CN105886618A - 一种定量检测液体样品中汞离子的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种定量检测液体样品中汞离子的方法及一种汞离子定量检测试剂盒，利用本发明提供的基于生物传感器和微滴PCR技术的定量检测方法和检测试剂盒可以实现对汞离子的绝对定量检测，定量检测限可达到40fmol，灵敏度可达到10fmol，能够满足汞离子实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种实现汞离子绝对定量检测的有效方法。

Description

一种定量检测液体样品中汞离子的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体的，涉及一种定量检测液体样品中汞离子的方法及试剂盒。
背景技术
在所有的水中的重金属离子中，汞离子是所有对人体有严重危害的金属离子之一。现阶段已经开发了大量的针对痕量汞离子的检测方法。近期，基于生物传感器的检测方法以其相对简单的操作和较低的成本已经取得了快速的进展。大部分的传感器都基于将物理或者化学信号转化为核酸信号，因此，生物传感器提供了一种通过检测核酸信号来检测重金属含量的方法。
基于核酸信号的产生形式，生物传感器可以分为“开型(turn-on)”传感器和“关型(turn-off)”传感器。对于“关型”传感器来说，由于其核酸信号是随着检测目的物质的增加而降低的，所以这类检测方法较容易受到检测样品中的荧光干扰因子的影响，从而导致假阳性或者假阴性的结果。因此，“开型”传感器更适合实际检测的需要。最近，一种基于T-Hg-T结构的生物传感器开发出来并得到了广泛的应用。这种结构可以特异性的结合规定数量的汞离子，并通过特定结构的核酸信号的转化达到汞离子检测的目的。目前这种类型的生物传感器已经与荧光检测、等温检测、G-四重结构、微流控芯片、电化学等方法相结合并开发出了各种类型的检测方法。对于实际检测工作来说，我们需要对痕量的汞离子进行定量，从而可以对样品或者污水中汞离子是否超标做出标识。但是以上的所有方法都是需要通过对不同梯度的样品进行梯度稀释才可以取得定量结果的，这个过程中会受到人为操作等一系列因素的影响。因此开发一种不依赖于标准曲线的重金属离子检测方法是很必要的。
对于汞离子绝对定量检测来说，检测方法必须符合以下几点要求：(1)汞离子信号转化为核酸信号的过程必须是线性的，而且这一步的影响信号富集也必须是可控的；(2)后续的检测方法必须是一种不依赖于标准曲线的检测方法。微滴PCR是一种新型的PCR扩增技术。这种方法通过将原始反应体系进行分割，使原始体系中的模板分子也分配到了不同的小反应体系中，PCR程序结束后，通过流式检测设备测定每个反应体系的荧光信号值，统一分析之后确定阴性微滴和阳性微滴的个数，借助泊松分布从而确定整个反应体系中目的片段的拷贝数。微滴PCR由于其简便的操作，稳定的扩增以及可以进行绝对定量的优势，现阶段已经得到了快速的发展，其在单分子检测，基因文库扩增等方面已经取得了很大的研究进展。由于其后续可以借助流式的荧光检测方法并可以借助数学统计实现绝对定量，所以微滴PCR也被认为是一种重要的定量PCR的代替方法。
因此有必要提供一种针对汞离子的基于生物传感器和微滴PCR的定量检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种不需要进行样品前处理步骤的，而且不依赖于标准曲线绘制的汞离子检测方法，实现对待测样品中汞离子的绝对定量。
为了达到以上目的，本发明提供了一种定量检测液体样品中汞离子的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)以待测液体样品为模板溶液，利用汞离子生物传感器进行等温PCR扩增获得含有等温PCR扩增产物的扩增后体系；
(2)利用超纯水对所述扩增后体系进行108倍稀释，获得最终的稀释后物料，以所述稀释后物料作为模板溶液，利用微滴PCR扩增引物和探针进行微滴PCR扩增，采集微滴PCR扩增产生的荧光信号，依照阴性孔的荧光确定荧光阈值以得到阳性扩增孔数；
(3)利用公式I计算每个扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数，公式I中，A为扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数，N0为总扩增孔数，X为阳性扩增孔数；
公式I：A＝-ln[(N0-X)/N0]×N0
(4)利用公式Ⅱ计算样品中汞离子的浓度，公式Ⅱ中，n为生物传感器中可形成T-Hg-T结构的数量，A为扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数，ER为液体样品中汞离子浓度：
公式Ⅱ：ER＝nA/4816。
优选的，步骤(1)中等温PCR扩增的体系为：
在本发明所提供的方法中，所述待测液体样品可以为直接采集的原始液体样品，待测样品种类可以是血清样品以及自然水样品。
其中，对所述扩增后体系进行稀释的目的是使目的核酸片段的量满足数字PCR的检测范围，优选的，将所述扩增后体系稀释108倍时，具有最佳的检测效果。
其中，等温PCR扩增的步骤包括：先将待测液体样品、汞离子生物传感器和ddH2O接触混匀后在95℃下温浴4.5-5.5min获得温浴后体系，将所述温浴后体系降温至25℃后加入Klenow大片段等温扩增酶、等温PCR缓冲液和dNTPs，混匀后在37℃温浴1.8-2.2h获得含有等温PCR扩增产物的扩增后体系。
可选的，微滴PCR扩增的体系为：
可选的，微滴PCR反应的条件包括将所述微滴PCR扩增体系在50℃热激活300s，95℃预变性300s，95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环，最后在60℃下采集荧光信号。
在本发明所提供的方法中，所述微滴PCR在微滴PCR生成芯片上进行，具体的可以包括以下步骤，首先将20μL所述微滴PCR扩增体系加入到微滴PCR生成芯片上，再加入70μL的微滴生成用油，进行微滴生成步骤，完成微滴生成步骤后，将微滴化的反应体系转移至96孔板中，封膜，将封膜后的96孔板放入PCR扩增仪中进行微滴PCR扩增。完成微滴PCR扩增后，将微滴吸入流式荧光检测器中进行荧光检测。其中，所述微滴PCR生成芯片和所述微滴生成用油可以为本领域所公知的适合于进行微滴PCR反应的商品化产品。
阈值的判定方法为按照阴性样品的荧光值确定反应的荧光阈值以区分反应中的阴性亮点与阳性亮点。
其中，在步骤(3)中，每个样品中的拷贝数是通过阳性扩增孔数和总扩增孔数的比例来确定的。通过如公式I所示的泊松分布公式计算扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数后通过ER值的计算获得重金属离子的绝对含量，最后计算得到的ER数值与样品中汞离子浓度相等，公式中汞离子的浓度以pmol为单位。
本检测体系反应原理如图1所示。检测体系主要包括三个部分：生物传感器等温延伸步骤、微滴PCR步骤、微滴荧光读取步骤。在第一个步骤中，通过生物传感器将汞离子信号转化为核酸信号，实现汞离子的线性信号转换。另外一个方面，T-Hg-T的结构在较低温度下可以保持稳定。所以本发明在等温PCR扩增步骤中选取的内切酶为Klenow大片段扩增酶。等温延伸后，发卡结构被补平成平端，从而产生引物结合位点。在等温过程结束后，将第一步的产物进行稀释后作为第二步微滴PCR扩增的模板。只有第一步经过延伸的发卡结构在这个步骤中可以产生阳性的扩增信号。微滴PCR步骤结束后，通过读取阳性扩增孔数，可以达到对目的片段进行绝对定量的目的。
在本发明所提供的方法中，生物传感器序列内部包含的T-Hg-T结构的数量会对最终的检测结果的定量能力和扩增表现产生影响，优选的，所述汞离子生物传感器为T-Hg-T数量为5的生物传感器。
本发明中，当待测液体样品中汞离子浓度在40fmol到40pmol时，ER随着汞离子的浓度有着很好的线性Y＝0.963X+0.153，线性相关系数R2＝0.992。这说明，当汞离子浓度位于40fmol到40pmol时，ER随着汞离子浓度的增加而呈现线性增长，并且在数据上ER值与汞离子浓度相同(pmol为单位)。本发明具有非常低的定量检测线可以满足绝大部分实际检测样品的需要。
优选的，所述汞离子生物传感器的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述，微滴PCR扩增引物和探针序列为：
上游引物Hg-F-5：CCCAACCCGCCCTACC；
下游引物Hg-R-5：TACCCGCTGAGGTTAAACAAC；
探针Hg-P-5：FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。
本发明还提供了一种汞离子定量检测试剂盒，所述试剂盒含有汞离子生物传感器以及微滴PCR扩增引物和探针：
其中，所述汞离子生物传感器的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
微滴PCR扩增引物和探针序列为：
上游引物Hg-F-5：CCCAACCCGCCCTACC，
下游引物Hg-R-5：TACCCGCTGAGGTTAAACAAC，
探针Hg-P-5：FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。
优选的，所述试剂盒中还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Klenow大片段等温扩增酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。
本发明所提供的方法可以直接对待检测样品中的汞离子进行定量检测，从而省去了常规仪器检测中的样品前处理步骤以及传感器检测中的需要标准曲线的步骤，使得检测过程简便易行，避免了繁琐的操作对检测结果准确性的不良影响。另外，在本发明方法中，通过定义了ER参数，可以直接通过ER的计算对汞离子进行绝对定量，极大的简化了反应步骤。
利用本发明提供的基于生物传感器和微滴PCR技术的定量检测方法和检测试剂盒可以实现对汞离子的绝对定量检测，定量检测限可达到40fmol，灵敏度可达到10fmol，能够满足汞离子实际检测的需要。此外，本方法操作简单，灵活性强，是一种实现汞离子绝对定量检测的有效方法。
附图说明
图1为基于生物传感器和微滴PCR反应体系的原理图。
图2为生物传感器序列与汞离子结合后的二级结构的差异图。
图中2+，2-为T-Hg-T结构为两个时，含有汞离子和不含汞离子的圆二色谱曲线；5+，5-为T-Hg-T结构为四个；7+，7-为T-Hg-T结构为七个。
图3为不同的生物传感器的扩增效果的差异；
其中a为含有2个T-Hg-T结构的生物传感器汞离子梯度稀释扩增曲线(圆圈线)，b为含有5个T-Hg-T结构的生物传感器，c为含有7个T-Hg-T结构的生物传感器。
图4为对于影响定量效果因素的优化图；
其中a为对等温扩增时间的优化，b为对生物传感器序列终浓度的优化；带有圆圈的线为最终选取的条件组。
图5为微滴PCR的扩增热点图；a-h图中汞离子浓度由低到高；
图中，纵坐标为Chi幅度(Chi Amplitude)，横坐标为事件数(Event Number)。
图6为定量范围以及ER与汞离子添加量之间的散点关系图；
其中，图6a为汞离子量与ER值之间的线性关系图；图6b为汞离子量与ER值之间的散点图；横坐标为原始体系中存在的汞离子的量，纵坐标为由本检测体系计算得出的ER值。
图7为检测系统的特异性验证图。
图8为检测系统的干扰离子影响的验证图，图中Positive为阳性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1用于汞离子基于生物传感器和微滴PCR定量检测的生物传感器序列以及引物和探针组合的设计
根据反应原理设置生物传感器内部的发卡结构，并进行不同T-Hg-T结构的优化，设计不同的汞离子生物传感器序列：SEQ.1-3；设计扩增引物探针组：SEQ.4-12。
实施例2针对汞离子检测的基于生物传感器和微滴PCR定量检测方法的建立
1.1实验材料
本实施例中使用的汞离子标准样品和溶液均购自sigma公司。微滴PCR相关的SuperMix、微滴生成芯片均购自Bio-Rad公司，等温扩增用酶以及其buffer购自NEB公司。
1.2生物传感器等温延伸
等温扩增体系为待测血清2μL，10μM汞离子生物传感器2μL，10×等温PCR buffer 2μL，dNTP混合液2μL、Klenow大片段等温扩增酶0.2μL，ddH2O补足至20μL。操作时先将待测溶液，生物传感器、水三种成分混匀后在95℃下温浴5min后，室温下缓慢降温，降至室温后，加入等温扩增酶、缓冲液、dNTPs三种组分，混匀后置于37℃温浴2h。取出产物后，进行108倍的稀释用于后续的微滴PCR的反应。
1.3微滴PCR扩增反应
(1)配置微滴PCR反应体系。微滴PCR扩增反应的反应体系以20μL计为10μL 2×SuperMix，10μM上下游引物各0.8μL，10μM探针0.4μL，经过稀释的步骤1.2的产物2μL，ddH2O补足至20μL。
(2)在微滴PCR的生成芯片上，加入20μL的上一个步骤的反应体系，再加入70μL的微滴生成用油，进行微滴生成步骤，完成微滴生成步骤后，将微滴化的反应体系转移至96孔板中，封膜。
(3)将封膜后的96孔板放入PCR扩增仪中，PCR扩增程序为50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；
(4)完成PCR扩增后，将微滴吸入流式荧光检测器中，在60℃下进行荧光检测。
1.4数据分析
数字PCR扩增完成后，采集所有样品扩增产生的荧光信号。经过系统自动分析，按照阴性反应孔的荧光值设定荧光阈值以区分阴性点和阳性点。
每个样品中的拷贝数是通过阳性扩增孔数和总扩增孔数的比例来确定的。通过泊松分布公式计算实际拷贝数：A＝-ln[(N0-X)/N0]×N0。上述公式中，A为每个样品中的拷贝数，N0为总扩增孔数，X为阳性扩增孔数。通过ER值的计算获得重金属离子的绝对含量，ER计算公式如下：ER＝nA/4816。其中n为生物传感器中可形成T-Hg-T结构的数量，A为每个样品中的拷贝数。最后计算得到的ER数值与样品中汞离子的浓度相等(以pmol为单位)。
1.5传感器序列对反应结果和二级结构的影响
在本检测体系中，生物传感器序列内部包含的T-Hg-T结构的数量会对最终的检测结果的定量能力和扩增表现产生影响，所以本检测体系在验证前通过圆二色谱和定量PCR的方法对这方面进行了优化。
1.5.1圆二色谱法对传感器序列二级结构的测定
由于不同T-Hg-T结构的数量会导致不同的汞离子的结合量，所以我们通过圆二色谱测定的方法对不同T-Hg-T个数的生物传感器序列进行了二级结构的分析。
圆二色谱的分析结果如图2所示，可以看出，空白组的色谱曲线相较于加入汞离子的色谱曲线有很大的区别，这说明，加入汞离子后确实会对生物传感器的二级结构产生影响。另外，当生物传感器序列中有不同数量的T-Hg-T结构时，生物传感器的二级结构会产生明显的不同，从色谱图上分析，随着T-Hg-T结构数量的增加，色谱曲线会向右侧移动。
1.5.2定量PCR对不同传感器扩增表现的分析
T-Hg-T结构的数量会对发卡结构的稳定产生以及汞离子的结合数量产生影响，从而会进一步的影响扩增表现和体系的线性范围。
本实验使用定量PCR对检测体系的优化评价如图3所示，由图3可以看出，对T-Hg-T数量为2、5、7的传感器序列进行了优化，当T-Hg-T数量为2时，定量PCR基本上没有阳性结果，这说明当T-Hg-T结构数量为2时，生物传感器不能形成稳定的二级结构，这点从我们之前的圆二色谱的数据也可以得出。当T-Hg-T数量为7时，从定量PCR对线性范围的实验可以得出，较大的T-Hg-T结构数量会对线性范围产生负面的影响。T-Hg-T数量为5的生物传感器序列能够取得最佳的检测结果。
1.6反应体系的优化
为了提高反应的灵敏度，优先进行了反应体系的优化，优化因素为等温反应的时间以及生物传感器的添加量(T-Hg-T数量为5的生物传感器序列)。
优化结果如图4所示，等温扩增时间为2h，传感器终浓度为0.6μM时，反应结果达到最佳。
1.7检测体系定量能力的验证
由于汞离子的传感器可以在一定的浓度范围内实现核酸信号的线性转化。因此，我们在这部分实验对我们检测体系的线性范围以及线性检测限进行了验证。
微滴PCR的扩增热点图如图5所示，ER值与汞离子浓度的标准曲线图和散点图如图6所示。当汞离子浓度在40fmol到40pmol时，ER随着汞离子的浓度有着很好的线性Y＝0.963X+0.153，线性相关系数R2＝0.992。这说明，当汞离子浓度位于40fmol到40pmol时，ER随着汞离子浓度的增加而呈现线性增长，并且在数据上ER值与汞离子浓度相同(pmol为单位)。
1.8特异性的验证
对于实际检测方法来说，特异性具有相当重要的地位。本检测体系中通过几种常见的重金属离子进行验证本检测体系的特异性，方法同1.1-1.4。
Ag+，Ni2+，Co2+，Cd2+，Fe2+，Cu2+，Zn2+，Pb2+，Fe3+和Cr6+用于本检测体系的特异性验证。验证结果如图7所示，从图7的结果可以看出，本研究体系在以上几种重金属离子的特异性很好，其余的重金属离子中几乎没有阳性检测信号的产生。
1.9干扰离子对定量检测的影响
由于之前的实验证明了本研究体系在不同重金属离子中具有很强的特异性，所以为了降低实验成本，在本部分用铜离子进行了干扰离子的研究。
干扰离子验证实验如图8所示。由检测结果可以看出，就算是干扰离子浓度相当的高(100倍)，也不会对定量检测结果产生显著的影响。
1.10灵敏度的验证
采用与1.1-1.4相同的方法，通过梯度稀释验证检测体系的灵敏度，检测结果如下表1所示，从表1可以看出，当汞离子量在10fmol时，检测组可以与阴性组产生明显的区别。
表1
1.11实际样品的验证
本实验对实际样品做了验证以确定本检测体系的实用性，方法同1.1-1.4。通过对血清样品和污水样品的实际检测，结果如下表2所示，本检测体系对于不同基质的汞离子都具有很好的定量效果。
表2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种定量检测液体样品中汞离子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)以待测液体样品为模板溶液，利用汞离子生物传感器进行等温PCR扩增获得含有等温PCR扩增产物的扩增后体系；
(2)利用超纯水对所述扩增后体系进行108倍稀释，获得最终的稀释后物料，以所述稀释后物料作为模板溶液，利用微滴PCR扩增引物和探针进行微滴PCR扩增，采集微滴PCR扩增产生的荧光信号，依照阴性孔的荧光确定荧光阈值以得到阳性扩增孔数；
(3)利用公式I计算每个扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数，公式I中，A为扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数，N0为总扩增孔数，X为阳性扩增孔数；
公式I：A＝-ln[(N0-X)/N0]×N0
(4)利用公式Ⅱ计算样品中汞离子的浓度，公式Ⅱ中，n为生物传感器中可形成T-Hg-T结构的数量，A为扩增后体系中等温PCR扩增产物的拷贝数，ER为液体样品中汞离子浓度：
公式Ⅱ：ER＝nA/4816。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中等温PCR扩增的体系为：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，等温PCR扩增的步骤包括：先将待测液体样品、汞离子生物传感器和ddH2O接触混匀后在95℃下温浴4.5-5.5min获得温浴后体系，将所述温浴后体系降温至25℃后加入Klenow大片段等温扩增酶、等温PCR缓冲液和dNTPs，混匀后在37℃温浴1.8-2.2h获得含有等温PCR扩增产物的扩增后体系。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，微滴PCR扩增的体系为：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，微滴PCR扩增反应的条件包括将所述微滴PCR扩增体系在50℃热激活300s，95℃预变性300s，95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环，最后在60℃下采集荧光信号。
6.根据权利要求1-3和5中任意一项所述的方法，其特征在于，所述汞离子生物传感器为T-Hg-T数量为5的生物传感器。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述汞离子生物传感器的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，微滴PCR扩增引物和探针序列为：
上游引物Hg-F-5：CCCAACCCGCCCTACC；
下游引物Hg-R-5：TACCCGCTGAGGTTAAACAAC；
探针Hg-P-5：FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。
9.一种汞离子定量检测试剂盒，其特征在于，含有汞离子生物传感器以及微滴PCR扩增引物和探针：
其中，所述汞离子生物传感器的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
微滴PCR扩增引物和探针序列为：
上游引物Hg-F-5：CCCAACCCGCCCTACC；
下游引物Hg-R-5：TACCCGCTGAGGTTAAACAAC；
探针Hg-P-5：FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。
10.根据权利要求9所述的汞离子定量检测试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Klenow大片段等温扩增酶、Mg2+、PCR反应缓冲液。
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