞抗原分子基因序列的解密后发现，多数人类白细胞抗原之间仅有极少数、甚至只有一个胺基酸的差异存在，因此以过去的血清学方式通常无法如核酸检测方式有效的进行人类白细胞抗原型别鉴定区分。
根据多年来的研究发现，几乎所有血球及组织细胞，均具有HLA抗原之表现，此种代表着个体特异性的抗原是器官移植时引起免疫排斥反应之主要物质；。HLA抗原型系由复杂的基因排列及其分子产物所形成，涉及免疫的调节及细胞的分化，为人体最复杂之基因多型性系统。HLA抗原包括有A、B、C、D（DR、DQ、DP）E、F等等基因，其中A、B、DR、DQ 是本产品锁定的分型基因。
过去的检测HLA-ABDRDQ主要是用血清学方法，操作步骤多，且结果判读时存在主观性，血清、补体以及分离淋巴细胞的质量，均会影响结果的准确性，随着基因序列解密后，发现多数型别间只存在极少的差异，血清学无法一一呈现，使得使用聚合酶链式反应（Polymerase Chain ReaCtion，PCR）为主的核酸检测，逐渐成为检测HLA抗原主流方法之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因分型的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明在一个试剂盒的96孔光学反应板内包含HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB基因分型检测及内部质控监测，PCR扩增后产生的双股DNA产物可与SYBR Green I结合，不同产物的双股DNA熔解温度不同(Tm值)，经过低温至高温的熔解曲线分析，当双股解离至其Tm值时，荧光会有巨幅的下降，以此分辨特异性产物，透过侦测96孔熔解曲线分析的结果，综合判断HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1的低分辨率基因分型，从而辅助器官移植的配型诊断。
试剂盒共包含4个组分：光学反应板，T3反应液，核酸聚合酶，光学封膜，
光学反应板包含262条特异性引物，其中，1~256号为特异性引物，序列如SEQ ID NO.1-256所示，257~262号为内控引物，序列如SEQ ID NO.257-262所示；
核酸聚合酶包含Taq DNA聚合酶；
引物序列：
试剂组分配方：
T3反应液#配方：50mM KCl、20mM Tris-HCl、2.0 mM MgCl2、0.2 mM dNTP、SYBR greenI 0.1×、ROX reference dye 30nM。
核酸聚合酶配方：Taq酶5U/µL。
本发明的优点在于：
优点：本发明的优势为1、荧光PCR程序结束后，可直接判读，无需后续实验操作，检测只需2小时；2、包含HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB等常规器官移植所需检测的基因型别。
有益效果：1、为临床器官移植提供快速的结果参考；2、一次检测覆盖临床常规检测的HLA基因座。
附图说明
图1为熔解曲线分析的典型阴性结果。Tm值为77.32℃，符合阴性判断范围（75~79.5℃）。
图2为熔解曲线分析的典型阳性结果。Tm值为89.56℃，符合阳性判断范围（87~92℃）。
图3为熔解曲线分析的典型阳性结果。Tm值为86.62℃，符合阳性判断范围（84~89℃）。
图4熔解曲线分析的典型阳性结果。Tm值为86.5℃及90.15℃，符合阳性判断范围（83.5-87.9℃及88-92℃）。
具体实施方式
实施例1
1、反应体系的配制
（1）光学反应板的制备
取10mL容量瓶，分别依96孔的配方表加入该孔指定的0.5 OD/mL专一性引物1500μL及0.5OD/mL内部质控引物375μL，用无菌水补足体积到10mL，翻转使之充分混匀，将液体转移到15mL离心管中，利用自动化移液工作站分注到96孔的深孔原料盘后，使用原盘式分注工作站将原料盘中的引物混合物分注到光学反应板内，短暂离心后至于温度22±2℃、湿度10±5%RH的环境进行16-24小时干燥，经袋装密封后即为可使用的光学反应板，于-20℃保存备用。
（2）T3反应液的制备
取100mL容量瓶，分别加入6M KCl 0.833mL，1M Tris-HCl 2mL， 1M MgCl2 0.2mL，100mM dNTP 0.2mL，10× SYBR Green I 1mL，25μM ROX reference dye 0.12 mL。用双重蒸馏水补足体积到100mL，以转子使之充分混匀，按1.53mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
2、核酸提取
采用已备案的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取后用微量紫外分光亮度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6~2.0之间。
3、加样上机
（1）反应混合物配制
取出光学反应板、T3反应液解冻，取出核酸聚合酶保持于冰盒上，取9.2µL的核酸聚合酶加入T3反应液中，震荡混匀，短暂离心。
（2）加样
取15µL的上述混合液分装至ABDRDQ反应板的A1反应孔，于A1孔加入3μL的灭菌超纯水，然后将提取好的样本取303µL加入T3反应液的混合液中，震荡混匀，短暂离心后，分装18µL至光学反应板的其余反应孔中。将光学封膜密封后，短暂离心，立即进行PCR扩增反应。
（3）上机检测
1）循环条件设置
96℃ 2分30秒；进入以下循环：96℃ 15秒，65℃ 1分钟，共10循环；进入以下循环95℃15秒，62℃ 50秒，72℃ 30秒（信号收集），共22循环； 进入熔解曲线分析:95℃15秒，60℃ 1分钟，60℃至95℃以1%的升温速率执行信号收集，95℃ 15秒，60℃ 15秒。
2）仪器检测信道选择
荧光素设定为FAM、ROX。
4、结果判断
（1）A1孔不出现75-79.5的Tm值；（2）每孔的阴性与阳性判断应参考下表的判断值范围；(3)Applied Biosystems 7500仪器选择转存为含Results和Multicomponent Data的TXT文件，然后导入HLA-ABDRDQ结果分析软件中进行分析，直接得出HLA等位基因的分型检验结果。
实施例2
1、试剂特异性验证
（1）实验样本
采取6份特异性样本对试剂的特异性进行验证，样本购自国际认可的IHWG (http://www.ihwg.org/cellbank/) 标准品。
（2）实验过程
用HLA-ABDRDQ(荧光PCR熔解曲线法)核酸检测试剂盒分别检测以上6份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。
（3）实验结果
6份特异性样本检测结果皆符合预期，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。具体结果见下表：
特异性检测结果
2、试剂精密性验证
（1）实验样本
采取1份精密性样本（浓度为10ng/μL）对试剂的精密性进行验证，样本购自国际认可的IHWG (http://www.ihwg.org/cellbank/) 标准品。
（2）实验过程
用HLA-ABDRDQ(荧光PCR熔解曲线法)核酸检测试剂盒分别检测以上精密度样本10次，分析检测结果，验证试剂的精密性。
（3）实验结果
精密性样本批内变异系数（CV值）均＜5%，表明试剂重复性好。具体结果见下表：
精密性检测结果
3、试剂最低检测限验证
（1）实验样本
取不同基因型的5临床样本，稀释核酸浓度至10ng/µL进行扩增，验证试剂的最低检测限。
（2）实验过程
用HLA-ABDRDQ(荧光PCR熔解曲线法)核酸检测试剂盒分别重复检测以上最低检测限10次，分析检测结果，验证试剂的最低检测限。
（3）实验结果
最低检测限验证结果符合预期型别，试剂的最低检测限为10ng。具体结果见下表：
实施例3：检测30例临床样本的结果
1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。
2、采用德必碁生物科技（厦门）有限公司生产的核酸提取试剂（全血型）提取30例临床样本的基因组DNA，用紫外分光亮度计检测DNA样本的纯度，30例样本OD260/OD280皆在1.6~2.0之间。
3、按照实施例1所示的步骤，进行DNA加样并上荧光定量PCR仪进行检测，本次使用的仪器为ABI7500.
4、按照实施例1所示判断标准，对结果进行判读并统计，结果如下表：
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 德必碁生物科技(厦门)有限公司
<120> 一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA基因型的试剂盒
<130> 262
<160> 262
<170> PatentIn version 3.3
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agcccgtcta cgcacc 16
<210> 76
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
tcacccagcg caagtg 16
<210> 77
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
ccagcgcgca ccagct 16
<210> 78
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
cctggaagac gagcgg 16
<210> 79
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
actgtgaagc tctcca 16
<210> 80
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
tgtggcggag caggac 16
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
gcgcgctcaa gcgtg 15
<210> 82
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
cgggtataac cagtta 16
<210> 83
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
gccactccac gcacag 16
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
gccactccac gcactc 16
<210> 85
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
aggtatttct acaccg 16
<210> 86
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
gttccggtcc caatat 16
<210> 87
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
aggtatttct acacct 16
<210> 88
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
tgtgtgttgg tcttgc 16
<210> 89
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
cctcctcagc gggc 14
<210> 90
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
ccaggtaggc tctcca 16
<210> 91
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
cgagtccgag gatggc 16
<210> 92
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
tgtgtgttgg tcttgg 16
<210> 93
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
tatttctaca ccgcca 16
<210> 94
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
gaggccttca tgttcc 16
<210> 95
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
tcctccgcag gcata 15
<210> 96
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
ctcagctgca ccgcct 16
<210> 97
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 97
tatttctaca ccgcca 16
<210> 98
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 98
tgtgtgttgg tcttgc 16
<210> 99
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 99
gtgccccgct tcatct 16
<210> 100
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 100
tggagatctg tgtctc 16
<210> 101
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 101
cgagtccgag gatggc 16
<210> 102
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 102
cttggagatc tgtgtg 16
<210> 103
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 103
gcgggcatgt ccagtc 16
<210> 104
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 104
gtatctgcgg agcccg 16
<210> 105
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 105
cgagtccgag gatggc 16
<210> 106
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 106
tggttgtagt agcgga 16
<210> 107
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 107
tgggctacgt ggacgg 16
<210> 108
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 108
atactccggc ccctct 16
<210> 109
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 109
acgtggacga cacgct 16
<210> 110
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 110
tgtgccttgg ccttgc 16
<210> 111
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 111
ccgcgagtca gaggac 16
<210> 112
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 112
cgcaggttcc gcaggc 16
<210> 113
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 113
gagccccgca tcatct 16
<210> 114
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 114
gcagggtcca caggtc 16
<210> 115
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 115
ctggcataac cagtta 16
<210> 116
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 116
gccactccaa gcacgt 16
<210> 117
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 117
gcaggagagg ccggaa 16
<210> 118
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 118
tggttgtagt agcgga 16
<210> 119
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 119
cggagcgcga gcgtta 16
<210> 120
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 120
tgcggagctc caactg 16
<210> 121
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 121
gcgggcataa ccagtt 16
<210> 122
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 122
tgccctccag gtaggt 16
<210> 123
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 123
tcacaccctc cagagg 16
<210> 124
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 124
gcgcgctcct gcttgt 16
<210> 125
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 125
aggtatttcc acacct 16
<210> 126
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 126
ctcctgctct atccat 16
<210> 127
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 127
gcgggcatga ccagta 16
<210> 128
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 128
ctgtcctgtt ccgcca 16
<210> 129
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 129
gcgggcataa ccagta 16
<210> 130
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 130
ctcagctgtt ccgcca 16
<210> 131
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 131
tatttctaca ccgcca 16
<210> 132
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 132
gcaggttctc tcggtc 16
<210> 133
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 133
gcaggctcac tcggtc 16
<210> 134
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 134
gccaggtctc acatca 16
<210> 135
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 135
aggtatctgc ggagcg 16
<210> 136
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 136
ggaacacaca gatctg 16
<210> 137
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 137
cggggtcaca caccgt 16
<210> 138
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 138
agggtctcac acttgg 16
<210> 139
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 139
aggtatctgc ggagcg 16
<210> 140
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 140
cgagtccgag gatggc 16
<210> 141
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 141
tgcctggcgc ttgtac 16
<210> 142
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 142
aggtatttct acaccg 16
<210> 143
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 143
gcagggtcca caggtc 16
<210> 144
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 144
ccgcgagtca gagaga 16
<210> 145
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 145
aagtctgtgt gttggt 16
<210> 146
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 146
ttcgacagcg acgcca 16
<210> 147
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 147
tagtagcgga gcgcgg 16
<210> 148
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 148
gccatgaggt atttcc 16
<210> 149
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 149
ctcctgctct atccat 16
<210> 150
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 150
ctcacacttg gcagac 16
<210> 151
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 151
gccactccac gcacag 16
<210> 152
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 152
ctacgtggac gacacc 16
<210> 153
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 153
tgtgcctgga ccttgt 16
<210> 154
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 154
tgtgccttgg ccttgc 16
<210> 155
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 155
catccagagg atctat 16
<210> 156
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 156
ccgcggtcca ggagct 16
<210> 157
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 157
gcgggctccg tgggtg 16
<210> 158
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 158
aggttccgca ggctct 16
<210> 159
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 159
ctgaacgagg acctga 16
<210> 160
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 160
ctcagctgtt ccgcct 16
<210> 161
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 161
cacagactgt ccgagt 16
<210> 162
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 162
cggggtcact caccgt 16
<210> 163
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 163
tatttctaca ccgcca 16
<210> 164
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 164
tgtgcctgga ccttgt 16
<210> 165
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 165
tcacaccctc cagagc 16
<210> 166
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 166
ctcagctgtt ccgcca 16
<210> 167
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 167
ctcacatcat ccaggt 16
<210> 168
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 168
gccactccaa gcacag 16
<210> 169
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 169
ccgcgagtcc gaggac 16
<210> 170
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 170
ggtaagtctg cgcgga 16
<210> 171
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 171
ggaacacaca gatctt 16
<210> 172
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 172
tggttgtagt agcgga 16
<210> 173
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 173
ctccgcggat accgg 15
<210> 174
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 174
ctccacgcaa gtgcca 16
<210> 175
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 175
ctacgtggac gacacc 16
<210> 176
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 176
tggagatctg tgtctc 16
<210> 177
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 177
ggagccccga ttcatt 16
<210> 178
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 178
tggttgtagt agcgga 16
<210> 179
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 179
tctcccagcg caagtt 16
<210> 180
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 180
ccagcgcgca ccagct 16
<210> 181
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 181
gagccccgct tcatct 16
<210> 182
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 182
tgtgcctgga ccttgt 16
<210> 183
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 183
gacacgctga tcgtga 16
<210> 184
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 184
gacacccaga tcgtga 16
<210> 185
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 185
tggttgtagt agcgga 16
<210> 186
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 186
gacacscagt tcgtga 16
<210> 187
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 187
tagtagccgc gcaggt 16
<210> 188
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 188
ctcacacttg gcagac 16
<210> 189
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 189
gccactccaa gcacgt 16
<210> 190
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 190
tacgtccgag tgtcaa 16
<210> 191
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 191
tgtcgaagcg cacgaa 16
<210> 192
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 192
gcagcttaag tttgaa 16
<210> 193
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 193
gcctctgctc caggag 16
<210> 194
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 194
cagcttaagt ttgaat 16
<210> 195
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 195
gctcgtcttc caggat 16
<210> 196
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 196
tgtggcagcc taagag 16
<210> 197
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 197
cggcacgcac ctgct 15
<210> 198
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 198
tgtggcagcc taagag 16
<210> 199
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 199
gcctgtcttc caggag 16
<210> 200
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 200
gcctgtcttc caggaa 16
<210> 201
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 201
ggagcgggag cggta 15
<210> 202
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 202
ttccagtact cggcat 16
<210> 203
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 203
tggagtactc tacgtc 16
<210> 204
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 204
gttatggaag tatctc 16
<210> 205
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 205
cttcaccaac gggacc 16
<210> 206
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 206
gttgtgtctg catacg 16
<210> 207
<211> 16
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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aggctgtgta tttgtc 16
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 262
tgctcaatga tagctc 16
Claims (5)
1.一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因分型的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下；光学反应板包含侦测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1的特异性引物及内部质控引物；T3反应液包含相关PCR反应的缓冲液；核酸聚合酶包含TaqDNA 聚合酶；光学封膜。
2.根据权利要求1所述的一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因分型的试剂盒，其特征在于：所述的光学反应板中干燥之特异性引物及内部质控引物为14-40mer的寡核苷酸序列，共有262条，其中，1~256号为特异性引物，序列如SEQ IDNO.1-256所示，257~262号为内控引物，序列如SEQ ID NO.257-262所示。
3.根据权利要求1所述的一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因分型的试剂盒，其特征在于：所述的T3反应液包括50mM KCl、20mM Tris-HCl、2.0mM MgCl2、0.2 mM dNTP、SYBR green I 0.1×、ROX reference dye 30nM。
4.据权利要求1所述的一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因分型的试剂盒，其特征在于：所述的核酸聚合酶包括5U/μL的Taq DNA聚合酶。
5.据权利要求1所述的一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1、HLA-DQB1基因分型的试剂盒，其特征在于：所述的光学封膜为医疗级聚合物，尺寸为13*8cm2。
Priority Applications (1)
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