CN112126687A - 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112126687A
CN112126687A CN202011228726.2A CN202011228726A CN112126687A CN 112126687 A CN112126687 A CN 112126687A CN 202011228726 A CN202011228726 A CN 202011228726A CN 112126687 A CN112126687 A CN 112126687A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
probe
represented
group
primers
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011228726.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郑仲征
安琳
徐祥
袁志阳
廖宽镇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Dishuobeiken Gene Technology Co ltd
Shanghai Tissuebank Biotechnology Co ltd
Shanghai Tissuebank Medical Inspection Co ltd
Shenzhen Tissuebank Precision Medicine Co ltd
Original Assignee
Shanghai Dishuobeiken Gene Technology Co ltd
Shanghai Tissuebank Biotechnology Co ltd
Shanghai Tissuebank Medical Inspection Co ltd
Shenzhen Tissuebank Precision Medicine Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Dishuobeiken Gene Technology Co ltd, Shanghai Tissuebank Biotechnology Co ltd, Shanghai Tissuebank Medical Inspection Co ltd, Shenzhen Tissuebank Precision Medicine Co ltd filed Critical Shanghai Dishuobeiken Gene Technology Co ltd
Priority to CN202011228726.2A priority Critical patent/CN112126687A/zh
Publication of CN112126687A publication Critical patent/CN112126687A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种用于检测患者HLA缺失型复发的引物和探针组合、含有该引物和探针组合的试剂盒以及采用该引物和探针组合或试剂盒检测患者HLA缺失型复发的方法。本发明基于最新的IMGT数据库对特异HLA型别设计引物和探针组合，可以准确鉴定移植复发患者类型，指导临床治疗方案。与现有技术相比，本发明的方法具有覆盖度高、性能稳定、灵敏度高、操作简单、结果易判读等优点。

Description

用于检测患者HLA缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于检测患者HLA缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
造血干细胞移植是唯一有可能治愈白血病的手段，但是移植后患者仍有三分之一会发生复发。一旦发生移植后复发，复发的预后差。目前，针对移植后复发患者的治疗方式主要有供者淋巴细胞输注、化疗和二次移植等等。
HLA缺失型复发是指在复发的患者肿瘤细胞中，患者特异性的HLA型别丢失的现象。针对HLA缺失型复发患者，供者淋巴细胞输注对该类型的患者无效，必须进行二次移植。
截至2017年，在半相合造血干细胞移植案例分析中，HLA缺失型复发占所有复发病例的33％。2018年发表在blood杂志上的国际多中心协作组研究结果显示，在396例有效入组病例中，HLA缺失型复发共51例(12.8％)，其中35例来自半相合移植(占半相合移植复发比例为22.6％)，12例来自HLA错配的无关供者移植(11.9％)，4例来自全相合无关供者移植(4.3％)。
因此，移植后复发患者HLA缺失检测对于明确复发原因，指导复发后治疗具有非常重要的临床价值。2019年EBMT的专家共识中推荐确诊的HLA缺失型复发患者使用不同的单倍型不匹配的供体或不相关供体，并提示原供者淋巴细胞输注不能获益。由此可知，当前临床迫切需要一种能准确、快速、灵敏高的移植后患者HLA缺失型复发检测技术。
发明内容
本发明针对临床需要快速、准确、灵敏度高的检测HLA缺失型复发的需求，提供了一整套用于检测患者HLA缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法。本发明的检测方法覆盖度高、性能稳定、灵敏度高、操作简单、结果易判读。
为此，本发明一方面提供了一种用于检测患者HLA缺失型复发的引物和探针组合，其由SEQ ID NO.1-69所示的引物和探针组成。
在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合进一步由第1-23组引物和探针组成，其中第1组由SEQ ID NO.1所示的探针和SEQ ID NO.2-3所示的引物组成，第2组由SEQID NO.4所示的探针和SEQ ID NO.5-6所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.7所示的探针和SEQ ID NO.8-9所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.10所示的探针和SEQ ID NO.11-12所示的引物组成，第5组由SEQ ID NO.13所示的探针和SEQ ID NO.14-15所示的引物组成，第6组由SEQ ID NO.16所示的探针和SEQ ID NO.17-18所示的引物组成，第7组由SEQ ID NO.19所示的探针和SEQ ID NO.20-21所示的引物组成，第8组由SEQ ID NO.22所示的探针和SEQID NO.23-24所示的引物组成，第9组由SEQ ID NO.25所示的探针和SEQ ID NO.26-27所示的引物组成，第10组由SEQ ID NO.28所示的探针和SEQ ID NO.29-30所示的引物组成，第11组由SEQ ID NO.31所示的探针和SEQ ID NO.32-33所示的引物组成，第12组由SEQ IDNO.34所示的探针和SEQ ID NO.35-36所示的引物组成，第13组由SEQ ID NO.37所示的探针和SEQ ID NO.38-39所示的引物组成，第14组由SEQ ID NO.40所示的探针和SEQ ID NO.41-42所示的引物组成，第15组由SEQ ID NO.43所示的探针和SEQ ID NO.44-45所示的引物组成，第16组由SEQ ID NO.46所示的探针和SEQ ID NO.47-48所示的引物组成，第17组由SEQID NO.49所示的探针和SEQ ID NO.50-51所示的引物组成，第18组由SEQ ID NO.52所示的探针和SEQ ID NO.53-54所示的引物组成，第19组由SEQ ID NO.55所示的探针和SEQ IDNO.56-57所示的引物组成，第20组由SEQ ID NO.58所示的探针和SEQ ID NO.59-60所示的引物组成，第21组由SEQ ID NO.61所示的探针和SEQ ID NO.62-63所示的引物组成，第22组由SEQ ID NO.64所示的探针和SEQ ID NO.65-66所示的引物组成，第23组由SEQ ID NO.67所示的探针和SEQ ID NO.68-69所示的引物组成。
本发明HLA型别覆盖表如表1所示，患者特异HLA采用低分型别，可覆盖更多临床患者。
表1 HLA型别覆盖情况，以及对应的引物和探针序列表
Figure BDA0002764450010000031
Figure BDA0002764450010000041
在本发明优选的实施方案中，该引物和探针组合均委托上海生工科技有限公司合成，纯化方式为HPLC，其中探针的5’端有FAM修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
在本发明优选的实施方案中，针对每组引物和探针组合单独配置工作液，每组引物和探针组合中，每种引物的浓度为300nM，探针的浓度为200nM。
本发明另一方面提供了一种用于检测患者HLA缺失型复发的试剂盒，其包含本发明所述的引物和探针组合。该试剂盒包含以下几种成分：
1、基因组DNA提取试剂盒；
2、2×Taqman Fast Advanced Master Mix反应液；
3、本发明所述的各HLA型别对应的引物和探针组合。
本发明另一方面提供了本发明所述的引物和探针组合在制备用于检测患者HLA缺失型复发的试剂盒中的应用。
本发明再一方面提供了本发明所述的引物和探针组合，或者本发明所述的试剂盒在检测患者HLA缺失型复发中的应用。
本发明最后一方面提供了一种检测患者HLA缺失型复发的方法，其包含以下步骤：
1、获取待测样品DNA；
获取待检测患者移植前后外周血样本和供者外周血样本，按照商品化试剂盒说明书提取样品基因组DNA，将供者、患者术前与患者术后样本稀释到约15ng/μl。
2、采用本发明所述的引物和探针组合，或采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，对供者移植前样本、患者移植前样本、患者移植后样本、内参基因和患者特异HLA型别进行检测；
根据供者与患者术前样本HLA型别，选取本发明所述的特定型别引物和探针组合，或者采用本发明所述的试剂盒，以步骤1中获取的基因组DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，反应体系如表2所示：
表2荧光定量PCR扩增反应体系表
组成成分 体积/反应
TaqMan FAST advance Master Mix 10μl
ddH<sub>2</sub>O 5μl
Primer Mix 2μl
模板DNA 3μl
总反应体系 20μl
荧光定量PCR反应程序为：50℃预处理3分钟，95℃预变性5分钟，预变性后按照以下程序进行40个循环：95℃15秒，62℃1分钟；50℃数据读取1分钟。
3、根据嵌合率计算公式进行计算，从而对待测样品进行HLA缺失型复发判定。
分析PCR反应孔对应FAM通道的内参REF，软件自动获取基线。若患者移植前样本Ct值≤30，患者样本Ct值≥40或无明显扩增曲线，则该位点可以定量分析患者特异性HLA比例。
HLA缺失定量检测：根据患者术前与术后样本特异HLA型别和Actin的Ct值，计算术后患者特异HLA型别比例。计算公式为2-ΔΔCt×100％，其中ΔΔCt＝ΔCt移植后-ΔCt移植前＝(Ct特异HLA基因移植后-Ct内参基因移植后)-(Ct特异HLA基因移植前-Ct内参基因移植前)，嵌合率＜3％，判定为HLA缺失型复发。
在本发明优选的实施方案中，步骤2中采用的探针的5’端有FAM修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
在本发明优选的实施方案中，步骤2中采用的每组引物和探针组合单独配置工作液，每组引物和探针组合中，每种引物的浓度为300nM，探针的浓度为200nM。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点。
1、型别覆盖率高。
本发明针对HLA I类与II类抗原设计检测引物与探针，其具体覆盖型别如表3所示。其中HLA-A，HLA-B，HLA-C，HLA-DQB1，HLA-DRB1与HLA-DPB1位点中国人群覆盖率分别达到77.16％，47.28％，81.63％，54.48％，53％，33％，可以满足临床检测的需求。
表3引物、探针与检测的HLA型别对照表
Figure BDA0002764450010000061
Figure BDA0002764450010000071
2、性能稳定。
对本发明设计引物进行扩增效率测试发现所有型别扩增效率均在91.6％到107.4％之间，说明引物特异性好、扩增能力强。HLA型别对应扩增效率如表4所示。
表4 HLA检测引物与探针的扩增效率表
Figure BDA0002764450010000072
Figure BDA0002764450010000081
3、灵敏度高。
本发明所有位点最低检测限为0.16％，该检测体系在临床阳性样本0.16％浓度下能够稳定检测，具体HLA型别与对应最低检测限如表5所示。
表5临床样本HLA检测结果表
Figure BDA0002764450010000082
Figure BDA0002764450010000091
综上所述，本发明提供了一种覆盖度高、性能稳定、灵敏度高、操作简单、结果易判读的HLA缺失型复发检测方法。
附图说明
图1：实施例1中分别采用HLA型别A*02、B*13、C*01与C*07阳性与阴性样本验证本发明检测体系的特异性的示意图。
图2：实施例2中分别采用HLA型别A*02、B*13、C*01与C*07样本梯度稀释验证本发明检测体系的引物对与探针的扩增效率的示意图。
图3：实施例3中分别采用HLA型别A*02、B*13、C*01与C*07样本梯度稀释验证本发明检测体系的灵敏度的示意图。
图4：实施例4中HLA缺失型复发阳性案例结果示意图。
图5：实施例5中HLA缺失型复发阴性案例结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。应当指出，对于本领域技术人员而言，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也同样落入本发明的保护范围之内。
实施例1：HLA缺失型复发检测引物对与探针的特异性
本实施例通过对特异的HLA型别设计引物对与探针，通过荧光定量PCR反应Ct值来判断引物对与探针的特异性。
本发明中标本Ct值≤30判断为阳性，Ct值≥40或无扩增曲线判断为阴性。
结合附图1，从特异HLA型别A*02、B*13、C*01与C*07阳性标本与阴性标本的扩增曲线图，可以看出阳性标本的Ct值分别为25.2、26.9、29.6与28.1，阴性标本无扩增。说明上述型别引物对与探针具有良好的特异性。
实施例2：HLA缺失型复发检测引物对与探针的扩增效率
本实施例选用一代测序检测过的HLA-A*02、B*13、C*01与C*07型别实验室供者样本作为阳性模板，不含该型别样本作为阴性。
阳性与阴性DNA样品均稀释到15ng/μl，使用阴性样品DNA对阳性样品进行5倍梯度稀释。利用上述5个浓度阳性样本(100％、20％、4％、0.8％、0.16％)进行qPCR检测，每个样本3个技术重复，利用阳性样本浓度与Ct值平均值绘制标准曲线。
结合附图2，可以看出上述位点标准曲线相关系数R2>0.99，证实引物在0.16％-100％范围内线性扩增。
通过附图2所示的引物扩增曲线斜率，计算得到A*02、B*13、C*01与C*07引物扩增效率分别为100.45％、96.19％、92.39％与91.60％。利用同样方法检测其余位点特定型别扩增效率也都在92.2％到107.4％之间(参见表4)，证实上述型别检测引物对与探针的扩增特异性与扩增能力较强。
实施例3：HLA缺失型复发检测引物对与探针的灵敏度
本实施例选用一代测序检测过的HLA-A*01、A*02、A*11、A*23、A*25、B*13、B*35、B*38、C*01、C*02、C*03、C*04、C*05、C*07、DRB1*04、DRB1*12、DQB1*02、DQB1*04、DQB1*05、DPB1*01:01、DPB1*02:01、DPB1*04:01与DPB1*05:01型别实验室供者样本作为阳性模板，不含该型别样本作为阴性。
上述样本DNA浓度均稀释到15ng/μl，利用阴性样本将阳性样本稀释到0.16％，每天检测2个批次，连续5天检测。
检测结果如表5，上述型别引物对与探针批次间与批次内Ct值变异系数均小于5％，其中A*02、B*13、C*01与C*07的检测结果如附图3所示，说明该检测体系在临床阳性样本为0.16％的浓度下能够进行稳定的检测。
实施例4：HLA缺失型复发检测阳性案例
本实施例为HLA缺失型复发阳性案例。
在内参基因Actin扩增正常的情况下，患者术前HLA-A*02型别检测为阳性，供者术前为阴性。
结合附图4，检测结果显示患者术后HLA-A*02特异型别检测为阴性。根据嵌合率％＝2-ΔΔCt×100％，患者术后HLA-A*02型别嵌合率为0％，小于3％。由此可以判断患者术后为HLA-A*02缺失型复发阳性。
实施例5：HLA缺失型复发检测阴性案例
本实施例为HLA缺失型复发阴性案例。
在内参基因Actin扩增正常的情况下，患者术前HLA-A*02型别检测为阳性，供者术前为阴性，患者术后HLA-A*02型别检测为阳性。
结合附图5，根据嵌合率％＝2-ΔΔCt×100％，患者术后HLA-A*02型别嵌合率为75％，大于3％。由此可以判断患者术后为HLA-A*02缺失型复发阴性。
序列表
<110> 上海荻硕贝肯生物科技有限公司
<120> 用于检测患者HLA缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ctggtcccaa tactcggg 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gacgccgcga gccataa 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccccaggttc gctcgctc 18
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
ccgcttcatc gcagtg 16
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
tcctcgtccg caggcact 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
gaactgcgtg tccctccacg 20
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
agctagaaat gtgccct 17
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
tcaggtggag aaggggtgaa a 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
ctgtgacttg tgactgctcg t 21
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
ccagatcctg taccagag 18
<210> 11
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
caattgggac caacactaga atatcg 26
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
ggatcgtctt tccgtcattc cg 22
<210> 13
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 13
actccatgag gtatttc 17
<210> 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 14
ccgggaagcc gcgact 16
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 15
cttacagatg cacagcagga agcacactg 29
<210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 16
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 17
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 18
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 19
cattagcaca acaggccttt ga 22
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 20
agggcccgct tggactt 17
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 21
tcgcgtgtcc ttctccgagc ct 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 22
gcagaggaaa cctcggattc t 21
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 23
tccaacgagc ggcttcac 18
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 24
cttacagatg cacagcagga agcacactg 29
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 25
tggagataac actctaagca taactaaagg t 31
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 26
gatgtagttg cttgggaccc a 21
<210> 27
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 27
ccatttttgg tttgggcttc acaccatt 28
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 28
cattagcaca acaggccttt ga 22
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 29
agggcccgct tggactt 17
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 30
ctcctcgtgg gaggccctc 19
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 31
tcagatcacc cagcgca 17
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 32
acatcgccct gaacgaagat 20
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 33
cagcgtctcc ttcccatcct t 21
<210> 34
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 34
cagttcgtgc ggttc 15
<210> 35
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 35
ggtctcagcc actcctggt 19
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 36
cctgctccac ccacggc 17
<210> 37
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 37
tctcagcccc tcctc 15
<210> 38
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 38
cctgggcctg tgagtgtga 19
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 39
ggcggtgtag aaatacctca agg 23
<210> 40
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 40
ctgtggtggt gccttc 16
<210> 41
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 41
ggatggggag gaccagtcc 19
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 42
cagcccctcg tgctacat 18
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 43
cctcagcctc tctgct 16
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 44
tttagtaaat ccaaaatcct aacaccact 29
<210> 45
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 45
atgtacaaaa gcttgaattg atgatgaa 28
<210> 46
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 46
aatcacaacc acagcta 17
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 47
gagtgggaga ctgagagaaa tgac 24
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 48
tttcttaatt tctctgccac tggtg 25
<210> 49
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 49
tcctgaccca gtggagc 17
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 50
agaactcgca acagtccttc g 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 51
cactcagacc ctgaggctca a 21
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 52
cccttcagcg gccagtagca tctga 25
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 53
gcttcactct gaccatcact gtct 24
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 54
atccacaggt gagtctggca tt 22
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 55
aacctcgaaa tcgtactgag aagcactcca 30
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 56
ccagcctcat gcacaacca 19
<210> 57
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 57
gggctcctcg gatactcaaa a 21
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 58
ccctccctga cctgtctcgg cc 22
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 59
cgctcctacc ctgcaaaca 19
<210> 60
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 60
ggcccctctg aataggatct c 21
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 61
acctcagctc cgcggaagtt gc 22
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 62
ctctgtctcc ccgcctgaa 19
<210> 63
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 63
caacgcctcg ctcatcttg 19
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 64
tcccaatggg catggcgtgc 20
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 65
cccaagtatc cctgtaaaac aaaaa 25
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 66
gatggagtcc acaggatcag agt 23
<210> 67
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 67
gaaaggaaac ttggatggct ca 22
<210> 68
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 68
caggctgcaa taagagatat tttaagc 27
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 69
gaagtcacac tggtatggtt tctca 25

Claims (10)

1.一种用于检测患者HLA缺失型复发的引物和探针组合，其由SEQ ID NO.1-69所示的引物和探针组成。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其进一步由第1-23组引物和探针组成，其中第1组由SEQ ID NO.1所示的探针和SEQ ID NO.2-3所示的引物组成，第2组由SEQ ID NO.4所示的探针和SEQ ID NO.5-6所示的引物组成，第3组由SEQ ID NO.7所示的探针和SEQ IDNO.8-9所示的引物组成，第4组由SEQ ID NO.10所示的探针和SEQ ID NO.11-12所示的引物组成，第5组由SEQ ID NO.13所示的探针和SEQ ID NO.14-15所示的引物组成，第6组由SEQID NO.16所示的探针和SEQ ID NO.17-18所示的引物组成，第7组由SEQ ID NO.19所示的探针和SEQ ID NO.20-21所示的引物组成，第8组由SEQ ID NO.22所示的探针和SEQ IDNO.23-24所示的引物组成，第9组由SEQ ID NO.25所示的探针和SEQ ID NO.26-27所示的引物组成，第10组由SEQ ID NO.28所示的探针和SEQ ID NO.29-30所示的引物组成，第11组由SEQ ID NO.31所示的探针和SEQ ID NO.32-33所示的引物组成，第12组由SEQ ID NO.34所示的探针和SEQ ID NO.35-36所示的引物组成，第13组由SEQ ID NO.37所示的探针和SEQID NO.38-39所示的引物组成，第14组由SEQ ID NO.40所示的探针和SEQ ID NO.41-42所示的引物组成，第15组由SEQ ID NO.43所示的探针和SEQ ID NO.44-45所示的引物组成，第16组由SEQ ID NO.46所示的探针和SEQ ID NO.47-48所示的引物组成，第17组由SEQ IDNO.49所示的探针和SEQ ID NO.50-51所示的引物组成，第18组由SEQ ID NO.52所示的探针和SEQ ID NO.53-54所示的引物组成，第19组由SEQ ID NO.55所示的探针和SEQ ID NO.56-57所示的引物组成，第20组由SEQ ID NO.58所示的探针和SEQ ID NO.59-60所示的引物组成，第21组由SEQ ID NO.61所示的探针和SEQ ID NO.62-63所示的引物组成，第22组由SEQID NO.64所示的探针和SEQ ID NO.65-66所示的引物组成，第23组由SEQ ID NO.67所示的探针和SEQ ID NO.68-69所示的引物组成。
3.根据权利要求1或2所述的引物和探针组合，其中探针的5’端有FAM修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的引物和探针组合，其中针对每组引物和探针组合单独配置工作液，每组引物和探针组合中，每种引物的浓度为300nM，探针的浓度为200nM。
5.一种用于检测患者HLA缺失型复发的试剂盒，其包含权利要求1-4中任一项所述的引物和探针组合。
6.权利要求1-4中任一项所述的引物和探针组合在制备用于检测患者HLA缺失型复发的试剂盒中的应用。
7.权利要求1-4中任一项所述的引物和探针组合，或者权利要求5所述的试剂盒在检测患者HLA缺失型复发中的应用。
8.一种检测患者HLA缺失型复发的方法，其包含以下步骤：
(1)获取待测样品DNA；
(2)采用权利要求1-4中任一项所述的引物和探针组合，或采用权利要求5所述的试剂盒，以步骤(1)中获取的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，对供者移植前样本、患者移植前样本、患者移植后样本、内参基因和患者特异HLA型别进行检测；
(3)根据嵌合率计算公式进行计算，从而对待测样品进行HLA缺失型复发判定。
9.根据权利要求8所述的方法，其中探针的5’端有FAM修饰，3’端有NFQ-MGB修饰。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中针对每组引物和探针组合单独配置工作液，每组引物和探针组合中，每种引物的浓度为300nM，探针的浓度为200nM。
CN202011228726.2A 2020-11-06 2020-11-06 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法 Pending CN112126687A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011228726.2A CN112126687A (zh) 2020-11-06 2020-11-06 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011228726.2A CN112126687A (zh) 2020-11-06 2020-11-06 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112126687A true CN112126687A (zh) 2020-12-25

Family

ID=73852293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011228726.2A Pending CN112126687A (zh) 2020-11-06 2020-11-06 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112126687A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113035276A (zh) * 2021-03-11 2021-06-25 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和系统
CN114457165A (zh) * 2022-04-13 2022-05-10 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 一种用于检测hla-a02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132069A1 (en) * 2001-06-06 2004-07-08 Pierre Aman Method to measure gene expression ratio of key genes
CN101654691A (zh) * 2009-09-23 2010-02-24 深圳华大基因科技有限公司 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物
WO2017100259A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Pretransplant prediction of post-transplant acute rejection
CN107190088A (zh) * 2017-07-19 2017-09-22 德必碁生物科技（厦门）有限公司 一种荧光pcr熔解曲线法检测hla基因型的试剂盒
CN110423818A (zh) * 2019-08-07 2019-11-08 南京实践医学检验有限公司 一种用于hla-loss检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法
CN111471770A (zh) * 2020-05-07 2020-07-31 南京实践医学检验有限公司 一种基于多重荧光rt-pcr检测白血病融合基因的试剂盒及方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040132069A1 (en) * 2001-06-06 2004-07-08 Pierre Aman Method to measure gene expression ratio of key genes
CN101654691A (zh) * 2009-09-23 2010-02-24 深圳华大基因科技有限公司 Hla基因扩增和基因分型方法及其相关引物
WO2017100259A1 (en) * 2015-12-08 2017-06-15 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Pretransplant prediction of post-transplant acute rejection
CN107190088A (zh) * 2017-07-19 2017-09-22 德必碁生物科技（厦门）有限公司 一种荧光pcr熔解曲线法检测hla基因型的试剂盒
CN110423818A (zh) * 2019-08-07 2019-11-08 南京实践医学检验有限公司 一种用于hla-loss检测和个体识别的引物、探针、试剂盒及方法
CN111471770A (zh) * 2020-05-07 2020-07-31 南京实践医学检验有限公司 一种基于多重荧光rt-pcr检测白血病融合基因的试剂盒及方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113035276A (zh) * 2021-03-11 2021-06-25 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和系统
CN113035276B (zh) * 2021-03-11 2021-12-03 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和系统
CN114457165A (zh) * 2022-04-13 2022-05-10 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 一种用于检测hla-a02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103045591B (zh) Hla基因特异性pcr扩增引物及hla分型的方法和试剂盒
CN108410980B (zh) 筛选甲基化pcr检测的目标区域的方法、试剂盒及应用
Creary et al. Next-generation sequencing reveals new information about HLA allele and haplotype diversity in a large European American population
Ponti et al. TCRγ-chain gene rearrangement by PCR-based GeneScan: diagnostic accuracy improvement and clonal heterogeneity analysis in multiple cutaneous T-cell lymphoma samples
CN112126687A (zh) 用于检测患者hla缺失型复发的引物、探针、试剂盒及方法
US20190367983A1 (en) Pcr primer set for hla gene, and sequencing method using same
Alasaad et al. Siberian tiger’s recent population bottleneck in the Russian Far East revealed by microsatellite markers
JP2023116700A (ja) 主要組織適合遺伝子複合体一塩基多型
CN114317693A (zh) 人5s核糖体dna拷贝数检测试剂盒及检测方法
CN104031989B (zh) 一种人基因组dna26个基因座的复合扩增的试剂盒
CN106244717B (zh) 一种对未知猪检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统
Takanosu et al. Improved clonality analysis based on immunoglobulin kappa locus for canine cutaneous plasmacytoma
Coppage et al. Leukemia specific loss of heterozygosity of MHC in a CLL patient: disease state impacts timing of confirmatory typing
CN110982898A (zh) 基于ARMS-PCR的MyD88基因L265P突变检测试剂盒及检测方法
CN113817856B (zh) 检测古菌Candidatus Methanoliparum的引物对、试剂盒及方法
CN112509638B (zh) 人类hla染色体区域杂合性缺失的分析方法和分析处理装置
Aloisio et al. A semi-nested real-time PCR method to detect low chimerism percentage in small quantity of hematopoietic stem cell transplant DNA samples
CN108998545B (zh) 半滑舌鳎外泌体piR-mmu-31018127应用
CN109112194B (zh) 半滑舌鳎性别标签piR-mmu-72274的应用
CN112609006A (zh) 人类白细胞抗原一步测序分型方法及其应用
CN109295241B (zh) 一种区别山羊与绵羊肉的方法
CN108642190B (zh) 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN106591462B (zh) 一种用于鉴定长江江豚个体间亲缘关系的引物、试剂盒及鉴别方法
CN111218453A (zh) 一种RhD血型抗原RHD-G353A突变体及检测
Patzelt History of forensic serology and molecular genetics in the sphere of activity of the German Society for Forensic Medicine

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20201225