CN101665833A - 一种检测hla-b27基因的方法及其专用引物与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测HLA－B27基因的方法及其专用引物与试剂盒。本发明所提供的检测HLA－B27基因的方法，是将待测样品用本发明的试剂盒进行荧光定量PCR检测，若熔解曲线出现两个峰，则待测样品中含有HLA－B27基因；若熔解曲线出现一个峰，则待测样品中不含有HLA－B27基因。为了降低人为视觉因素造成的误差，还可以利用已知HLA－B27阴性和/或阳性样本计算出参考值；将待测DNA样品中保守基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与HLA－B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值相比，所得比值与参考值进行比较。本发明的试剂盒具有操作简便、判定速度快、对仪器要求低和费用低的优点，在强直性脊柱炎的早期诊断和鉴别诊断方面将具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测HLA-B27基因的方法及其专用引物与试剂盒。
背景技术
HLA-B27是人类白细胞抗原(HLA)B座上的一组重要等位基因，HLA-B27作为MHC I类分子，位于人类第6号染色体的短臂上，其主要的生理功能是提呈内源性抗原肽给CD8T细胞，通常被认为参与T细胞的限制性识别。HLA-B27与强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、Reiters综合征、关节炎性银屑病、葡萄膜炎等都有相关性。
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一种病因尚不明确的自身免疫型疾病，主要累及骶髂关节、脊柱骨软组织及四肢关节，也可累及内脏和其他组织，具有慢性、进行性和炎性等特点，严重危害人体健康。目前AS的诊断主要按照1966年的纽约标准和1984年的纽约修订标准，除要求存在X线≥2级骶髂关节炎外，还要求存在腰椎活动受限、胸椎活动降低等损害。患者早期由于受累关节尚未发生明显改变，容易出现误诊和漏诊。一般患者在发病后4-10年左右才能被诊断，但诊断时多已发生局限性骨侵蚀、硬化，即形态学变化，从治疗角度讲，此时已失去最佳的治疗时机，因此早期诊断成为争取良好预后的关键。
多年来，人们一直在寻找AS早期诊断的标志物，直到1973年Brewerton首次报道AS与HLA-B27抗原的表达相关后，大量AS与HLA-B27的相关性研究证实，HLA-B27与AS的发生密切相关，这一发现使早期诊断AS成为可能。目前，HLA-B27检测已经成为临床诊断AS的常规手段，但是，用何种方法才能准确检测HLA-B27成为人们研究和关注的焦点。
分子生物学技术的发展大大推动了方法学的进步，从最初的补体依赖性微量淋巴细胞毒试验、ELISA检测法，过渡到现在的流式细胞法以及PCR法。
补体依赖性微量淋巴细胞毒试验是目前应用最广泛的检测HLA-B27的方法。但其准确性受诸多因素影响，如细胞纯度、补体的活性和差异、抗体的纯度和效价、HLA的高度多态性、细胞表面B27抗原分子的表达数目以及抗原交叉性、操作者的主观性影响等，都容易造成假阳性或假阴性的结果。
临床上较为常用的流式细胞技术是一种集生物技术、计算机、流体力学、激光技术、单克隆抗体等于一体的检测手段，以其快速、简便、准确等特点迅速被临床检验所接受，但其仪器昂贵，对操作人员及待测样本的质量要求较高，这在很大程度上限制了该技术的推广。
因此，将简单、快捷、高灵敏、高特异和低污染的荧光定量PCR方法，应用于AS的早期诊断、鉴别诊断、个体化的有效治疗和控制将具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测HLA-B27基因的引物。
本发明所提供的检测HLA-B27基因的引物，由用于扩增保守基因的引物对和用于扩增HLA-B27基因的引物对组成。
所述保守基因具体可为肌动蛋白基因、细胞色素C-1基因或D甘油醛-3-磷酸脱氢酶等基因。
当所述保守基因为肌动蛋白基因时，用于扩增肌动蛋白基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
当所述保守基因为D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因时，用于扩增D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
本发明的另一个目的是提供一种检测HLA-B27基因的试剂盒。
本发明所提供的检测HLA-B27基因的试剂盒，包括用于扩增保守基因和HLA-B27基因的引物对。
上述试剂盒中，所述保守基因具体可为肌动蛋白基因、细胞色素C-1基因或D甘油醛-3-磷酸脱氢酶等基因。
当所述保守基因为肌动蛋白基因时，用于扩增肌动蛋白基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
当所述保守基因为D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因时，用于扩增D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
上述试剂盒中还包括双链特异性荧光染料，所述双链特异性荧光染料为SybrGreen、EvaGreen或SuperGreen等。
具体应用时，上述试剂盒中还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括Hotstar Taq、dNTP和MgCl2。
本发明的第三个目的是提供一种检测HLA-B27基因的方法。
本发明所提供的检测HLA-B27基因的方法，是将待测DNA样品用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测，若PCR扩增产物的熔解曲线出现两个峰，则待测DNA样品中含有HLA-B27基因；若PCR扩增产物的熔解曲线出现一个峰，则待测DNA样品中不含有HLA-B27基因。
为了降低人为视觉因素造成的误差，还可以利用已知HLA-B27阳性样本和/或阴性样本，使用上述试剂盒进行荧光定量PCR检测；将已知HLA-B27阳性样本和/或阴性样本中保守基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与该HLA-B27阳性样本和/或阴性样本中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应峰值相比，所得比值使用ROC方法进行统计，得出该HLA-B27扩增体系的参考值；通过对待测DNA样品中保守基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与该待测DNA样品中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值相比，所得比值与参考值进行比较，得出待测DNA样品中是否含有HLA-B27基因的结论。
具体的，当所述保守基因为肌动蛋白基因时，本发明所提供的检测HLA-B27基因的方法，是将待测DNA样品用上述包括序列3和序列4的试剂盒进行荧光定量PCR检测，若待测DNA样品中肌动蛋白基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与该待测DNA样品中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值的比值小于参考值2.9，则待测DNA样品中含有HLA-B27基因；若待测DNA样品中肌动蛋白基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与该待测DNA样品中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值的比值大于参考值2.9，则待测DNA样品中不含有HLA-B27基因。
当所述保守基因为D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因时，本发明所提供的检测HLA-B27基因的方法，是将待测DNA样品用上述包括序列5和序列6的试剂盒进行荧光定量PCR检测，若待测DNA样品中D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与该待测DNA样品中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值的比值小于参考值2.7，则待测DNA样品中含有HLA-B27基因；若待测DNA样品中D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与该待测DNA样品中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值的比值大于参考值2.7，则待测DNA样品中不含有HLA-B27基因。
本发明的试剂盒具有操作简便、判定速度快、对仪器要求低和费用低的优点，在强直性脊柱炎的早期诊断和鉴别诊断方面将具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为使用肌动蛋白基因作为内参基因检测HLA-B27阴性和阳性样本的熔解曲线峰图
图2为使用D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因作为内参基因检测HLA-B27阴性和阳性样本的熔解曲线峰图
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、人类HLA-B27基因与非HLA-B27基因的判别
根据肌动蛋白(ACTB)编码基因设计引物对甲，引物对甲由引物1和引物2组成，引物1的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1所示，引物2的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。
根据HLA-B27基因设计引物对乙，引物对乙由引物3和引物4组成，引物3的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，引物4的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。
分别以200例HLA-B27阳性及200例HLA-B27阴性志愿者血液DNA为模板(血液样本来源于临床开展HLA-B27基因检测的医院的志愿者)，利用引物对甲和引物对乙用ABI 7700实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，具体PCR反应体系如表1所示：
表1PCR反应体系
PCR反应条件为：先96℃15min；然后96℃25sec、62℃30sec、72℃30sec，共40个循环，随后进行熔解曲线分析。
PCR扩增过程中会产生大量的DNA双链分子，反应体系中的荧光染料可以与产生的双链DNA分子特异性结合而发出荧光，使用荧光染料激发所需波长的光源进行实时检测，收集在PCR产物合成期荧光染料发射的特定波长的荧光信号。以温度和发射光的荧光信号作图，可得到一条曲线，称为熔解曲线。由于PCR产物长度和G/C含量的不同，不同的PCR扩增产物会在不同的特定温度点解链。对熔解曲线进行微分处理，绘制出熔解曲线峰图，其峰值所对应的温度即为PCR产物的退火温度(Tm)。熔解峰可以反映体系中扩增得到的PCR产物的特异性。
荧光信号采集点在72℃30sec，在PCR反应结束后，逐渐升温，进行熔解曲线分析程序(96℃10sec、72℃10sec、96℃10sec，在升温过程中，在每个温度点检测并记录荧光信号)。
HLA-B27阴性和阳性样本的熔解曲线峰图如图1所示，其中，A为HLA-B27阳性样本的熔解曲线峰图，B为HLA-B27阴性样本的熔解曲线峰图。图1中，纵坐标-d(F)/d(t)表示荧光信号对温度求负一阶导数。从图1中可以看出，以HLA-B27阳性样本为模板进行PCR扩增时，产生两种PCR产物，其熔解曲线峰图出现退火温度不同的两个熔解峰，分别为保守基因扩增产物和HLA-B27基因扩增产物；而以HLA-B27阴性样本为模板进行PCR扩增时，产生一种PCR产物，其熔解曲线峰图只有一个熔解峰，为保守基因扩增产物。
实验设三次重复，根据保守基因(ACTB)和HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值进行结果判断。保守基因(ACTB)和HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值如表2所示，表2中数值为三次重复实验的平均值。
表2保守基因和HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值
| 比值(保守基因/HLA-B27基因) | 0.3743 | 146.0094 |
| 熔解温度(保守基因/HLA-B27基因) | 82.72℃/87.09℃ | 83.28℃/88.85℃ |
| 判读结果 | 阳性(小于参考值2.9) | 阴性(大于参考值2.9) |
结果表明，HLA-B27阳性样本的保守基因(ACTB)与HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值小于参考值2.9，判读结果为阳性；而HLA-B27阴性样本的保守基因与HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值大于参考值2.9，判读结果为阴性。以上结果说明本发明检测方法的结果是正确、可信的。
实施例2、人类HLA-B27基因与非HLA-B27基因的判别
根据D甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)编码基因设计引物对丙，引物对丙由引物5和引物6组成，引物5的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5所示，引物6的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列6所示。
根据HLA-B27基因设计引物对乙，引物对乙由引物3和引物4组成，引物3的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，引物4的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列4所示。
分别以200例HLA-B27阳性及200例HLA-B27阴性的DNA为模板(血液样本来源于临床开展HLA-B27基因检测的医院的志愿者)，利用引物对丙和引物对乙用ABI 7700实时荧光定量PCR仪进行PCR反应，具体PCR反应体系如表3所示：
表3PCR反应体系
PCR反应条件为：先96℃15min；然后96℃25sec、62℃30sec、72℃30sec，共40个循环，随后进行熔解曲线分析。
PCR扩增过程中会产生大量的DNA双链分子，反应体系中的荧光染料可以与产生的双链DNA分子特异性结合而发出荧光，使用荧光染料激发所需波长的光源进行实时检测，收集在PCR产物合成期荧光染料发射的特定波长的荧光信号。以温度和发射光的荧光信号作图，可得到一条曲线，称为熔解曲线。由于PCR产物长度和G/C含量的不同，不同的PCR扩增产物会在不同的特定温度点解链。对熔解曲线进行微分处理，便可绘制出熔解曲线峰图，其峰值所对应的温度即为PCR产物的退火温度(Tm)。熔解峰可以反映体系中扩增得到的PCR产物的特异性。
荧光信号采集点在72℃30sec，在PCR反应结束后，逐渐升温，进行熔解曲线分析程序(96℃10sec、72℃10sec、96℃10sec，在升温过程中，在每个温度点检测并记录荧光信号)。
HLA-B27阴性和阳性样本的熔解曲线峰图如图2所示，其中，A为HLA-B27阳性样本的熔解曲线峰图，B为HLA-B27阴性样本的熔解曲线峰图。图2中，纵坐标-d(F)/d(t)表示荧光信号对温度求负一阶导数。从图2中可以看出，以HLA-B27阳性样本为模板进行PCR扩增时，产生两种PCR产物，其熔解曲线峰图出现退火温度不同的两个熔解峰，分别为保守基因扩增产物和HLA-B27基因扩增产物；而以HLA-B27阴性样本为模板进行PCR扩增时，产生一种PCR产物，其熔解曲线峰图只有一个熔解峰，为保守基因扩增产物。
实验设三次重复，根据保守基因(GAPDH)和HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值进行结果判断。保守基因(GAPDH)和HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值如表4所示，表4中数值为三次重复实验的平均值。
表4保守基因GAPDH和HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值
| 比值(保守基因/HLA-B27基因) | 0.6819 | 193.43 |
| 熔解温度(保守基因/HLA-B27基因) | 76.6℃/86.41℃ | 76.9℃/87.30℃ |
| 判读结果 | 阳性(小于参考值2.7) | 阴性(大于参考值2.7) |
结果表明，HLA-B27阳性样本的保守基因(GAPDH)与HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值小于参考值2.7，判读结果为阳性；而HLA-B27阴性样本的保守基因与HLA-B27基因的熔解峰荧光信号峰值的比值大于参考值2.7，判读结果为阴性。以上结果说明本发明检测方法的结果是正确、可信的。
序列表
<110>博奥生物有限公司 清华大学
<120>一种检测HLA-B27基因的方法及其专用引物与试剂盒
<130>CGGNARZ92556
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
cgttgacatc cgtaaagacc 20
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>2
agccagggca gtaatctcc 19
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
catgtggtat ttccacacct 20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>4
acaaccagag cgaggccggt 20
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ctccctcttt ctttgcagca at 22
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
cagctctcat accatgagtc ct 22
Claims (12)
1、一种检测HLA-B27基因的引物，由用于扩增保守基因的引物对和用于扩增HLA-B27基因的引物对组成。
2、根据权利要求1所述的引物，其特征在于：所述保守基因为肌动蛋白基因、细胞色素C-1基因或D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。
3、根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：所述保守基因为肌动蛋白基因，用于扩增肌动蛋白基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
4、根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：所述保守基因为D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，用于扩增D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
5、一种检测HLA-B27基因的试剂盒，包括用于扩增保守基因和HLA-B27基因的引物对。
6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述保守基因为肌动蛋白基因、细胞色素C-1基因或D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因。
7、根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述保守基因为肌动蛋白基因，用于扩增肌动蛋白基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列1和序列2所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
8、根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于：所述保守基因为D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因，用于扩增D甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列5和序列6所示，用于扩增HLA-B27基因的引物对的脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3和序列4所示。
9、根据权利要求5-8中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括双链特异性荧光染料，所述双链特异性荧光染料为Sybr Green、EvaGreen或SuperGreen。
10、根据权利要求5-9中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包括Hotstar Taq和MgCl2。
11、一种检测HLA-B27基因的方法，包括将待测DNA样品用权利要求5-10中任一所述试剂盒进行荧光定量PCR检测，若PCR扩增产物的熔解曲线出现两个峰，则待测样品中含有HLA-B27基因；若PCR扩增产物的熔解曲线出现一个峰，则待测样品中不含有HLA-B27基因。
12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将已知HLA-B27阳性样本和/或阴性样本用权利要求5-10中任一所述的试剂盒进行荧光定量PCR检测，将已知HLA-B27阳性样本和/或阴性样本中保守基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与已知HLA-B27阳性样本和/或阴性样本中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应峰值相比，所得比值经统计计算得到参考值；
将待测DNA样品用权利要求5-10中任一所述的试剂盒进行荧光定量PCR检测，将待测DNA样品中保守基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值与待测DNA样品中HLA-B27基因的PCR扩增产物的熔解曲线对应的峰值相比，所得比值与参考值进行比较。
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